Skript zum Masterpraktikum Modul: Strahlung α−, β−, γ−Spektroskopie

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Skript zum Masterpraktikum Modul: Strahlung

α−, β−, γ− Spektroskopie

Stand: Sommersemester 2009

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Strahlungsarten

α−Strahlung

Abgabe von 2 Protonen und 2 Neutronen (⁴2He).

He Pb Po ²⁰⁶₈₂ ₂⁴

210

84 ⇒ +

Die Nukleonenzahl verringert sich beim a-Zerfall um 4, die Ordnungszahl um 2.

Die Reichweite beträgt in Luft wenige cm (²¹⁰Po: 4 cm) in Flüssigkeiten und Feststoffen wenige µm (abhängig von der Dichte).

β−Strahlung

β⁻−Strahlung: Abgabe eines Elektrons und eines Antineutrinos β⁺−Strahlung: Abgabe eines Positrons und eines Neutrinos

Elektoneneinfang aus innerem Orbital (EC) unter Abgabe eines Neutrinos

e

e e

Ar

K⇒₁₈⁴⁰ + ⁺+ν

40 19

Mn+νe 55 25

e Bi

Pb⇒²¹⁰₈₃ + ⁻+ν

210 82

e Fe+ ⁻ ⇒

55 26

Die Nukleonenzahl bleibt gleich, die Ordnungszahl erhöht sich um 1 (bei β⁻) und verringert sich um 1 (bei β⁺, EC).

Die Reichweite beträgt wenige cm bis 1 m (abhängig von der Energie) Abschirmung erfolgt mit Plexiglas (2 Größenordnungen)

γ−Strahlung

Durchdringendste elektromagnetische Strahlung, die beim Zerfall der Atomkerne vieler radioaktiver Nuklide entsteht.

Die Reichweite beträgt in Feststoffen einige cm bis m (abhängig von Dichte und γ−Energie)

Abschirmung erfolgt mit Blei, Schwerbeton (hohe Dichte) Strahlungsmessung – Spektrometrie

Nicht nur die Bestimmung der gesamten Strahlungsmenge ist

von Interesse, sondern auch die Art und Herkunft der Strahlung. Dazu ist Spektrometrie notwendig – die Unterscheidung nach der Strahlungsenergie.

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α−Spektrometrie mit Halbleiterdetektor (PIPS) PIPS: Passivated Implanted Planar Silicon detector

Bei diesen Detektoren handelt es sich um n-leitende Siliziumdetektoren, deren Eintrittsseite p-leitend ist durch wenige nm einer Bor Implantationsschicht. Am pn-Übergang bildet sich eine Ladungsfreie Zone, die durch Anlegen einer Spannung in Sperrichtung vergrößert wird. Die einfallende Strahlung (α−Strahlen) in diese Zone erzeugt Paare von Elektronen und Löchern.In der pn-Übergangsschicht werden Elektronen und Löcher durch das Ladungsfeld getrennt

(Löcher wandern ins p- und Elektronen ins n-Gebiet ). Die Anzahl der Elektronen-Loch-Paare hängt von der Energie des einfliegenden Teilchens ab. Der resultierende Stromstoß ist ein Maß für die Energie der Strahlung.

Es wird im Vakuum gemessen, um die Reichweite der α−Partikel zu erhöhen.

Der Nulleffekt ist extrem niedrig (1-2 Impulse/h). Die hohe Auflösung von 20 keV erlaubt α−strahlende Nuklide, deren Energien nahe beieinander liegen, zu trennen.

3500 4000 4500 5000

0 50 100 150 200 250 300 350 400

237Np _α−Standard, dünne Schicht

237Np eingetrocknete Probe, dickere Schicht

Impulse

Energie in keV

Abb. 1: α−Spektren von ²³⁷Np, gemessen mit PIPS Detektor

α−, β−Spektrometrie mittels Flüssigszintillation

Es wird ein homogenes Gemisch aus Probe und Szintillations-Cocktail hergestellt.

Der Szintillations-Cocktail, bestehend aus Lösungsmittel, primärer Szintillator und sekundärer Szintillator wird durch β− oder α−Teilchen zur Emission von Lichtquanten angeregt:

• Lösungsmittel (z. B. Toluol, Benzol, Xylol, Diisopropylnaphtalin) kinetische Energie des Kernzerfalls regt p-Elektronen an: 200-300 nm

• primärer Szintillator (z.B. Oxazole, Oxadiazole, Benzooxazole, Pyrazoline,

2,5 Diphenyloxazol PPO ca. 10^-2 m) Energieübertragung durch Molekülzusammenstöße, Strahlung, Dipol-Dipol-Wechselwirkung: 340-400 nm

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• sekundärer Szintillator (ähnliche Struktur wie primäre aber längerwelliges

Fluoreszenzmaximum, z.B. p-bis-(o-Methylsteryl)-benzol ca. 10^-4 m) absorbiert das Licht vom primären Szintillator und gibt es als Fluoreszenzlicht weiter – „Wellenlängenschieber“

400-470nm Photoverstärkerröhre:

• Lichtumwandlung in elektrische Impulse

• Photoeffekt: Elektronenfreisetzung

Hochspannung

Photover- stärkerröhre

Koinzidenz- schaltung

Verstärker

ADC Impulshöhen-

analysator Probe

Analyse des Spektrums

• Auf Dynoden (pos. Elektrode) gelenkt

• Erzeugung von Sekundärelektronen

• Weitere Dynoden → Kaskade von Elektronen

• Letzte Dynode – Messung des elektrischen Impulses

Koinzidenzschaltung:

Nur Messung von Spannungsimpulsen, die von beiden Photoverstärkerröhren kommen

Unterdrückung thermischer Impulse Impulshöhenanalysator:

Die im Szintillationsprozess freigesetzte

Photonenzahl ist der α−, β−Energie proportional.

Lineare Umsetzung in Photoverstärker Impulshöhe proportional der α−, β−Energie

200 400 600 800

0 500 1000 1500

α - S pektrum ²³⁷N p β - spectrum ²³³P a

233P a

237 Np

Impulse

E nergie [K anal]

Abb. 2: α−Spektrum von ²³⁷Np und β−Spektrum von ²³³Pa (Tochter) gemessen mit Flüssigszintillationsspektroskopie

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0 200 400 600 800 1000 0

200 400 600 800 1000 1200

α-Spektrum ²¹⁰Po β-Spektrum ²¹⁰Pb, ²¹⁰Bi

Impulse

Energie [Kanal]

Abb. 3: α−Spektrum von ²¹⁰Po und β−Spektrum von ²¹⁰Pb und ²¹⁰Bi gemessen mit Flüssigszintillationsspektroskopie

0 200 400 600 800 1000

0 50 100 150 200 250 300

Energie [Kanal]

β LS Spektrum gesamt Fit

210Pb Fit

210Bi Fit

Impulse

Abb. 4: Spektrenentfaltung des β−Spektrums

γ−Spektrometrie mit Reinst-Germaniumdetektor Halbleiterdetektor:

Ein Halbleiterzähler stellt eine in Sperrrichtung gepolte Diode dar. Die Konversion der einfallenden Strahlung in ein messbares elektrisches Signal geschieht in der Verarmungszone einer Halbleiterdiode, die in der Regel eine p-i-n Struktur aufweist. Die in der intrinsischen Zone erzeugten Ladungsträger werden mittels eines angelegten Spannungsgradienten von 100 bis 200 V/mm gesammelt. Der resultierende Strom führt zu einer Änderung der angelegten Spannung.

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Der Ladungsimpuls wird über einen ladungsempfindlichen Vorverstärker und einen Spektroskopieverstärker, den Vielkanal-Impulshöhen-Analysator, zugeführt.

Der Detektor wird auf ca. 90 K gekühlt. Dadurch wird das thermische Rauschen unterdrückt und die Beweglichkeit der Elektronen und Löcher erhöht.

Wechselwirkung γ−Strahlung –Materie

• γ−Strahlen sind keine geladenen Teilchen sondern Photonen

• nach der Wechselwirkung mit Materie Messung möglich Drei Prozesse der Wechselwirkung:

• Photoeffekt

o γ−Quanten an stark gebundenen Elektronen (innere Schalen) von Atomen inelastisch gestreut. Das Elektron wird aus dem Atom geschlagen.

o Sekundäreffekt: Augereffekt

• Comptoneffekt

o Wechselwirkung der γ−Quanten mit freien Elektronen – Stoßprozess

o Elektron gewinnt kinetische Energie, Photon ändert seine Wellenlänge (abhängig vom Streuwinkel)

• Paarbildung

o Energie des Photons > als Energieäquivalent der doppelten Elektronenmasse

→ Photon vernichtet, Erzeugung eines Elektron - Positron Paares Erläuterung am Beispiel von ¹³⁷Cs

Photopeak

Comptonkante Rückstreulinie

Comptonkontinuum

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Abb. 5: γ−Spektrum von ²³⁷Np mit seiner Tochter ²³³Pa

Spektrometrieversuch

Es soll in einem Versuch ²¹⁰Pb und die Töchter ²¹⁰Bi und ²¹⁰Po bestimmt werden.

Stellung in der Nuklidtabelle zeigt das folgende Bild:

Abb. 6: Nuklidtabelle

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Die Nuklide haben folgende Eigenschaften:

210Pb: T1/2 = 22,2 Jahre

β⁻ 16,96 keV (84%), 63,5 keV (16%) α 3720 keV (1,9·10^-6%)

γ 46,539 keV (4,25%)

X-Ray 16 Linien 9.42 bis 15,71 keV (Σ 23,6%)

210Bi: T1/2 = 5.012 Tage

β⁻ 1162,1 keV (100%) α 5036,0 keV (1,3·10^-4%)

γ keine

X-Ray keine

210Po: T1/2 = 138,38 Tage

α 5307,56 keV (100%)

γ 803,10 keV (0,00121%)

X-Ray 9,184 bis 87,580 keV (Σ 1,3·10^-5%)

Folgender Aktivitätsverlauf kann berechnet werden: nach ²¹⁰Pb Abtrennung erfolgt ein Anwachsen von ²¹⁰Bi und ²¹⁰Po

210Pb → β⁻→ ²¹⁰Bi → β⁻ ²¹⁰Po → α⁺ → ²⁰⁶Pb (stabil)

0 1 2 3 4

0 20 40 60 80 100

Zeit / Jahre

Aktivität / %

210Pb _Τ_1/2 = 22,3 a

210Bi _Τ_1/2 = 5,013 d

210Po _Τ_1/2 = 138,38 d

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Skript zum Masterpraktikum Modul: Biologie

Wechselwirkung von Metallen in Biosystemen

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Schwermetalle in der Umwelt

Als Schwermetalle werden Metalle mit einer höheren Dichte als 3,8 g/cm³ bezeichnet. Einige von ihnen sind für den Menschen in geringen Mengen lebensnotwendig. Zu diesen essentiellen Schwermetallen zählen die sogenannten Spurenelemente Eisen, Kupfer, Mangan, Molybdän und Zink. Andere Schwermetalle haben bei Stoffwechselprozessen keine erkennbare Funktion und sind bereits in geringen Mengen giftig. Dazu gehören beispielsweise Chrom, Cadmium, Blei, Quecksilber und Arsen.

Tabelle 1: Toxische Wirkung und essentieller Funktion ausgewählter Schwermetalle

Schwermetall Toxische Wirkung Essentieller Nutzen

Blei

gelöstes Blei, Bleiverbindungen, Bleistäube, Organobleiverbindungen

• kumulative Wirkung (Anreicherung in Knochen, Zähnen und im Gehirn)

• beeinträchtigt das Nervensystem und die Immunabwehr

Kupfer

• für viele Mikroorganismen bereits in geringen Konzentrationen toxisch

• verschluckte Kupferverbindungen verursachen beim Menschen Schwäche, Erbrechen und Entzündungen im Verdauungstrakt

Bei Säugern in verschiedenen Kupferproteinen z.B.

• für Sauerstofftransport

• für Entgiftung

Chrom Cr(VI)

• stark mutagen und cancerogen

Chromodulin

• aktiviert die Tyrosin- kinase-Aktivität des Insulinrezeptors für Sauerstofftransport Nickel

• Nickelmetall = Überempfindlichkeit

• Ni(CO)4 = starkes Inhalationsgift

• Nickelstaub = karzinogen

• Für Methanogenese methanogener Bakterien

• Ureasen von Bakterien und Pflanzen

Cadmium • bereits in geringen Konzentrationen giftig

• krebserzeugend, erbgut- und fruchtschädigend

• Für die marine Kieselalge Thalassiosira weissflogii Æ Cadmiumenzym

Metalle kommen auf der Erde sowohl im Wasser als auch im Boden und sogar in der Luft vor.

Am häufigsten sind sie als Erze, fest im Felsgestein der Erdkruste eingebunden, aufzufinden.

Durch natürliche oder anthropogene Freisetzung können diese Schwermetalle auch ins Grundwasser und somit in den Nahrungs- und Nährstoffkreislauf gelangen. Die natürliche Freisetzung von Schwermetallen geschieht unter anderem durch vulkanische Eruptionen, Verwitterung und Erosion.

Da viele Metalle wichtige Werkstoffe für den Menschen darstellen und die moderne Welt auf die technische Nutzung von Metallen nicht mehr verzichten kann, müssen mehr und mehr Metallvorkommen abgebaut werden. Durch den Wunsch des Menschen sich die Metalle nutzbar zu machen, werden immer mehr auch giftige Metalle durch Tage- und Bergbau in die Umwelt

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freigesetzt und mobilisiert. Auch während der Verarbeitung werden durch Abwässer und Abfallstoffe stets Metalle in unsere Umwelt eingebracht. Dadurch können Metallkonzentrationen zum Teil so stark erhöht werden, dass sie für die Pflanzen- und Tierwelt im toxischen Bereich liegen.

Wasserpflanzen & Algen

Bakterien

Wasserpflanzen & Algen

Bakterien Bakterien

Abb. 1: Eintrag von Schwermetallen in den Nahrungs- und Nährstoffkreislauf.

Schwermetalle können leicht über den Nahrungspfad aufgenommen werden (Abb. 1). Viele von ihnen werden im Körper schlecht abgebaut oder reichern sich in den verschiedensten Organen an. Einige Metalle blockieren sogar biochemische Abläufe im Körper aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu essentiellen Elementen. Eine klare Abgrenzung zwischen nützlichen und schädlichen Metallen ist nicht immer eindeutig möglich. Der jedem Chemiker bekannte Satz: „Dosis sola facit venenum – die Dosis allein macht das Gift“ (Paracelsus 1493-1541) gilt in besonderem Maße bei der Betrachtung der Schadwirkung von Schwermetallen. Einige Schwermetalle sind durchaus von essentiellem Nutzen, wogegen andere als nichtessentiell gelten (siehe auch Tabelle 1). Essentielle Schwermetalle können bei einer zu geringen (Mangel) oder zu hohen Aufnahme (Vergiftung) negative Auswirkungen auf den Organismus haben, wobei nichtessentielle Schwermetalle schon in sehr geringen Konzentrationen schädigend wirken (Abb. 2).

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Abb. 2: Schematische Darstellung der physiologischen Wirkung von Schwermetallen.

Darüber hinaus ist die Bioverfügbarkeit von Schwermetallen und somit deren Toxizität stark abhängig von der vorliegenden chemischen Form.

Bestes Beispiel ist hier das Quecksilber:

metallisch Ö oral aufgenommen = ungiftig

Ö einatmen der flüchtigen Dämpfe = chronische Vergiftungen

ionisch Ö Hg (I) z.B. Hg2Cl2 = gesundheitsschädigend, LD50 (oral, Ratte) = 210 mg/kg Ö Hg (II) z.B. HgCl2 = sehr toxisch, LD50 (oral, Ratte) = 1 mg/kg

Organoquecksilber Verbindungen Ö extrem toxisch Uran in der Umwelt

Neben den bisher aufgezeigten Schwermetallen, ist die Freisetzung radioaktiver Schwermetalle besonders problematisch, da sie neben ihrer chemotoxischen Wirkung auch radiotoxisch auf Mensch und Tier wirken. Ein Beispiel für ein radioaktives Schwermetall ist das Uran. Uran kommt in Uranmineralen wie z.B. Uraninit bzw. Pechblende (Uranoxid), Autunit (Uranylphosphat), Boltwoodit (Uransilikat), Coffinit (Uransilikat), Carnotit (Uranvanadat), Brannerit (Urantitanat) vor (Abb. 3).

Pechblende Autunit Boltwoodit

Abb. 3: Beispiele für verschiedene Uranminerale (www.geo.tu-freiberg.de)

Der Abbau von Uranmineralen erfolgt hauptsächlich für die Kernenergiegewinnung und zur Herstellung nuklearer Waffen, sowie von urangemantelten Geschossen. Zum Teil findet sich Uran auch in Industrieprodukten, wie Düngemitteln und Zement wieder. Neben dem natürlichen Eintrag von Uran in die Natur, wie z.B. durch Quellwasser (Problem der Mineralwasserbelastung), besteht insbesondere durch Sicker- und Flutungswässer von Uran-

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Halden und –Gruben, sowie durch die Verwendung urangemangelter Munition ein deutlicher anthrophogener Uraneintrag in die Umwelt.

Das Gefährdungspotential für den Menschen beruht hauptsächlich auf den chemischen Eigenschaften des Urans und weniger auf dessen Radioaktivität. Die Aufnahme von Uran erfolgt nahezu ausschließlich über die Nahrung und das Trinkwasser und beträgt täglich 1,5 – 2,6 μg.

Davon werden allerdings mehr als 90 % innerhalb der ersten 24 h über den Urin wieder ausgeschieden. In die Nahrungskette gelangt es zunächst durch die Aufnahme und Anreicherung in verschiedenen Pflanzen. Mögliche Folgen einer dauerhaft hohen Uran-Exposition für den Menschen sind vor allem Nierenschäden, Entwicklungsstörungen, Schädigungen des Erbgutes und ein vermindertes Knochenwachstum. Die Uranminerale bergen außerdem neben ihrer eigenen Toxizität die Gefahr der gasförmigen Alphastrahler (z.B. Radon-222), die als ihre Zerfallsprodukte entstehen können. Diese Gase können schwere gesundheitliche Schäden bei der Inhalation verursachen und gelangen häufig unbemerkt in Wohnhäuser, z.B. über Kellerräume beim Bau auf uranmineralhaltigen Böden.

Uran tritt in den Wertigkeitsstufen II, III, IV, V und VI auf, wobei in der Natur die vier- und sechswertigen Verbindungen überwiegen. Neben vielfältigen Wechselwirkungen mit anorganischen Komponenten der Geosphäre, spielen ubiquitär verbreitete Mikroorganismen, Algen und Pflanzen eine entscheidende Rolle bei der Mobilisierung bzw. Immobilisierung dieses Radionuklids.

Bakterien

Bakterien sind mikroskopisch kleine Organismen ohne echten Zellkern. Zusammen mit den Archaeen werden sie deshalb als Prokaryoten bezeichnet. Bakterien bilden neben Eukaryoten und Archaeen eine der drei Domänen des Lebens, in die alle Organismen eingeteilt werden (Abb. 4).

LUCA*

Abb. 4: Phylogenetischer Stammbaum, (*Last Universal Common Ancestor)

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Wichtige Charakteristika von Bakterien (Abb. 5)

• Einzeller

Zellwand

Zytoplasma- membran

Plasmid DNA Chromosomale

DNA Ribosomen

Zytoplasma Flagellum

Zellwand

Zytoplasma- membran

Plasmid DNA Chromosomale

DNA Ribosomen

Zytoplasma Flagellum

• Durchschnittliche Größe 0,5 bis 2 μm

• Kein Cytoskelett

• Kein Zellkern

• DNA ist ringförmiges Fadenmolekül

• Extrachromosomales Erbmaterial (Plasmide)

• Keine oder nur geringe interne Gliederung (Organellen, Kompartimente)

• Vermehrung durch Teilung, kurze Generationszeiten (E. coli: 20 Minuten)

Abb. 5: Aufbau einer prokaryotischen Zelle

• Unterschiede bei der Transkription und Translation im Vergleich zu den Eukaryonten

• Einfachere Kontrollsysteme zur Regulation der Genaktivität im Vergleich zu den Eukaryonten

Abb. 6: Anordnung von Flagellen auf Bakterien Bakterien können sich mit Hilfe von Flagellen

fortbewegen oder auf Oberflächen anheften.

Bakterienarten unterscheiden sich in der Anzahl und Anordnung der Flagellen auf der Zelloberfläche (Abb.6).

peritrich lophotrich monotrich peritrich lophotrich monotrich peritrich lophotrich monotrich

Bakterien lassen sich aufgrund ihrer Gestalt in drei Grundformen unterteilen (Abb.7-links).

Dabei werden kugelige Bakterien als Kokken, längliche, zylindrische Bakterien als Stäbchenbakterien und gekrümmte Stäbchen bei kommaförmigen Zellen als Vibrionen und bei schraubenartigen Zellen als Spirillen oder Spirochäten bezeichnet. Neben den Grundformen gibt es noch keulenförmige Zellen bzw. Bakterien, die filamentöse, verzweigte Gebilde ähnlich den Pilzmycelien formen (Streptomyceten). Die Bakterienzellen können nach der Zellteilung noch zusammen bleiben, wobei typische Formen aus mehreren Zellen entstehen (Doppelkokken = Diplokokken, Kettenkokken = Streptokokken, Haufenkokken = Staphylokokken).

Wenn Bakterien auf festen Oberflächen wachsen und sich teilen, bilden sie Kolonien, deren Morphologie charakteristisch für die jeweilige Spezies ist. Eine genaue Beschreibung einer isolierten Kolonie kann eine große Hilfe für die Identifikation von Mikroorganismen sein. Zur Charakterisierung der Kolonieform wurden spezielle Umschreibungen der Koloniemerkmale, wie Form, Rand, Höhe, Größe und Farbe eingeführt (Abb.7-rechts).

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ganzrandig wellig filamentös gelappt gezackt geringelt

flach erhöht konvex polsterförmig gebuckelt

punktförmig rund filamentös unregelmäßig wurzelartig spindelförmig Form

Rand

Höhe

punktförmig rund filamentös unregelmäßig wurzelartig spindelförmig

punktförmig rund filamentös unregelmäßig wurzelartig spindelförmig Form

Rand

Höhe

H Häände:nde:

von 100 von 100--10001000 Bakterien/cm Bakterien/cm²²

Achselh Achselhööhlehle

1 1--10 Mio.10 Mio.

Bakterien/cm Bakterien/cm²²

Stuhl Stuhl

ca. 100 Mio.

Bakterien/g Bakterien/g

Fusssohle Fusssohle

100.000 100.000--1 Mio.1 Mio.

Stirn Stirn

con 10.000 bis con 10.000 bis 100.000 Bakterien/cm 100.000 Bakterien/cm²²

Haarwurzeln Haarwurzeln

ca. 1 Mio.

Nasensekret Nasensekret

ca. 10 Mio.

Speichel Speichel

ca. 100 Mio.

H Häände:nde:

1 1--10 Mio.10 Mio.

Stuhl Stuhl

ca. 100 Mio.

100.000 100.000--1 Mio.1 Mio.

Stirn Stirn

ca. 1 Mio.

ca. 10 Mio.

ca. 100 Mio.

H Häände:nde:

1 1--10 Mio.10 Mio.

Stuhl Stuhl

ca. 100 Mio.

Stuhl Stuhl

ca. 100 Mio.

100.000 100.000--1 Mio.1 Mio.

Stirn Stirn

ca. 1 Mio.

ca. 10 Mio.

ca. 100 Mio.

Abb. 7: Bakterielle Zellformen (links) und Formen von Bakterienkolonien (rechts).

Die Zellwand ist die natürliche Abgrenzung eines jeden Bakteriums zur Umwelt und besitzt eine Vielzahl von Funktionen (Stabilität, Schutz, Stofftransport). Dadurch ist ihre Struktur und Permeabilität von entscheidender Bedeutung für die Toxizität von Schwermetallen.

Nach dem Aufbau der Zellwand werden Bakterien in Gram-positive und Gram-negative Bakterien unterteilt. Beide haben eine Cytoplasmamembran, auf die die Zellwand aufgelagert ist.

Bei Gram-positiven besteht diese aus vielen Schichten des sogenannten Mureins (Peptidoglycan), in welches (Lipo)teichonsäuren und Proteine eingelagert sind (Abb. 8-links).

Bei Gram-negativen liegt der Cytoplasmamembran (innere Membran) nur eine dünne Peptidoglykanschicht auf, auf der eine zweite, äußere Zellmembran, die sich aber in Chemie und Aufbau von der Cytoplasmamembran unterscheidet, aufgelagert ist. Diese äußere Membran durchziehen Proteine, wie Porine, und auf der Außenseite sind Lipopolysaccharide (LPS) aufgelagert, wodurch sie auch als Lipopolysaccharidschicht bezeichnet wird (Abb. 8-rechts).

Abb. 8: Aufbau der Zellwand von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien

Abb. 9: Vorkommen von Bakterien am/im menschlichen Körper

Vorkommen von Bakterien

Bakterien sind ubiquitär verbreitet. Sie besiedeln alle Lebensräume, in denen höhere Lebewesen vorkommen. Zusätzlich sind viele Bakterien in der Lage, auch an Standorten mit extremen Lebensbedingungen zu überleben.

Bakterien besiedeln auch den menschlichen Körper (Abb. 9). Zu jedem Menschen gehören etwa 10 Billionen (10¹⁴) Bakterien. Das ist etwa 10-mal soviel, wie der Mensch selbst Körperzellen hat. Die meisten Bakterien beherbergt der Dickdarm. Viele Bakterien im und am menschlichen Körper sind weder

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nützlich noch schädlich. Andere, wie etwa Pneumokokken in den Atemwegen, können gefährlich werden, wenn sie sich übermäßig vermehren (Lungenentzündung). Doch solange sie von anderen Bakterien in Schach gehalten werden, stellen sie keine Gefahr dar. Der Mensch nutzt einige Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen: Darmbakterien liefern beispielsweise das lebenswichtige Vitamin K. Zudem produzieren sie Säuren und so genannte Bacteriocine, die neu eingeschleppte Bakterien oder auch potenziell krankheitserregende Pilze abtöten oder deren Wachstum hemmen. Selbstverständlich tragen Darmbakterien auch einen erheblichen Teil zur Nahrungsmittelverwertung des Menschen bei.

e

Wechselwirkungen von Bakterien mit Uran und anderen Schwermetallen

Mikroorganismen sind aufgrund ihres vielseitigen Metabolismus in der Lage, auf verschiedenste Art und Weise mit Uran und anderen Schwermetallen in ihrer Umgebung zu interagieren. Dabei beeinflussen sie die Mobilität und Stabilität der Metalle sowohl durch direkte, enzymatische, als auch indirekte, nicht-enzymatische Reaktionen. Die wichtigsten Wechselwirkung von mikrobiellen und pflanzlichen Zellen mit Uran sowie anderer Schwermetalle sind: die Biosorption, die Biotransformation, die Biomineralisierung, die intrazelluläre Aufnahme und die Chelation (Abb. 10).

e d

Unter Biosorption versteht man die Anlagerung von (Schwer)metallen und Radionukliden an Biomasse oder Biomaterialien. Die Metallbindung erfolgt an reaktiven Gruppen wie Carboxyl-, Amin-, Hydroxyl-, Phosphat- und Sulfhydryl-Resten verschiedener Zellwandkomponenten.

Biotransformation ist die durch Mikroorganismen katalysierte Reduktion bzw. Oxidation von Metallen. Die Oxidationsstufe von Uran sowie anderer Schwermetalle und Radionuklide bestimmt deren Löslichkeit, Mobilität und Bioverfügbarkeit.

Unter Biomineralisierung versteht man die Bildung von unlöslichen Metallpräzipitaten, wie Phosphate, Carbonate und Hydroxide, mit Hilfe enzymatisch gebildeter Liganden.

Chelation

Mobilisierung durch z.B.

Siderophore

Biotransformation

(nur Mikroorganismen) Reduktion/Oxidation von Aktiniden

→Beeinflussung der Löslichkeit UO₂²⁺ UO₂

Bioakkumulation

Aufnahme in die Zelle

UO₂²⁺

UO22+

2L^- O U

2 2 +

Biosorption

Chemische Sorption durch Komplexierung mit zellulären

Liganden (L)

Biomineralisierung

Bildung unlöslicher Präzipitate mit anorganischen Liganden HPO₄^2- + UO₂²⁺ UO₂HPO₄ CO₃^2- + UO₂²⁺ UO₂CO₃ 2OH^- + UO₂²⁺ UO₂(OH)₂

Chelation

Mobilisierung durch z.B.

Siderophore

Biotransformation

(nur Mikroorganismen) Reduktion/Oxidation von Aktiniden

→Beeinflussung der Löslichkeit UO₂²⁺

UO₂²⁺ UOUO₂₂

Bioakkumulation

UO₂²⁺

Bioakkumulation

UO₂²⁺

UO22+

2L^- O U

2 2 +

Biosorption

Liganden (L)

2L^- O U

2 2 +

O U

2 2 +

Biosorption

Liganden (L)

Biomineralisierung

Bildung unlöslicher Präzipitate mit anorganischen Liganden HPO₄^2- + UO₂²⁺ UO₂HPO₄ CO₃^2- + UO₂²⁺ UO₂CO₃ 2OH^- + UO₂²⁺ UO₂(OH)₂

Abb. 10: Mechanismen der Wechselwirkungen von Schwermetallen am Beispiel von Uran mit mikrobiellen und pflanzlichen Zellen

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Eine Sonderform der Mobilisierung kann durch chelatierende Agenzien, wie Siderophoren erfolgen. Siderophoren werden bei Eisenmangel gebildet und dienen normalerweise der Bindung und dem Transport von Fe(III). Allerdings interagieren sie ebenfalls über funktionelle Gruppen, wie Catechol-, Hydroxamat- oder Carboxylgruppen sehr effektiv mit verschiedenen Metallen und Radionukliden und erhöhen dadurch deren Mobilität und Bioverfügbarkeit.

Stressantwort von Bakterien

Schwermetalle gehören für alle Lebewesen zu den potentiellen Stressoren. Wie bereits erwähnt führen dabei hohe Konzentrationen zur Toxizität. Alle Umweltbedingungen, die nicht dem Wachstumsoptimum der Bakterien entsprechen, führen in der Zelle zu Veränderungen die unter

„Bakterieller Stressantwort“ zusammengefasst werden. Da Bakterien als Einzeller direkt allen Umwelteinflüssen ausgesetzt sind, ist Stress nicht ungewöhnlich, aber oft von sehr unterschiedlicher Natur. Weitere Stressfaktoren für die Zellen sind beispielsweise:

• Limitation der C, N, S,…-Quelle(n)

• Hohe Ionenstärke oder Trockenheit

• Zu niedriger oder hoher pH-Wert

• Hohe Temperaturen

Welche Faktoren Stress für ein Bakterium darstellen, ist ganz vom Wachstumsoptimum des jeweiligen Bakterienstammes abhängig.

Stressfaktoren wie Hitze oder hohe Schwermetallkonzentrationen führen oft zu Fehlfaltung von Proteinen. Diese Proteine verlieren dabei ihre Funktion und können darüber hinaus in der Zelle agglomerieren, was im Extremfall zum Zelltod führen kann. Eine Agglomeration erfolgt in der Regel dann, wenn hydrophobe Reste, die normalerweise im Inneren des Proteins zu finden sind, durch die Strukturänderung an die Außenseite des Proteins gelangen.

Zelluläre Stressantwort

Die Erkennung von Stress erfolgt über spezifische und unspezifische Signalwege.

Verallgemeinert lassen sich alle Signalwege in folgende Teile gliedern:

• Erkennung durch einen Rezeptor

• Weiterleitung über eine Signalkaskade

• Veränderung der Proteinexpression

Die Veränderung der Proteinexpression leitet Maßnahmen zur Stressbewältigung ein, die sehr unterschiedlich sein können. Hier einige Beispiele:

• Chaperone (spezielle Proteine) helfen andere Proteine richtig zu falten

• Metallakzeptoren binden Metallionen in der Zelle z.B. Proteine mit Thiolgruppen

• Aktiver Transport aus der Zelle, z.B. direkter Ionen Efflux

• Oberflächenproteine binden Metallionen und verhindern den Eintritt in die Zelle

Spezifische Signalwege beinhalten am Anfang der Signalkette einen Rezeptor für den jeweiligen Faktor. Auf einen allgemeinen Signalweg soll hier näher eingegangen werden. Die Abbildung 11 zeigt die allgemeine (RpoE abhängige) Stressantwort, die so in vielen Gram negativen Bakterien vorkommt. Dieser Signalweg beginnt mit der Erkennung von denaturierten Proteinen durch RseB. RseB ist normalerweise mit einem Komplex in der inneren Membran verankert. Durch die

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Bindung an denaturierte Proteine löst es sich vom Komplex, wodurch die Transmembrankomponente RseA proteolytisch abgebaut wird. Im Cytoplasma ist RpoE, ein Sigmafaktor, am Komplex assoziiert. Durch den Abbau von RseA wird RpoE freigesetzt. RpoE erkennt die Promotorregion spezieller Gene, die für eine allgemeine Stressantwort notwendig sind. RpoE initiiert durch die Anlagerung an die DNA die Bildung des Transkriptionskomplexes.

Die RNA-Polymerase lagert sich an den Transkriptionskomplex und beginnt mit der Transkription. Damit beginnt die Expression von Proteinen, die zur Stressbewältigung dienen.

Abb. 11:

Schematische Darstellung der zellulären Stressantwort in Gram-negativen Bakterien.

Verwendete Bakterienstämme

Die im Praktikum verwendeten Bakterienstämme gehören den Gattungen Pseudomonas, Escherichia und Sporosarcina an. Dabei handelt es sich zum Einen um Gram-negative Bakterienstämme (Pseudomonas und Escherichia), zum Anderen um Gram-positive sporenformende Bakterien (Sporosarcina). Pseudomonaden sind ubiquitär in der Natur verbreitet. Sie sind typische Bewohner von Böden und Gewässern. Auch Sporosarcinen sind in solchen Habitaten zu finden, allerdings weit seltener und in geringerer Anzahl. Sporosarcinen bilden bei schlechten Wachstumsbedingungen Endosporen aus, welche robuste Überdauerungsformen darstellen. In Sporen ist der Metabolismus auf ein Minimum reduziert, so dass diese weder Wasser noch Nährstoffe noch Sauerstoff benötigen. Deswegen können sie sehr lange unter schlechten Bedingungen überleben. Aus diesen Sporen bilden sich bei verbesserten Wachstumsbedingungen neue Zellen. Der verwendete Stamm der Gattung Eschericha – Escherichia coli – ist dagegen ein typischer Bewohner des Darmes von Mensch und Tier. Daher gilt der Nachweis dieses Bakterium in der Außenwelt, insbesondere in Wasser und in Lebensmitteln, als Indikator für fäkale Verunreinigungen.

Alle im Praktikum verwendeten Stämme sind nicht pathogen, neutrophil (Wachstumsoptimum bei pH~7), mesophil (Temperaturoptimum ~30 °C) und besitzen einen aeroben Stoffwechsel, d.h. sie benötigen für ihr Wachstum Sauerstoff (Aerobier) bzw. tolerieren diesen (fakultative Anaerobier).

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Mikrobiologisches Arbeiten

Allgemeines

Arbeiten in einem mikrobiologischen Labor erfordern die üblichen Sicherheitsvorkehrungen, wie sie von chemischen Laboratorien bekannt sind.

• tragen von Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille und festem Schuhwerk

• im Labor sind Essen, Trinken, Rauchen, Schminken, Aufbewahrung von Nahrungs- mitteln, Tabakwaren, und Kosmetika verboten

• den Anweisungen der Praktikumsassistenten ist Folge zu leisten

• Abfälle werden gesammelt und nach Beenden der Arbeiten autoklaviert

Besonderheiten beim mikrobiologischen Arbeiten

Abb. 13: Sterilwerkbank

Mikrobiologisches Arbeiten setzt die Anwendung steriler Techniken voraus. Verwendete Geräte, Arbeitsmaterialien und Arbeitsoberflächen müssen von lebenden Mikroorganismen oder deren Ruhestadien befreit werden. Die dazu verwendeten Verfahren werden Sterilisation oder Entkeimung genannt. Nur durch die Verwendung von sterilen Arbeitsmaterialien kann eine ungewollte Kontamination der

Nährlösungen und -platten mit fremden Mikroorganismen vermieden werden.

Zur Sterilisation werden unter- schiedliche Techniken eingesetzt.

Kolben, Flaschen und viele Lösungen lassen sich durch feuchte Hitze im Autoklaven (Abb. 12) bei 121°C und 1 bar Überdruck für 20 min sterilisieren.

Kleine Geräte wie Spatel oder Pinzetten

werden in 70 %igen Ethanol getaucht und anschließend in der Brennerflamme abgeflammt, Impfösen werden ausgeglüht.

Hitzeempfindliche Lösungen können durch Sterilfiltration von Keimen befreit werden. Es ist ebenfalls darauf zu achten, einen Eintrag von Kontaminationen über die Hände zu vermeiden.

Daher ist es beim mikrobiologischen Arbeiten unerlässlich, vor und nach dem sterilen Arbeiten, die Hände zu waschen und zu desinfizieren. Zusätzlich sollten stets Handschuhe getragen werden.

Abb. 12: Autoklav

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Weiterhin sollten sämtliche Arbeiten, die sterile Bedingungen erfordern, unter einer sogenannten Sterilwerkbank (Abb. 13) durchgeführt werden. Vor Beginn und nach Beenden der Arbeiten werden die Arbeitsoberflächen (z.B. Oberfläche in der Sterilwerkbank) desinfiziert. Dies kann unter anderem durch das Einsprühen und Abwischen mit 70 %igen Ethanol geschehen. Da unsere Labore auch für gentechnische Arbeiten der Stufe S1 (nicht humanpathogen) zugelassen sind, gelten darüber hinaus spezielle Hygieneanweisungen (siehe Anhang).

In mikrobiologischen Laboratorien werden einige Arbeiten wiederholt und routinemäßig durchgeführt. Zu diesen Arbeiten gehören unter anderen:

• Das Herstellen von Agarplatten und Nährmedien

• Das Animpfen von Nährmedien

• Das Ernten von Zellen

• Das Ausplattieren von Kulturen auf Agarplatten

Die Wichtigsten dieser Arbeiten, welche auch für den entsprechenden Praktikumsversuch benötigt werden, werden hier kurz erläutert.

Handhabung Impföse und Ausstreichen von Kulturen auf Agarplatten

• Sterilisation der Drahtspitze einer Impföse durch ausglühen, d. h. schräg von oben in die Flamme eines Gasbrenners halten, bis der Draht glüht (3 mal wiederholen) siehe Abbildung 14

• nach dem Abkühlen, die sterile Öse in das Kulturmedium tauchen

• durch die Oberflächenspannung bildet sich in der Öse ein Flüssigkeitsfilm, der genügend Zellen enthält, welche dann entsprechend auf einer Agarplatte, ohne zu sehr aufzudrücken, ausgestrichen werden

• anschließend die Impföse durch Ausglühen erneut sterilisieren

Abb. 14: Ausglühen der Impföse

Sterilisation von Lösungen

• Hergestellte Lösungen werden in einem Erlenmeyerkolben gegeben und mit einem Wattestopfen verschlossen.

• Der Stopfen wird noch mit Aluminiumfolie abgedeckt und mit etwas Autoklavier- indikatorband versehen.

• Anschließend werden die Kolben bei 121 °C für 20 min dampfsterilisiert.

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• Bei Agarlösungen sollten die Kolben bis zum Gießen der Platten nach dem Autoklavieren im 70 °C-Brutschrank aufbewahrt werden, um ein vorzeitiges Erstarren des Agars zu verhindern.

Ansetzen von Agarplatten

• Agar in Erlenmeyerkolben einwiegen und mit destilliertem Wasser vermischen

• Kolben mit Sterilstopfen verschließen, mit Aluminiumfolie abdecken und einem Stück Autoklavierband versehen

• Dampfsterilisation bei 121 °C für 20 min; anschließend Aufbewahrung der Kolben im 70 °C- Brutschrank bis zum Gießen der Platten

• Der warmen Agarlösung unter leichtem Rühren und sterilen Bedingungen entsprechende (je nach Art des herzustellenden Mediums) sterile Nährbestandteile zugeben.

• Noch warme Lösung in sterile Petrischalen ausgießen, so dass etwa eine Agardicke von 0,5 cm entsteht (Abb. 15)

• Platten zum Abkühlen leicht geöffnet in Brennerflammennähe und unter der Sterilbox stehen lassen.

• Wenn die Agarplatten fest geworden sind, werden die Platten abgedeckt und am Boden mit der

Bezeichnung des Medium beschriftet. Abb. 15: Gießen von Agarplatten

Ausplattieren von Kulturen

• Entnehmen von 50 µl oder 100 µl einer Bakterien- kultur und Pipettieren dieses Volumens auf die Mitte einer Agarplatte.

• Abgeflammten Drigalskispatel zunächst zum Erkalten auf einen keimfreien Teil der Agarplatte halten

• gleichmäßiges Verteilen der aufgetragen Flüssigkeitsmenge auf der Agaroberfläche (Abb. 16)

Abb. 16: Handhabung des

Drigalskispatels beim Ausplattieren

• Erneutes Abflammen des Drigalskispatels und Abstellen im Ständer

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Bedienung des Lichtmikroskops

Das Ziel der Mikroskopie ist die Beobachtung und Charakterisierung der eingesetzten Bakterienstämme.

• Aufbringen von 2 µl verdünnter Bakteriensuspension auf einen Objektträger and Abdecken der Probe mit einem Deckgläschen (Abb. 17)

• Vergrößerung der Bakterien mit dem Lichtmikroskop

Olympus BX61 (Abb. 18) Abb. 17: Mikroskopisches Präparat

• Untersuchung der Probe zunächst mit dem 40x Objektiv bei 400facher Vergrößerung der Zellen

• Dazu die Probe auf dem Objekttisch einspannen, den Objekttisch an das 40x Objektiv heranbewegen und die Probe scharf stellen (Phasenkontrast 2 beachten)

• Die Probenposition merken, den Objekttisch vom 40 x Objektiv entfernen, die Probe entnehmen, einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf das Deck- gläschen geben, die Probe wieder einspannen, das 100 x Objektiv einstellen und die Probe diesem an die vorherige Probenposition annähern und scharf stellen Æ Zellen sind nun 1000fach vergrößert zu

sehen (Phasenkontrast 3 beachten) Abb. 18: Lichtmikroskop Olympus BX61

• Beobachtung der Bakterien über die Kamera auf dem Bildschirm und Aufnahme jeder Bakterien- probe

Kultivierung von Bakterien

Unter der Kultivierung von Mikroorganismen versteht man deren gezielte Vermehrung durch die Verwendung definierter Kulturmedien und die Schaffung optimaler Wachstumsbedingungen (Temperatur, pH-Wert, O2-Zufuhr). Dabei unterscheidet man zwischen Flüssigkulturen (Bioreaktor oder Schüttelkolben) und festen Nährmedien (Agarplatten) (Abb. 19).

Im Versuch erhalten Sie frisch gewachsene Flüssigkulturen in Nutrient Broth Medium. Dieses Komplexmedium enthält Hefeextrakt und peptisch verdautes Fleischprotein (Pepton) Die Zusammensetzung dieser Extrakte ist nicht genau definiert. Sie liefern aber alle wichtigen Wachstumsfaktoren, wie Aminosäuren, Mineralsalze, sowie Kohlenstoff und Stickstoffquellen.

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Abb.19: Mit Bakterien bewachsene Schüttelkolben (links); Agarplatten (rechts)

Im Gegensatz dazu wird für die im Versuch verwendeten Agarplatten ein spezielles Medium verwendet, das sehr wenig Phosphat enthält. Phosphat ist ein wichtiger Nährstoff für Bakterien und ein Baustein vieler organischer Verbindungen. Gleichzeitig führt Phosphat aber auch zu einer Komplexierung der gelösten Schwermetalle. Bei einer zu hohen Phosphatkonzentration kann es daher zur Ausfällung anorganischer Phosphatkomplexe kommen, welche nicht mehr bioverfügbar sind.

Wachstum von Bakterien (Abb. 20)

Die Vermehrung der Bakterien erfolgt asexuell durch Zellteilung. Das kann durch Querteilung, Knospung oder Sporenbildung geschehen. Bringt man Bakterien aus einer über Nacht gewachsenen Kultur in eine frische Nährlösung, so befinden diese sich zunächst in der lag- Phase. Während dieser Phase adaptieren sich die Bakterien an die Wachstumsbedingungen.

Dabei werden Enzyme synthetisiert, die zur Verwertung der verfügbaren Nährstoffe benötigt werden. In der darauffolgenden exponentialen Phase (log Phase) kommt es zur exponentiellen Vermehrung der Bakterien. Bei logarithmischer Darstellung der Zellzahl über der Zeit, entspricht der in dieser Phase lineare Anstieg, der spezifischen Wachstumsrate des Organismus, welche der Anzahl der Teilungen pro Zelle und Zeiteinheit entspricht. Infolge des schnellen Wachstums kommt es zur Reduktion der Nährstoffe und gleichzeitig einer Anreicherung mit (z.T. giftigen) Stoffwechselprodukten im Medium. Dadurch treten die Bakterien in die stationäre Phase ein, in der es zu einem Gleichgewicht zwischen Vermehrung und Tod der Bakterien kommt. Die weitere Verschlechterung der Bedingungen führt zum Absterben der Kultur (Absterbephase).

Abb. 20: Schematische Darstellung einer bakteriellen Wachstumskurve.

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Metalltoleranztest

Das Wachstum auf Agarplatten dient im Praktikumsversuch der Quantifizierung der koloniebildenden Einheiten (CFU = ‘colony forming units’).

Bringt man die einzelnen Bakterien auf einen festen Nährboden und bebrütet diese Platten ein bis zwei Tage bei ca. 30 °C, so vermehren sich die einzelnen Bakterien zu sichtbaren Bakterienkolonien. Die Anzahl der gewachsenen Kolonien entspricht dabei der Anzahl der auf den Nährboden aufgebrachten und vermehrungsfähigen Bakterien. Im Versuch wird immer die gleiche Anzahl Bakterien auf Platten mit unterschiedlichen Schwermetallkonzentrationen aufgetragen. Ein Unterschied in der Anzahl der gewachsenen Kolonien ist daher allein auf die wachstumshemmende Wirkung der Schwermetalle zurückzuführen.

In den frisch gewachsenen Übernachtkulturen kann ein Bakterientiter, d.h. die Anzahl der Bakterien pro ml Kulturmedium, von bis zu 10¹⁰ erreicht werden. Da eine solche Bakterienanzahl keine Einzelkolonien, sondern einen Bakterienrasen auf der Platte bilden würde, muss die Zellsuspension deutlich verdünnt werden. Für ein gutes Auszählen sollte ein Wert von 30 bis 300 Kolonien pro Platte angestrebt werden. Im Praktikumsversuch werden die gewaschenen Zellen 1:100.000 bzw. 1:1.000.000 verdünnt und von diesen Suspensionen wird je 0,1 ml auf die Agarplatten aufgetragen (Abb. 21).

Abb. 21: Schematische Darstellung zur Verdünnung einer Bakteriensuspension Geeignete Verdünnungsstufen

Anhand der Anzahl der gewachsenen Kolonien können die minimale Hemmstoffkonzentration (MHK50) und die minimale bakterizide Konzentration (MBK) ermittelt werden. Die MHK50 entspricht dabei der Konzentration des Schwermetalls, die das Wachstum von 50 % der Kolonien hemmt. Die MBK ist die niedrigste Konzentration, bei der das Wachstum der Bakterienstämme auf der Agarplatte vollständig gehemmt wird und makroskopisch nicht mehr nachzuweisen ist.

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Lochtest

Der Lochtest ist ein weiteres Verfahren zur Resistenz- bestimmung von Mikroorganismen. Zumeist findet er Verwendung bei der Empfindlichkeitsprüfung von Bakteriestämmen gegenüber Antibiotika. Hier im Praktikumsversuch werden jedoch verschiedene Metalllösungen auf ihre wachstumshemmende Wirkung getestet. Dabei wird die Metalllösung in ein Loch in der Mitte der Agarplatte gegeben.

Durch die Diffusion der Lösung bildet sich ein Konzentrationsgradient aus. Sind die Testbakterien gegenüber einer gewissen Metallkonzentration empfindlich, werden sie im

Wachstum gehemmt und der Impfstrich wird nicht vollkommen ausgebildet. Die Bakterien stellen ihr Wachstum in mehr oder minder großer Entfernung vom Loch ein (Abb. 22). Die Länge des unbewachsenen Impfstrichs zeigt den Umfang der Wirkung des Metalls in entsprechender Konzentration an.

Abb. 22: Metalltolleranztest

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ANHANG: Kurzbetriebsanweisung für gentechnische Arbeiten gem. § 12 Abs. 2 GenTSV (SICHERHEITSSTUFE 1)

Raum: P430 und P433 im Gebäude 8a (Forschungszentrum Dresden-Rossendorf)

BBS (Uniklinikum): B. Schild Tel.: 458 2808

Notruf/Alarmzentrale über Tel.: 112 oder Tel.: 3333 1. Art der gentechnischen Arbeiten

In der Anlage sind nur gentechnische Arbeiten der Sicherheitsstufe 1 zulässig.

Gehandhabte biologische Agentien: Archaea-, Bakterien- und Hefekulturen der Risikogruppe1 2. Verhalten im Labor

Grundsatz: Jede zum Arbeiten im Kontrollbereich berechtigte Person ist dafür verantwortlich, dass eine Freisetzung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) verhindert wird.

Allgemeine Verhaltensregeln: Grundlegend gelten die Verhaltensregeln sauberer mikrobiologischer, radiochemischer und gentechnischer Arbeiten. Insbesondere ist darauf zu achten, dass:

• Türen und Fenster während der Arbeiten geschlossen sind.

• innerhalb der gentechnischen Anlage eigenständige Schutzkleidung zu tragen ist.

• Essen, Trinken und Rauchen untersagt ist.

• das Pipettieren mit dem Mund grundsätzlich untersagt ist.

• Kanülen und sonstige spitze Verbrauchsmaterialien zur Entsorgung getrennt zu sammeln sind.

• bei allen Arbeiten die entsprechenden Bedienungsanleitungen und Schutzvorschriften zu beachten sind.

• der für die gentechnische Anlage erstellte Hygieneplan generell zu befolgen ist.

3. Lagerung/Entsorgung

• Die längerfristige Lagerung aller GVO erfolgt bei -80°C im Raum P433.

• Bakteriell kontaminiertes Material (Kulturen, Kulturgefäße etc.) muss getrennt nach festen und flüssigen Abfällen im Labor in dafür bereitstehenden, geeigneten Behältern gesammelt werden.

• Alle mit GVO kontaminierten Materialien, die den S1-Bereich verlassen, müssen entweder vorher dekontaminiert (Vernichtungssterilisation im Autoklaven, Desinfek- tionsmittel) oder sicher eingeschlossen sein.

• Sind die GVO mit radioaktiven Stoffen in Berührung gekommen, sind die Anforder- ungen bei der Sammlung und Entsorgung von radioaktiven Reststoffen zu beachten. Die Vernichtungssterilisation erfolgt dann nur im Autoklaven SANOclav im KB6, R228 unter dem radiochemischen Abzug.

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• 4. Verhalten nach Laborunfällen mit biologischen Agenzien Der oberste Grundsatz ist, Mensch und Umwelt vor Schaden zu bewahren

• Erst überlegen, dann handeln!

• Bei Freisetzung (z.B. Verschütten) von GVO Mitarbeiter warnen und Vorgesetzte (Projektleiter und ggf. Strahlenschutzbeauftragten) sofort informieren.

• Kleine Mengen verschüttetes biologisches Material unter entsprechendem Selbstschutz (Kittel, Handschuhe) sofort aufsaugen und die biologisch kontaminierten Oberflächen nach den Methoden des Hygieneplans desinfizieren.

• Bei größeren Unfällen eine weitere Person zu Hilfe rufen, gegebenenfalls frische Schutzkleidung anlegen, zwei Paar Schutzhandschuhe anziehen und biologisch kontaminierten Bereich großflächig mit Zellstofftüchern abdecken, diese dann mit bereitstehendem Desinfektionsmittel tränken, Einwirkungszeit abwarten und dann aufwischen. Siehe Hygieneplan!

Beachte: Erst Dekontamination von Personen und Kleidung, dann von Flächen und Geräten vornehmen.

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Hygieneplan für die gentechnische Anlage der Sicherheitsstufe S1 in den Räumen P430, P433 im Gebäude 8a des Forschungszentrum Dresden-Rossendorf e.V.

Was Wann Womit Wie Wer

Pflege der Hände nach dem Händewaschen Handcreme: Hausmarke Pflegen Jeder, der im Labor arbeitet

Allgemeine Instrumente nach jeder möglichen Kontamination mit GVOs

Autoklav Sterilisation im Autoklaven,

Sterilisationszeit 20 min bei 121°C, Reinigung erst nach dem Sterilisieren

der jeweilige Benutzer

Thermolabile Instrumente nach jeder möglichen Kontamination mit GVOs

Präparat:

4 %-ig Korsolex AF

Desinfizieren und Reinigen:

unter Verwendung von Handschuhen mit Einwegtüchern einreiben, gegebenenfalls in Lösung einweichen, mind. 15 min einwirken lassen

Werkbänke

Oberflächen von Geräten und Inventar

vor und nach jeglicher gentechnischer und mikrobiologischer Arbeit

Präparat:

70-%-iger Ethanol verg.

(Fläche<1qm) 1 %-ig Kohrsolin

unter Verwendung von Handschuhen mit

Einwegtüchern einreiben, 1h einwirken lassen

Fußböden nach jeder möglichen

Kontamination mit GVOs

Präparat:

3 %-ig Kohrsolin,

unter Verwendung von Handschuhen mit

Einwegtüchern einreiben, 4h einwirken lassen

Jeder Verursacher,

Allg.: Reinigung zentral (zweimal wöchentlich) alle 1 – 3 Wochen Textilsack Sammeln: Reinigung durch eine

Fachfirma

der jeweilige Benutzer Schutzkleidung

nach jeder

möglichen/stattgefundenen Kontamination mit GVOs

Präparat:

2 %-ig Kohrsolin oder Autoklav

12h Einwirkzeit oder

Autoklavieren, Reinigung durch eine Fachfirma

Persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe)

nach Beendigung der Arbeit oder öfter

nach jeder möglichen Kontamination wechseln

In Autoklaviersäcken sammeln

Entsorgung über allgemeinen Laborabfall

Autoklavieren

Bakteriell kontaminierte Abfälle

sofort in geeigneten Behältern Sammeln, Autoklavieren, der jeweilige Benutzer

…, welche zusätzlich radioaktiv kontaminiert sind

sofort in geeigneten Behältern Autoklavieren: nur im Autoklaven SANOclave im radiochemischen Abzug KB6, P228, Öffnen erst nach

der jeweilige Benutzer Waschen; Abtrocknen

mit Einmalhandtuch aus Handtuchspender;

Desinfektionspräparat entnehmen, verteilen und einreiben, mindestens 30sec einwirken lassen;

erst danach Hände waschen; Abtrocknen mit Einmalhandtuch aus

Jeder, der im Labor arbeitet

Händedesinfektions- präparat: Softaman Präparat aus Direktspender, Dosierung: 2-3 Hübe Vor Aufnahme jeglicher

gentechnischer und mikrobiologischer Arbeit

und nach Beenden jeglicher

gentechnischer und mikrobiologischer Arbeit

Händereinigung/

hygienische Händedesinfektion

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Skript zum Masterpraktikum Modul: Sorption

Sorption von Uran an mineralischen und biologischen Systemen

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Sorption

Grundbegriffe der Sorption

Unter Sorption versteht man einen Vorgang, bei dem ein flüssiger oder gasförmiger Bestandteil, genannt Sorptiv, an eine Flüssig- oder Festphase, genannt Sorbens, angelagert (Adsorption) oder in sie eingelagert (Absorption) wird.

Den Verbund aus Sorbens und an- oder eingelagertes Sorptivteilchen bezeichnet man als Sorbat.

Desorption bezeichnet den Umkehrvorgang der Sorption, bei dem sich das sorbierte Teilchen wieder vom Sorbens löst. Zur Veranschaulichung dieser Grundbegriffe empfiehlt sich eine schematische Darstellung (Abb. 1).

Abb. 1: Grundbegriffe der Sorption [nach Kümmel und Worch (1990)].

Verschiedene Bindungsmechanismen können für die Sorption verantwortlich sein. Grundsätzlich unterscheidet man dabei nach Physi- und Chemisorption. Bei der Physisorption treten relativ schwache Kräfte auf, wie z.B. Dispersions- und Dipol-Dipol-Kräfte, mit Wechselwirkungsenergien, die kleiner als 50 kJ/mol sind. Die Chemisorption beruht auf chemischen Reaktionen zwischen Sorbens und Sorptiv, wodurch die Wechselwirkungsenergien deutlich größer werden (60-400 kJ/mol). Die Bindung erfolgt dabei meist ionisch oder kovalent, wodurch die Chemisorption oft irreversibel ist.

Zusammensetzung des Bodens

Unerlässlich für die Abschätzung der Sorption ist ein fundiertes Wissen über die Zusammensetzung des Sorbens. Der Boden setzt sich durchschnittlich aus folgenden Teilen zusammen.