Wiederfindung - Bestimmung möglicher Oxidationsprodukte mittels HPLC

3.7 Bestimmung möglicher Oxidationsprodukte mittels HPLC

3.7.4 Wiederfindung

Um die Wiederfindungsrate der Oxidationsprodukte bei der Probenaufarbeitung durch die SPE zu bestimmen, wurden Rohwurst-Leerproben und Rohwurstproben mit Oxidationsproduktvergleichs-Zusätzen (7-Formyl-β-tocotrienol und 5-Formyl-γ-tocotrienol) sechsmal einer SPE unterzogen und vermessen. Dazu musste einem Teil der Proben vor dem ersten Aufbereitungsschritt und einem anderen Teil erst nach der Verseifung die Vergleichssubstanzlösung zugesetzt werden, deren Konzentration sich an den zu erwartenden Gehalten in den Versuchsproben orientierte. Die ermittelte Wiederfindungsrate der Tocotrienol-Oxidationsprodukte lag

im Schnitt bei den Proben mit Vergleichssubstanz vor der Verseifung bei 56 % und bei den Proben mit Standardzugabe nach der Verseifung bei 98 % (s. Abb. 30, Kap.

4.4).

3.8 Identifizierung der Fettsäuren/ Fettsäureethylester mittels Gaschromatographie - Massenspektrometrie

3.8.1 Probenaufbereitung

Probenaufbereitung für die Untersuchung des „unbekannten Peaks“:

Die Probenaufarbeitung entspricht der für die Tocochromanole (s. Kap. 3.6.1). Hinzu kam jedoch eine anschließende Fraktionierung der Probe. Hierfür musste die Probenlösung kurz vor der Retention des zu bestimmenden Stoffpeaks bis kurz danach separat in einem Spitzkolben aufgefangen und über mehrere Vorgänge gesammelt werden. Nach dem letzten eindampfen mittels Rotationsverdampfer wurde die Probe in Heptan gelöst.

Probenaufarbeitung zur Untersuchung der Fettsäurezusammensetzung der Rohwürste:

Die Probenaufarbeitung erfolgte nach einer Instituts-internen Methodenanweisung (M-010-00.CA). Dabei wurden 100 mg der Probe (auf 0,1 mg genau) in einen 10 mL Spitzkolben eingewogen und eine Spatelspitze Glasperlen (als Siedesteinchen) und 2 mL 0,5 mol/L methanolische Natronlauge (NaOH) hinzugegeben. Der Spitzkolben musste an einen Rückflusskühler angeschlossen, die Probe über einer Flamme erhitzt und für 3 - 5 min zum Sieden gebracht werden bis sich das Fett gelöst hat.

Anschließend erfolgte über den Kühler die Zugabe von 3 mL 12 %ige Bortrifluoridlösung und eine Erhitzung der Probe für nochmals 2 min. Danach musste

Abb.: 17 Strukturformel von 7-Formyl-β-tocotrienol

Abb.: 18 Strukturformel von 5-Formyl-γ-tocotrienol

die Probe für 5 min abkühlen bevor 2 mL Heptan zugefügt und das Gemisch für weitere 2 min zum Sieden gebracht wurde. Wenn die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt war, erfolgte zur besseren Trennung der Heptanphase die Zugabe von soviel gesättigter NaCl-Lösung bis die Heptanphase im Hals des Spitzkolbens stand.

Die Heptanphase wurde mit einer Pipette abgenommen und über einem mit getrocknetem Natriumsulfat gefüllten Faltenfilter filtriert um eventuell mitgeführtes Wasser zu entziehen. Das Filtrat konnte dann zur gaschromatographischen Messung eingesetzt werden.

3.8.2 Gaschromatograph-System (dem MS vorgeschaltet)

Das Prinzip der Gaschromatographie (GC) beruht, ähnlich wie das der HPLC, auf der Trennung einer Vielzahl von Stoffen, nur in diesem Fall von leicht flüchtigen Substanzen. Dabei werden die Stoffe durch ein Trägergas an die stationäre Phase getragen und je nach Stoffeigenschaft früher oder später retardiert und vom Detektor gemessen.

GC-Bedingungen:

Trägergas: Helium Heliumfluss: 40 PSI

Programm Säule: Anfangstemperatur: 120 °C, 5 Minuten lang Aufheizrate: 4,0 °C /min, 31 min lang

Endtemperatur: 245 °C wird 28 min gehalten Gesamtlaufzeit: 64 min

Start der Datenaufnahme nach 15 Minuten Delay (die Messung startet erst 15 Minuten nach Start des Säulengradienten).

Programm-Injektor: Anfangstemperatur: 150 °C Aufheizrate: 200 °C/min 0,5 min lang Erreichte Temperatur: 250 °C wird 0,7 min gehalten Aufheizrate: 70 °C/min 1,0 min lang

Erreichte Endtemperatur: 320 °C wird 5,0 min gehalten

Nach 7,2 min ist der Injektionsgradient beendet und geht wieder auf die Anfangstemperatur zurück. Die Transferline (Übergang vom GC zum MS) besitzt eine gleichbleibende Temperatur von 250 °C.

3.8.3 Flüssigchromatographie-Massenspektrometer-System (LC-MS)

Das Prinzip der Massenspektrometrie beruht auf der Trennung von Ionen unterschiedlicher Massen. Dabei werden das Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) der Ionen und die Intensität des Ionenstrahls gemessen. Der Aufbau des MS-Systems, sowie die Einstellungen wurden so angewendet wie bereits von Büsing und Ternes (2011) publiziert.

MS-Bedingungen:

Eluent: Gradient, n-Hexan/1,4-Dioxan/TBME

0 min (99:1:0, v/v/v), 20 min (97,8:1,6:0,6, v/v/v), 30 min (95:3:2, v/v/v)

Flussrate: 0,4 mL/min

Injektionsvolumen: 10 µL

Säule: 250 x 4 mm mit Vorsäule, ProntoSIL 120-3 Diol

Multiplyer: 1500 V

Quellentemperatur: 150 °C

Massenscanbereich: 100 - 1300 m/z Massenscanfrequenz: 1/s

Solvent delay: 1 min PBI-Temperatur: 35 °C

Software: ICIS (MAT Finigan); Xcalibur (Thermo Finigan, USA)

3.8.4 Gaschromatographische Untersuchung der Fettsäurezusammensetzung in den Rohwürsten

GC-Bedingungen:

Trägergas: Helium

Heliumfluss: 200 kPa

GC-Säule: SP-2560 Quarzkapillarsäule 100m x 0,25 mm x 0,2 µm Anfangstemperatur: 120 °C 5 min lang

Temperaturgradient: 4 °C/min

Endtemperatur: 245 °C bis 64,2 min Gesamtlaufzeit: 64 min

Injektortemperatur: 250 °C Detektortemperatur: 250 °C Injektionsvolumen: 1,0-1,5 µL

3.9 Bestimmung der Ascorbinsäuegehalte mittels HPLC 3.9.1 Probenaufbereitung und Ascorbinsäure-Extraktion

Die Probenaufarbeitung erfolgte nach der Arbeitsanweisung aus Matissek et al.

(2010).

Dabei mussten die Proben zerkleinert und ca. 3 g des Proben-Homogenisats in einen 100 mL Messkolben eingewogen werden. 80 mL Metaphosphorsäure (c = 20 g/L) wurden auf die Probe gegeben und der Messkolben geschüttelt. Dann musste mit der Metaphosphorsäure bis zur Marke aufgefüllt und nach weiterem Schütteln die Probenlösung filtriert werden. Vom Filtrat wurden 20 mL abgenommen, unverzüglich in ein 50 mL Becherglas überführt und 10 mL L-Cysteinlösung (c = 40 g/L) zugesetzt.

Unter Rühren erfolgte die Zugabe von Trinatriumphosphat-Lösung (c = 200 g/L) bis zu einem pH-Wert zwischen 7,0 und 7,2 mit folgendem Weiterrühren für genau 5 min. Danach wurde mit Metaphosphorsäure (c = 200 g/L) ein pH-Wert zwischen 2,5 und 2,8 eingestellt. Die Lösung musste mengenmäßig in einen 50 mL Messkolben überführt und mit destilliertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt werden. Diese Lösung konnte dann zur Analyse mittels HPLC eingesetzt werden.

45 3.9.2 HPLC-System

Auch das HPLC-System wurde nach den Angaben von (Matissek et al., 2010) aufgebaut.

HPLC-Bedingungen (Umkehr-Phase):

Eluent: isokratisch, Pufferlösung A + B (90:10 v/v) A: 13,6 g KH2PO4 in 900 mL dest. H2O

B: 1,82 g N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid in 100 mL Methanol

Flussrate: 0,7 mL/min

Injektionsvolumen: 40 µL

Säule: 250 mm x 4,0 mm, RP 18, Hypersil 120 ODS, 5 µm Detektoreinstellung: UV-Detektion

265 nm

Arbeitssoftware: Eurochrom 2000 für Windows (PC-Betriebssystem: XP Professionell)

3.9.3 Kalibrierung

Für die Kalibrierung des HPLC-Systems musste eine Ascorbinsäure-Stammlösung hergestellt werden (c = 1000 mg/L). Dazu wurden 100 mg Ascorbinsäure in 100 mL Metaphosphorsäure gelöst. Die externe Kalibration erfolgte mit Vergleichslösungen in bestimmten Verdünnungsstufen (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg). Durch die Injizierung der fünf unterschiedlich konzentrierten Vergleichslösungen ins HPLC-System und der davon gemessenen Signale (Peakfläche = aera under the curve) konnte eine lineare Kalibrierfunktion erstellt werden. Dabei stellte die Steigung der Kalibriergeraden die Empfindlichkeit des Analyseprinzips dar.

Abb. 19: Beispiel einer Kalibriergeraden zur Ascorbinsäurebestimmung

3.9.4 Probenmessung und Berechnung

Die Injizierung der Proben in das System erfolgte jeweils mindestens zweimal. Die Ascorbinsäuremessung fand mit Hilfe eines isokratischen HPLC-Systems mit UV-Detektion statt. Die Peaks wurden durch die jeweilige Retentionszeit bezugnehmend auf die Standards bestimmt. Die Integration der Chromatogramme erfolgte über die Peakfläche. Der in der Probe befindliche Ascorbinsäuregehalt wurde durch einen Vergleich der Probenpeakfläche mit denen der bei der Kalibrierung verwendeten Vergleichslösungen unter Zuhilfenahme der aufgestellten Kalibriergeraden bestimmt.

Konzentration in der Messlösung: Gleichung: cM = ((Pf+ a)/b)

Konzentration in der Probe: Gleichung: cP = ( cM x Probenvolumen)/ Einwaage

cM: Konzentration in der Messlösung (mg/kg) Pf: Peakfläche

a: Steigung der Kalibriergeraden

b: Achsenabschnitt der Kalibriergeraden cP: Konzentration in der Probe (mg/kg)

3.10 Bestimmung der Carnosolsäuregehalte mittels HPLC 3.10.1 Probenaufbereitung und Carnosolsäure-Extraktion

Die Aufarbeitung und Extraktion erfolgte nach einer intern im Institut entwickelten Methode basierend auf der Publikation von Schwarz und Ternes (1992).

y = 3,06x - 1,73 R² = 0,99

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Peakfläche

Ascorbinsäure mg/kg

47 Vorbereitung der verwendeten Chemikalien:

Vitamin C-Lösung: 30 mg Ascorbinsäure wurden in 100 mL Methanol gelöst.

Extraktionsmittel: Methanol wurde mit konzentrierter ortho-Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt.

Interner Standard: 20 mg Anthracen + 40 mg Biphenyl wurden in 100 mL Methanol gelöst.

Durchführung bei den Wurstproben:

Nach der Zerkleinerung der Wurstprobe mit einer Moulinette wurden 5 g in ein Zentrifugenglas abgewogen. Beim ersten Extraktionsschritt wurden 5 mL des Extraktionsmittels und 10 mL Methanol, die zuvor in einem Wasserbad auf 40 - 50 °C erwärmt wurden, zur Probe zugefügt und mit dem Ultraturax homogenisiert.

Eventuell anhaftendes Probenhomogenisat musste mit Methanol vom Ultraturaxstab zurück in das Zentrifugenglas gespült werden. Im Anschluss wurde die Probe mit 3200 - 3400 U/min zentrifugiert. Nach jeder Zentrifugation schloss sich eine Überführung des Überstands durch einen mit Glaswolle gestopften Trichter in einen 50 mL Kolben an. Beim zweiten Extraktionsschritt wurde die Probe mit 15 mL Methanol homogenisert und beim dritten mit 10 mL Methanol, der Rest des Extraktionvorgangs blieb gleich. Dem Filtrat mussten 5 mL frische Vitamin C-Lösung und 500 µL interner Standardlösung zugegeben und ferner mit Methanol bis zur Marke aufgefüllt werden.

3.10.2 HPLC-System

HPLC-Bedingungen (Umkehr-Phase):

Eluent: isokratisch, Acetonitril/ tridest. H2O/ 2 M Zitronensäure/

Tetramethylammoniumhydroxid (65/35/1/0,3 v/v/v/v)

Flussrate: 0,6 mL/min

Injektionsvolumen: 50 µL

Säule: 250 mm x 4,0 mm, ODS-Hypersil, 5 µm Detektoreinstellung: UV-Detektion: 230 nm

48 3.10.3 Kalibrierung

Für die Kalibrierung des HPLC-Systems musste eine Carnosolsäure-Stammlösung hergestellt werden (c = 1113,25 mg/kg). Für die externe Kalibration wurden Vergleichslösungen in bestimmten Verdünnungsstufen hergestellt (100 µL Stammlösung auf 5 mL = 22,27 mg/kg, 75 µL Stammlösung auf 5 mL = 16,70 mg/kg, 50 µL Stammlösung auf 5 mL = 11,13 mg/kg, 50 µL Stammlösung auf 10 mL = 5,57 mg/kg).

Durch Injektion der vier unterschiedlich konzentrierten Vergleichslösungen ins HPLC-System konnte aus den gemessenen Signalen (Peakfläche = aera under the curve) der bekannten Konzentrationen eine lineare Kalibrierfunktion erstellt werden. Dabei stellt die Steigung der Kalibriergeraden die Empfindlichkeit des Analyseprinzips dar.

Als interner Standard wurden Anthracen (20 mg) und Biphenyl (40 mg) in 100 mL Methanol gelöst und in einer Menge von 500 µL der Probe zugesetzt. Die Carnosolsäure eluierte zwischen den beiden internen Standardsubstanzen (s. Kap. 8.13).

Abb. 20: Beispiel einer Kalibriergeraden zur Carnosolsäurebestimmung

3.10.4 Probenmessung und Berechnung

Die Proben wurden jeweils mindestens zweimal in das System injiziert. Die Messung der Carnosolsäure fand mit Hilfe eines isokratischen Systems und mittels UV-Detektion statt. Die Identifizierung der Peaks erfolgte durch die jeweilige Retentionszeit bezugnehmend auf die internen Standards. Die Integration der

y = 59333x - 1363, R² = 0,999

0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000

0 5 10 15 20 25

Peakfläche

Carnosolsäure (mg/kg)

Chromatogramme erfolgte über die Peakfläche. Die quantitative Bestimmung des in der Probe befindlichen Carnosolsäuregehaltes wurde durch einen Vergleich der Probenpeakfläche mit denen, der bei der Kalibrierung verwendeten Vergleichslösungen unter Zuhilfenahme der aufgestellten Kalibriergeraden durchgeführt.

Konzentration in der Messlösung: Gleichung: cM = ((Pf+ a)/b)

Konzentration in der Probe: Gleichung: cP = ( cM x Probenvolumen)/ Einwaage

cM: Konzentration in der Messlösung (mg/kg) Pf: Peakfläche

a: Steigung der Kalibriergeraden

b: Achsenabschnitt der Kalibriergeraden cP: Konzentration in der Probe (mg/kg)

3.11 Enzymatische Bestimmung von Nitrit und Nitrat mittels UV-Spektrometrie 3.11.1 Probenaufbereitung und enzymatische Umsetzung

Vorbereitung der verwendeten Chemikalien:

Carrez-I-Lösung (150 g/L): 150 g Kalium-hexacyanoferrat(II) wurden in 1 L Messkolben eingewogen und bis zur Marke mit dest. Wasser aufgefüllt.

Carrez-II-Lösung (230 g/L): 230 g Zinkacetat wurden in einen 1L Messkolben eingewogen und bis zur Marke mit dest. Wasser aufgefüllt.

Puffer-/Enzymlösung: Der Inhalt der Flasche Nitrat-Reduktase wurde in 12 mL Imidazolpufferlösung gelöst und mit 0,05 g Titriplex III versetzt.

Farbreagenzmischung (I+II):

Farblösung I: 8,0 g Sulfanilamid wurden in 500 mL dest. Wasser unter Rühren im warmen Wasserbad gelöst, danach auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Dem Filtrat musste anschließend unter ständigem Rühren 330 mL nitrit- und nitratfreie, konzentrierte Salzsäure zugegeben und die Lösung mit destilliertem Wasser auf 1000 mL aufgefüllt werden.

Farblösung II: 330 mg N-(1-Naphthal)-ethylendiammoniumdichlorid wurden in 250 mL destilliertem Wasser gelöst.

Die Probenaufarbeitung für die Nitrit- und Nitratgehaltsbestimmung der Rohwürste erfolgte unter Verwendung der Testkombination zur enzymatsichen Nitratbestimmung (UV-Test von r-biopharm 10905658035 und § 64 LFGB 08.00-14).

Dabei wurden 10 g von der homogenisierten Probe in einen 200 mL Erlenmeyerkolben eingewogen, etwa 50 mL kochendes destilliertes Wasser zugesetzt und mit einem Stabhomogenisator homogenisiert. Der Stab musste mit 50 mL heißem destilliertem Wasser nachgespült und die Spülung in den Erlenmeyerkolben überführt werden. Danach erfolgte eine Titration mit Natronlauge (c = 1 mol/L) bis ein pH-Wert von 8 erreicht war. Die Probenlösungen siedeten für 15 min im heißen Wasserbad und kühlten danach im kalten Wasserbad auf Raumtemperatur ab. Folgend wurden je 3 mL Carrez-I-Lösung und Carrez -II-Lösung zugegeben und nach jeder Zugabe der Erlenmeyerkolben geschwenkt. Anschließend musste der Inhalt quantitativ in einen 200 mL Messkolben überführt, mit destilliertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt und durchmischt werden. Nachdem die Proben zur besseren Fettabscheidung für einige Minuten im Kühlschrank standen, erfolgte die Filtrierung durch einen Faltenfilter. Hierbei wurden die ersten mL des Filtrates verworfen, sodass für die Anwendung der Testkombination ausschließlich das klare Filtrat eingesetzt werden konnte.

Die Testkombination wurde nach Herstelleranweisung verwendet. Dazu mussten zwei Reagenzglasständer mit der entsprechenden Anzahl von Reagenzgläsern bestückt werden, ein Ständer für die Gesamt-Nitrat-/Nitritgehalt Bestimmung und einer zur Nitritgehalt Bestimmung. Für die Gesamt-Nitrat-/Nitritgehalt Bestimmung wurde eine NADPH Tablette mit 2 mL Probenlösung und 1 mL Puffer-Enzymlösung in ein Reagenzglas gegeben, mit dem Vortexer durchmischt und für 60 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurden 3 mL Farbreagenzlösung zugefügt, die Probe nochmals durchmischt und für 30 min in einen abgedunkelten Schrank gestellt. Direkt nach Ablauf der Zeit erfolgte die Probenmessung mit dem UV-Spektrometer. Während der zuvor genannten 60 minütigen Wartezeit wurden die Reagenzgläser zur Nitritgehaltsbestimmung mit 2 mL Probenlösung, 1 mL destilliertem Wasser und 3 mL Farbreagenzmischung bestückt, durchmischt, für 30 min ins Dunkle gestellt und die Probe mit dem UV-Spektrometer analysiert.

51 3.11.2 UV-Spektrometer

Photometer-Bedingungen:

Wellenlänge: 540 nm

Probenmessung: gegen dest. Wasser

Küvetten: Einmalküvetten, aus Polystyrol 4,5 mL, zwei klare Seiten

3.11.3 Kalibrierung

Kaliumnitrat-Vergleichslösung:

Die Erstellung der Kalibrationsreihe erforderte die Herstellung einer Kaliumnitrat-Stammlösung (600 g/L) sowie einer verdünnten Kaliumnitrat-Kaliumnitrat-Stammlösung (30 mg/L). Für die Standardlösungen wurden jeweils 10 mL (= 0,3 mg), 20 mL (= 0,6 mg), 30 mL (= 0,9 mg) und 40 mL (= 1,2 mg) der verdünnten Stammlösung in einen 200 mL Messkolben pipettiert, mit 0,2 mL Bromthymolblau-Lösung versetzt, bis zum Farbumschlag titriert und je 2 mL Carrez I und Carrez II zugegeben.

Anschließend wurde die Lösung mit dest. Wasser bis zur Marke aufgefüllt und filtriert. Zur Erstellung der Kalibriergeraden wurden jeweils 2 mL der Kaliumnitrat-Standardlösungen verwendet und wie zur Bestimmung für NO2

-/NO3

behandelt.

Natriumnitrit-Vergleichslösung:

Für die Erstellung der Kalibrationsreihe wurde eine Natriumnitrit-Stammlösung (400 g/L) und eine verdünnte Natriumnitrit-Stammlösung (20 mg/L) hergestellt. Für die Standardlösungen wurden jeweils 10 mL (= 0,2 mg), 20 mL (= 0,4 mg), 30 mL (= 0,6 mg) und 40 mL (= 0,8 mg) der verdünnten Stammlösung in einen 200 mL Messkolben pipettiert, mit 0,2 mL Bromthymolblau-Lösung versetzt, bis zum Farbumschlag titriert und je 2 mL Carrez I und Carrez II zugegeben. Anschließend wurde die Lösung mit dest. Wasser bis zur Marke aufgefüllt und filtriert. Zur Erstellung der Kalibriergeraden wurden jeweils 2 mL der Natriumnitrit-Standardlösungen verwendet und wie zur Bestimmung für NO2

behandelt.

Abb. 21: Beispiel der Kalibriergeraden zur Nitrat- und Nitritbestimmung

3.11.4 Probenmessung und Berechnung

Jede Rohwurstprobe wurde doppelt bestimmt. Das UV-Spektralphotometer konnte für einen Messvorgang mit 6 Küvetten bestückt werden. Die quantitative Bestimmung des in der Probe befindlichen Nitrat/ Nitritgehaltes erfolgte durch einen Vergleich des Proben-Absorptionswerts mit denen, der bei der Kalibrierung verwendeten Vergleichssubstanzen unter Zuhilfenahme der aufgestellten Kalibriergeraden.

Nitrat/Nitrit - Gleichung: (Abs. - a ) x 10/(b x Einwaage) Nitrit -Gleichung: Einwaage x (Abs. - a)/(b x Einwaage)

Abs.: gemessene Absorption a: Steigung der Kalibriergeraden

b: Achsenabschnitt der Kalibriergeraden

y = 0,361x + 0,032 R² = 0,999

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

Absorption

Nitrat-Konzentration (mg/kg)

y = 0,7183x - 0,0083 R² = 1,000

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

Absorption

Nitrit-Konzentration (mg/kg)

53 3.12 Statistische Auswertung

Die Statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistical Analysis Program (SAS für Windows) Version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Dazu wurden zu allererst alle Daten auf Normalverteilung hin überprüft (Prozedur UNIVARIATE).

Dementsprechend erfolgte der t-Test (normalverteilt) oder der Wilcoxon-Test (nicht normalverteilt) für unabhängige Stichproben, sowie der t-Test für verbundene Stichproben, um den Effekt der unterschiedlichen Rezepturen sowie der Zeit auf die Tocochromanol Stabilität zu überprüfen. Der Ryan-Einot-Gabriel-Welsch multiple range test wurde speziell verwendet, um die komplexen Daten der gefriergetrockneten Proben auszuwerten. Als signifikant wurde ein Wert von P < 0,05 gewertet.

54 4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Gehalte von α-Tocotrienol, α-Tocopherol, γ-Tocotrienol und γ-Tocopherol im Laufe der Reifung und Lagerung

Bei allen Rohwürsten, unabhängig von den Zusätzen, war der α-Tocotrienolgehalt (bezogen auf die Trockenmasse = TM) während der 21-tägigen Reifungsphase nahezu konstant (s. Abb. 22). Das gleiche galt für die ermittelten α-Tocopherol-, γ-Tocotrienol- und γ-Tocopherolgehalte (s. Abb. 23, 24 und Kap. 8.14).

Bezogen auf die einzelnen Probentage waren dennoch signifikante α-Tocotrienolgehaltsunterschiede (P < 0,05) zwischen den Rohwurstrezepturen bestimmbar (s. Abb. 22). Am ersten Tag war der α-Tocotrienolgehalt bei den Rohwürsten mit Ascorbinsäure und Carnosolsäure signifikant höher als bei den Rohwürsten, die nur mit Nitritpökelsalz hergestellt wurden (s. Abb. 22 Tag 0). Am dritten Tag waren ebenfalls die Gehalte von den Ascorbinsäure und Carnosolsäure beinhaltenden Rohwürsten signifikant höher als bei den beiden anderen Rohwurstrezepturen (s. Abb. 22 Tag 3). Am letzten Tag der Reifung (Tag 21) ließ sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Rohwürsten mit Carnosolsäure und denen mit Natriumchlorid feststellen. Am Ende der Reifung hatten die Rohwürste einen mittleren α-Tocotrienolgehalt von 130 mg/kg in der Feuchtmasse (Gehalte im Diagramm sind in der Trockenmasse angegeben) und die mittlere Trockenmasse betrug 72 % (s. Kap. 8.11).

Bei der statistischen Untersuchung des gesamten Untersuchungszeitraumes von 51 Tagen stellte sich heraus, dass es nur bei den Rohwürsten mit Carnosolsäurezusatz zu einer signifikanten Veränderung der α-Tocotrienolwerte gekommen war. Diese gingen allerdings nicht mit einem massiven Verlust des Vitamers einher (s. Abb. 22).

Auffällig, jedoch statistisch auch nicht signifikant, waren die Tocochromanolwert-Schwankungen der Rohwürste ausschließlich mit Nitritpökelsalz zum Ende der Lagerung (Tag 42 und 51). Die Messungen an den letzten beiden Versuchstagen zeigten, dass der α-Tocotrienolwert um bis zu 50 % variiert.

Das könnte für einen beginnenden Abbau des α-Tocotrienols in den Rohwürsten ohne zusätzlichen Antioxidationsschutz sprechen.

Abb. 22: α-Tocotrienolgehalte der Rohwürste im Laufe der Reifung und Lagerung (Werte bezogen auf TM) NPS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz; NPS + AS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz und Ascorbinsäure;

NPS + CS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz und Carnosolsäure; NaCl = Rohwürste mit Natriumchlorid = Zugesetzte Menge an α-Tocotrienol

Unterschiedliche Buchstaben (a, b) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Zusätzen innerhalb eines Versuchstages. kennzeichnet signifikante Unterschiede im Laufe des Untersuchungszeitraumes (Mittelwert + SD, n = 3, P < 0,05)

Die Messungen der α-Tocopherol-Werte zeigten ein ähnliches Muster wie die von α-Tocotrienol (s. Abb. 23). Hier zeigten sich allerdings nur am Tag 42 signifikante Unterschiede zwischen den Rohwurstrezepturen. Dabei sind die α-Tocopherol-Gehalte der Rohwürste, die mit NaCl hergestellt wurden am niedrigsten (s. Abb. 23 Tag 42 und Kap. 8.14). Ähnlich wie beim α-Tocotrienol lagen auch beim α-Tocopherol hohe Vitamergehaltsschwankungen am Ende der Lagerungszeit vor (s. Abb. 23 Tag 51). Insgesamt kam es aber auch beim α-Tocopherol nicht zu einem statistisch signifikanten Abbau im Laufe der 51-tägigen Untersuchung.

Abb. 23: α-Tocopherolgehalte der Rohwürste im Laufe der Reifung und Lagerung (Werte bezogen auf TM) NPS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz; NPS + AS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz und Ascorbinsäure;

NPS + CS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz und Carnosolsäure; NaCl = Rohwürste mit Natriumchlorid = Zugesetzte Menge an α-Tocopherol

Unterschiedliche Buchstaben (a, b) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Zusätzen innerhalb eines Versuchstages (Mittelwert + SD, n = 3, P < 0,05)

Die Untersuchungen der beiden γ-Vitamere zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Rohwurstrezepturen an den einzelnen Versuchstagen (s. Abb. 24). Bei γ-Tocopherol kam es am Tag 51 zu einer höheren Standardabweichung bei den Rohwürsten mit Nitritpökelsalz (s. Abb. 24 links). Bezogen auf den gesamten Untersuchungszeitraum kam es jedoch bei den Rohwürsten mit Nitritpökelsalz ohne Antioxidationsmittel zu einem signifikanten Unterschied (s. Abb. 24 links Tag 0 und 51). Eine vermehrte Konzentrationsschwankung am Tag 51 zeigte sich auch bei den γ-Tocotrienolwerten der Rohwürste mit Nitritpökelsalz (s. Abb. 24 rechts). Bei γ-Tocotrienol kam es im Laufe des Untersuchungszeitraums (ausgenommen Tag 3) zu relativ hohen Konzentrationsschwankungen, allerdings ohne eine statistische Signifikanz.

Abb. 24: γ-Tocopherol- und γ-Tocotrienolgehalte der Rohwürste im Laufe der Reifung und Lagerung (Werte bezogen auf TM)

NPS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz; NPS + AS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz und Ascorbinsäure;

NPS + CS = Rohwürste mit Nitritpökelsalz und Carnosolsäure; NaCl = Rohwürste mit Natriumchlorid = Zugesetzte Menge an γ-Tocopherol (5 mg/kg) und γ-Tocotrienol (10 mg/kg)

Diese Studie zeigt, dass es bei der Rohwurst im Laufe der Reifung und Lagerung zu keinem massiven Verlust an den untersuchten Vitameren kommt. Auch Harms et al.

(2003) stellten bei den Untersuchungen der α-Tocopherol-Konzentration in acht Wochen gelagerten Rohwürsten aus Schweinefleisch von mit α-Tocopherol zugefütterten Schweinen keine signifikanten Abnahmen fest. Die Arbeitsgruppe um Liu et al. (1996) analysierten den α-Tocopherolgehalt in verschiedenen Muskelpartien von Stieren, deren Gehalt ebenfalls durch die Zufütterung von α-Tocopherol angereichert wurde und fanden nur einen geringen Abbau nach einer Zeitspanne von 56 Tagen und einer Lagerungstemperatur von 4 °C. Der schützende Effekt der Ascorbinsäure sowie der Carnosolsäure auf α-Tocotrienol kam insbesondere an den ersten Tagen der Reifung zur Geltung. Obwohl einige vorherige Studien belegten, dass der α-Tocopherol-Gehalt in Fleisch und Fleischprodukten während einer längeren Lagerung stabil bleibt (Harms et al., 2003; Liu et al., 1996), passt die hier gezeigte Abnahmetendenz von Tocochromanol im Laufe der Lagerung

zu den Untersuchungsergebnissen von Sammet et al. (2006), welche einen signifikanten Abbau von α-Tocopherol in Rohwürsten während der Lagerung feststellten.

In dieser Arbeit zeigten die α-Tocotrienol- und α-Tocopherol-Mittelwerte der Rohwürste mit Ascorbinsäurezusatz, Carnosolsäurezusatz und Natriumchlorid eine

Im Dokument Stabilität von Vitamin E (α-Tocotrienol, α- Tocopherol, γ-Tocotrienol und γ-Tocopherol) in Rohwürsten und Pökellake: Einfluss von Zusatzstoffen und Lagerung (Seite 48-0)