und dem International Neuroscience Institute Hannover
GLP-1 sezernierende mesenchymale
alginatverkapselte Stammzellen zur Neuroprotektion nach
Schädel-Hirn-Trauma
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Pia Rittmann aus Dortmund
Hannover 2005
Prof. Dr. Thomas Brinker
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hans J. Hedrich 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Ulrich Ebert
Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2005
Fördernde Institution:
Internationale Stiftung Neurobionik Hannover
und
meinem Bruder Jens
gewidmet
AC Adenylatcyclase
AK Antikörper
Aqua dest. destilliertes Wasser
BB Beam Balance Test
BSA Bovines Serum Albumin
BW Beam Walking Test
CCI Controlled Cortical Impact
CO2 Kohlenstoffdioxid
DAB Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid
DPP-IV Dipeptidyl-Peptidase-IV
EtOH Ethanol
GFAP Saures Gliafaserprotein, Glial fibrillary acidic Protein
GLP-1 Glucagon-like Peptide-1
H2O2 Wasserstoffperoxid
HCl Salzsäure
HP Hidden Platform Version
H.E. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
i.c.v. intrazerebroventrikulär
i. p. intraperitoneal
kD Kilo Dalton
KGW Körpergewicht
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
m molar
MAP-1 Microtubule-associated Protein-1 MAPK Mitogen-activated Protein Kinase
MEZ Mitteleuropäische Zeit
MHH Medizinische Hochschule Hannover
MSC Mesenchymale Stammzellen
hMSC Humane mesenchymale Stammzellen
MWM Morris Water Maze Test Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
NaCl Kochsalz
NGS Normal Goat Serum
NRS Normal Rat Serum
NSS Normal Swine Serum
O2 Sauerstoff
OT Objektträger
OX6 MHC Klasse II Oberflächenantigen auf Mikroglia
p Piko
PBS Phosphatpuffer
PFA Paraformaldehyd
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
RT Raumtemperatur
SD Standardabweichung
SEM Standardfehler
SHT Schädel-Hirn-Trauma
SP Spatial Probe
SPF Spezifisch Pathogenfrei
StreptABKomplex Streptavidin Biotinylierte Meerrettich Peroxidase
TBI Traumatic Brain Injury
VP Visible Platform Version
Ztm Zentrales Tierlaboratorium der MHH
2.1 Schädel-Hirn-Trauma _____________________________________________ 3 2.1.1 Einführung __________________________________________________________3 2.1.2 Pathophysiologische Grundlagen ________________________________________5 2.1.3 Mechanismen der Zellschädigungen ______________________________________5 2.1.4 Klinisch-therapeutische Konsequenzen ____________________________________7 2.2 Neuroprotektion _________________________________________________ 9 2.2.1 Einführung __________________________________________________________9 2.2.2 Therapieansätze _____________________________________________________9 2.3 Experimentelles Schädel-Hirn-Trauma ______________________________ 11 2.4 Controlled Cortical Impact (CCI) ___________________________________ 13 2.5 Glucagon-like Peptide-1 __________________________________________ 14 2.5.1 Einführung _________________________________________________________14 2.5.2 Rezeptor __________________________________________________________16 2.5.3 Wirkungen _________________________________________________________18 2.5.4 Therapeutischer Einsatz ______________________________________________20 2.6 Mikroverkapselung ______________________________________________ 23 2.6.1 Einführung _________________________________________________________23 2.6.2 Verkapselungsmaterial: Alginat _________________________________________26 2.6.3 Therapeutischer Einsatz ______________________________________________28 2.7 Ziel der vorliegenden Arbeit_______________________________________ 31 3 Material und Methoden________________________________________32 3.1 Tiere __________________________________________________________ 32 3.1.1 Herkunft ___________________________________________________________32 3.1.2 Haltung und Fütterung ________________________________________________32 3.1.3 Narkose und Analgesie _______________________________________________34 3.2 Implantate: CellBeads®___________________________________________ 34 3.2.1 Herkunft ___________________________________________________________34 3.2.2 Verkapselungstechnik ________________________________________________35 3.3 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen _________________________ 37 3.3.1 Biokompatibilitätsuntersuchung _________________________________________37 3.3.1.1 Gruppe I: Implantation leerer CellBeads®______________________________38 3.3.1.2 Gruppe II: Implantation von CellBeads® mit xenogener Zelllinie ____________38 3.3.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma ____________39 3.3.2.1 Gruppe I: Kontrolltiere ____________________________________________40 3.3.2.2 Gruppe II: Trauma (CCI)___________________________________________41 3.3.2.3 Gruppe III: Trauma (CCI) und Implantation leerer CellBeads®______________41 3.3.2.4 Gruppe IV: Trauma (CCI) und Implantation GLP-1 CellBeads®_____________41 3.4 Versuchsdurchführung __________________________________________ 42 3.4.1 Koordinaten zur zerebralen Implantation __________________________________42 3.4.2 Behandlung der CellBeads® vor Implantation ______________________________42 3.4.3 Stereotaktische Implantationstechnik_____________________________________43 3.4.4 Controlled Cortical Impact (CCI) ________________________________________46 3.4.5 Explantation der CellBeads® nach Langzeitimplantation _____________________48 3.4.6 Vitalitätsuntersuchung der explantierten CellBeads®_________________________49
3.4.9.1 Beam Balance Test ______________________________________________52 3.4.9.2 Beam Walking Test ______________________________________________53 3.4.9.3 Morris Water Maze Test ___________________________________________54 3.5 Neuropathologische Untersuchungen ______________________________ 57 3.5.1 Transkardiale Perfusion _______________________________________________57 3.5.2 Fixierung __________________________________________________________58 3.5.3 Kryobehandlung_____________________________________________________58 3.5.4 Gefrierschnitte ______________________________________________________58 3.5.5 Färbungen _________________________________________________________59 3.5.5.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)___________________________________59 3.5.5.2 Nissl-Färbung ___________________________________________________60 3.5.6 Immunhistologie_____________________________________________________61 3.5.6.1 Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) ____________________________________63 3.5.6.2 Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1) _____________________________64 3.5.6.3 Gliafaserprotein (GFAP) ___________________________________________64 3.5.6.4 MHC Klasse II Oberflächenantigen (OX6) _____________________________64 3.5.7 Mikroskopische Auswertung ___________________________________________65 3.5.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)___________________________________66 3.5.7.2 Nissl-Färbung ___________________________________________________67 3.5.7.3 Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) ____________________________________67 3.5.7.4 Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1) _____________________________68 3.5.7.5 Gliafaserprotein (GFAP) ___________________________________________69 3.5.7.6 MHC Klasse II Oberflächenantigen (OX6) _____________________________71 3.6 Statistische Auswertung _________________________________________ 73 4 Ergebnisse _________________________________________________74 4.1 Biokompatibilitätsuntersuchung ___________________________________ 74 4.1.1 Koordinaten zur zerebralen Implantation __________________________________74 4.1.2 Untersuchung der Umgebungsreaktion ___________________________________75 4.1.3 Explantation der CellBeads® nach Langzeitimplantation ______________________80 4.1.4 Vitalitätsuntersuchung der explantierten CellBeads®_________________________81 4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma_____ 82 4.2.1 H.E.-Färbung: Histologischer Nachweis der Implantate_______________________82 4.2.2 Liquoruntersuchung: Nachweis der Proteinfreisetzung _______________________84 4.2.3 H.E.-Färbung: Morphologische Befunde nach Trauma _______________________86 4.2.4 Nissl-Färbung: Morphologische Befunde nach Trauma _______________________89 4.2.5 Immunhistologie_____________________________________________________91 4.2.5.1 Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) ____________________________________91 4.2.5.2 Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1) _____________________________94 4.2.5.3 Gliafaserprotein (GFAP) ___________________________________________97 4.2.5.4 MHC Klasse II Oberflächenantigen (OX6) ____________________________101 4.2.6 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung _____________________105 4.2.6.1 Beam Balance Test _____________________________________________105 4.2.6.2 Beam Walking Test _____________________________________________110 4.2.6.3 Morris Water Maze Test __________________________________________114
5.1.1 Tierexperimentelles Modell ___________________________________________119 5.1.1.1 Zerebrale Implantation von CellBeads® ______________________________120 5.1.1.2 Experimentelles Schädel-Hirn-Trauma (CCI) __________________________121 5.1.2 Untersuchungsmethoden_____________________________________________122 5.1.2.1 Biokompatibilitätsuntersuchung ____________________________________122 5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma __________123 5.2 Diskussion Ergebnisse__________________________________________ 127 5.2.1 Biokompatibilitätsuntersuchung ________________________________________127 5.2.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma ___________129 5.2.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate______________________________129 5.2.2.2 Untersuchung der Proteinfreisetzung ________________________________130 5.2.2.3 Morphologische Befunde nach Trauma ______________________________131 5.2.2.4 Immunhistologie ________________________________________________133 5.2.2.5 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung _________________135 5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung ________________________________ 137 6 Zusammenfassung __________________________________________ 138 7 Summary __________________________________________________ 140 8 Literaturverzeichnis _________________________________________ 142 9 Anhang ___________________________________________________ 162 9.1 Bezugsquellen_________________________________________________ 162 9.1.1 Versuchstiere______________________________________________________162 9.1.2 OP-Bedarf ________________________________________________________162 9.1.3 Verbrauchsmaterialien: Histologie und Immunhistologie _____________________164 9.1.4 Geräte und Software ________________________________________________167 9.2 Reagenzien ___________________________________________________ 169 9.3 Färbeprotokolle ________________________________________________ 171 9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung _____________________________ 175 9.4.1 Protokoll: Operation _________________________________________________175 9.4.2 Protokoll: Gefrierschneidetechnik ______________________________________176 9.4.3 Protokoll: Beam Balance Test _________________________________________177 9.4.4 Protokoll: Beam Walking Test _________________________________________178 9.4.5 Protokoll: Morris Water Maze Test______________________________________179 9.5 Statistik ______________________________________________________ 181 9.5.1 Deskriptive Statistik _________________________________________________181 9.5.2 Statistisches Testverfahren: Fisher PLSD Test ____________________________187 9.6 Danksagung___________________________________________________ 192
1 Einleitung
Das Schädel-Hirn-Trauma entsteht im Rahmen von Verkehrsunfällen und Stürzen und gilt als die häufigste Todesursache junger Erwachsener in der Altersgruppe zwischen 15 bis 20 Jahren.
Die Verletzungsformen werden je nach Länge und Tiefe der Bewusstlosigkeit in leichte, mittelschwere und schwere Schädelhirnverletzungen eingeteilt.
Das leichte Schädel-Hirn-Trauma oder die Commotio cerebri ist verbunden mit einer Funktionsstörung des Gehirns durch eine vorübergehende Fehlregulation der Durchblutung, die in der Regel zu keinerlei morphologischen Veränderungen oder neurologischen Ausfällen führt.
Bei der Contusio cerebri, der Gehirnprellung, kommt es hingegen immer zu strukturellen Schäden in Form von Prellungsherden in Kortex, Marklager und Hirnstamm, die Bewusstseinsstörungen, Herdsymptome mit Paresen, Krampfanfälle und Hirnnervenausfälle zur Folge haben können.
Im Verlauf von schweren Gehirnverletzungen können Raum fordernde Prozesse wie Hämatome und Ödeme zu einer Druckerhöhung, einer Compressio cerebri führen, die als schwerste Form des Schädel-Hirn- Traumas gilt.
Die Prognose nach einer schweren Gehirnschädigung ist neben der primären, mechanischen Verletzung, von sekundären, posttraumatisch auftretenden zerebralen Veränderungen abhängig.
Ischämisch bedingte Sekundärschäden des Nervengewebes sind als Ursachen anzusehen für eine meist lebenslang bestehende Behinderung der Patienten.
Da die primären Hirnschädigungen meist irreversibel sind zielt man vor allem durch so genannte neuroprotektive Therapien auf die Vermeidung sekundärer Schäden ab.
Neuroprotektion umfasst im weitesten Sinne alle therapeutischen Verfahren, welche die neuronalen Zellen nach der initialen Hirnverletzung vor weiteren Schädigungen schützen. Es sind eine Reihe neurotropher oder neuroprotektiver
Proteine bekannt, deren Wirksamkeit experimentell nachgewiesen ist. Die Substanzen wurden dabei dem Zentralen Nervensystem durch Injektion oder Infusion direkt zugeführt.
Grundlage der vorliegenden Arbeit war die Verwendung von mikroverkapselten, gentechnisch modifizierten Stammzellen, die zerebral implantiert ein neuroprotektives Protein, das Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1), sezernierten.
Unter Mikroverkapselung versteht man die Einbettung von Zellen in eine auf Hydrogelen basierende Alginatmatrix. Alginat besitzt als natürliches, aus Braunalgen gewonnenes Substrat die Fähigkeit, eingebettete Zellen durch eine semipermeable Membran vor dem Immunsystem des Wirt-Gewebes zu schützen, eine Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und eine Freisetzung des Wirkstoffes zu gewährleisten. Eine zerebrale Implantation ermöglicht die Umgehung der Blut-Hirn-Schranke und eine hohe Wirkstoffkonzentration am Applikationsort. Im Gegensatz zur in-vivo Gentherapie, bei der genetisches Material in körpereigenen Zellen transferiert wird, gewährleistet die eingesetzte ex-vivo Gentherapie einen sicheren Transfer von in Zellkultur gentechnisch modifizierten verkapselten Zellen in den Wirt (TSENG u. AEBISCHER 2000).
Glucagon-like Peptide-1 als ein 3,3 kD großes Peptid, induziert eine Glukose abhängige Insulinsekretion, beeinflusst die Neubildung von pankreatischen β- Inselzellen und ist an der zentralen Steuerung der Nahrungsaufnahme beteiligt (TSENG et al.1999; DRUCKER 2001a, 2001b; STOFFERS et al.2000;
TURTON et al.1996). GLP-1 und der zugehörige Rezeptor wurden im Zentralen Nervensystem nachgewiesen (MERCHENTHALER et al.1999; ALVAREZ et al.
1996). Kürzlich konnte tierexperimentell gezeigt werden, dass GLP-1 neuroprotektiv wirkt (PERRY et al. 2003) und das assoziative und räumliche Lernen verbessert (DURING et al. 2003).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand eines etablierten, experimentellen Schädel-Hirn-Trauma-Modelles (Controlled Cortical Impact) die neuroprotektive Wirksamkeit des GLP-1 bei Ratten untersucht.
2 Literaturübersicht
2.1 Schädel-Hirn-Trauma 2.1.1 Einführung
Bei dem Schädel-Hirn-Trauma handelt es sich um eine durch Gewalteinwirkung verursachte Schädigung des Gehirns. Dabei kann es zu reversiblen oder dauerhaften Funktionsstörungen als Folge der Einwirkung eines stumpfen oder penetrierenden Traumas kommen.
Als Ursachen sind sowohl direkte, meist axonale, mechanische Schädigungen des Nervengewebes (Impakttrauma), als auch indirekte Verletzungen durch bewegungsbedingte Scherkräfte (Akzeleration-/Dezelerationstrauma) zu nennen. Weiterhin kann es indirekt durch die Erhöhung des intrakraniellen Druckes durch Hämatome, Ödeme, Fremdkörper oder Infektionen zu einer Beeinträchtigung des Gehirns kommen.
In Deutschland werden etwa zwischen 27.000 und 40.000 Fälle eines schweren Traumas pro Jahr behandelt (NEUGEBAUER et al. 2000; LEHMANN u.
KRETTEK 2001). Schätzungen gehen von 200-300 Schädel-Hirn-Traumata aller Schweregrade pro 100.000 Einwohner aus (PIEK u. JANTZEN 2000).
Anhand von Untersuchungen der Deutschen Gesellschaft für Neurologie handelt es sich bei 80 Prozent der in eine Klinik überwiesenen Schädel-Hirn- Traumata um leichtgradige Verletzungen, während je 10 Prozent der Patienten mittelschwere und schwere Schädigungen aufweisen.
Dabei wird zwischen einem leichten (Commotio cerebri) und mittelschweren bis schweren (Contusio cerebri) Schädel-Hirn-Trauma unterschieden.
In der klinischen Klassifikation hat sich international die 1974 von TEASDALE u.
JENNETT eingeführte Glasgow-Coma-Scale (GCS) durchgesetzt. Sie dient der initialen Bestimmung des Schweregrades des Schädel-Hirn-Traumas, der Verlaufsbeurteilung und der Prognoseabschätzung mit Hilfe eines Punktesystems zur Bewertung der funktionellen Beeinträchtigung der Grundfunktionen Augenöffnen, verbaler und motorischer Reaktionen.
Basierend auf der Summeneinteilung repräsentiert ein GCS von 3-8 Punkten ein schweres, von 9-12 ein moderates und von 13-15 Punkten ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma. Dabei werden die pathologischen und strukturellen Ursachen der Hirnschädigung nicht berücksichtigt.
Das leichte Schädel-Hirn-Trauma 1. Grades oder die Commotio cerebri, die auch als Gehirnerschütterung bezeichnet wird, ist gekennzeichnet durch eine mechanisch induzierte, vorübergehende Hirnfunktionsstörung mit kurzzeitiger Bewusstlosigkeit und in der Regel vollständiger Erholung und meist ohne pathologisch-anatomisch fassbare Veränderungen.
Die Contusio cerebri oder Gehirnprellung entspricht einem Schädel-Hirn- Trauma 2. und 3. Grades. Sie ist mit einer langen Bewusstlosigkeit und grundsätzlich mit morphologischen Hirnsubstanzschädigungen verbunden.
Diese treten als Rindenprellungsherde durch das so genannte Kontaktphänomen und auf der Gegenseite der Gewalteinwirkung (Contre-Coup) in Erscheinung oder sind verursacht durch Scherkräfte, die axonale und vaskuläre Veränderungen des Gehirngewebes hervorrufen können.
Auftretende Einblutungen und Hirnödeme können zu einer Erhöhung des intrakraniellen Druckes und damit zu einer Compressio cerebri führen.
In den USA gehen Schätzungen davon aus, dass etwa bis zu 2 Millionen Menschen jährlich ein Schädel-Hirn-Trauma erleiden, wobei 70.000 Menschen sofort an den Folgen des initialen Traumas sterben (KOSSMANN et al.1997).
Etwa die Hälfte der Patienten leiden nach einem schweren Schädel-Hirn- Trauma unter erheblichen Langzeitbeschwerden in Form von Einschränkungen der geistigen Leistungsfähigkeit, zentralen Paresen und weiteren motorischen und verbalen Behinderungen (SCHWEIBERER 1996).
2.1.2 Pathophysiologische Grundlagen
Als Folge des Schädel-Hirn-Traumas spielen sowohl primäre als auch sekundäre Vorgänge eine Rolle, die fokale oder diffuse Schäden verursachen.
Bei den primären Hirnschäden handelt es sich um unmittelbare, durch die mechanische Einwirkung von äußerer Gewalt verursachte, strukturelle Hirnschädigungen, die irreversibel und nicht therapierbar sind. Sie können die Blutgefäße, Nervenzellen, Axone und Gliazellen betreffen.
Es entstehen durch Kontakteffekte fokale Gewebeverletzungen in Form von Schädelfrakturen, Kontusionen, Lazerationen oder zerebralen Hämatomen.
Gleichzeitig können Beschleunigungseffekte auch diffuse, axonale und vaskuläre Verletzungen durch die auftretenden Scherkräfte verursachen (shearing injuries).
Bei den Sekundärverletzungen spielen sowohl intrakranielle Raum fordernde Ereignisse als auch ischämisch bedingte metabolische Prozesse auf zellular- molekularer Ebene eine Rolle.
Als wesentliche Ursache der sekundären Veränderungen sind eine Ischämie und Hypoxie (CHESNUT et al.1993; BOUMA et al.1991), ein blutungsbedingter Vasospasmus, Infektionen und traumatisch bedingte Epilepsien zu nennen. Die kritische Absenkung der Hirndurchblutung innerhalb der zerebralen Ischämie führt zu einer mangelhaften Versorgung des Gehirns mit Substraten und zu einer Akkumulation von metabolischen Abfallprodukten.
2.1.3 Mechanismen der Zellschädigungen
Die zellulären Mechanismen, die der posttraumatischen Ischämie zugrunde liegen, sind auftretende Ionenverschiebungen.
Die Ischämie, die sekundär nach einem Schädel-Hirn-Trauma entstehen kann, führt zu einer Depolarisation der Zellmembran und folgend zu einem Einstrom von Wasser und damit zu einer Gliazellschwellung. Dieses intrazelluläre Hirnödem ist mit einer Erhöhung des intrakraniellen Druckes und einer Verminderung der Hirndurchblutung und einer Zellschädigung verbunden.
Als weitere Ursache der Ausbildung von Hirnödemen ist die vorübergehende Störung der Blut-Hirn-Schranke anzusehen (vasogenes Hirnödem).
Der zentrale Mechanismus posttraumatischer Zellschädigungen umfasst drei pathophysiologische Vorgänge. Zum einen die Erhöhung der extrazellulären Glutamatkonzentration, den exzessiven Einstrom von Kalziumionen in die Zelle und zum anderen die Bildung freier Sauerstoffradikale.
Infolge des Energiemangels kommt es zu einer gestörten Wiederaufnahme von Glutamat in die Zelle. Gleichzeitig führt die neuronale Depolarisation zu einer vermehrten Freisetzung des Stoffes. So entstehen hohe extrazelluläre Konzentrationen von Glutamat, die neurotoxisch wirken. Man spricht in diesem Zusammenhang von Exzitotoxizität (OLNEY 1969), die zu einer akuten Schwellung der Neurone und folgend zu einem Zelluntergang führt.
Ebenfalls bewirkt der Glutamat induzierte, verstärkte Energieverbrauch einen anaeroben Gehirnstoffwechsel und damit eine intrazelluläre Ansäuerung des Gehirngewebes (PELLERIN u. MAGISTRETTI 1994).
Der massiv erhöhte Glutamatspiegel führt zur Daueraktivierung des NMDA- Rezeptors mit einer permanenten Öffnung des Kalziumkanals und einem ununterbrochenen Einstrom und Überschwemmung des intrazellulären Kompartiments mit Kalziumionen.
Diese induzieren eine Aktivierung intrazellulärer Enzyme wie Phospholipasen, Proteasen und Endonukleasen und führen damit verbunden zu einer vermehrten Lipolyse, Proteolyse und DNA-Fragmentierung, die einen Zelltod zur Folge haben können (FARBER 1990).
Dabei beeinflussen sich Kalzium und Glutamat gegenseitig. Die durch Kalzium induzierte Störung der neuronalen Zellmembranen bewirkt eine vermehrte präsynaptische Freisetzung des vesikulär gespeicherten Glutamats, welches wiederum einen gesteigerten Kalziumeinstrom zur Folge hat. Durch den Abbau der Membranphospholipide bildet sich Arachidonsäure und durch deren Metabolisierung entstehen eine Fülle von biochemischen Folgeprodukten und freie Sauerstoffradikale (LAFON-CAZAL et al.1993; SCHMIDLEY 1990).
Freie Radikale sind hochreaktive, toxische Stoffe, die in der Reoxygenierungsphase nach einer Ischämie entstehen und zu einer Peroxidation von Zellmembranphospholipiden und zur Oxidation von Glykoproteinen und so zur Zerstörung von Neuronen, Glia- und Endothelzellen führen können (ASANO et al. 1989; KONTOS u. POVLISHOCK 1986).
Einige Tage nach einem Trauma kann es erneut zur Öffnung der Blut-Hirn- Schranke (BASKAYA et al. 1997) und zur Einwanderung von Entzündungsmediatoren kommen (SOARES et al.1995). Entsprechende Entzündunsvorgänge können ein zytotoxisches Hirnödem (KLATZO 1967) zur Folge haben.
2.1.4 Klinisch-therapeutische Konsequenzen
Als Folge posttraumatischer, ischämisch-hypoxischer Veränderungen können durch die Gewebsunterversorgung mit Sauerstoff, Hirninfarkte und Lähmungen entstehen, auf zellulärer Ebene sind neuronale Degenerationen und neuronaler Zelltod zu beobachten. Neben Schädigungen, die durch direkte mechanische Verletzungen und lokale Verdrängung entstehen, sind die Glutamat induzierte Exzitotoxizität, ein durch das Überangebot an intrazellulärem Kalzium bedingte gesteigerte proteolytische Enzymaktivität und inflammatorische Prozesse als Ursache für einen vermehrten Zelluntergang zu sehen.
Hierbei sind sowohl nekrotische Veränderungen als auch apoptotische Mechanismen für den Zelltod verantwortlich. Neben ischämischen Nekrosen kann es unter Beteiligung immunologisch aktivierter Zellen zur Aktivierung von Endonukleasen und damit zu einer DNA-Fragmentierung kommen.
Fokale Hirnkontusionen können durch Verletzungen der Blutgefäße zu Hämatomen, bei Schäden der Blut-Hirn-Schranke zu Ödemen führen.
Infolge der Kontusion kommt es durch mitogene Faktoren zur Aktivierung der Mikro- und Makroglia. Es ist dabei eine narbige Abgrenzung des Kontusionsbereiches, eine deutliche reaktive Hyperplasie und Hypertrophie der
Astrozyten (CORTEZ et al.1989) und Aktivierung der Mikroglia (KOSTULAS et al. 2002) zu beobachten.
Aufgrund einer ödematösen vasoparalytischen Erhöhung des zerebralen Blutvolumens und durch traumatisch bedingte Störungen der Liquorzirkulation, kann es zur Ausbildung eines posttraumatischen Hydrozephalus (PTH) (MAZZINI et al. 2003; GUYOT u. MICHAEL 2000; MARMAROU et al. 1996) und zu einer Gehirnschwellung kommen. Ein damit verbundener Anstieg des intrakraniellen Druckes und Herabsetzung des zerebralen Stoffwechsels führt zur Kompression und Atrophie des Gehirngewebes.
Bei diffusen axonalen Verletzungen sind durch Schädigungen des Zytoskeletts ein Verlust der Mikrotubuli mit Unterbrechung des axonalen Transports und eine reaktive axonale Schwellung mit Wallerscher Degeneration zu beobachten (CASTEJON u. ARISMENDI 2003). Sie führen zu einer Bewusstlosigkeit und Koma des Patienten. Die durch die Scherkräfte bedingten diffusen Verletzungen treten dabei als Kleinstkontusionen und -blutungen entlang der Kraftlinien am Übergang von grauer zu weißer Substanz auf.
2.2 Neuroprotektion 2.2.1 Einführung
Unter Neuroprotektion versteht man alle therapeutischen Interventionen mit Hilfe schadensbegrenzender, hirnfunktionsschützender Maßnahmen zur Protektion vulnerabler Neurone. Dabei geht es vor allem um die Vermeidung sekundäre Zellschäden und damit um die Verzögerung der Krankheitsprogression im Rahmen neurodegenerativer und neurotraumatologischer Erkrankungen. Die Zellen sollen vor akuten und chronischen Schäden geschützt werden, die durch eine erhöhte Konzentration freier Radikale, oxidativem Stress, durch eine Reduktion des Energiemetabolismus, durch eine gestörte Proteindegradation und durch das Überwiegen des exzitotoxischen Glutamates entstehen.
2.2.2 Therapieansätze
Die Therapieansätze umfassen im weitesten Sinne die Verlängerung der vom neuronalen Gewebe tolerierten Ischämiedauer unter Einschluss von Prävention und Regeneration. Zur neuroprotektiven Behandlung wurde ein breites Spektrum an Substanzen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen wie anti-inflammatorische, anti-apoptotische, anti-oxidative oder anti- exzitatorische Effekte untersucht (KOSSMANN et al. 1997).
Im Rahmen der klinischen Neurochirurgie werden zur neuroprotektiven Behandlung zerebroprotektive Pharmaka wie beispielsweise Kortikosteroide und Mannitol eingesetzt. Dabei üben die Kortikosteroide durch eine Verminderung der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke einen positiven Einfluss auf die Hirnschwellung aus. Weiterhin hemmen sie den Abbau der Membranphospholipide.
Mannitol kommt aufgrund des osmotischen Effektes zur Reduktion eines Hirnödems und zur Senkung des intrakraniellen Druckes bei der Behandlung
des Schädel-Hirn-Traumas zum Einsatz. Es führt zur Volumenreduktion und zur Verbesserung der zerebralen Durchblutung.
Bei einer zerebralen Ischämie tritt eine intrazelluläre Kalziumakkumulation auf, die im Rahmen klinischer Studien mit dem Kalziumantagonisten Nimodipin bei Patienten mit Subarachnoidalblutungen (SAB) behandelt wird. Es soll zu einer Verminderung des Vasospasmus und zu einer Verbesserung des zerebralen Blutflusses führen. Dabei ist ein wissenschaftlicher Beweis der Wirksamkeit jedoch noch ausstehend.
Im Rahmen der medizinischen Forschung wurden der Einsatz von Radikalfängern (ANDERSON et al.1985), Kalzium- (MOHAMED et al.1985) und Glutamat-Antagonisten (DIXON et al. 2003), NMDA- und AMPA-Antagonisten zur Hemmung der glutamatergen Transmission, Stickstoffmonoxid-Modulatoren zur Hemmung der neurotoxischen Wirkung von Glutamat (CHERIAN et al.
2000; SINZ et al.1999), Dopamin-Agonisten (DIXON et al.1999a) und Wachstumsfaktoren beschrieben.
Untersuchungen beinhalteten beispielsweise den Einsatz von Amantadin als Dopamin-Agonist (DIXON et al.1999a) und Etomidat als Glutamat-Antagonist (DIXON et al. 2003) im Rahmen einer experimentellen Gehirnverletzung anhand des Controlled Cortical Impact, das auch in der vorliegenden Arbeit zur Erzeugung einer fokalen Kontusionsverletzung des Gehirns eingesetzt wurde.
Nach systemischer Verabreichung von Amantadin und Etomidat zeigte sich eine gesteigerte Überlebensfähigkeit der hippokampalen Neurone und eine verbesserte motorische und kognitive Leistung der Tiere, die mit Hilfe des Beam Balance Tests, des Beam Walking Tests und des Morris Water Maze Tests untersucht wurde. Diese Untersuchungsmethoden kamen in der gleichen Weise in der vorliegenden Arbeit zum Einsatz.
Als Neurotrophine werden die Proteine bezeichnet, die regulativ an der Differenzierung und der Überlebensfähigkeit sich entwickelnder Neurone im Zentralen und Peripheren Nervensystem beteiligt sind.
Diverse Veröffentlichungen beschreiben das neurotrophe und neuroprotektive Potential von Wachstumsfaktoren, beispielsweise der Fibroblast growth factor-2 (YOSHIMURA et al. 2001, 2003; CHADI u. FUXE 1998), der Nerve growth factor (SINSON et al.1996), der Insulin-like growth factor-1 (CARRO et al. 2000, 2002) und der Brain-derivated neurotrophic factor (HAMA et al. 2001;
GRIESBACH et al. 2004), die nach Induktion einer experimentellen Gehirnschädigung zu einer Stimulation der Neurogenese führten.
2.3 Experimentelles Schädel-Hirn-Trauma
Zur Beurteilung der komplexen physiologischen, histopathologischen und kognitiven Änderungen, die mit einer traumatischen Hirnverletzung einhergehen, wurden eine Reihe von tierexperimentellen Modellen entwickelt.
Aufgrund der Heterogenität der Erkrankung ist der Einsatz nur eines Modells zur Abdeckung des gesamten Spektrums des Schädel-Hirn-Traumas nicht möglich. Die Voraussetzung für den Einsatz tierexperimenteller Modelle ist die Kontrolle der für die benutzte Tierart relevanten Variabilitäten wie Alter, genetischer Hintergrund und Physiologie (FINNIE u. BLUMBERGS 2002).
Dies wird durch standardisierte Zucht- und Haltungsbedingungen gewährleistet.
Weiterhin müssen die mechanischen Parameter und operativen Techniken, unter anderem die Lokalisation und der Schweregrad der Verletzung klar definiert sein, um eine Quantifizierbarkeit und Reproduzierbarkeit der Versuche zu ermöglichen.
Dies gilt auch für eine standardisierte Protokollierung und Untersuchung.
Die am häufigsten verwendete und am besten etablierten Nager-Modelle sind das „Weight-Drop“ Modell, das „Fluid-Percussion“ Modell und das „Rigid Indentation“ oder „Controlled Cortical Impact“ Modell.
Prinzipiell kann man die Modelle hinsichtlich der Art des induzierten Traumas unterscheiden.
Zum einen kommen Modelle zum Einsatz, die ein Impakttrauma zur Folge haben, dazu gehört das „Fluid Percussion“ (FP) Modell und das „Controlled
Cortical Impact“ (CCI) Modell, zum anderen werden Modelle verwendet, bei denen durch Akzeleration Gehirnverletzungen erzeugt werden. Dabei sind auch Kombinationen möglich, wie beispielsweise das „Weight-Drop“ Modell, bei dem der Schädel durch ein aufprallendes Gewicht eine Beschleunigung erfährt.
Prinzip des „Fluid Percussion Brain Injury“ Modelles ist eine lokale, impulsartige Injektion von physiologischer Kochsalzlösung nach Trepanation der Schädeldecke in den epiduralen Raum. Als Folge der sich ausbreitenden Druckwelle entsteht lokal eine Gehirnprellung mit fokalen Schäden, petechialen, intraparenchymalen und subarachnoidalen Blutungen, deren Schweregrad durch Veränderung der Injektionsparameter variiert werden kann.
Vorteilhaft ist bei diesem Modell die breite Varianz der erzeugten Kontusionen und Reproduzierbarkeit der Verletzung. Die Impulsvariablen sind zwar gut bestimmbar, aber andererseits ist die biomechanische Analyse anhand des komplexen Wechselspiels zwischen der Energie der Flüssigkeit und den lokalen Gewebe schwierig (LIGHTHALL et al. 1989).
Als ein Beispiel für ein geschlossenes Schädel-Hirn-Trauma ist das „Weight- Drop Closed Head Injury“ Modell (MARMAROU et al. 1994) zu nennen, bei dem ein frei fallendes Gewicht auf die uneröffnete Schädeldecke trifft.
Neben einer fokalen Kontusion und Einblutungen, treten hierbei auch diffuse axonale Verletzungen auf, die durch die Beschleunigung des Kopfes als Folge des Aufpralles entstehen. Somit ist das gesamte Spektrum eines Schädel-Hirn- Traumas über Variationsmöglichkeit der Höhe und Schwere des eingesetzten Gewichtes möglich. Vorteilhaft ist die relativ schnell durchführbare Operationstechnik ohne Trepanation des Schädeldaches, allerdings unter schwer kontrollier- und reproduzierbaren Bedingungen.
Zur Erzeugung einer isolierten, fokalen kortikalen Kontusion, die als klinisch relevante Einzelkomponente bei einem Schädel-Hirn-Trauma zu nennen ist, kam bei der vorliegenden, experimentellen Untersuchung das „Controlled Cortical Impact“ Modell zum Einsatz. Dies wird im folgenden Kapitel näher erläutert.
2.4 Controlled Cortical Impact (CCI)
Zur Erzeugung eines Impakttraumas wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das „Controlled Cortical Impact“ Modell oder „Rigid Indentation Brain Injury“ Modell verwendet.
Es handelt sich um ein etabliertes Kontusionsmodell bei Maus und Ratte (LIGHTHALL 1988, LIGHTHALL et al.1989, LIGHTHALL et al.1990; DIXON et al.1991). Die Erstbeschreibung erfolgte 1988 durch LIGHTHALL.
Prinzip des Modells ist die Übertragung von Energie auf einen in den Stereotakten fixierten Schädel mit Hilfe eines so genannten „pneumatic impactors“ auf die intakte Dura mater. Es ermöglicht eine Erzeugung des gesamten Spektrums der fokalen Gehirnverletzungen. Technisch handelt es sich um einen pneumatisch betriebenen Stempel, der kontrolliert in den freipräparierten Kortex eingeschossen wird.
Nach einer durchgeführten Kraniotomie trifft ein mit Druckluft betriebener Schusszylinder in einem definierten Winkel auf die freigelegte Dura mater. Der Zylinder ist auf einem Mikromanipulator fixiert, der eine exakte Bestimmung des Zentrums des Aufpralls und des Schusswinkels ermöglicht.
Es entsteht eine kortikale, unilaterale und reproduzierbare Kontusion.
Histologisch findet man eine klar abgegrenzte, fokale Verletzung unterschiedlichen Schweregrades mit intraparenchymalen, petechialen Hämorrhagien.
Im Versuch können sowohl die Schussgeschwindigkeit durch Veränderungen des eingestellten Druckluftwertes, die Aufprallsdauer, der Schusswinkel als auch die Eindringtiefe des auftreffenden Bolzens individuell eingestellt werden (LIGHTHALL et al. 1989).
Vorteile dieses Modelles sind die Kontrollierbarkeit der Parameter und die Vermeidung schwer steuerbarer diffuser Verletzungen, die im Rahmen anderer tierexperimenteller Modelle bei einem unfixierten Kopf durch Beschleunigung entstehen.
2.5 Glucagon-like Peptide-1 2.5.1 Einführung
Bereits 1964 wurde beobachtet, dass es nach oraler Gabe von Glukose zu einer deutlich stärkeren Insulinfreisetzung kam, als nach intravenöser Verabreichung (zitiert nach CREUTZFELDT 2005). Als Ursache wurde eine Freisetzung intestinaler humoraler Substanzen vermutet, die diesen inkretinen Effekt auslösen.
Neben den duodenalen Glucose-depent insulinotropic polypeptiden (GIP), denen als erstes die Wirkung eines Inkretins nachgewiesen werden konnte (DUPRE et al.1973), zeigten spätere Untersuchungen ein weiteres Inkretin, das Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) (MOJSOV et al.1987; KREYMANN et al.
1987).
Dieses intestinale Hormon führt nach der Nahrungsaufnahme zu einer Stimulation der Glukose abhängigen Insulinsekretion.
Die Klonierung und Sequenzierung des Präproglukagon-Gens und Glukagon- Präkursors in verschiedenen Spezies ermöglichte die Aufklärung der Biosynthese von Glukagon und der Glucagon-like Peptide.
BELL et al. (1983) konnte zwei Glukagon-ähnliche Substanzen finden und nannte sie Glucagon-like Peptide-1 und -2.
HOLST et al. (1987) gelang die Isolierung von GLP-1 aus Schweinedünndarm und eine teilweise Analyse der Aminosäure-Sequenz, die vollständig von ORSKOV et al. (1989) bestimmt wurde.
GLP-1 entspricht Proglukagon 78-107, besteht aus 30 Aminosäuren (ORSKOV u. NIELSEN 1988) und hat ein Molekulargewicht von 3,3 Kilodalton (ORSKOV et al. 1989).
Die Zugehörigkeit der Glucagon-like Peptide-1 und -2 zu den Peptiden der Glukagon-Familie erklärt sich durch die Sequenzhomologie der Aminosäuren zu Glukagon (KIEFFER u. HABENER 1999).
Bei Säugern enkodiert ein Proglukagon-Gen neben weiteren Peptiden, zwei Glucagon-like Peptide (GLP-1 und GLP-2), die in ihrer Aminosäure-Struktur bis
zu 50 Prozent Identität mit dem pankreatischen Glukagon aufweisen (DRUCKER 2001a).
Bei Glukagon (MAYO et al. 2003) handelt es sich um ein einkettiges Polypeptidhormon, das in den α-Zellen des pankreatischen Inselapparates gebildet wird und dessen Hauptfunktionen als Insulinantagonist die Freisetzung von Glukose aus der Leber und einer verstärkte Glykogenolyse, Glukoneogenese und Lipolyse sind.
Die biologische Aktivität von Glukagon, GLP-1 und GLP-2 dient der Regulation der Nahrungsaufnahme und der Energiehomöostase.
Die Prozessierung des Proglukagons in das Glucagon-like Peptide-1 erfolgt in endokrinen L-Zellen des Darms, die aus pluripotenten Stammzellen der Krypten stammen (POTTEN u. LOEFFLER 1990) und deren höchste Konzentrationen im Ileum und Kolon gefunden wurden (EISSELE et al. 1992).
Im Darm wird GLP-1 aus Proglukagon gebildet, dabei dient dieser als Hauptquelle des zirkulierenden GLP-1. Die Speicherung erfolgt in den ilealen L-Zellen in der aktiven Form von GLP-1, während es sich bei 50 Prozent des zirkulierenden, endogenen Peptids im Plasma allerdings um die inaktivierte, N- terminal gespaltene Form von GLP-1 handelt.
GLP-1 wird im Pankreas, Magen-Darm-Trakt (ORSKOV et al.1986) und auch im Zentralen Nervensystem synthetisiert (LARSEN et al.1997a, 1997b; TANG- CHRISTENSEN et al. 1998).
In-vivo besitzt das bioaktive Glucagon-like Peptide-1 in der Zirkulation eine nur sehr kurze Halbwertszeit von etwa 1 bis 5 Minuten (DEACON et al.1998).
Es wird nach subkutaner und intravenöser Applikation zu 80 Prozent in die inaktive Form des GLP-1 gespalten (KNUDSEN u. PRIDAL 1996).
Die Inaktivierung des GLP-1 über eine N-terminale Degradation erfolgt durch ein endogenes Enzym, die Dipeptidyl-Peptidase-IV (DPP-IV) (MENTLEIN et al. 1993; KIEFFER et al. 1995).
Dieses Enzym ist identisch mit dem T- Zelloberflächenantigen CD 26. Es übt drei Hauptfunktionen aus. Zum einen besitzt es eine Peptidase-Funktion, bei der es regulatorisch auf spezielle inkretine Substrate wirkt, wie GIP oder GLP-1.
In-vitro- und in-vivo Studien zeigten die Umwandlung von aktivem GLP-1 durch die DPP-IV in die inaktivierte, am GLP-1-Rezeptor antagonisierende Form des GLP-1 (KIEFFER et al.1995).
Zum anderen besitzt CD 26 neben der Peptidase-Funktion auch eine Adenosin- Desaminase-Bindungsfunktion und nimmt als Zelloberflächenmarker Einfluss auf die Proliferation von Lymphozyten.
Weiterhin wirkt CD 26 über die Extrazelluläre-Matrix-Bindungs-Funktion auf die Regulation der T-Zell-Aktivität und die Gewebe-Remodulierung ein.
2.5.2 Rezeptor
Der GLP-1-Rezeptor zählt zu der Gruppe der Guanin-Nukleotidbindender Protein (G-Protein) gekoppelter Glukagon-Rezeptor-Familie und wurde mit Hilfe einer permanenten Insulinoma-Zelllinie nachgewiesen (GOKE u. CONLON 1988). GLP-1 bindet dabei an einen spezifischen 7-Transmembran-Rezeptor.
Er ist unter anderem auf β-Zellen des Inselapparates des Pankreas (ORSKOV et al.1991) zu finden, wo GLP-1 als enteroendokrines Peptid zu einer Glukose- abhängigen Freisetzung von Insulin und zu einer Inhibition der Glukagon- Ausschüttung führt (KREYMANN et al.1987).
Weitere Lokalisationsorte des Rezeptors sind Herz, Lunge, Niere, Leber, Magen, Muskel- und Fettgewebe und das Zentrale Nervensystem (WEI u.
MOJSOV 1995; KANSE et al.1988; BULLOCK et al.1996).
Der Nachweis der Expression des GLP-1-Rezeptors im Gehirn erfolgte bei Nagern (GOKE et al.1995) und beim Menschen (WEI u. MOJSOV 1995;
SATOH et al. 2000; SHUGHRUE et al.1996).
Untersuchungen über die Wirkungen des GLP-1 im Gehirn ließen anhand Lokalisationsbestimmungen des GLP-1-Rezeptors, die Vermutungen zu, dass aktive Formen des GLP-1 über einen parakrinen Mechanismus als Neurotransmitter oder Neuromodulatoren fungieren (KANSE et al.1988;
SHIMIZU et al.1987; CALVO et al.1995). Dabei konnten Einflüsse des Peptids auf die Nahrungsaufnahme beobachtet werden (NAVARRO et al.1996).
Bei Untersuchungen der Lokalisation des GLP-1-Rezeptors zeigten sich hohe Bindungsaffinitäten im Hypothalamus und Thalamus (ALVAREZ et al.1996;
SHUGHRUE et al.1996).
Im Hypothalamus wurde der GLP-1-Rezeptor vor allem in den Nuclei supraopticus, paraventrikularis und arcuatus nachgewiesen (SHUGHRUE et al.
1996). Außerdem gelang eine Rezeptorbestimmung im Hippokampus, in den Ependymzellen des Plexus chorioideus des dritten Ventrikels und im primären olfaktorischen Kortex.
Immunhistochemische Untersuchungen bestätigten, dass eine intrazerebrale Verabreichung von GLP-1, Neurone in diesen Gebieten und im Hirnstamm aktivierte (LARSEN et al. 1997a, 1997b) und zu einer deutlich verminderten Nahrungsaufnahme führte, die durch die Gabe des Antagonisten Exendin-9 blockiert werden konnte (TURTON et al. 1996).
TANG-CHRISTENSEN et al. (2001) zeigte schließlich, dass der Nucleus arcuatus eine zentrale Rolle in der Vermittlung der der Reduzierung der Nahrungsaufnahme spielt.
Bei Untersuchung der Rezeptorexpression nach Gehirnverletzungen konnte eine vermehrte Expression des GLP-1-Rezeptors sowohl in neuronalen als auch in glialen Zellen beobachtet werden (CHOWEN et al. 1999).
Der GLP-1-Rezeptor ist gekoppelt an ein Adenylatcyclase-System (AC). Eine schematische Darstellung der Mechanismen der Signaltransduktion ist in der Abbildung 1 einzusehen. Eine Aktivierung des Rezeptors führt zur Stimulation der Adenylatcylase und daraus folgend zu einer gesteigerten Konzentration von zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP). Dies konnte durch Präparationen von Membranen hypothalamischen Ursprungs (KANSE et al. 1988) und sich in Kultur befindlicher Neurone des Hippokampus (PERRY et al. 2002a, 2002b) gezeigt werden. Die gesteigerte Konzentration von cAMP bringt eine Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) mit sich, bei der es durch Veränderungen der Aktivität der Ionenkanäle zu einem erhöhten Einstrom von Kalziumionen kommt. Dies führt zu einer gesteigerten Exozytose von Insulin (GROMADA et al. 1998a, 1998b).
Abbildung 1
Schematische Darstellung der Signaltransduktion des GLP-1-Rezeptors
7-Transmembran-Rezeptor mit den Untereinheiten α/β/γ, Adenylatcyclase (AC), Proteinkinase-A (PKA), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), Proteinkinase C (PKC), pancreatic and duodenal homeobox gene-1 (PDX-1), Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK), extracellular signal-regulated kinase (ERK), Inhibitoren: PD 98059, LY 294002 aus: PERRY u. GREIG (2003)
2.5.3 Wirkungen
Haupteffekt des GLP-1 ist dessen Rolle als Inkretin am endokrinen Pankreas über aktivierte GLP-1-Rezeptoren an der Zellmembran der β-Zellen, bei der die Insulinfreisetzung durch die absorbierte Glukose ausgelöst und potenziert wird (HOLST et al.1987; MOJSOV et al.1987; ORSKOV et al.1988).
Die Wirkung ist dabei gebunden an die Anwesenheit von Glukose und führt zur gesteigerten Sekretionsleistung der β-Zellen (MONTROSE-RAFIZADEH et al.
1994) und zur Sensibilisierung der β-Zellen für Glukose (HOLZ et al. 1993).
Am Pankreas konnten drei Wirkungswege des GLP-1 beobachtet werden.
Dabei spielen im Pankreas und im Zentralen Nervensystem die gleichen Signaltransduktionswege eine Rolle.
Zum einen wurde anhand von Untersuchungen durch den Einsatz von GLP-1 bei β-Zelllinien in-vitro (BUTEAU et al. 2003) und von GLP-1-Rezeptoragonisten in-vivo eine gesteigerte β-Zellproliferation beobachtet werden (PERFETTI u.
MERKEL 2000, PERFETTI et al. 2000; XU et al.1999; EDVELL u. LINDSTROM 1999; STOFFERS et al. 2000). Zum anderen konnten antiapoptotische Wirkungen an den β-Zellen nach GLP-1-Gabe bei Ratten und Mäusen nachgewiesen werden (FARILLA et al. 2002; LI et al. 2003).
In-vitro Versuche an β-Zelllinien, bei denen apoptotische Stimuli in Form von Zytokinen oder Peroxiden zugesetzt wurden, waren ein deutlich verminderter Zelltod zu beobachten (LI et al. 2003; HUI et al. 2003).
Weiterhin besitzt GLP-1 eine stimulierende Wirkung auf die Neogenese und die Differenzierung der pankreatischen Inselzellen (ZHOU et al.1999; PERFETTI et al. 2000; XU et al. 1999).
Weitere metabolische Effekte umfassen die Unterdrückung der Glukagon- sekretion (RITZEL et al.1998; ORSKOV et al.1988) und die Regulation der Nahrungsaufnahme (TURTON et al.1996).
Im Zentralen Nervensystem konnte die Expression des GLP-1-Rezeptors (GOKE et al.1995; SHUGHRUE et al.1996) und eine Beteiligung an der Futteraufnahme belegt werden. Es entstand die Vermutung, dass es sich bei GLP-1 um einen endogenen Sättigungsfaktor handelt (TURTON et al.1996).
Sowohl TURTON et al. (1996), LARSEN et al. (2001), als auch MEERAN et al.
(1999) zeigten, dass eine zerebrale Verabreichung von GLP-1 mit einer verminderten Futteraufnahme verbunden war. Diesen anorektischen Wirkungen konnte eine zentrale Vermittlung zugesprochen werden (TURTON et al.1996), da GLP-1 in den Nuclei des Hypothalamus gefunden wurde, welcher eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle des Essverhaltens spielt.
Weitere GLP-1 induzierte Effekte sind eine Verminderung der Magensäuresekretion (WETTERGREN et al.1998) und eine reduzierte Dünndarmmotorik (TOLESSA 1998). Außerdem wurden anabolische Wirkungen an der Leber, dem Muskel- und Fettgewebe (VILLANUEVA-
PENACARILLO et al.1994; OBEN et al.1991) und Einflüsse auf das kardiovaskuläre System mit einer Steigerung des arteriellen Blutdruckes und der Herzleistung dargestellt (BARRAGAN et al. 1994,1999).
Eine Zusammenfassung der Effekte des GLP-1 liefert die Abbildung 2.
Abbildung 2
Übersicht über die Wirkungen des Glucagon-like Peptide-1 aus: KIEFFER u. HABENER (1999)
2.5.4 Therapeutischer Einsatz
Diverse Untersuchungen zeigten die regulatorische Wirkung des Glucagon-like Peptide-1 innerhalb der Zellproliferation, der Differenzierung und im Rahmen apoptotischer Vorgänge der pankreatischen β-Zellen (BRUBAKER u.
DRUCKER et al. 2004; FARILLA et al. 2002, 2003). Außerdem wurde die Wirksamkeit des GLP-1 im Gehirn nach Aufnahme des Proteins aus der Blutbahn über den entsprechenden Rezeptor bewiesen (ORSKOV et al.1996).
Aktuelle Publikationen weisen auf ein mögliches neurotrophes und neuroprotektives Potential des GLP-1 hin (PERRY et al. 2002a, 2002b, 2002c, 2003; DURING et al. 2003).
Nach zerebraler Gabe von GLP-1 konnte eine Aktivierung endokriner Neurone im Hypothalamus und Hirnstamm beobachtet werden (LARSEN et al. 1997b).
So konnten zytotrophe und antiapoptotische Wirkungen von GLP-1 sowohl am Pankreas als auch in neuronalen Zelllinien gezeigt werden.
Dabei wurde festgestellt, dass sowohl in der Zellkultur (PERRY et al. 2002a) als auch nach zerebraler Injektion von GLP-1 (DURING et al. 2003) über dessen Rezeptor im Gehirn, apoptotische Stimuli modifiziert werden konnten.
Zum Nachweis der Induktion der neuronalen Zellproliferation und Differenzierung wurde eine in Kultur genommene Tumorzelllinie verwendet.
Nach Zugabe von GLP-1 und dessen Analogon Exendin-4 zeigten sich eine verstärkte Differenzierung und ein gesteigertes Auswachsen der kultivierten Neuriten, deren Ausmaß dem Neuritenwachstum nach der Zugabe des Nerve- growth-factors (NGF) ähnlich war (PERRY et al. 2002a).
Weiterhin wurden Untersuchungen des protektiven Potentials des GLP-1 vor exzitotoxischer neuronaler Schädigungen durchgeführt. Die beteiligten Faktoren sind in der Abbildung 3 einzusehen.
Sowohl bei mit Glutamat behandelten kultivierten, hippokampalen Rattenneuronen als auch im Rahmen eines etablierten neurodegenerativen Nagermodelles durch die Infusion von Ibotensäure (PERRY et al. 2002c, 2003), zeigten GLP-1 und dessen Analogon einen Schutz vor einer Glutamat induzierten Apoptose (GREIG et al. 2004).
Die möglichen proliferativen und antiapoptotischen Wirkungen von GLP-1 im Zentralen Nervensystem führten zum Einsatz von GLP-1 bei der Behandlung von Alzheimer oder anderen neurodegenerativen Erkrankungen (PERRY et al. 2002c, 2003). GLP-1-Antagonisten bewirkten eine Steigerung der Amyloid-β- proteininduzierten Apoptose (OKA et al. 2000), die bei der Alzheimererkrankung eine entscheidende Rolle spielt.
Die antiapoptotische, G-Protein gekoppelte Signaltransduktion spielt auch bei der Zellplastizität, bei Lernen und Gedächtnis eine wesentliche Rolle. Der GLP-1-Rezeptor ist unter anderem im Hippokampus zu finden (ALVAREZ et
al.1996), durch GLP-1-Gabe stimulierbar und führte zu einer Steigerung des Lernverhaltens (MATTSON et al. 2003).
Bei Untersuchungen von GLP-1-Rezeptor defizienten Mäusen wurden im Gegensatz zu gesunden Tieren eine deutliche Verminderung der Lernfähigkeit und eine Verstärkung des neuronalen Zellunterganges nach Kainat-Injektion beschrieben (DURING et al. 2003).
Abbildung 3
Schematische Darstellung der Mechanismen des Zellschutzes durch das Glucagon-like Peptide-1
Proteinkinase A (PKA), Ser/Thr Kinase Akt/PKB, Transkriptionsfaktors cAMP response element-binding protein (CREB), Phospatidylinositol-3-kinase (PI3K), Mitogen- activated-Proteinkinase (MAPK), extracellular signal-regulated kinase (ERK), Inhibitoren: LY294002, PD98059, Rp-cAMP
aus: PERRY u. GREIG (2003)
2.6 Mikroverkapselung 2.6.1 Einführung
Die Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems, hierbei besonders bei neurotraumatologischen Veränderungen, beschränkt sich derzeit aufgrund der Komplexität der Krankheitsbilder auf eine meist nur symptomatische Therapie. Die systemische Verabreichung potentieller therapeutisch nutzbarer Stoffe wird durch die Präsenz der Blut-Hirn-Schranke erschwert. Die geringe passive Permeabilität und das hoch selektive Transportsystem der Blut-Hirn-Schranke wirkt bei dem Einsatz therapeutischer Moleküle zur Behandlung zerebraler Krankheiten stark limitierend (EMERICH u.
SALZBERG 2001).
Als Lösungsansätze wurden die direkte zerebrale Injektion bioaktiver Proteine und der Einsatz von Implantationspumpen untersucht. Problematisch erwiesen sich zum einen die Dosierung und Stabilität der eingesetzten Proteine, zum anderen kam es zu infektiösen Gewebsreaktionen auf die sich dauerhaft im Gewebe befindlicher Apparaturanteile der Implantationspumpen (TSENG u.
AEBISCHER 2000).
Bereits 1964 entstand durch CHANG die Idee einer durch polymere Membranen immunisolierende Transplantation von Zellen. Im diesem Zusammenhang bietet sich insbesondere die zerebrale Transplantation an, da es sich bei dem Gehirn um ein immunologisch privilegiertes Organ mit einer geringen Immunreaktion handelt.
In den letzten Jahren wurden zwei Verkapselungsansätze untersucht, zu einem Makrokapseln wie zum Beispiel Hohlfaserkapseln und Diffusionskammern und zum anderen Mikrokapseln. Unter Mikroverkapselung versteht man die Einbettung von Zellen in eine auf Hydrogelen, zum Beispiel Alginat, basierende Matrix.
Die Implantation von makroverkapseltem Gewebe führte neben chirurgischen Problemen, die auf die Größe der Kapseln zurückzuführen waren, zu einer starken Abwehrreaktion beim Empfänger. Außerdem kam es, aufgrund der
langen Diffusionsstrecken in den Makrokapseln, zu einer Nekrose des implantierten Gewebes und schließlich zu einem Versagen der Implantate (KUHTREIBER et al.1999).
Im Gegensatz dazu bieten Mikrokapseln das Potential zur Lösung der bei den Makrokapseln auftretenden Probleme. Zum einem haben sie durch ihren kleineren Durchmesser ein besseres Oberflächen-Volumen-Verhältnis, zum anderen erlauben sie ein definierte Bestimmung ihrer Permeabilität. Damit kann die Diffusion von Metaboliten in die Implantate (zum Beispiel Sauerstoff oder Glukose) und die Freisetzung der von den verkapselten Zellen produzierten Stoffe ermöglicht werden. Gleichzeitig wird durch die immunisolierende Alginathülle ein Eindringen der Immunglobuline ausgeschlossen. Weiterhin ist durch die geringe Größe der Mikrokapseln, deren Durchmesser in der Regel unter einem Millimeter liegt, die Möglichkeit der Transplantation mehrerer Kapseln gewährleistet. Die Mikrokapseln können direkt injiziert oder mit minimal invasiven chirurgischen Eingriffen in den Muskel, den Bauchraum oder in das Zentrale Nervensystem transplantiert werden.
Diese auch als „Bioreaktoren“ bezeichneten Mikrokapseln können zur Behandlung neurologischer Erkrankungen therapeutische Proteine freisetzen.
Das am häufigsten verwendete und derzeit bevorzugte Verkapselungsmaterial ist Alginat (O’SHEA et al.1984). Bei der „Microencapsulated based cell and tissue Therapy“ handelt es sich um eine neue Art der Transplantation, die sich in den letzten Jahren entwickelt hat (LANZA et al.1996). Hierbei werden Gewebe oder Zellen durch eine semipermeable Membran vor dem Immunsystem des Empfängers geschützt und machen so eine dauerhafte Behandlung ohne eine begleitende immunsuppressive Therapie möglich.
Neben verkapselten Gewebeanteilen, beispielsweise bei der Implantation verkapselter pankreatischer Inselzellen zur Behandlung von Diabetes, wurden bisher 3 Kategorien von Zellen (EMERICH u. SALZBERG 2001) eingesetzt.
Zum einen wurden postmitotische Zellen verwendet, wie adrenerge chromaffine Zellen zur chronischen Schmerzbehandlung (BUCHSER et al.
1996), zum anderen kamen immortilisierte Zellen wie Dopamin sezernierende PC12-Zellen zur Therapie der Parkinson Erkrankung zum Einsatz (AEBISCHER et al.1991).
Ein weiterer innovativer Ansatz ist die Verwendung gentechnisch modifizierten Zellen („cell engineering“).
Dieses Verfahren wird auch als somatische ex-vivo Gentherapie bezeichnet, die im Unterschied zur in-vivo Gentherapie, bei der genetisches Material direkt in patienteneigene Zellen eingebracht wird, eine genetische Insertion in die Zellen in-vitro und eine folgende Implantation verkapselter, patientenfremder Zellen in den Patienten beinhaltet.
Diverse Publikationen weisen auf einen möglichen Einsatz von Stammzellen bei der Behandlung neurologischer Erkrankungen hin (TAI u. SVENDSEN 2004).
Im Rahmen der Verkapselungstechnik wurde der Einsatz von humanen mesenchymalen Stammzellen beschrieben. Stammzellen sind am Anfang der Entwicklung stehende Zellgruppen, die eine Fähigkeit zur Autoreproduktion haben und nicht endgültig differenziert sind. Je nach Gewebezugehörigkeit, beziehungsweise je nach Gewebe, das sie schließlich bilden, unterscheidet man: embryonale (ES), germinale, hämatopoetische, somatische, epitheliale und mesenchymale Stammzellen (MSC). Dabei werden sie nach ihren Eigenschaften differenziert in pluripotente Zellen (beispielsweise embryonale Stammzellen), in multipotenten Zellen (zum Beispiel mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks) und in unipotente Zellen (zum Beispiel Zellen der Blutbildung).
Mesenchymale Stammzellen sind Zellen, die aus dem Mesenchym oder so genannten embryonalem Bindegewebe stammen. Es stellt das multipotente Muttergewebe von Binde- und Stützgewebe, glatter Muskulatur, sowie von Skelett- und Herzmuskulatur dar. Bei den mesenchymalen Stammzellen handelt es sich um adhärente, morphologisch den Fibroblasten ähnliche Zellen, die aus dem adulten Knochenmark isoliert werden können.
2.6.2 Verkapselungsmaterial: Alginat
In den letzten zwei Jahrzehnten sind eine große Anzahl von Mikrokapseln aus verschiedenen Materialien (Alginat, Agarose, Agar und synthetischen Polymeren) entwickelt und getestet worden (DULIEU et al.1999).
Bei Alginat handelt es sich um ein anionisches Polysaccharid, das aus den Bausteinen β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) besteht, die über 1,4-Bindungen verknüpft sind. Einen schematischen Einblick über die Bestandteile des Alginates gibt die Abbildung 4.
Alginat kann aus den Zellwänden von Braunalgen (Phaeophyceae) extrahiert werden. Der Aufbau des Alginates wird durch 3 Sequenzblöcke bestimmt, neben homopolymeren M-M- oder G-G-Blöcken liegen alternierende heteropolymere M-G-Blöcke vor.
Es findet Anwendung in der Lebensmittelindustrie als Verdickungsmittel, Stabilisator und Gelbildner.
Alginate besitzen die Fähigkeit, unter Zugabe von di- und polyvalenten Kationen, mit Ausnahme von Magnesium (Mg2+), wässrige Gele zu bilden, die zur Herstellung Poren enthaltender semipermeabler Mikrokapseln verwendet werden können. Während monovalente Kationen zu keiner Gelbildung führen, kommt es durch di- und multivalente Kationen wie beispielsweise Kalzium (Ca2+) oder Barium (Ba2+) zu einer Quervernetzung innerhalb der G-Blöcke.
Es entsteht ein dreidimensionales Netzwerk, in dem die eingebetteten Zellen eine Immobilisierung erfahren.
Im Rahmen der Verkapselungstechnologie wird bevorzugt Barium (Ba2+) verwendet, das im Vergleich zu Kalzium (Ca2+) eine höhere Affinität zu Alginat besitzt und zu einer stärkeren Gelbildung führt. Ein weiterer Nachteil des Kalziums ist seine Chelatbildungsfähigkeit mit anderen körpereigenen Molekülen wie beispielsweise Citrate. Im Rahmen von Untersuchungen fand sich bei Alginatkapseln mit hohem Mannuronsäureanteil, die mit einer Bariumchloridvernetzung hergestellt wurden, eine geringere fibrotische
Reaktion als bei Kalziumchlorid vernetzten Kapseln (DUVIVIER-KALI et al.
2001).
Durch eine Vertropfung der Alginatgele in divalente Kationen enthaltende Alginatlösungen lassen sich Alginatperlen oder Alginatbeads mit Hilfe spezieller Beadgeneratoren formen. Diese Mikrokapseln bestehen aus einer inneren Alginathülle, in dem die entsprechenden Zellen in der polymeren Alginatmatrix eingebettet sind und einer äußeren Alginathülle, die durch ihre immunisolierenden Eigenschaften vor dem Immunsystem des Wirtes schützt.
Zusätzlich gibt diese Doppelverkapselung den Implantaten die nötige Stabilität.
Die Biokompatibilität oder Verträglichkeit der Alginatkapseln ist von der Größe der Implantate, der Reinheit des Rohstoffes und insbesondere von der Struktur des Alginates abhängig. Als Komplikation der Implantation von Alginatkapseln ist ein fibrotisches Überwachsen der Kapseln zu nennen, das durch den Sauerstoff- und Nährstoffentzug den Tod der verkapselten Zellen verursachen kann.
Alginatkapseln mit einem hohen Mannuronsäureanteil führten innerhalb von Untersuchungen zu einer verstärkten Stimulation des Immunsystem des Wirtes mit einer vermehrten Bildung proinflammatorischer Zytokine, während Guluronsäurereiche Alginate sich intraperitoneal (KULSENG et al.1999) und innerhalb des Gehirns von Ratten (READ et al. 2001) als gut tolerierbar erwiesen. Weiterhin zeigten Alginatkapseln mit einem hohen Guluronsäureanteil die größte Porenbildung, die sowohl zu einer verbesserten Versorgung der verkapselten Zellen als auch zu einer effizienteren Freisetzung des sezernierten Proteins führte (READ et al. 1999).
Abbildung 4
Schematische Darstellung der Bestandteile des Alginates A: β-D-Mannuronsäure
B: α-L-Guluronsäure
2.6.3 Therapeutischer Einsatz
Viele Krankheiten werden durch fehlerhafte oder abnormale metabolische und sekretorische Zellfunktionen verursacht, wie zum Beispiel Diabetes mellitus und Parkinson. Bisher wurden solche Krankheiten durch extrakorporale Gabe der fehlenden Stoffe (Hormone, Enzyme) therapiert. Damit kann allerdings die physiologische Feinregulierung innerhalb eines komplexen Metabolismus nicht nachempfunden werden (KUHTREIBER et al.1999). Ein Beispiel hierfür ist der Insulin abhängige Diabetes mellitus (IDDM). Solche Patienten müssen sich regelmäßig Insulin spritzen, was allerdings nicht ausreicht, um einen bedarfsadaptierten Blutzuckerspiegel zu gewährleisten.
Anstelle medikamentöser Behandlungen sollen nicht-autologe standardisierte Zelllinien, allogene und xenogene Zellen oder Gewebe transplantiert werden.
Diese Zellen oder Gewebe können die benötigten Substanzen produzieren und bedarfsadaptiert in den Organismus freisetzen.
O COOH
OH OH
O
OH OH
COOH
A B
Vorteile der Mikroverkapselung als Methode zur Implantation lebender, patientenfremder Zellen umfassen die lokale Applikationsmöglichkeit der Implantate unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke, eine kontinuierliche und dauerhafte Wirkstofffreisetzung, den Einsatz von Proteinen mit kurzer Halbwertszeit, eine gute Verträglichkeit durch den Patienten und einen gentherapeutischen Ansatz ohne Eingriff in das Genom des Menschen.
Erste erfolgreiche Implantation mikroverkapselter, lebender Zellen wurden bereits 1980 von LIM u. SUN durchgeführt, denen eine dauerhafte Behandlung diabetischer Tiere mittels implantierter, xenogener Inselzellen gelang.
AEBISCHER et al. zeigte 1988 im Rahmen eines experimentellen Parkinsonmodelles bei Ratten in einer Langzeitimplantation von neuronalem verkapselten Gewebe, dass die Kapseln zu keinerlei Abstoßungsreaktion oder nekrotischer Veränderung führten. Innerhalb klinischer Versuche wurde bestätigt, dass Alginat für die Stabilität, Verträglichkeit und das Überleben der verkapselten Zellen sorgt (LAHAM et al.1999; SOON-SHIONG et al.1994).
Zahlreiche technische Fortschritte dieser Immunisolierungsmethode haben es unter anderem ermöglicht, eine erfolgreiche therapeutische Transplantation von allogenem Parathyroidgewebe in Patienten mit Hypoparathyroidismus durchzuführen (HASSE et al.1997).
Die Verkapselungstechnologie wird bisher bei der Behandlung einer ganzen Reihe von Erkrankungen wie Hämophilien, Anämien, Zwergwuchs, Leber- und Nierenversagen, Insuffizienzen der Hypophyse und des ZNS in präklinischen Versuchen angewendet. In einigen Anwendungen wurden bereits therapeutische Heilversuche durchgeführt, zum Beispiel bei Diabetes mellitus (SOON-SHIONG et al.1994), amyotropher Lateralsklerose (ZURN et al. 2000;
AEBISCHER et al.1996), chronischem Schmerz (BUCHSER et al.1996), Hypoparathyreodismus (HASSE et al.1997), Pankreaskarzinom (LOHR et al.
2001), Morbus Huntington (BACHOUD-LEVI et al. 2000) und bei der Behandlung maligner Gehirntumore (READ et al. 1999; BJERKVIG et al. 2003;
VISTED u. LUND-JOHANSEN 2003).
Aktuelle Publikationen befassen sich auch mit einer neuroprotektiven Therapie mittels verkapselter neurotropher Faktoren oder entsprechender Zellen, die neuroprotektive Stoffe sezernierten.
YASUHARA et al. (2005) zeigte den erfolgreichen intrazerebralen Einsatz des verkapselten neurotrophen Faktors Glial cell line-derivated neurotrophic factor (GDNF) als Neuroprotektivum bei der Behandlung der Parkinsonerkrankung.
Auch im Zusammenhang mit Morbus Huntington und Schlaganfall konnten die neuroprotektiven Effekte von GDNF bestätigt werden. Dies erfolgte mit Hilfe der intrakraniellen Implantation verkapselter, fetaler, porziner chorioidaler Plexusanteile, die in hohem Maße neurotrophe Faktoren freisetzen (BORLONGAN et al. 2004a, 2004b).
CHIANG et al. (2005) konnte durch die Transplantation von fetalen Nierenzellen, die sich durch eine hohe Expression des neurotrophen GDNF auszeichneten, hirnschützende Effekte bei neuronalen Verletzungen belegen.
Weiterhin wurde der neuroprotektive Einsatz von transplantierten, humanen Stammzellen beschrieben (HAGAN et al. 2003), die neurotrophe Faktoren zur Behandlung von Parkinson sezernieren konnten (AKERUD et al. 2001).
Der Therapieansatz des Glucagon-like Peptide-1 als Neuroprotektivum wurde in verschiedenen Veröffentlichungen untersucht. Dabei konnten protektive Effekte sowohl in einer kultivierten Tumorzelllinie (PERRY et al. 2002a) als auch nach zerebraler Injektion (PERRY et al. 2002b, 2002c; DURING et al.
2003) gezeigt werden.
Bisher liegen keine Publikationen vor, die eine Verabreichung von Glucagon- like Peptide-1 anhand GLP-1 sezernierender, verkapselter Stammzellen zur neuroprotektiven Behandlung einer traumatologischen Gehirnverletzung beschreiben.
