Stereotaktische Implantationstechnik

Die Operationen erfolgten mittels eines stereotaktischen, mikrochirurgischen Verfahrens mit zerebraler Implantation der CellBeads^® unter Kontaktaufnahme mit dem liquorführenden System und bei lichtmikroskopischer Sichtkontrolle (Mikroskop NC 32 Zeiss).

Zur Vorbereitung der Operation wurden die Tiere gewogen, gekennzeichnet und das Operationsfeld auf der Schädeloberseite wurde auf einer Fläche von etwa 2 x 2 cm rasiert, gereinigt und desinfiziert (Cutasept^®).

Im Rahmen der Versuchsdurchführung wurden die Tiere mit einer intraperitonealen Injektionsnarkose aus der Kombination von Ketanest^® und Domitor^® anästhesiert.

Zum Schutz vor Austrocknung der Bulbi oculi wurde eine pflegende Augensalbe (Bepanthen Roche^®) aufgebracht.

Vor der Fixierung der Ratte in dem Stereotakten (SAS 4120, ASI Instruments) wurde mit Hilfe der Kombination aus den seitlichen Ohrbalken und der vertikal am beweglichen Arm des Stereotakten positionierten Operationsnadel

Interaural 0 (IA0) bestimmt, das anhand anatomischer Richttoleranzwerte eine Überprüfung des Bregmas als Orientierungspunkt möglich machte.

Die vollständige Schmerzausschaltung wurde vor Beginn der Operation anhand von peripheren Schmerzreizen sichergestellt.

Das Tier wurde mit den auf 6 mm eingestellten Ohrbalken und der Schnauzenklemme (Incisor bar) des Stereotakten fixiert und die Schädeldecke horizontal ausgerichtet. Vor Beginn des Eingriffes erfolgte eine erneute Desinfektion des Operationsfeldes (Cutasept^®).

Die benötigten Instrumente wurden 20 Sekunden lang in ein auf 150°C erhitztes Schnell-Sterilisiergerät (FST Fine Science Tools) verbracht.

Zur Präparation des OP- Bereiches wurde eine sagittale Hautinzision auf einer Länge von etwa 1 cm vorgenommen. Die Haut wurde mit 4 Bulldog-Klemmen aus dem OP-Bereich ferngehalten. Daraufhin wurde das Periost mehrmals geschlitzt und mit einem Raspatorium zur Seite geschoben. Die Knochennähte wurden zur besseren Darstellung mit 3%-iger H2O2-Lösung gebleicht.

Im Anschluss erfolgte die Bestimmung und Protokollierung der Koordinaten des Bregmas nach Orientierung an der Sutura interfrontalis und der Sutura sagittalis. Eine Kontrolle der Werte wurde mittels einer Differenzbestimmung zu Interaural 0 durchgeführt. Daraufhin wurde die Position der Bohrlochtrepanation ausgehend von Bregma im Bereich 1 mm posterior und 2 mm rechts lateral der Mittelllinie bestimmt. Einen schematischen Überblick über die Implantationskoordinaten gibt die Abbildung 7.

Die Trepanation der Schädelkalotte wurde mit einem 2,1 mm-Bohrkopf (FST Fine Science Tools) unter Schonung der Dura mater vorgenommen. Diese wurde anschließend durch eine Kanüle vorsichtig geschlitzt, um eine Verlegung der Mikroliter-Kanüle bei der folgenden Implantation zu vermeiden.

Unter mikroskopischer Sichtkontrolle wurde die mit CellBeads^® befüllte und im Stereotakten fixierte Mikroliterspritze mit einer stumpfen Mikroliterkanüle (Hamilton) in das Bohrloch gefahren und von der Knochenoberfläche aus 6 mm abgesenkt. Die ventrale Koordinate ermöglichte eine Penetration des

Ventrikels. Dabei wurden in der Biokompatibilitätsuntersuchung 10 CellBeads^®, innerhalb der Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 20 CellBeads^®, in jeweils 10 µlsteriler PBS-Lösung in das Gehirn verbracht.

Die Abbildung 8 zeigt das stereotaktische Operationsverfahren.

Die Injektion der verkapselten Zellen erfolgte nach Hochziehen der Kanüle um 1 mm in einer Tiefe von 5 mm. Die Injektion wurde schnell und mit dem gesamten Volumen auf einmal verabreicht. Nach etwa 10 Sekunden Wartezeit wurde die Kanüle langsam, in etwa 30 Sekunden, aus dem Gehirn entnommen.

Anschließend erfolgte unter der Sterilbank eine lichtmikroskopische Überprüfung der Kanüle auf mögliche Restinhalte und Protokollierung der Ergebnisse.

Die Trepanationsstelle blieb unverschlossen und die Hautwunde wurde mit etwa 3 Stichen in Form von Einzelheften mit nicht-resorbierbarem Nahtmaterial (Ethilon 4/0) versorgt. Das Operationsprotokoll ist im Anhang aufgeführt.

Abbildung 7

Bereich der Implantationskoordinaten

A: Schematische Darstellung des Rattengehirns von dorsal mit markierter Implantationsstelle

B: Querschnitt durch das Rattengehirn im Bereich der Implantation

aus: Paxinos u. Watson (1998): „The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates“

Koordinaten: 1 mm posterior, 2 mm lateral und 5 mm ventral zu Bregma

5 mm ventral 2 mm lateral

A B

Abbildung 8

Stereotaktische Implantationstechnik

A: Im Stereotakten mittels Ohrbalken und Incisor bar fixiertes Tier (BDIX/Ztm) B: Dorsalansicht der Implantationstechnik der CellBeads^® mit abgesenkter

Mikroliterkanüle, Bregma (mit Pfeil markiert), 1: Sutura interfrontalis, 2: Sutura sagittalis

3.4.4 Controlled Cortical Impact (CCI)

Zur Erzeugung eines moderaten Schädel-Hirn-Traumas mit fokaler Kontusion fand das so genannte „Controlled Cortical Impact“ (CCI) Verwendung. Eine Darstellung der CCI-Einheit ist in der Abbildung 9 einzusehen.

Nach tiefer Narkotisierung der Tiere mittels einer intraperitonealen Injektion von Ketanest^® und Domitor^® wurde das Operationsfeld rasiert und desinfiziert (Cutasept^®).

Im Anschluss erfolgte die Fixierung des Tieres im stereotaktischen Rahmen.

Nach einer Mittelinzision der Haut und Entfernung des Periostes, wurden die Koordinaten des Bregmas bestimmt und 1 mm posterior und 2 mm lateral die entsprechenden CellBeads^® nach einer Vorbehandlung stereotaktisch in den rechten Seitenventrikel implantiert.

Nach Abpräparation und lateraler Abspannung des rechten Temporalmuskels und sorgfältiger Blutstillung wurde der Kraniotomiemittelpunkt 3 mm posterior und 4 mm rechts lateral zu Bregma markiert.

Folgend wurde eine im Durchmesser 6 mm große, kreisrunde Kraniotomie mit einem Diamantbohrer so angelegt, dass die Dura mater unverletzt blieb.

A

2 1 1

B

Nun wurde der auf einer stereotaktischen Halterung fixierte pneumatische Schusszylinder (nach LIGHTHALL 1988) positioniert.

Über zwei getrennt ansteuerbare, pneumatische Ventile wurde mit Hilfe eines eingestellten Druckes eine Stange mit einem an der Spitze angebrachten

„Impaktor“ nach unten geschossen, verblieb für eine definierte Zeit in dieser Endposition und sprang danach zurück .

Die Ansteuerung und Geschwindigkeitsmessung erfolgte mit Hilfe eines Laptops und der Software „Labview“. Die Einschlagsgeschwindigkeit wurde laseroptisch anhand eines hinter dem Schusszylinder angebrachten Abstandsmessungssystems (optoNCDT) ermittelt und unmittelbar nach dem Schuss von der Software des Laptops angezeigt.

Die mittlere Einschlaggeschwindigkeit (impact velocity) lag bei 3 Metern pro Sekunde (m/sec). Unmittelbar vor der Traumaapplikation wurde die Geschwindigkeit des Schusszylinders nochmals mit Probeschüssen überprüft.

Der „Impaktor“ oder Schusszylinder mit einem 5 mm großen Durchmesser wurde mittig über der Kraniotomiestelle positioniert, dabei betrug der seitliche Neigungswinkel 22° zur Vertikalen. Als Parameter zur Erzeugung einer moderaten Kontusion wurde die Eindringtiefe mit 2 mm ab dem höchsten Punkt der Dura mater und die Verweildauer mit 150 ms festgelegt.

Die Hautwunde wurde mit etwa 4 Einzelheften aus nicht-resorbierbarem Nahtmaterial (Ethilon 4/0) versorgt, dabei blieben die Bohrlochtrepanation und die Kraniotomie unverschlossen.

Nach erfolgter Operation wurden die Tiere einzeln für mindestens 3 Tage in Makrolon^®-Käfige Typ III verbracht, ihre Erholung wurde in den ersten Stunden überwacht und sie wurden analgetisch über 3 Tage mit Novaminsulfon ratiopharm^® über das Trinkwasser versorgt.

Abbildung 9

Aufbau der CCI-Einheit

A: Stereotaktische Halterung für die Versuchstiere

B: Schussapparat im ausgelösten Zustand, laseroptischer Abstandsmesser * C: Einheit mit 2 pneumatischen Ventilen zur Ab- und Aufwärtsbewegung des Schusszylinders

D: Netzteil und Messeinheit zur laseroptischen Abstandsmessung

E: Laptop zur Ansteuerung der Ventile und Errechnung der Impaktgeschwindigkeit nicht dargestellt: Druckluftkompressor