Mikroskopische Auswertung

Die Beurteilung der Gewebeschnitte erfolgte lichtmikroskopisch mit dem Mikroskop Olympus BX50 F4, die fotografische Dokumentation der histologischen Präparate mittels einer digitalen Kamera (Leica DC 300). Die Bilddokumente wurden als Dateien im JPEG-Format gespeichert.

Die Benennung der Dateien fand nach folgendem Schema statt:

Tiernummer/ Objektträgernummer/ Nummer des Gewebeschnittes/

Vergrößerung/ Färbemethode (Beispiel: GLP3_1.2_5x_HE.jpg).

Der Schwerpunkt der mikroskopischen Auswertung war innerhalb der Biokompatibilitätsuntersuchung die Beurteilung der Umgebungs- oder Abstoßungsreaktion auf die leeren CellBeads^® und die Implantate mit der xenogenen Zelllinie im Vergleich zwischen einem immundefizienten und einem immunkompetenen Rattenstamm.

Im Rahmen der Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei einem Schädel-Hirn-Trauma erfolgte eine histologische und immunhistologische Bewertung der traumatisierten Hemisphäre mit der Untersuchung der geweblichen, posttraumatischen Morphologie der fokalen, kortikalen Kontusionsverletzung unter verschiedenen Gesichtspunkten. Desweiteren wurde ein histologischer und immunhistologischer Nachweis der Implantate und der Proteinfreisetzung angestrebt.

Zur Abschätzung der Folgezustände des Schädel-Hirn-Traumas wurden der kontusionelle Kortex, die perikontusionelle Zone und das benachbarte Marklager untersucht. Dabei sollte der histologische Einfluss der Behandlung der Tiere mit GLP-1 auf die Folgezustände des induzierten Schädel-Hirn-Traumas im zeitlichen Rahmen von 4 und 8 Wochen nach den Operationen untersucht werden. Neben der Beurteilung der neuronalen Zelluntergänge,

Störungen der neuronalen Zellarchitektur und Verletzungen des Zytoskeletts, wurden sowohl degenerative Prozesse als auch entzündliche Vorgänge innerhalb der Traumaregion berücksichtigt. Die Interpretation der Untersuchungsergebnisse erfolgte auf histologischer und immunhistologischer Basis anhand einer qualitativen Auswertung der H.E.- und Nissl-Färbung und mittels einer semiquantitativen Analyse mit Kategorisierung der Ergebnisse im Rahmen der Immunhistologie.

Alle Veränderungen wurden bei der GLP-1- und MAP-1-Färbung als positiv oder negativ gegenüber dem Status der Kontrolltiere unterteilt. Bei der GFAP-und OX6-Färbung erfolgte eine Graduierung in 3 Schweregrade (geringe, moderate und massive Zunahme der Immunreaktion). Diese Einteilung wurde der entsprechenden immunhistologischen Technik angepasst, definiert und für alle Versuchstiere durchgeführt. Für jede immunhistologische Färbung wurden jeweils 3 Objektträger mit je 6 Gewebeschnitten pro Tier untersucht und der schwerste Grad wurde in die Beurteilung aufgenommen. Die Darstellung der Gesamtbeurteilung erfolgte tabellarisch und graphisch. Die Abbildungen 11 bis 17 zeigen die definierten Graduierungen und die Schwerpunkte der Untersuchung.

3.5.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)

Die histologische Untersuchung anhand der H.E.-Färbung diente der Übersichtsfärbung und dem Nachweis der Implantate. Im Rahmen der Wirksamkeitsuntersuchung wurden zudem die morphologischen, geweblichen Veränderungen nach dem Schädel-Hirn-Trauma beurteilt. Dabei wurde der Bereich der Kontusion, die kontusionellen Randgebiete und das Ventrikelsystem berücksichtigt.

3.5.7.2 Nissl-Färbung

Die Nissl-Färbung wurde zur qualitativen Untersuchung der Neuronenmorphologie nach der kontusionellen Gehirnverletzung eingesetzt.

Dabei wurden sowohl die neuronalen Veränderung des gesamten Kortex im kontusionellen Bereich und in den Kontusionsrandgebieten, bevorzugt in der Lamina pyramidalis externa, betrachtet.

3.5.7.3 Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1)

Der Einsatz des Primärantikörpers gegen das Glucagon-like Peptide-1 diente dem Nachweis der Proteinsekretion innerhalb der Implantate und damit der Funktionsfähigkeit der Implantate. Dabei erfolgte die immunhistologische Nachweisführung bei 4 behandelten Tieren. Zum Vergleich der Ergebnisse wurde bei je 1 Tier der Kontrollgruppe, der Tiere, bei denen nur ein Trauma induziert wurde und der Gruppe der Implantation leerer CellBeads^®, eine immunhistologische Untersuchung mit Hilfe des GLP-1-Antikörpers durchgeführt. Die Ergebnisse wurden klassifiziert in eine positive und negative Immunreaktion.

Abbildung 11

Darstellung der Auswertung und Graduierung der GLP-1-Färbung

A: Transversalschnitt eines Gehirns bei 12,5facher Vergrößerung, Schwerpunkt der Untersuchung im Bereich des Ventrikel, des angrenzenden Gewebes und innerhalb der Kontusion (markiert mit Rahmen), Messbalken 800 µm, Schnittdicke 20 µm

B: CellBead^® bei 200facher Vergrößerung, positive Immunreaktion der GLP-1 sezernierenden Stammzellen (Pfeile), Messbalken 50 µm, Schnittdicke 20 µm

A B

3.5.7.4 Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1)

Mit Hilfe der immunhistologischen Anfärbung des Microtubule-associated Protein-1 wurden die posttraumatischen Zytoskelettverletzungen untersucht.

Für jedes Tier wurde der Bereich der maximalen Traumaausprägung beurteilt.

Als Schwerpunkt der Untersuchung diente eine Bewertung der dendritischen Strukturen innerhalb des kontusionellen Kortex. Aufgrund der anatomischen Faserverläufe der Dendriten wurde in die Analyse neben der Lamina pyramidalis externa, die oberhalb angrenzende Lamina granularis externa miteinbezogen, da die Spitzendendriten der Pyramidalschicht bis in diese Zone hineinreichen. Die Färbung wurde anhand einer Klassifikation in eine positive und negative Immunreaktion ausgewertet.

Abbildung 13

Darstellung der Graduierung der MAP-1-Färbung (Dendriten) Transversalschnitte des Neokortex bei 400facher Vergrößerung, Messbalken 25 µm, Schnittdicke 20 µm, Immunreaktion der mikrotubulären Strukturen der Dendriten als brauner Niederschlag sichtbar, A: positive Immunreaktion der apikalen, kortikalen Dendriten (Pfeile) B: negative Immunreaktion ohne Anfärbung des Zytoskeletts

A B

Abbildung 12

MAP-1 Immunhistologie (Dendriten) Transversalschnitt eines Gehirns bei 12,5facher Vergrößerung,

Schwerpunkt der Untersuchung im Bereich der kortikalen Lamina granularis externa und Lamina pyramidalis externa (markiert mit Rahmen), Messbalken 800 µm, Schnittdicke 20 µm

3.5.7.5 Gliafaserprotein (GFAP)

Das saure Gliafaserprotein diente der Darstellung aktivierter Astrozyten zur Beurteilung der Makroglia unter Berücksichtigung degenerativer Prozesse.

Im Rahmen der Untersuchung wurde der traumatisierte Kortex und der angrenzende Balken ausgewertet. Untersucht wurde die globale Zunahme der Intensität der GFAP-Immunrektion mit Beurteilung der angefärbten Astrozyten in 3 Kategorien:

Geringe Zunahme der Immunreaktion: reguläres Muster der Astrozyten mit fokal begrenzter Anfärbung einzelner Astrozyten.

Moderate Zunahme der Immunreaktion: Zunahme der Immunreaktion mit verstärkter flächiger Anfärbung der Astrozyten ohne Ausbildung einer Glianarbe.

Massive Zunahme der Immunreaktion: Starke Zunahme der globalen Immunintensität im gesamten dargestellten Areal mit einer Verdichtung und narbiger Abgrenzung (Glianarbe) des Kontusionsdefektes.

Abbildung 14

GFAP- Immunhistologie (Astroglia) Transversalschnitt eines Gehirns bei 12,5facher Vergrößerung,

Schwerpunkt der Untersuchung im Bereich der Kontusion, der K o n t u s i o n r a n d z o n e u n d d e s angrenzenden Balkens (Rahmen), Messbalken 800 µm, Schnittdicke 20 µm

Abbildung 15

Darstellung der Graduierung der GFAP-Färbung (Astroglia)

Transversalschnitte des Neokortex, bei 400facher Vergrößerung (außer E), Messbalken 25 µm, Schnittdicke 20 µm, Immunreaktion der Astroglia als brauner Niederschlag sichtbar

A/B: Geringe Immunreaktion mit Anfärbung einzelner Astrozyten (Pfeile).

C/D: Moderate Immunreaktion mit zunehmend flächiger Anfärbung der Astrozyten E/F: Massive Immunreaktion mit Ausbildung einer Glianarbe, bei 12,5fach

vergrößerter Übersichtsaufnahme, Messbalken 800 µm (E), Ausschnittsvergrößerung des astrozytären Narbenbereiches (F)

A

C D

B

E F

3.5.7.6 MHC Klasse II Oberflächenantigen (OX6)

Zur Beurteilung immunologischer Prozesse wurde die Aktivierung der Mikroglia mittels immunhistologischer Darstellung der MHC Klasse II-Expression auf den zerebralen Hortegazellen herangezogen.

Sie diente der Untersuchung der immunologischen Abwehrreaktion im Bereich der maximalen Traumaausprägung als Folge der experimentellen Gehirnverletzung.

Die Kategorisierung der Ergebnisse erfolgte unter Berücksichtigung der vermehrten Ausprägung der Hortegazellen innerhalb des Kortex und des Marklagers. Die Schweregrade der Immunreaktion wurden unter Bezugnahme auf den Status der gesunden Kontrolltiere in 3 Schweregrade eingeteilt:

Geringe Zunahme der Immunreaktion: vereinzelte oder fokal begrenzte immunpositive Mikrogliazellen nachweisbar.

Moderate Zunahme der Immunreaktion: gesteigerte Immunreaktion innerhalb des Marklagers und des ventralen Kontusionsrandes, Reaktion auf ipsilaterale Traumaseite begrenzt.

Massive Zunahme der Immunreaktion: schwerwiegende Immunreaktion mit starker Aktivierung der Mikroglia innerhalb der Kontusion, des Kontusionsrandes und des Marklagers, auf ipsi- und contralateraler Traumaseite. Kortikale, mikrogliäre Reaktionen mit Ausbildung von Traumamarken.

Abbildung 16

OX6-Immunhistologie (Mikroglia)

Transversalschnitt eines Gehirns bei 12,5facher Vergrößerung,

Schwerpunkt der Untersuchung im Bereich der Kontusion, des ventralen Kontusionsrandes und des Marklagers (Rahmen), Messbalken 800 µm, Schnittdicke 20 µm

Abbildung 17

Darstellung der Graduierung der OX6-Färbung (Mikroglia))

Transversalschnitte des Neokortex, bei 400facher Vergrößerung (außer E), Messbalken 25 µm, Schnittdicke 20 µm, Immunreaktion der Mikroglia als brauner Niederschlag sichtbar

A/B: Geringe Immunreaktion: vereinzelte immunpositive Mikrogliazellen (Pfeile) und fokal begrenzte Immunreaktion (B, gestrichelte Markierung)

C/D: Verstärkte, moderate mikrogliäre Reaktion (Pfeile) innerhalb der Kontusion (C) und am Übergang von ventralem Kontusionsrand zum angrenzenden Marklager (D) E/F: Massiven, bilateralen Immunreaktion mit kortikaler Ausbreitung und Bildung einer Traumamarke, Übersichtsaufnahme bei 40facher Vergrößerung, Messbalken 40 µm (E), Ausschnittsvergrößerung des Bereiches zwischen Kortex und Marklager (F)

A B

C D

E F