Wirksamkeitsuntersuchung des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma In Publikationen verschiedener Autoren wurde im Rahmen einer Reihe von

Erkrankungen der therapeutische Einsatz des Glucagon-like Peptide-1 beschrieben. Der Hauptanteil der Veröffentlichungen befasste sich aufgrund der inkretinen Wirkung des GLP-1 mit der Therapie von diabetischen Erkrankungen und Veränderungen des Pankreas (DRUCKER 2001b; BRUBAKER u.

DRUCKER 2004). Weitere Untersuchungen umfassten den Einfluss des GLP-1 auf die Gewichtsregulation (TANG-CHRISTENSEN et al. 1998; MEERAN et al.1999), Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes (KINZIG et al. 2002) und dessen Wirkung auf das kardiovaskuläre System (BARRAGAN et al.1994;

BARRAGAN et al.1999; YAMAMOTO et al. 2002).

Anhand von Publikationen wurde der GLP-1-Rezeptor unter anderem im zerebralen Kortex und Ventrikelsystem (CALVO et al.1995; ALVAREZ et al.

1996) nachgewiesen und es konnte dessen Aktivierung im Zentralen Nervensystem gezeigt werden (LARSEN et al.1997b).

Desweitern wurden neuroprotektive Effekte im Rahmen neuronaler degenerativer Schädigungen (PERRY et al. 2002a, PERRY et al. 2002b, PERRY u. GREIG 2003) und im Zusammenhang mit Gehirnverletzungen

(CHOWEN et al.1999) beschrieben. Mit Hilfe des GLP-1 konnte zudem eine Verbesserung des Lernverhaltens und des Gedächtnisses bewiesen werden (DURING et al. 2003). Während GLP-1 in den genannten Untersuchungen in Form von Injektionen und mit Hilfe von osmotischen Pumpen dem Gehirn zugeführt wurde (DURING et al. 2003; PERRY et al. 2002c), erfolgte die Behandlung der Tiere in der vorliegenden Arbeit anhand einer zerebralen Implantation GLP-1 sezernierender mesenchymaler alginatverkapselter Stammzellen. Anhand dessen konnte eine dauerhafte, kontinuierliche Zuführung des Proteins gewährleistet werden, die mit nur einem einmaligen operativen Eingriff für die Versuchstiere verbunden war.

5.1.2.2.1 Histologie

Die histologische Auswertung erfolgte anhand fixierter Gefrierschnitte mit einer Schnittdicke von 20 µm und mit Hilfe verschiedener Färbungen.

Eine Anfärbung der Zellkerne und die Erstellung von Übersichten des zu analysierenden Gewebes durch die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) und die Darstellung der Neuronenstruktur mit der Nissl-Färbung wurden entsprechend der Literatur bezüglich experimenteller traumatischer Gehirnverletzungen (DIXON et al. 1999a; NAKAJIMA et al. 2000) lichtmikroskopisch durchgeführt.

Die H.E.-Färbung ließ Aussagen über den allgemeinen morphologischen Gewebeaufbau infolge des experimentellen Schädel-Hirn-Traumas und den Nachweis der Implantate zu. Mit Hilfe der Nissl-Färbung wurde eine qualitative Auswertung der kontusionell veränderten Neuronenstruktur durchgeführt.

Zur Beurteilung der implantierten CellBeads^® wurde eine Schnittdicke von 20 µm gewählt. Dies war für die histologische Auswertung der Traumafolgen nachteilig, da es bei dieser Schneidetechnik zu einer Überlagerung der dargestellten zerebralen Strukturanteile kam, die eine semiquantitative Analyse verhinderte. Im Gegensatz dazu zeigte sich die Schnittdicke innerhalb der immunhistologischen Darstellung der Dendriten, Astrozyten und Hortegazellen als vorteilhaft. Zur spezifischen Untersuchung der posttraumatischen,

insbesondere sekundärer Folgeschäden, wurden immunhistologische Spezialfärbungen verwendet.

5.1.2.2.2 Immunhistologie

In Anlehnung an verschiedene Publikationen, die sich mit den Folgen eines induzierten Schädel-Hirn-Traumas mit Hilfe des Controlled Cortical Impact (CCI) befassten, wurden spezifische immunhistologische Färbungen eingesetzt.

Innerhalb der vorliegenden Arbeit kamen Antikörper gegen das Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1), das Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1), das Glial fibrillary acidic Protein (GFAP) und das MHC Klasse II Oberflächenantigen auf der Mikroglia (OX6) zum Einsatz.

Die Verwendung des Primärantikörpers gegen GLP-1 diente dem Nachweis der Wirkstoffsekretion und Proteinfreisetzung der Implantate und damit der exogenen Zuführung des therapeutischen Stoffes. Desweiteren erfolgte eine immunhistologisch Auswertung der posttraumatischen zerebralen Zytoskelettverletzungen mit Hilfe der Anfärbung des Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1). Diverse Veröffentlichungen konnten die posttraumatischen Veränderungen der Axone und Dendriten, die infolge mechanischer Einwirkung und Ionenverschiebungen entstehen, nachweisen. Infolge der Verletzungen wurden Störungen des axonalen Transports und ein Verlust der Mikrotubuli beschrieben, die anhand der MAP-1-Färbung sichtbar gemacht werden konnten (CARBONELL u. GRADY 1999; POVLISHOCK 1986; CASTEJON u.

ARISMENDI 2003). Als weitere Folgen einer traumatischen Gehirnverletzung wurden eine reaktive Astrogliareaktion und eine vermehrte mikrogliäre entzündliche Zellaktivierung gezeigt, die mit Hilfe etablierter immunhistologischer Verfahren durch eine Anfärbung von GFAP und OX6 durchgeführt wurden (CORTEZ et al.1989, CSUKA et al. 2000; KOSTULAS et al. 2002).

In der vorliegenden Arbeit wurden mittels der Anfärbung des Gliafaserproteins (GFAP) und des MHC Klasse II auf der Mikroglia (OX6) die sekundären

Folgeschäden des Schädel-Hirn-Traumas in Form degenerativer und entzündlicher Prozesse und damit die Behandlungseffekte des GLP-1 untersucht. Anhand dessen wurde eine Darstellung des reparativen Potentials der Astrozyten mit Ausbildung einer fibrösen Glianarbe und die durch Antigeneinfluss aktivierten mikrogliären Hortegazellen möglich.

5.1.2.2.3 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung

Zahlreiche Autoren befassten sich mit den neurologischen Dysfunktionen, motorischen Ausfälle und den Defiziten des Lernverhaltens und des Gedächtnisses, die nach einem Controlled Cortical Impact entstehen können (DIXON et al. 1999b; KLINE et al. 2002; PRINS u. HOVDA 2001). Im Rahmen der Veröffentlichungen wurden etablierte, spezielle motorische und kognitive Untersuchungen durchgeführt, die in ihrem Aufbau und ihrer Ausführung auch in der vorliegenden Abhandlung zum Einsatz kamen.

Zur zeitnahen Auswertung der vestibulomotorischen Fähigkeiten am Tag 1 vor den Eingriffen und an den Tagen 1 bis 5 nach der Traumainduktion wurden der Beam Balance Test und der Beam Walking Test verwendet. Sie dienten innerhalb der Arbeit zur Beurteilung der Balancefähigkeit der Tiere im Stand und im Lauf und wurden im Vergleich zu gesunden, traumatisierten und mit GLP-1 behandelten Tieren betrachtet. Der frühe Untersuchungszeitpunkt und die kurze Versuchsdauer wurde in Anlehnung an bestehende Publikationen und aufgrund der schnellen motorischen posttraumatischen Erholung der Tiere durchgeführt.

Der Morris Water Maze Test kam als ein etabliertes Untersuchungsverfahren des Lernverhaltens und des Gedächtnisses zum Einsatz. Er diente dem Vergleich der Lernprozesse im Zusammenhang mit räumlichem Lernen an den postoperativen Tagen 14 bis 18, einer Analyse des räumlichen Gedächtnisses am Tag 19 und der Untersuchung des Lernverhaltens bei der Verwendung einer sichtbaren Plattform an den Tagen 20 und 21 nach den Eingriffen.

Die statistische Auswertung wurde ähnlich zu DIXON et al. (2003) durchgeführt.