Charakterisierung eines murinen Norovirus –
Auswirkungen des Virus auf die experimentelle chronisch entzündliche Darmerkrankung bei der Interleukin-10
defizienten Maus
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Marcel Achard
Münster
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Hans-J. Hedrich Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium
Medizinische Hochschule Hannover Univ.-Prof. A. Bleich, Ph.D.
Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium
Medizinische Hochschule Hannover Apl.-Prof. Dr. M. Mähler
Labor für biomedizinische Diagnostik - BioDoc Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hans-J. Hedrich 2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Ludwig Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 24. November 2011
Meinen Eltern
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... V
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 2
2.1 Caliciviridae ... 2
2.2 Genetik und Molekularbiologie von MNV ... 3
2.3 MNV in der Zellkultur ... 5
2.4 Nachweisverfahren für MNV ... 7
2.5 MNV-Prävalenz in Versuchstierhaltungen ... 8
2.6 Erfassung und Bekämpfung von MNV in der Labortierhaltung ... 8
2.7 Infektionsverlauf ... 9
2.8 Untersuchungen zum Einfluss von MNV auf bestimmte Mausstämme und Tiermodelle ... 9
2.9 Weitere Forschung mit murinen Noroviren ... 12
2.10 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) ... 12
2.11 Die Interleukin-10 defiziente Maus ... 15
2.12 Ziele dieser Arbeit ... 17
3 Eigene Untersuchungen ...18
3.1 Material ... 18
3.1.1 Mäuse ... 18
3.1.2 Herkunft ... 18
3.1.3 Haltung im Experiment ... 19
3.1.4 Synthetische Oligonukleotide ... 22
3.1.5 Zelllinie ... 24
3.1.6 Eingesetzter Virusstamm ... 24
II
3.1.7 Eingesetzter Bakterienstamm ... 24
3.1.8 Materialliste ... 24
3.2 Methoden ... 31
3.2.1 Zellkultur ... 31
3.2.2 Virusisolation ... 31
3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR ... 32
3.2.4 Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR ... 35
3.2.5 Sequenzierung ... 36
3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch ... 37
3.2.7 Virus-Titer-Bestimmung ... 37
3.2.8 Immunofluorescence Assay (IFA) ... 39
3.2.9 Virusaufreinigung mittels Ultrazentrifugation ... 40
3.2.10 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ... 42
3.2.11 Elektronenmikroskopische Aufnahmen... 44
3.2.12 Isolation und Anzucht von Helicobacter hepaticus für den Doppelinfektionsversuch ... 44
3.2.13 Experimentelle Infektion der Mäuse mit MNV ... 45
3.2.14 Experimentelle Infektion der Mäuse mit Helicobacter hepaticus ... 45
3.2.15 Sterile Aufarbeitung des Mesenteriallymphknotens unter einer Werkbank ... 48
3.2.16 Vorbereitung und Verwendung der Zellkulturplatten für die Bestimmung von Interferon γ... 49
3.2.17 Bestimmung von Interferon γ im Lymphozytenzellkulturüberstand mit Hilfe eines ELISA ... 49
3.2.18 Anfertigung histologischer Präparate ... 50
3.2.19 Histologische Auswertung der Präparate ... 51
III
3.2.20 Statistische Auswertung ... 52
4 Ergebnisse ...53
4.1 Anzucht von MNV in der Zellkultur ... 53
4.2 Virus-Nachweis mittels PCR ... 53
4.3 Sequenzierung des Virus ... 56
4.4 Virusquantifizierung ... 58
4.5 Indirekte Antikörpernachweisverfahren ... 58
4.5.1 IFA ... 58
4.5.2 Antigenaufreinigung und ELISA ... 60
4.6 Elektronenmikroskopische Aufnahmen ... 66
4.7 Serologische Untersuchung von Anzeigertieren des zentralen Tierlaboratoriums auf MNV ... 68
4.8 Infekionsversuche ... 68
4.8.1 Klinik ... 70
4.8.2 Sektion ... 70
4.8.3 Serologie ... 70
4.8.4 Lymphozytenstimulation ... 71
4.8.5 PCR-Nachweis von MNV ... 78
4.8.6 PCR-Nachweis von Helicobacter hepaticus ... 79
4.8.7 Histologie ... 79
5 Diskussion ...84
5.1 Zellkultur und Quantifizierung ... 84
5.2 Sequenzierung ... 84
5.3 Nachweisverfahren ... 85
5.4 Prävalenz ... 89
5.5 MNV im Tierversuch ... 90
IV
5.6 Ausblick ... 91
6 Zusammenfassung ...93
7 Summary ...95
8 Anhang ...97
9 Literaturverzeichnis ...115
Abbildungsverzeichnis ...126
Tabellenverzeichnis ...129
Erklärung ...131
Danksagung ...132
V
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
BHI Brain-Heart-Infusion
BLAST Basic Local Alignment Search Tool bzw. beziehungsweise
CD Cluster of differentiation cDNA Complementary DNA
CED Chronisch entzündliche Darmerkrankung CPE Cytopathischer Effekt
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DNA Desoxyribonucleic Acid
EDTA Ethylendiamintetraacetat EL Charles-River-ELISA-Messung
ELISA Enzyme linked immune sorbent assay
FELASA Federation of Laboratory Animal Science Associations FKS L.E. Fetales Kälberserum low endotoxin
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
h Stunde
H. hepaticus Helicobacter hepaticus H.E. Hämatoxylin-Eosin
HPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase IFA Immunofluorescence Assay
IFNγ Interferon gamma IL Interleukin
kb Kilobasenpaare
l Liter
m männlich
MCMV Maus Cytomegalie Virus
MDA Melanoma-differentiation-associated gene MDR Multiple drug resistance
MEZ Mitteleuropäische Zeit
MFI Multiplex fluorescent immunoassay MHH Medizinische Hochschule Hannover
min Minute
ml Milliliter
MLK Mesenteriallymphknoten MNV Murines Norovirus
MNV-h Murines Norovirus/ Hannover1/2007/DEU MW Mittelwert
NCBI National Center for Biotechnology Information
VI NEA Nicht essentielle Aminosäuren
ng Nanogramm
NSR Nicht spezifische Reaktion OD Optical density
ORF Open reading frame p.i. post infectionem
PBS Phosphate buffered saline
PBSM Phosphate buffered saline ohne Mg2+- und Ca2+-Ionen PCR Polymerase Chain Reaction
pg Picogramm
RAG Recombination-activating gene RNA Ribonucleic Acid
RT Raumtemperatur
scid Severe combined immunodeficiency SD Standardabweichung
SEM Standard Error of the Mean
STAT Signal transducer and activator of transcription TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer
TCID Tissue culture infectious dose
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
Th T-Helfer
TJL The Jackson Laboratory TLR Toll-like receptor
TNF Tumornekrosefaktor
TRIS Trishydroxymethylaminomethan
U Umdrehung
v.a. vor allem
VK Variationskoeffizient
vs. versus
w weiblich
ZTL Zentrales Tierlaboratorium
1
1 Einleitung
Noroviren sind unbehüllte, sehr umweltresistente RNA-Viren und gehören zur Familie der Caliciviridae, in der sie ein eigenständiges Genus bilden. Sie wurden erstmals 1968 bei einem Ausbruch akuter Gastroenteritis an einer Schule in Norwalk/Ohio in den USA entdeckt (DOLIN et al. 1972) und werden für ca. 90% aller nicht-bakteriell bedingten epidemischen Gastroenteritiden beim Menschen verantwortlich gemacht.
Zu den animalen Noroviren gehören bovine, porzine und murine Noroviren. Bisher wurde keine Übertragung dieser Viren vom Tier auf den Menschen oder umgekehrt nachgewiesen.
Der erste Nachweis eines Norovirus bei der Maus wurde 2003 beschrieben (KARST et al. 2003). Infektionsexperimente mit diesem Virus, dem murinen Norovirus 1 (MNV-1), zeigen, dass Infektionsdauer und Krankheitsmanifestation vom Mausstamm beeinflusst werden (KARST et al. 2003; HSU et al. 2005; MUMPHREY et al. 2007). Seit der Erstbeschreibung von MNV-1 wurden viele weitere MNV- Stämme mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften isoliert (HSU et al. 2006;
THACKRAY et al. 2007). Untersuchungen in Nordamerika (HSU et al. 2005;
PRITCHETT-CORNING et al. 2009) und Westeuropa (MÜLLER et al. 2007;
MÄHLER u. KÖHL 2009) dokumentieren eine hohe Prävalenz von MNV-Infektionen bei Labormäusen. In der bis dato größten Studie (PRITCHETT-CORNING et al.
2009) wiesen 32,4% von 44.876 getesteten Serumproben MNV-spezifische Antikörper auf.
Die Bedeutung von murinen Noroviren als mögliche Einflussgröße für Tierexperimente ist gegenwärtig unklar und Untersuchungsziel verschiedener Forschergruppen. Ziel dieser Arbeit war es, ein murines Norovirusisolat zu charakterisieren, direkte und indirekte Nachweisverfahren für MNV zur Erfassung der Prävalenz in einer Labortierhaltung zu entwickeln, sowie den Einfluss des murinen Norovirus auf die Interleukin-10 (IL10) defiziente Maus - ein Tiermodell für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) (KÜHN et al. 1993) - zu untersuchen.
2
2 Literaturübersicht
2.1 Caliciviridae
Die Familie der Caliciviridae besteht aus kleinen (27 bis 40 nm) unbehüllten ikosaedrischen Viren. Ihr Genom ist eine lineare, positiv polare, einsträngige RNA.
Innerhalb der Familie Caliciviridae gibt es vier Genus: Norovirus, Sapovirus, Vesivirus und Lagovirus. Die am häufigsten auftretenden humanmedizinschen Krankheitserreger dieser Familie gehören zu den Noro- und Sapoviren, die eine akute Gastroenteritis hervorrufen. Diese sind auch bekannt als „Norwalk-like“ Viren;
erstmals wurde ein Krankheitsausbruch 1968 an einer Schule in Norwalk/Ohio in den USA beschrieben und weitergehend untersucht (DOLIN et al. 1972).
Wichtige veterinärmedizinische Erreger sind das feline Calicivirus (FCV, Vesivirus), das Atemwegserkrankungen bei der Katze hervorruft, und das Virus der hämorrhagischen Erkrankung beim Kaninchen, abgekürzt RHDV (rabbit hemorrhagic disease virus), das zu den Lagoviren gehört (FIELDS et al. 2007).
Noroviren bei Labornagern
Der erste Nachweis eines Norovirus bei der Maus wurde 2003 beschrieben (KARST et al. 2003). Weitere murine Noroviren mit der Bezeichnung MNV-2, MNV-3 und MNV-4 wurden 2006 isoliert (HSU et al. 2006) und charakterisiert (HSU et al. 2007).
Im gleichen Jahr wurden auch in Berlin drei neu Stämme isoliert und charakterisiert (MÜLLER et al. 2007). Thackray et al. vergleichen 2007 die Genome 21 neuer MNV- Isolate mit 5 bekannten und nehmen eine phylogenetische Einteilung in 15 Stämme vor (THACKRAY et al. 2007). Auch aktuell werden weitere Isolate publiziert (KIM et al. 2010). Bisher konnten keine Noroviren bei Ratten oder anderen Nagern nachgewiesen werden (HENDERSON 2008).
3 2.2 Genetik und Molekularbiologie von MNV
Das murine Norovirus besitzt ein lineares, positiv polares, einsträngiges RNA- Genom, das ungefähr 7,5 kb lang ist und drei offene Leseraster beinhaltet (ORF1, ORF2 und ORF3; Abbildung 1) (FIELDS et al. 2007). ORF1 kodiert ein Polyprotein, das durch eine 3C-ähnliche Protease endolytisch in mindestens sechs nicht- strukturelle Proteine gespalten wird (BLAKENEY et al. 2003). ORF2 kodiert das Haupt-Kapsid-Protein (Virales Protein 1). ORF 3 kodiert das virale Protein 2, das eine Rolle bei der Stabilität vom Kapsid-Protein spielt (HSU et al. 2006). Ein viertes offenes Leseraster, das sich mit ORF2 überlappt, wird von Thackray beschrieben (THACKRAY et al. 2007). Die verschiedenen murinen Noroviren weisen eine genetische Diversität von bis zu 13% auf (THACKRAY et al. 2007). Konservierte Bereiche werden in der „junction region“ zwischen ORF1 und ORF2 beschrieben (MÜLLER 2009).
Abbildung 1: Schema des MNV-Genoms; unterhalb der Leseraster sind die verschiedenen Proteinprodukte mit ihrem Gewicht in Kilodalton aufgeführt; N, N Terminus; 3A, NTPase 3A-like; P, Vpg Protease; RdRp, RNA dependent RNA Polymerase; VP1, VP2 Hauptkapsidproteine (HENDERSON 2008).
4
Das murine Norovirus ist unbehüllt, hat eine Größe von 28 - 35 nm und weist die typische äußere Kelchstruktur der Caliciviridae auf (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3) (KARST et al. 2003).
Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme von MNV-1 (markiert durch schwarze Pfeile) (HSU et al. 2005).
5 Abbildung 3: Dreidimensionale Rekonstruktion anhand cryoelektronen- mikroskopischer Aufnahmen von humanem Norovirus (NV, virus-like particles), murinem Norovirus (MNV) und dem Virus der hämorrhagischen Erkrankung beim Kaninchen (RHDV, virus-like particles) im Vergleich (KATPALLY et al. 2010).
2.3 MNV in der Zellkultur
Als erstes Virus des Genus Norovirus ist eine Anzucht von MNV in der Zellkultur möglich. Das murine Norovirus zeigt dabei einen Tropismus zu Makrophagen und dendritischen Zellen (WOBUS et al. 2004). Die Anzucht erfolgt in der Mausmakrophagen-Zelllinie RAW 264.7 (RASCHKE et al. 1978; WOBUS et al.
2004). Das Virus verursacht einen deutlichen cytopathischen Effekt (CPE). Eine
6
Virusquantifizierung erfolgt daher mittels Plaque-Test (WOBUS et al. 2004). Nicht alle isolierten MNV-Stämme weisen jedoch auszählbare Resultate im Plaque-Test auf. In diesen Fällen wird ein „tissue culture infectious dose“ (TCID)50-Test angewandt (MÜLLER et al. 2007; THACKRAY et al. 2007).
Durch Passagieren in der Zellkultur kann es zu einer Attenuierung von MNV kommen (WOBUS et al. 2004). In einem Fall ließ sich diese Attenuierung auf eine Aminosäurenveränderung auf Position 296 des Viruskapsid-Proteins zurückführen.
Wird die Veränderung rückgängig gemacht, erreicht der Erreger seine alte Virulenz im Infektionsversuch mit signal transducer and activator of transcription (STAT) 1- defizienten Mäusen (KARST et al. 2003; BAILEY et al. 2008). Die erfolgreiche Anzucht ermöglicht biochemische und molekulare Untersuchungen zum Zelleintritt und zur Replikation des murinen Norovirus. So untersuchten Perry et al. den Mechanismus des Zelleintritts von MNV1-Virionen, der im Gegensatz zu felinen Caliciviren keinen niedrigen pH-Wert im Endosom erfordert (PERRY et al. 2009;
PERRY u. WOBUS 2010). Ein niedriger pH-Wert löst bei felinen Caliciviren die Freisetzung des Virusgenoms in der Zelle aus (STUART u. BROWN 2006).
Gerondopoulos et al. untersuchten weitere Abhängigkeiten der Virusendozytose bei MNV-1 (GERONDOPOULOS et al. 2010). Elektronenmikroskopische Aufnahmen der Virusreplikation zeigen starke Veränderungen der Zellmorphologie. Unter Verlust eines intakten Golgi-Apparates werden intrazelluläre Membranen extensiv umgewandelt (WOBUS et al. 2004). Hyde et al. untersuchten die Virus-Replikation und spätere Proteinlokalisation in der Wirtszelle bei MNV-1 (HYDE et al. 2009; HYDE u. MACKENZIE 2010). Han et al. analysierten die in vitro RNA-Synthese-Aktivität der
„RNA dependent RNA Polymerase“ (HAN et al. 2010). Die virusbedingte Zellapoptose mit MNV infizierter Makrophagen erfolgt durch eine Aktivierung von Kaspase-9 und Kaspase-3. Außerdem wird die Expression von Survivin herunterreguliert (BOK et al. 2009).
7 2.4 Nachweisverfahren für MNV
MNV kann in der Zellkultur vermehrt und anschließend mittels Ultrazentrifugation per Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradient aufgereinigt werden. Es ergibt sich eine Bande auf der Höhe anderer Noroviren (Dichte 1,36 ± 0,04 g/cm³) (KARST et al. 2003). Aus der entnommenen Bande angefertigte elektronenmikroskopische Präparate zeigen Partikel mit der für Caliciviren typischen Struktur (KARST et al. 2003).
Das MNV-Genom kann mittels PCR nachgewiesen werden. Hierzu muss die Virus- RNA zuerst zu cDNA umgeschrieben werden. Dann erfolgt im zweiten Schritt eine Vervielfältigung der cDNA. Da Noroviren eine hohe Mutationsrate haben, ist ein Nachweis aller murinen Noroviren mit einem Primerpaar bisher nicht beschrieben.
Bisher werden mehrere Primerpaare für einen diagnostischen Nachweis herangezogen (HENDERSON 2008). Ein Nachweis ist beschrieben aus Milz, Leber, Mesenteriallymphknoten, Duodenum, Jejunum, Zäkum und Kotproben (HSU et al.
2005; MANUEL et al. 2008; GOTO et al. 2009). Dabei gelten Kot sowie Organe des Magen-Darm-Traktes, vor allem Zäkum und Mesenteriallymphknoten, als zuverlässige Nachweisorte für MNV (GOTO et al. 2009). Auch das „Poolen“ von mehreren MNV-negativen und einer MNV-positiven Kotprobe sowie das anschließende Lagern bei Raumtemperatur für 14 Tage führten zu einem positiven PCR-Ergebnis (MANUEL et al. 2008). Der PCR-Nachweis wird erschwert durch die variable Ausscheidungsdauer von MNV je nach Virusstamm und infiziertem Mausstamm (HSU et al. 2006).
Von der Maus gegen MNV gebildete Antikörper können mit serologischen Tests nachgewiesen werden. Hsu et al. stellten eine Kreuzreaktivität bei Antikörpern gegen MNV-1, MNV-2, MNV-3 und MNV-4 fest (HSU et al. 2006). Die Antikörper richten sich dabei gegen das Viruskapsid (CHACHU et al. 2008). Die Kreuzreaktivität ermöglicht die Anwendung serologischer Testverfahren wie multiplex fluorescent immunoassay (MFI), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und immunofluorescence assay (IFA) (HSU et al. 2005). Murine Noroviren sind
8
Bestandteil einer einzigen Genogruppe und weisen einen Serotyp auf (THACKRAY et al. 2007).
2.5 MNV-Prävalenz in Versuchstierhaltungen
Die Prävalenz von MNV in Labortierhaltungen in den USA und Kanada wurde 2005 anhand von 12639 Serumproben untersucht. Hierbei ergab sich eine Prävalenzrate von 22,1% (HSU et al. 2005). Eine von Januar 2007 bis Juni 2008 durchgeführte Erhebung bei Mäuseseren aus westeuropäischen Labortierhaltungen ergab für MNV eine Prävalenzrate von 31,8% (MÄHLER u. KÖHL 2009). Die bisher größte Studie ergab eine Prävalenzrate von 32,4% bei 44876 auf MNV getesteten Mäuseseren, die aus Versuchstierhaltungen in Nordamerika und Europa stammten (PRITCHETT- CORNING et al. 2009). Eine koreanische Studie zeigte eine 36,5 prozentige serologische Prävalenz für MNV bei gentechnisch veränderten Mäusen (YEOM et al.
2009). Goto et al. untersuchten Maus-Zäkum-Proben von verschiedenen Labortierhaltungen per PCR auf ein Vorhandensein von MNV und ermittelten dabei eine Prävalenzrate von 13,1% (GOTO et al. 2009).
2.6 Erfassung und Bekämpfung von MNV in der Labortierhaltung
Der Einsatz von Anzeiger-Mäusen zur MNV-Erfassung im Experiment wird in zwei Studien erläutert. Bei Manuel et al. waren 80% der Anzeiger-Mäuse positiv für MNV im PCR-Nachweis, nachdem sie Kontakt zur Einstreu von mit MNV infizierten Mäusen hatten (MANUEL et al. 2008). Eine gegensätzliche Beobachtung schildern Compton et al. Hier kam es keineswegs immer zu einer MNV-Infektion nach Haltung von Anzeiger-Mäusen auf der Einstreu von MNV-infizierten Mäusen (COMPTON et al. 2010).
Die Sanierung eines Haltungsbereichs, in dem Mäuse mit MNV infiziert waren, gelang nur durch Keulen aller Tiere und anschließende Raumdesinfektion vor der Neubesiedlung. Eine Testung und Entfernung positiver Tiere allein war nicht erfolgreich (KASTENMAYER et al. 2008; GOTO et al. 2009). Eine Infektion neugeborener Mäuse von MNV-positiven Muttertieren konnte durch Transfer der
9 Säuglinge auf MNV-freie Ammen („cross fostering“) in den ersten 24 Stunden nach der Geburt verhindert werden (ARTWOHL et al. 2008; COMPTON 2008). Eine andere Studie hatte weniger Erfolg bei der Sanierung von gentechnisch manipulierten Mäusen durch „cross fostering“ (YEOM et al. 2009). Embryotransfer und Hysterektomie wurden ebenfalls als erfolgreiche Eradikationsmethoden beschrieben (PERDUE et al. 2007; GOTO et al. 2009).
2.7 Infektionsverlauf
Die Infektion mit MNV unterscheidet sich in Dauer und klinischer Symptomatik je nach infiziertem Mausstamm als auch dem für die Infektion verantwortlichen Norovirusstamm (WOBUS et al. 2004; MUMPHREY et al. 2007; THACKRAY et al.
2007; KELMENSON et al. 2009). Je nach Virusstamm und infiziertem Mäusestamm kann es zu einer persistenten Infektion oder verlängerten Ausscheidung über den Kot kommen (HSU et al. 2006). Bei immunkompetenten 129S6 Mäusen wurde eine Infektionsdauer mit MNV-1 von 7-14 Tagen festgestellt. Bei immunkompetenten Hsd:ICR Mäusen dauerte die Infektion 5 Wochen und länger. Die Infektion ging nicht mit klinischen Symptomen einher (KARST et al. 2003; HSU et al. 2005). Bei bestimmten immundefizienten Mausstämmen [Interferon (INF)-αβγ Rezeptor- Defizienz und STAT1-Defizienz] konnte die Infektion jedoch zu tödlichen systemischen Erkrankungen wie Enzephalitis, Vaskulitis, Meningitis, Hepatitis und Pneumonie führen. Bei anderen immundefizienten Mausstämmen [Recombination- activating gene (RAG)1- und RAG2-Defzienz] persistierte die Infektion länger als 90 Tage ohne jegliche Krankheitssymptome (KARST et al. 2003).
2.8 Untersuchungen zum Einfluss von MNV auf bestimmte Mausstämme und Tiermodelle
- Ward et al. erforschten die Pathologie natürlich vorkommender MNV-Infektionen bei 28 immundefizienten Mäusen verschiedener Genotypen in zwei verschiedenen Maushaltungen. In der einen Haltung stellten sie bei Tieren mit verschiedenen kombinierten genetischen Defekten Hepatitis, Peritonitis oder Pneumonie anhand histologischer Veränderungen fest. Diese kombinierten
10
genetischen Defekte betrafen das RAG1, den IFNγ-Rezeptor, OT-1, OT-2 und STAT1. RAG2-defiziente Mäuse aus der zweiten Maushaltung waren histologisch unauffällig. Bei ihnen wurde MNV jedoch per PCR im Mesenteriallymphknoten nachgewiesen (WARD et al. 2006).
- Wobus et al. stellten eine STAT1-abhängige Interferon-Immunantwort im Zellkultur- und Infektionsversuch fest (WOBUS et al. 2004). Mumphrey et al.
infizierten im Folgeversuch Wildtyp- und STAT1-defiziente Mäuse. Verwandt wurden zwei verschiedene MNV-Isolate, eines davon war attenuiert.
Neugeborene Wildtyp-Mäuse zeigten weder Diarrhoe noch Gewichtsverlust. Bei den STAT1-defizienten Mäusen kam es zu einem Gewichtsverlust. Außerdem wurden milde histologische Veränderungen in Darm und Milz erfasst. Das Virus wurde in Milz, Leber, Lunge und Lymphknoten nachgewiesen; in der Milz konnte MNV dauerhaft bis Versuchsende nachgewiesen werden, was für eine persistente Infektion spricht (MUMPHREY et al. 2007).
- Chachu et al. beobachteten einen längeren Verlauf einer MNV-Infektion bei B- Zell-defizienten Mäusen. Außerdem versahen sie RAG1-defiziente Mäuse mit Splenozyten von B-Zell defizienten Mäusen. Dies führte nicht zu einer Virusclearance. Die Gabe von polyklonalem Anti-MNV-Serum oder monoklonalen Antikörpern verringerte den systemischen und luminalen Virusgehalt (CHACHU et al. 2008).
- Lencioni et al. untersuchten den Einfluss von MNV-4 auf die multiple drug resistance 1α (MDR1α) defiziente Maus, ein Tiermodell für CED. Die Infektion mit MNV-4 und anschließender Verabreichung von Helicobacter (H.) bilis 7 Tage danach führte hierbei zu größerem Gewichtsverlust und höhergradigen histologischen Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe, die nur mit H. bilis infiziert wurde. Eine alleinige MNV-4-Infektion führte zu erhöhten Serum- Biomarkern. Mittels Durchflusszytometrie wurden außerdem Veränderungen bei dendritischen Zellen (CD11c+) und anderen nicht T-Zell (CD4- CD8-)
11 Populationen ermittelt. Dendritische Zellen, gewonnen aus MNV-4-infizierten Mäusen, sorgten für eine höhere IFNγ-Sekretion bei polyklonalen T-Zellen im in vitro-Versuch an Tag 2 p.i. Zu späteren Messzeitpunkten wurde keine höhere IFNγ-Sekretion gemessen. Die akute Infektion mit MNV-4 förderte die Antigen- Präsentation dendritischer Zellen und wirkte sich immunmodulatorisch auf den Krankheitsverlauf aus. Es wurden keine klinische Symptome bei Mäusen beobachtet, die nur mit MNV-4 infiziert waren (LENCIONI et al. 2008).
- McCartney et al. untersuchten den Einfluss von MNV auf melanoma- differentiation-associated gene (MDA)5- und toll-like receptor (TLR)3-defiziente Mäuse sowie dendritische Zellen mit dem jeweiligen Defekt. Sowohl bei MDA5- defizienten Mäusen als auch bei MDA5-defizienten dendritischen Zellen wurde ein höherer Virustiter im Vergleich zum Wildtyp durch einen Plaquetest ermittelt.
TLR3-defiziente dendritische Zellen hatten keinen höheren Virustiter im in vitro- Versuch, TLR3-defiziente Mäuse wiesen jedoch einen leicht erhöhten Virustiter auf. MDA5-defiziente Mäuse eliminierten die MNV-Infektion vollständig (MCCARTNEY et al. 2008).
- Doom et al. zeigten, dass MNV kaum Einfluss auf die experimentelle Infektion mit dem Cytomegalievirus der Maus (MCMV) hat. Lediglich die CD8 T-Zell-Antwort wurde in der akuten Phase der Infektion geringgradig herabgesetzt. Eine MNV- Infektion führte nicht zu einem Wiederaufblühen einer latenten MCMV-Infektion (DOOM et al. 2009).
- Hensley et al. stellten keinen Einfluss von MNV auf die adaptive Immunität gegen das Vaccinia oder Influenza A Virus bei C57BL/6 Wildtyp Mäusen fest (HENSLEY et al. 2009).
- Compton et al. erforschten den Einfluss von MNV auf die Ausscheidung von Maus Parvovirus (MPV). Eine MNV-Infektion verlängerte die Ausscheidungsdauer von MPV über den Kot und erhöhte den MPV-DNA-Spiegel in Organen von
12
BALB/c-Mäusen. Die Serokonversion für MPV erfolgte bei einer Doppelinfektion von BALB/c-Mäusen innerhalb kürzerer Zeit. Außerdem konnte bei Anzeiger- Mäusen, die Kontakt mit der Einstreu MNV-infizierter Tiere hatten, nicht in jedem Fall eine Serokonversion für MNV festgestellt werden (COMPTON et al. 2010).
- Paik et al. stellten keinen Einfluss von MNV auf ernährungsbedingte Fettleibigkeit und Insulinresistenz bei C57BL/6 Wildtyp Mäusen fest. Bei diesen Mäusen war vor der Infektion durch eine extrem fettreiche Diät eine Insulinresistenz herbeigeführt worden (PAIK et al. 2010).
2.9 Weitere Forschung mit murinen Noroviren
Da das murine Norovirus in der Zellkultur anzüchtbar ist, wird es als Ersatz für das humane Norovirus im Rahmen der Effektivitätsuntersuchung von Desinfektions- techniken und -mitteln verwendet (BAERT et al. 2008; PARK et al. 2010). Auch für die Erfassung sowie Reduktion des Eintrags von Noroviren in die Lebensmittelkette über Muscheln, Fisch, Salat und Gemüse wird MNV als Surrogatmarker eingesetzt (WEI et al. 2010, 2011).
2.10 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED)
CED sind charakterisiert durch rezidivierende oder kontinuierliche Entzündungen des Intestinaltraktes (BAUMGART u. CARDING 2007; BAUMGART u. SANDBORN 2007). Zu den häufigsten CED beim Menschen gehören Morbus Crohn und Colitis ulcerosa (FARROKHYAR et al. 2001). Morbus Crohn ist durch eine transmurale Entzündung verschiedener Segmente des Gastrointestinaltraktes mit diskontinuierlicher Ausbreitung und episodischer Progression gekennzeichnet.
Hierbei können Strikturen, Abszesse und Fisteln als Komplikation auftreten (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Colitis ulcerosa weist eine Entzündung der Mukosa und oberflächlichen Submukosa des Kolons auf, die schubweise voranschreitet und sich kontinuierlich nach oral ausbreitet. Typische Symptome für beide Erkrankungen sind blutige bis wässrige Durchfälle, Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Fieber (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Die Äthiopathogenese
13 der CED ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Es gibt deutliche Hinweise, dass durch eine Kombination von immunologischen und umweltbedingten Faktoren eine unkontrollierte Immunantwort innerhalb des Darms ausgelöst wird, die in einem genetisch prädisponierten Individuum zu einer chronischen Entzündung führt (TORRES u. RIOS 2008).
Tiermodelle, zum Beispiel für CED, ermöglichen es, störende Umwelteinflüsse durch standardisierte Haltungsbedingungen zu kontrollieren. Durch den Einsatz von Inzuchtstämmen können Studien an genetisch homogenen Populationen durchgeführt werden. Techniken der Transgenese und der gerichteten Mutagenese stehen zur Verfügung, um das Genom der Tiere gentechnisch zu verändern. Seit Anfang der 90er Jahre werden zahlreiche Tiermodelle, v.a. Mausmodelle, für CED beschrieben, die klinische und histopathologische Analogien zum Morbus Crohn oder zur Colitis ulcerosa aufweisen.
Einige Tiermodelle für CED - spontan:
SAMP1/Yit-Maus (MATSUMOTO et al. 1998) - durch Chemikalien induziert:
Dextran Natriumsulfat (OKAYASU et al. 1990) Trinitrobenzolsulfonsäure (ELSON et al. 1996) Oxazolon (BOIRIVANT et al. 1998)
- durch Zelltransfer:
CD4+/CD45RBhigh-Zellen in Prkdcscid-Mäuse (POWRIE et al. 1993)
Knochenmarkszellen in CD3ε transgene Mäuse (HOLLANDER et al. 1995)
- durch genetische Manipulation:
IL2-defiziente Maus (SADLACK et al. 1993) IL10-defiziente Maus (KÜHN et al. 1993)
MDR1α-defiziente Maus (PANWALA et al. 1998)
14
SMAD3-defiziente Maus (YANG et al. 1999)
Verschiedene Tiermodelle für CED werden durch Umweltfaktoren beeinflusst.
Besonders die Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora sowie spezifische Keime haben starken Einfluss (siehe Tabelle 1). Der genetische Hintergrundstamm der Merkmalsträger kann sich ebenfalls auf den Verlauf der CED auswirken (siehe Tabelle 2).
Tabelle 1: Interaktion verschiedener Umweltfaktoren auf das CED-Modell der IL10- defizienten Maus
Umweltfaktor Auswirkung Referenz
Haltung unter keimfreien
Bedingungen Keine Kolitis (SELLON et al. 1998) Haltung unter keimarmen
Bedingungen bzw. nach Antibiotikagabe
Reduktion der Kolitissymptome
(KÜHN et al. 1993; MADSEN et al.
2000) Keim
Lactobacillus spp. Protektiv (MADSEN et al. 1999; SCHULTZ u.
SARTOR 2000) Keim
Enterococcus faecalis Proinflammatorisch (BALISH u. WARNER 2002) Keim
Helicobacter spp. Proinflammatorisch (CAHILL et al. 1997; KULLBERG et al.
1998; BURICH et al. 2001)
Tabelle 2: Ausprägung der Kolitis bei IL10-defizienten Inzuchtstämmen Hintergrundstamm Schwere und Verlauf der
Kolitis Referenz
C57BL/6J Mild, protrahiert
(BERG et al. 1996; TAKEDA et al. 1999; BRISTOL et al.
2000)
BALB/c Intermediär, progressiv (BERG et al. 1996)
NOD/Lt Intermediär, progressiv (MÄHLER u. LEITER 2002) NOD.NON-H2nb1 Intermediär, progressiv (MÄHLER u. LEITER 2002)
129/SvEv Schwer, progressiv (TAKEDA et al. 1999)
C3H/HeJBir Schwer, beginnt sehr früh (BRISTOL et al. 2000) C3H.SW Schwer, beginnt sehr früh (MÄHLER u. LEITER 2002)
15 2.11 Die Interleukin-10 defiziente Maus
Die IL10-defiziente Maus (formal: Il10tm1Cgn; abgekürzt Il10-/-) wurde 1993 am Institut für Genetik der Universität Köln durch gezielte Mutation entwickelt (KÜHN et al.
1993). Ein Teil des ersten Exons des IL10-Gens (Codon 5-55) wurde mit Hilfe homologer Rekombination durch ein Stopcodon und ein neo-Gen (Neomycin exprimierend) ersetzt. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Exon 3 des Gens eingefügt. Mäuse mit dieser Nullmutation entwickeln nach dem Absetzen eine spontane Form der CED. Der Entzündungsprozess kann sich über den gesamten Intestinaltrakt erstrecken. Er tritt dabei segmental, teilweise transmural auf.
Histologisch ist diese Enterokolitis durch Entzündungszellinfiltrate in der Lamina propria und der Submukosa, Erosionen und Ulzerationen der Mukosa, Schleimhauthyperplasie, eine abnorme Kryptarchitektur, Becherzelldepletionen sowie Kryptabszesse gekennzeichnet (KÜHN et al. 1993; LÖHLER et al. 1995;
BERG et al. 1996). Im Spätstadium der Erkrankung können kolorektale Tumoren auftreten (BERG et al. 1996). Da bei IL10-defizienten Mäusen außer dem Intestinaltrakt keine weiteren Organsysteme entzündlich verändert sind, eignet sich dieses Tiermodell besonders für Studien bezüglich der CED. Daher wurde es auch an der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) bereits häufig untersucht und für CED-Studien eingesetzt (MOST 2001; BLEICH 2003; BÜCHLER 2010).
IL10 ist ein regulatorisches Zytokin, welches von zahlreichen Immunzellen, wie Makrophagen, dendritischen Zellen und T-Zellen produziert wird. Innerhalb der T- Zellen sezernieren fast alle Untergruppen IL10, inklusive Th1-, Th2- und regulatorischen T-Zellen (MURRAY 2006). Neben Immunzellen sind auch Epithelzellen und Keratinozyten in der Lage, IL10 freizusetzen. IL10 unterdrückt die Effektorfunktion von Th1/Th17-Zellen, Natürlichen Killerzellen und Makrophagen. Es moduliert die zelluläre Immunreaktion (MOORE et al. 1993). Diese modulierenden Effekte bleiben bei IL10-defizienten Mäusen aus. Ihr Immunsystem reagiert gegenüber luminalen Antigenen bzw. der intestinalen Bakterienflora mit einer überschießenden Immunantwort (siehe Abbildung 4) (BERG et al. 1996). Eine Analyse von konditionalen Knockout-Mäusen, bei denen IL10 nur in T-Zellen
16
inaktiviert wurde, zeigte eine vergleichbare Kolitis wie bei IL10-defizienten Mäusen (ROERS et al. 2004). Das von T-Zellen produzierte IL10 ist also essentiell für die Verhinderung einer spontanen CED in diesem Tiermodell. Vermutlich nehmen die IL23-Th17-Achse und die von Th17-Zellen produzierten Zytokine wie IL17, IL21, IL22, Tumornekrosefaktor (TNF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) und IL6 eine wichtige Funktion bei der Entzündungsreaktion ein (YEN et al. 2006).
Abbildung 4: Pathogenese der CED bei IL10-defizienten Mäusen, modifiziert nach Powrie (POWRIE 1995) und Elson (ELSON 1999).
17 2.12 Ziele dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es, das bereits isolierte murine Norovirus zu charakterisieren.
Das Virus sollte mit gebräuchlichen Methoden quantifiziert werden. Zusätzlich sollte eine serologische Diagnostik in Form eines ELISA aufgebaut werden. Mit Hilfe serologischer Testverfahren sollte die Prävalenz für MNV in einer Labortierhaltung - dem Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) – ermittelt werden.
Nach der Charakterisierung sollten dann Infektionsversuche durchgeführt werden, die den Einfluss von MNV auf die IL10-defiziente Maus - ein Tiermodell für CED (KÜHN et al. 1993) - erfassen.
18
3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material
Die Durchführung der Versuche wurde mit den Bescheiden vom 13.03.2008 und 10.04.2008 durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit mit den Aktenzeichen 08/1443 und 08/1467 genehmigt.
3.1.1 Mäuse
In der Zeit vom 2.4.2008 bis 6.5.2009 wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Mäuseinzucht- und Defektmutantenstämme für den Infektionsversuch mit dem murinen Norovirus Stamm Hannover eingesetzt. Im Weiteren werden für eine übersichtlichere Gestaltung nur noch die entsprechenden Abkürzungen für die Mausstämme benutzt.
Tabelle 3: Verwendete Mausstämme und ihre Abkürzung
Stammbezeichnung Knockout/
Wildtyp Abkürzung
C3H/HeJBirZtm Wildtyp C3-wt
C57BL/6JZtm Wildtyp B6-wt
C3Bir.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm Knockout C3-Il10-/- B6.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm Knockout B6-Il10-/- 3.1.2 Herkunft
Alle im Experiment eingesetzten Mäuse stammten aus Zuchten des ZTL der MHH.
Sie wurden dort regelmäßigen, mikrobiologischen Kontrolluntersuchungen entsprechend den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) unterzogen (NICKLAS et al. 2002). Die Versuchstiere entstammten aus Haltungsbereichen, die frei von bakteriellen, viralen (inklusive MNV) und parasitären Infektionserregern gemäß der Empfehlungsliste der FELASA waren.
19 3.1.3 Haltung im Experiment
Die experimentell infizierten Mäuse wurden im S2-Bereich des ZTL der MHH in einem belüfteten Käfigregalschrank (Scantainer) gehalten. Es wurden jeweils 1-5 Mäuse in Makrolon-Käfigen des Typs II oder III mit Filterdeckeln getrenntgeschlechtlich gehalten. Die Kontrolltiere wurden bis auf 5 Tiere in der Haltungsabteilung belassen, um eine mögliche Kontamination mit MNV zu vermeiden. Die 5 Kontrolltiere, die gesondert mit im Käfigregalschrank saßen, wurden daher zuerst umgesetzt und versorgt. Futter (Tabelle 4) und autoklaviertes Trinkwasser (über Tränkeflaschen) wurden ad libitum angeboten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal in der Woche erneuert. Die Reinigung der Käfige erfolgte routinemäßig. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2° C, die relative Luftfeuchte lag bei 55 ± 5%. Der Hell-Dunkel-Zyklus wurde automatisch geregelt; es herrschte ein Lichtrhythmus von 14 Stunden Helligkeit zu 10 Stunden Dunkelheit, wobei die Hellphase von 7 bis 21 Uhr mitteleuropäischer Zeit (MEZ) dauerte.
Tabelle 4: Zusammensetzung von Altromin 1324 TPF Inhaltsstoffe Prozent %
Rohprotein 19,0
Rohfett 4,0
Rohfaser 6,0
Rohasche 7,0
Kalzium 0,9
Phosphor 0,7
Zusatzstoffe je Kilogramm
Vitamin A 15000 I.E.
Vitamin D3 600 I.E.
Vitamin E 75 mg
Vitamin C 36 mg
Kupfer 5 mg
20
Verwendete Lösungen
Alle verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, über die Firma Carl Roth in Karlsruhe bezogen.
Phosphate buffered saline (PBS) (pH = 7,2)
Menge
NaCl (Natriumchlorid) 8,00 g
KCl (Kaliumchlorid) 0,20 g
Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) 1,15 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 0,20 g
Aqua bidest. 1,0 l
CaCl2 (Calciumchlorid) 0,10 g
MgCl2 x 6 H2O (Magnesiumchlorid –
Hexahydrat) 0,10 g
PBS Tween (pH = 7,4)
Menge
NaCl (Natriumchlorid) 8,00 g
KCl (Kaliumchlorid) 0,20 g
Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) 2,90 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 0,20 g
Aqua bidest. 1,0 l
Tween 20 0,5 ml
PBSM (pH = 7,2)
Menge
NaCl (Natriumchlorid) 8,00 g
KCl (Kaliumchlorid) 0,20 g
Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) 1,15 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 0,20 g
Aqua bidest. 800 ml
Evan´s Blue
Menge
Evans blue 5 mg
Glycerin 200 ml
Aqua bidest. 800 ml
21 Coating Buffer (ph = 9,6)
Menge Na2CO3 (Natriumcarbonat, wasserfrei) 1,59 g NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat) 2,93 g
Aqua bidest. 1,0 l
Konjugate
Hersteller/
Artikelnummer Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-FITC Sigma / Art. F 0257 Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Peroxidase Sigma / Art. A 4416 10x TBE-Puffer
Menge
TRIS 108 g
Borsäure 53,4 g
EDTA 7,4 g
Aqua bidest. ad 1 l
1x TBE-Puffer
Menge
10x TBE-Puffer 100 ml
Aqua bidest. 900 ml
Orange G-Ladepuffer
Menge
Orange G (Sigma) 0,05 g
Glycerin 99% 30 ml
Aqua bidest. 70 ml
RAW-Medium
Pro Flasche Menge
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium (DMEM) 22 ml Fetales Kälberserum (FKS) Ultra Low Endotoxin (L.E.) 2,5 ml
Penicillin-Streptomycin 0,5 ml
22
Anti-mCD3
Menge
PBS 10 ml
Anti-mCD3 (145-2C11) 1 µg/µl 50 µl Lymphozyten-Medium
Menge
RPMI 1640 500 ml
FKS Ultra Low Endotoxin 25 ml
NEA (nicht essentielle Aminosäuren) 5 ml
L-Glutamin 5 ml
2-Mercaptoethanol 0,5 ml
Pyruvat 5 ml
Penicillin-Streptomycin 5 ml
Neutrales Formalin nach Sörensen (10%ig)
Puffer A Menge
Kaliumhydrogenphosphat 13,6 g
Aqua bidest. 1 l
Puffer B
Kaliumhydrogenphosphat 17,7 g
Aqua bidest. 1 l
Puffer A 352,8 ml
Puffer B 547,2 ml
35 – 37% Formalin 100 ml
3.1.4 Synthetische Oligonukleotide
Für die Umschreibung der MNV-RNA in cDNA wurden Oligo(dT)18 und Random Hexamer Primer der Firma Fermentas vergleichend eingesetzt.
Die zur Detektion und Sequenzierung verwendeten Primer wurden von der Firma Sigma Aldrich bezogen.
Tabelle 5: Primer zur Detektion von MNV Sequenz von 5´ nach 3´
5205f AATTGACCCCTGGATCTTCC 5388r GACCAGCTGAACCTCCATGT 5469r AGTGGTGAGTGACCCTTTGG
23 Fortsetzung Tabelle 5
5473f CAGATCACATGCTTCCCAC 5659r AGACCACAAAAGACTCATCAC 5580f GGAGGAATCTATGCGCCTGG 5671r GAAGGCGGCCAGAGACCAC 4972f CACGCCACCGATCTGTTCTG 5580r GCGCTGCGCCATCACTC 5004f TTTGGAACAATGGATGCTGA 5219r ATCCAGGGGTCAATTTGGTT 5277r GGTGTTTCGAGGTGAAATGG Tabelle 6: Primer zur Klonierung von MNV
Sequenz von 5´ nach 3´
Noro Hannover for 1 GTGAAATGAGGATGGCAACG Noro Hannover rev 1 GTGATGACATCTGTGGCCAT Noro Hannover for 2 ATGGCCACAGATGTCATCAC Noro Hannover rev 2 GGAAGCATGTGATCTGAGCA Noro Hannover for 3 TGCTCAGATCACATGCTTCC
Noro Hannover rev 3 GCCAACGACCGGGAGGCCAGCTTTTTTTTTTTTTTTV Tabelle 7: Primer zur Sequenzierung von MNV
Sequenz von 5´ nach 3´
Norosense 1 CCGATCAAGAACCTACTGGCA
Noroantisense 1 AATCATCCCAGAGAACCACC
Norosense 2 ACTTCACCAATGCCGTTA
Noroantisense 2 CAAACTGGTCACCGACTATC
Norosense 3 TTCCTTCCAAGATGAGCTCC
Noroantisense 3 CCCTGAGTAAGACACAGCAA
Norosense 1 CCGATCAAGAACCTACTGGCA
Noroantisense 1 AATCATCCCAGAGAACCACC
Tabelle 8: Primer zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA Sequenz von 5´ nach 3´
RPS9f TGACGTTGGCGGATGAGCACA RPS9r TTTTTGACAGGGGGAGTGG
Hierbei wurde das Housekeeping Gen RPS-9 nachgewiesen.
24
Tabelle 9: Primer zur Detektion von Helicobacter (H.) hepaticus Sequenz von 5´ nach 3´
H276f CTATGACGGGTATCCGGC H676r ATTCCACCTACCTCTCCCA B38 GCATTTGAAACTGTTACTCTG B39 CTGTTTTCAAGCTCCCCGAAG 3.1.5 Zelllinie
Zur Anzucht von MNV wurden RAW 264.7 Zellen verwendet (ATCC TIB-71™). Es handelt sich hierbei um eine Mausmakrophagenzelllinie, die vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde. Die Zelllinie wurde von der Firma QM Diagnostics (Nimwegen, Niederlande) per PCR negativ auf Mycoplasmen getestet.
3.1.6 Eingesetzter Virusstamm
Der im Experiment eingesetzte Virusstamm wurde aus NOD-Prkdcscid-Mäusen des ZTL der MHH isoliert und nach genetischer Charakterisierung als Murines Norovirus/Hannover1/2007/DEU (MNV-h) bezeichnet.
3.1.7 Eingesetzter Bakterienstamm
Der im Experiment eingesetzte Bakterienstamm H. hepaticus wurde im ZTL der MHH von Mitarbeitern des mikrobiologischen Labors im Rahmen der wissenschaftlichen Arbeit von Frau Büchler isoliert und angezüchtet (BÜCHLER 2010).
3.1.8 Materialliste Vorversuche
Zellkultur
Zelllinie RAW 264.7, DKFZ Heidelberg, Deutschland
Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland
Sicherheitswerkbank MSC 1.8, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Zellkultur-Flaschen 75 cm² Vented Cap, Straight Neck, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
25 Zellschaber Cell Scraper, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland
Medium DMEM High Glucose 4,5 g/l, L-Glutamin, 500 ml, PAA, Parching, Österreich Antibiotikum Penicillin (5000IU/ml) Streptomycin 5000 µg/ml, MP Biomedicals, Eschwege, Deutschland
Fetales Kälberserum Ultra Low Endotoxin, PAA, Parching, Österreich
Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Glas-Gewindeflaschen mit flachem Boden und Deckel, Omnilab, Bremen, Deutschland
Gefrierschrank Premium No-Frost, Liebherr, Biberach an der Riss, Deutschland -80° C Truhe 6385, GFL, Großburgwedel, Deutschland
Identifizierung, Sequenzierung
Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland
Primer Fermentas, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland PTC Thermocycler-200TM, MJ Research, Watertown, MA, USA
Phusion™ Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase, Finnzymes, Maahantuonti, Finnland
Stratagene StrataClone PCR Cloning Kit, Agilent, La Jolla, CA, USA QIAprep Spin Miniprep Kit (50), Qiagen, Hilden, Deutschland
Sequenzierung: MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland Software zur Analyse der Sequenz:
DNA Dynamo, Blue Tractor Software, North Wales, UK BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Nachweisverfahren IFA
Wasserbad 1008, GFL, Großburgwedel, Deutschland
Objektträger Cel-Line Diagnostic Microscope Slides 8 Well 8mm, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland
PBS PBSM
26
Diluter Microlab 500, Hamilton-Robotics, Martinsried, Deutschland
Antikörper Anti Mouse IGG-FITC F0257, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Evans Blue, Fluka, Buchs, Schweiz
Fluoreszenzmikroskop DM2000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland Lichtquelle EL6000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland
ELISA
Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ultrazentrifuge L7, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland
Ultrazentrifugenrotor SW 28, SW 32, SW 55, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland
Bechereinsätze Centrifuge Tubes Polyallomer 32683; 326819 (SW55), Beckman- Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland
Sucrose analytical grade, Serva, Heidelberg, Deutschland Waage LA 2200S, Sartorius, Göttingen
Waage ALJ 120-4, Kern und Sohn, Balingen-Frommern, Deutschland PBSM
Coating Buffer
Immuno-Modules U8 Maxisorp 475078, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland
Multikanal-Pipette Eppendorf, Hamburg, Deutschland Washer Columbus Pro, Tecan, Männedorf, Schweiz PBS Tween
Zweitantikörper Anti Mouse IGG Peroxidase, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland ABTS-Substrat Tablets 11 112 422 001, Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland Photometer Sunrise, Tecan, Männedorf, Schweiz
Laptop Inspiron 6000, Dell Deutschland, Frankfurt, Deutschland Software Magellan 5.03, Tecan, Männedorf, Schweiz
PCR-Nachweis
Für die RNA-Isolierung: Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren, Deutschland
27 Für die DNA-Isolierung: PSP® Spin Stool DNA Kit, Invitek, Berlin, Deutschland
Photometer Nanodrop 1000, Peqlab, Erlangen, Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland
REDExtract-N-AmpTM PCR ReadyMix, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Taq PCR Core-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland
Primer, Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Primer, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
DNA-Leiter, Biozym Art.-Nr.: 850321 (50321), Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf PTC Thermocycler-200TM, MJ Research, Watertown, MA, USA
Magnetrührer L81, Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland Agarose LE Agarose, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf
DNA-Farbstoff Gelstar Nucleic Acid Gel Stain, Lonza, Basel, Schweiz 10x TBE
Orange G Ladepuffer, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Gelschlitten, Gelkammer Eigenkonstruktion der MHH, Hannover, Deutschland Gleichstromgerät, Omnilab, Bremen, Deutschland
UV-Transilluminator, PC+Kamera, INTAS, Göttingen, Deutschland
Virusquantifizierung
Mikroskop, Zeiss, Jena, Deutschland
Neubauer-Zählkammer 0,1mm Tiefe; 0,0025mm² Fläche, Brand, Wertheim, Deutschland
Kristallviolett-Indikator, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Plaque-Test
Platten Multi Dish 6 Well 140675, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland
Agarose SeaPlaque, Lonza, Basel, Schweiz TCID50-Test
96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland
28
Elektronenmikroskopische Darstellung
Tischultrazentrifuge Airfuge® im Institut für Virologie der MHH, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland
Elektronenmikroskop Elektronenmikroskopie-Labor MHH, Tecnai 20, FEI Europe;
Eindhoven, Niederlande
Hauptversuche Infektionsversuche
Sicherheitswerkbank Klasse II, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ventilierter Haltungsschrank, Scantainer, Scanbur Technology, Karlslunde, Dänemark
Mini-Isolator „Gnotocage“ (Deckel: Eigenkonstruktion der technischen Werkstatt der MHH; Unterbau: Multifunktionstopf Nalgene DS5300-9212), Hannover, Deutschland bzw. Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland
Filterdeckelkäfige Typ II, III, UNO, Roestvaststaal BV, Niederlande
Futter, pelletiertes Altromin© 1324 total pathogen free (TPF) Haltungsfutter, Altromin, Lage, Deutschland
Autoklaviertes Trinkwasser
Einstreu, Weichholzgranulat, Fichten- und Tannenholz, Hahn & Co, Bredenbeck- Kronsburg, Deutschland
Spritze, Spritzenkolben, Knopfkanüle/Braunüle zur Gavage, Braun, Melsungen, Deutschland
Histocassetten, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Lymphozytenstimulation
3-Polysterene-Reaktionsgefäße-Gefäße 15 ml, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland
Petrischalen, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland
Gewebesieb, 40µm BD Falcon M, BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland
29 Lymphozytenmedium
Zellzählgerät scil Vet ABC, scil animal care company, Viernheim, Deutschland 96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland
Anti-mCD3 (145-2C11) 1µg/µl
ELISA zur IFNBestimmung (extern: Arbeitsgruppe Detlef Neumann, MHH)
mIFN Antikörper eingesetzt als Fänger (an ELISA-Platte gebunden) und späterer Detektor, Pierce Antibodies, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland
P96 Immuno MaxiSorb Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Beschichtungspuffer: 100 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6
Blockpuffer: PBS mit 4 % BSA Lymphozytenmedium
Waschpuffer: PBS mit 0,005 % Tween 20 Streptavidin-HRP 0,5 mg/ml
Substrat: 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine (TMB) 1 mg/ml in DMSO Substratpuffer: 1,36 g Natriumacetat x 3 H2O +
2,1 g Zitronensäuremonohydrat in 100 ml H2O (pH 4,9) 3% H2O2
Isolation und Anzucht von H. hepaticus für den Doppelinfektionsversuch (ZTL) Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Impföse, Omnilab, Bremen, Deutschland
Wattetupfer, Omnilab, Bremen, Deutschland
Polypropylen-Röhrchen, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Brain-Heart-Infusion Medium, Merck, Darmstadt, Deutschland 0,45 µm Weißrandfilter, Schleicher & Schuell, Basel, Schweiz
Petrischale Ø 60 mm, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Columbiaagar, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland
Amphotericin B, Biochrom, Berlin, Deutschland
Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Skirrow), Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland
30
Pferdeblut, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland
Anaerobiertopf HP0011A, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland
1,5 ml Schraubdeckelgefäß Twist Top Vial und Twist Top Vial Caps, Sorenson BioScience, Salt Lake City, UT, USA
Stereomikroskop zur histologischen Auswertung
Zur statistischen Auswertung wurden folgende Programme genutzt:
StatView D-4.5, Abacus Corporation
Graphpad Prism 5, Graphpad Software Inc., La Jolla, CA, USA Excel 2003, 2007, Microsoft, Redmond, WA, USA
31 3.2 Methoden
In den ersten Versuchen mussten grundlegende Erkenntnisse zum Virus gesammelt werden. Das Virus war bereits isoliert worden, jedoch nicht klassifiziert. Außerdem mussten direkte und indirekte Nachweismethoden und Virusquantifizierungs- verfahren für den Infektionsversuch etabliert werden. Im Anschluss erfolgten Infektionsversuche, die den Einfluss einer MNV-Infektion auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus erfassen sollten.
3.2.1 Zellkultur
Die RAW 264.7 Zellen wurden in 75 ml Filterdeckel-Zellkulturflaschen mit DMEM, 2%
Penicillin-Streptomycin und 10% low endotoxine fetalem Kälberserum bei 37° C und 5% CO2-Begasung in einem Brutschrank kultiviert. Zum Passagieren wurde der Zell- rasen mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden dann in 5 ml vorbereitetem Medium und anschließend anteilig je nach gewünschter Zelldichte in insgesamt 25 ml Medium pro Zellkulturflasche resuspendiert.
3.2.2 Virusisolation
Die Virusisolation wurde von Mitarbeitern der MHH und der Firma Biodoc (Hannover, Deutschland) durchgeführt. Aus vorhergehenden wissenschaftlichen Veröffent- lichungen war bekannt, dass MNV weit verbreitet in versuchstierkundlichen Einrichtungen ist. Klinische Symptome blieben jedoch abhängig vom infizierten Mausstamm aus. Mesenteriallymphknoten und Milz waren als Virusreservoir beschrieben. Eine Virusvermehrung gelang in RAW 264.7 Zellen. Mehrere genetische Sequenzen von MNV-Isolaten waren bereits beschrieben. Als potentielle Virusträger wurden NOD-Prkdcscid-Mäuse, die als Anzeigertiere im ZTL verwendet wurden, eingeschätzt. Von ihnen wurden im Rahmen einer diagnostischen Routine- Sektion Mesenteriallymphknoten und Milz gewonnen. Diese wurden bei -80° C eingefroren. Eine kleine Probe der Organe wurde für eine PCR-Untersuchung mit dem Primerpaar 5004f/5219r verwandt. Die PCR-Untersuchung ergab für Milz und Mesenteriallymphknoten der Mäuse einen positiven Befund. Daraufhin wurde ein Viertel der PCR-positiven Milz mit einem Cell-Douncer in DMEM homogenisiert.
32
Nach einer Zentrifugation bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) wurde der Überstand filtriert. Mit dem aus dem Milz-Isolat gewonnenen Überstand wurde eine zu 75%
besiedelte RAW-Zellkulturflasche beimpft. Nach zwei Tagen trat ein cytopathischer Effekt >90% auf, der bei einer parallel bebrüteten Kontrollflasche nicht zu beobachten war. Die beimpfte Zellkulturflasche wurde daraufhin bei -20° C eingefroren, aufgetaut, erneut eingefroren (-20° C) und dann aufgetaut. Das Medium inklusive cryolysierter RAW 264.7 Zellen sowie vermeintlicher Viruspartikel wurde bei 6000 U/min für 10 min (2800 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und filtriert, das Pellet wurde verworfen. Das Filtrat wurde in 1 ml Portionen konfektioniert und bei -80° C tiefgefroren.
3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR 3.2.3.1 RNA-Isolation
Da es sich bei Noroviren um RNA-Viren handelt, musste zuerst die Virus-RNA aus dem Filtrat gewonnen werden. Hierzu wurde das Macherey Nagel Kit NucleoSpin RNA II mit dem Support-Protokoll zur Isolation von Gesamt-RNA aus Zellkulturüberstand eingesetzt (siehe Anhang S.97). Bei der RNA-Isolation aus Organen wurde ebenfalls das vom Hersteller empfohlene Protokoll angewandt (siehe Anhang S. 97). Zur Isolation von Gesamt-RNA aus Kot wurde erfolgreich ein modifiziertes Protokoll angewandt, das der Hersteller auf Anfrage übersandte. Es handelte sich hierbei um die Modifikation eines Kunden, dem es auf diese Art und Weise gelungen war, RNA aus Kot zu isolieren (siehe Anhang S. 99).
3.2.3.2 Reverse Transkription
Um die isolierte RNA weiter zu analysieren, wurde diese mit Hilfe des Quiagen Omniscript RT-Kits umgeschrieben. Für den Reaktionsansatz wurde der RNA-Gehalt der Proben photometrisch bestimmt. Es erfolgte eine Einstellung auf 500 ng RNA pro 10 µl Ansatz.
33 Ansatz pro Probe
RT-Buffer 2 µl
dNTPs 5 µM 2 µl
Oligo(dT)18 20 µM bzw. Random Hexamer 1 µl RNAse-Inhibitor 1:4 verdünnt 1 µl
Reverse Transkriptase 1 µl
Eingestellte RNA 13 µl
Summe 20 µl
Temperaturprofil für die reverse Transkription Temperatur Dauer
37° C 60 min
3.2.3.3 PCR
Die gewünschten cDNA-Abschnitte wurden nun entweder mit dem Redextract-Kit oder dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit vervielfältigt, je nach verwendetem Primerpaar.
Ansatz pro Probe
Redextract 5 µl
H2O 2,5 µl
Forward-Primer RPS 9 (13,7 µM) 0,25 µl Reverse-Primer RPS 9 (13,7 µM) 0,25 µl
cDNA 2 µl
Summe 10 µl
Ansatz pro Probe
Q-Solution 2 µl
10x PCR-Buffer 1 µl
dNTPs 2 µM 1 µl
Forward-Primer (13,7 µM) 1,5 µl
Reverse-Primer (13,7 µM) 1,5 µl
Taq-Polymerase 0,05 µl
cDNA 2,95 µl
Summe 10 µl
34
Anhand von bereits publizierten Sequenzen verschiedener MNV-Stämme (MNV 1 - 4) wurden passende Primerpaare in einer genetisch konservierten Region entwickelt, mit denen möglichst viele Varianten von MNV reagieren; zusätzlich wurden Primerpaarsequenzen aus Publikationen übernommen.
Tabelle 10: Primmerpaare zum Nachweis von MNV mit Hilfe des Quiagen-Taq PCR Core-Kit (Primersequenzen siehe S. 22f.)
Name des Primerpaars Länge des
Amplikon
5205f/5388r 183 bp
5004f/5219r 215 bp
Nach Sequenzierung getestet:
5004f/5277r 273 bp
5580f/5671r modifiziert (MÜLLER et al. 2007) 91 bp 4972f/5080r (BAERT et al. 2008) 608 bp
5205f/5469r 264 bp
5473/5659r modifiziert (HSU et al. 2006) 186 bp
Die Probenansätze wurden anschließend mit nachfolgendem Temperaturprofil im Thermocycler zur Reaktion gebracht.
Temperaturprofil für die MNV-PCR Temperatur Dauer
95° C 4 min
94° C 1 min
55° C 1 min
72° C 2 min
39x Schritt 2-4
72° C 7 min
8° C Bis zur Entnahme
Zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA wurde das Housekeeping-Gen RPS- 9 mit Hilfe des Primerpaares RPS9f/RPS9r nachgewiesen. Hierbei wurde das Redextract-Kit verwendet.
35 Temperaturprofil für die RPS-9-PCR
Temperatur Dauer
95° C 4 min
94° C 1 min
55° C 1 min
72° C 2 min
24x Schritt 2-4
72° C 7 min
8° C Bis zur Entnahme
3.2.4 Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR
Die Gesamt-DNA wurde aus den im Infektionsversuch gewonnenen Kotproben mit Hilfe des Invitek PSP® Spin Stool DNA Kit gemäß Herstellerprotokoll isoliert. Für die Detektion kamen die Primerpaare H276f/H676r und B38/B39 zum Einsatz. Mit dem Primerpaar H276f/H676r lassen sich 16S rRNA Gensequenzen der Helicobacter spp.
nachweisen (RILEY et al. 1996). Alle Helicobacter spp. ergeben ein 374- Basenpaarfragment. Das Primerpaar B38/B39 weist eine H. hepaticus spezifische 16S rRNA-Gensequenz nach (SHAMES et al. 1995). Das Basenpaarfragment ist 417 bp groß. Für beide Primerpaare wurde das Redextract-Kit verwendet.
Ansatz pro Probe
Redextract 5 µl
H2O 2,5 µl
Forward-Primer (20 µM) 0,25 µl
Reverse-Primer (20 µM) 0,25 µl
cDNA 2 µl
Summe 10 µl
Temperaturprofil für die Helicobacter spp.- / H. hepaticus - PCR Temperatur Dauer
94° C 3 min
94° C 0,5 min
53° C 0,5 min
72° C 0,5 min
34x Schritt 2-4
72° C 10 min
8° C Bis zur Entnahme
36
3.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese
Für ein 1,5%iges Gel wurden 2,25 g Agarosepulver in 150 ml 1x TBE-Puffer gegeben und in der Mikrowelle erhitzt. Unter ständigem Rühren mittels Magnetrührer wurde die Agaroselösung auf 50° C abgekühlt. Dann wurden der Lösung 6 µl Gelstar DNA- Farbstoff zugefügt. Die Flüssigkeit wurde dann bis zu einer Höhe von 0,5 cm in den mit bis zu zwei 25er-Taschen-Kämmen präparierten Gelschlitten gegossen. Nach einem Auskühlen von 30 min konnten die Kämme gezogen werden, und das Gel war einsatzbereit.
Für die Elektrophorese wurde das Gel in die mit 1x TBE-Puffer gefüllte Gelkammer gelegt. Danach wurden die dem Thermocycler entnommenen Proben mit 4 µl Orange G Ladepuffer versehen, sofern der PCR-Ansatz mit dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit erstellt wurde. Ein mit Redextract erstellter PCR-Ansatz enthält bereits Ladepuffer.
Je nach Ansatz wurden pro Tasche 10-14 µl Probenvolumen einpipettiert. Zur Größendifferenzierung der Basenfragmente wurde in mindestens eine Tasche pro Kamm 6 µl einer standardisierten Basenleiter gegeben. Die anschließende Laufzeit bei 180 V 250 mA betrug ca. 45 min. Zur Auswertung wurde das Gel abschließend mit einem UV-Transilluminator betrachtet und digital fotografiert.
3.2.5 Sequenzierung
Die Klonierung und Vorbereitung für eine externe Sequenzierung wurde durch Herrn Dr. Nils-Holger Zschemisch vom ZTL durchgeführt. Aus Zellkulturüberstand isolierte MNV-RNA wurde mit dem Oligo(dT)18-Primer zu cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wurde als Template verwandt. Die Primerpaare für die PCR-Produkte, die kloniert wurden, sind Tabelle 6 (S.23) zu entnehmen. Der Primer Noro Hannover rev 3 entspricht dem Primer 15T-aTAG (MÜLLER et al. 2007). Die Klonierung und Transformation erfolgte gemäß Anweisungen und gelieferten Materialien des StrataCloneTM PCR Cloning Kit von Agilent Technologies. Detaillierte Protokolle sind zusätzlich in der Dissertation von Herrn Dr. Zschemisch zu finden (ZSCHEMISCH 2004).
37 Die Bakterienkulturen mit erfolgreich klonierten Abschnitten des MNV-Genoms in Plasmidform wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit gemäß Anweisungen des Herstellers aufgearbeitet. Abschließend erfolgte eine PCR mit den Primerpaaren, die in Tabelle 7 (S.23) genannt werden. Die Sequenzierung der drei PCR-Produkte wurde extern durch die Firma MWG Biotech AG durchgeführt. Eine Analyse der erhaltenen Sequenzen erfolgte auf einem Macbook mit DNA Dynamo und internetbasiert mit BLAST (ALTSCHUL et al. 1990).
3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch
Eine Portion des Virusisolats wurde zweimal mit RAW-Zellen passagiert, von dieser Passage wurden für Infektionsversuche und weitere Virusanzucht erneut 1 ml Portionen in sterile Glasfläschchen abgefüllt und bei -80° C tiefgefroren.
3.2.7 Virus-Titer-Bestimmung 3.2.7.1 Plaque-Test
Um den Virus-Titer zu bestimmen, wurde ein Plaque-Test durchgeführt. Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen auf einer 6er-Zellkultur-Platte in einer Dichte von 6 x 105 Zellen/ml ausgesät. Die Zelldichte pro ml wurde durch Auszählung mit einer Neubauer Zellzählkammer bestimmt. Pro Vertiefung der Platte wurden 2,5 ml aufgetragen, was einer Gesamtzellzahl von 1,5 x 106 Zellen pro Vertiefung entsprach. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am nächsten Tag wurden Zehner-Verdünnungen der Virussuspension für den Infektionsversuch angefertigt. Das ursprüngliche Zellmedium wurde von den Platten abgesaugt. Danach wurden pro Verdünnung 2 Vertiefungen als Doppelbestimmung mit 500 µl der angefertigten Virusverdünnungsreihe beimpft. Die Platten wurden danach eine Stunde im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C bebrütet.
Währenddessen wurde eine Lösung aus 2,5% SeaPlaque Agarose und ergänztem DMEM-Medium (10% FKS LE, 2% Penicillin-Streptomycin) hergestellt. Nach der einstündigen Inkubation wurde die Virussuspension von den Vertiefungen abgesaugt und durch 2,5 ml der vorbereiteten Agarose-Medium-Mischung ersetzt. Nachdem die
38
Agarose-Mediummischung bei Raumtemperatur erstarrt war, wurden die Platten bei 5% CO2 und 37° C für 48h bebrütet. Um die Auswertung zu erleichtern, wurden die Platten mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.
3.2.7.2 Auswertung eines Plaque-Tests
Die Löcher im Zellrasen werden bei zwei bis drei auszählbaren Verdünnungsstufen der Virussuspension erfasst und mit dem Kehrwert der Verdünnungsstufe multipliziert. Hierbei erhält man die Anzahl von plaqueforming units pro inokkuliertes Volumen der Virussuspension.
3.2.7.3 TCID50-Test
Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen in der Konzentration von 3 x 104 Zellen/Vertiefung auf eine Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Pro Vertiefung wurden 100 µl Zellsuspension aufgetragen, dies entspricht einer Zellkonzentration der Suspension von 3 x 105 Zellen/ml. Die Vertiefungen am Plattenrand wurden mit 300 µl Medium befüllt, um einer Verdunstung im Randbereich vorzubeugen. Die Platten wurden über Nacht bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am folgenden Tag wurde eine Verdünnungsreihe der Virussuspension in Zehnerschritten angelegt. Je 200 µl einer Verdünnungsstufe der Virussuspension wurden pro Vertiefung auf der Reaktionsplatte zugegeben. Je eine Reihe mit 10 Vertiefungen wurde mit einer Verdünnungsstufe befüllt. Eine Kontrollreihe bekam statt der Virussuspension 200 µl Medium. Dies entsprach einem Gesamtvolumen von 300 µl Flüssigkeit pro Vertiefung. Danach erfolgte eine weitere Bebrütung bei 5% CO2 und 37° C über acht Tage.
3.2.7.4 Auswertung eines TCID50-Tests
Zur Auswertung wurde der CPE optisch erfasst. Bereits der dem Nährmedium zugesetzte Indikator Phenolrot ließ eine Unterscheidung zwischen toten (rosa) und lebenden (gelb) RAW-Zellen in den Vertiefungen zu, zur Erleichterung wurde jedoch auch hier mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.
39 Die Berechnung der Viruskonzentration erfolgt mit der Formel nach Spearmann und Kärber.
Zuerst wurde die Verdünnungsstufe bestimmt, in der noch ein vollständiger CPE in allen Vertiefungen zu ermitteln ist. Diese Verdünnungsstufe ergab die Variable a (bei 10-6 ist diese gleich -6). Für die Variable b wurden die Anzahl Vertiefungen mit CPE der niedrigeren Verdünnungsstufen zu der Anzahl Vertiefungen der Verdünnungsstufe mit vollständigem CPE addiert (10+9+2+1=22). Die Variable c war gleich der Gesamtzahl an Vertiefungen pro Verdünnungsstufe (in diesem Fall c=10).
Dies entsprach 107,7 TCID50/200 µl oder 2,5 x 108 TCID50/ml.
3.2.8 Immunofluorescence Assay (IFA)
Dieser Test dient dazu, in einem Mausserum möglicherweise vorhandene Antikörper gegen MNV nachzuweisen. Entwickelt und validiert wurde der Test bei der Firma Biodoc. Verdünntes Maus-Serum wird hierbei auf Objektträger aufgetragen, die mit fixierten MNV-infizierten Zellen beschichtet sind. Die Auswertung erfolgt optisch mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops.
3.2.8.1 Herstellung und Anwendung der Objektträger für die Immunfluoreszenz Für diesen Test wurden RAW-Zellen in der Flasche kultiviert. Bei einer Zelldichte von 75% wurden diese mit 0,5 ml der eingefrorenen Virussuspension infiziert. Nach einer flexiblen Inkubationszeit von 4 bis 8 Stunden wurde das Medium entfernt, die Zellen abgeschabt und in 25 ml neuem Medium (DMEM, 2% Penicilin-Streptomycin, 10%
LE-FKS) pro Flasche suspendiert. Diese Zellsuspension wurde in 50 µl-Tropfen auf teflonbeschichtete 8-Loch-Objektträger aufgetragen. Danach erfolgte eine weitere
