3.2 Methoden
3.2.18 Anfertigung histologischer Präparate
Die histologischen Gewebeschnitte wurden am ZTL von Frau Wiebe angefertigt und mit Hämatoxilyn-Eosin (HE) gefärbt. Die Organe wurden über Nacht paraffinisiert und anschließend per Hand eingebettet. Nach Einbettung wurden 3 µm dicke Längs-schnitte gemacht und im Färbeautomaten HE gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden anschließend mit Korbitbalsam eingedeckt.
51 3.2.19 Histologische Auswertung der Präparate
Die Schnitte wurden ohne vorher bekannte Zuordnung beurteilt. Zur Beurteilung der Entzündungsherde in Zäkum und Kolon kam der The Jackson Laboratory-Schlüssel zur Anwendung (BLEICH et al. 2004).
Dieser gliedert sich in:
Schweregrad
Der Schweregrad der Entzündung wurde beurteilt als: 0 = keine Entzündung;
1 = mild; 2 = mäßig; 3 = schwer. Milde Läsionen waren kleine, fokale oder weiter voneinander entfernte multifokale Areale, in denen das Entzündungsgeschehen auf die Lamina propria beschränkt blieb. Bei mäßigen Veränderungen handelte es sich entweder um multifokale oder lokal extensive Entzündungsgebiete, in denen das Entzündungsgeschehen bis in die Submukosa fortschritt. Schwere Läsionen waren Ulzerationen größeren Ausmaßes (>1 mm der Mukosa betroffen).
Hyperplasie
Der Grad der Hyperplasie wurde beurteilt als: 0 = keine Hyperplasie; 1 = mild;
2 = mäßig; 3 = schwer. Bei einer milden Hyperplasie erschien das Epithel morphologisch normal als einfaches, hochprismatisches Schleimhautepithel, das aber im Vergleich zur normalen Mukosa eine mindestens zweifache Schleimhautdicke aufwies, was durch die Länge der Krypten angezeigt wurde. Eine mäßige Hyperplasie war durch eine zwei bis dreifache Schleimhautdicke mit hyperchromatischen Zellen, eine verringerte Anzahl an Becherzellen und vereinzelt verlängerte und verzweigte Krypten charakterisiert. Bei einer schweren Hyperplasie war das Epithel deutlich verdickt (vierfach oder mehr) und zeigte eine deutliche Hyperchromasie der Zellen, sehr wenige bis keine Becherzellen, einen hohen Mitoseindex der Zellen innerhalb der Krypten und viele Krypten mit verlängerter und verzweigter Struktur.
52
Ulzeration
Ulzeration wurde beurteilt als: 0 = kein Ulkus; 1 = eine bis zwei Ulzerationen, die insgesamt maximal 20 Krypten einbezogen; 2 = eine bis vier Ulzerationen, an denen insgesamt 20-40 Krypten beteiligt waren; 3 = jegliche Ulzeration, die über die vorher genannten Kriterien hinaus gingen.
Fläche
Der Anteil der entzündlich veränderten Fläche wurde in 10%-Schritten auf einer Skala von 0-100% geschätzt, bezogen auf die gesamte Fläche des jeweiligen Darmabschnitts. Für die Analysen wurden die Prozentzahlen folgendermaßen umgerechnet: 0 = 0%; 1 = 10-30%; 2 = 40-70%; 3 = >70%
Aus den Werten für Schweregrad, Hyperplasie, Ulzeration und Fläche wurde die Summe gebildet und als Gesamtscore angegeben.
3.2.20 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der INFγ-Bestimmung wurde mit dem Programm GraphPad Prism auf einem PC durchgeführt. Das Programm StatView wurde für die statistische Auswertung des MNV-ELISA auf einem Apple Powerbook G4 genutzt.
Für weitere graphische Darstellungen und Berechnungen wurde Microsoft Excel 2007 verwendet.
53
4 Ergebnisse
4.1 Anzucht von MNV in der Zellkultur
Eine Anzucht und Vermehrung von MNV war problemlos möglich. RAW-Zellen, die in einer gleichmäßigen Zellschicht wuchsen, reagierten mit einem deutlichen CPE.
Dieser trat je nach Infektionsdosis innerhalb weniger Stunden bis zu 1,5 Tagen auf.
Die Zellen kugelten sich ab und lösten sich aus dem Zellverband von der Flaschenoberfläche. Der CPE erfasste vollständig alle Zellen.
4.2 Virus-Nachweis mittels PCR
Zu Beginn wurden die Primerpaare 5205f/5388r und 5004f/5219r erprobt. Die isolierte RNA wurde mit dem Reverse-Primer des jeweiligen Paares zur cDNA umgeschrieben. Hierbei erwies sich das Paar 5004f/5219r als geeignet.
Bei den PCR-Untersuchungen des Infektionsversuches kamen Zweifel auf, ob das Primerpaar 5004f/5219r MNV in Organproben detektieren kann. Das MNV-Isolat wurde aus einer Milz isoliert (siehe 3.2.2 Virusisolation). Alle im Infektionsversuch gewonnenen Milzen wurden jedoch negativ getestet. Es erfolgte eine Entwicklung von weiteren Primerpaaren unter Berücksichtigung der Sequenzierungsergebnisse.
Zur Austestung der Primerpaare wurde RNA verwandt, die aus Zellkulturüberstand, sowie aus Organ- und Kotproben des Infektionsversuchs isoliert worden war. Die RNA wurde mit dem OligoDT-Primer zu cDNA umgeschrieben, um mit der gleichen cDNA auch die RPS9-PCR durchführen zu können (siehe Abbildung 6). Letztlich zeigte sich, dass das Primerpaar 5004f/5219r weiterhin die besten Resultate brachte, da eine deutliche Bande auszumachen war. MNV war bei den in den Infektionsversuchen verwendeten Mausstämmen in keiner Milz nachweisbar (siehe Tabelle 20 S. 78).
54
Abbildung 5: Vergleich verschiedener Primerpaare im Gradienten.
Die PCR in Abbildung 5 wurde mit einer cDNA-Positivkontrolle (gewonnen aus MNV-positivem Zellkulturüberstand) bei 4 unterschiedlichen Annealingtemperaturen (53°
C, 55,6° C, 58,4° C und 62° C) durchgeführt. Die Primerpaare 5580f/5671r und 5205f/5469r wiesen besonders kräftige Banden auf.
Abbildung 6: Vergleich der Primerpaare 5580f/5671r und 5205f/5469r mit 5 verschiedenen Proben, die aus Organen und Kot isoliert wurden.
55 Die PCR in Abbildung 6 wurde mit 3 MNV-positiven cDNA-Proben (gewonnen aus 2 MLK und einer Kotprobe), 2 MNV-negativen cDNA-Proben (gewonnen aus 2 Milzen) sowie Negativ- und Positiv-Kontrolle durchgeführt. Die 3 Banden der MNV-positiven Proben in der PCR mit dem Primerpaar 5580f/5671r sind schwer zu unterscheiden von den negativen Proben. Dies wird beim Primerpaar 5205f/5469r aufgrund eines größeren Amplikons (265bp) wesentlich erleichtert. Die RPS9-PCR wurde mit der cDNA, die aus den 2 MNV-negativen Milzen isoliert worden war, sowie Negativ- und Positiv-Kontrolle durchgeführt.
Abbildung 7: Vergleich der Primerpaare 5205f/5469r und 5004f/5219r.
Das Gel in Abbildung 7 zeigt 8 MNV-positive Kotproben aus einer PCR mit dem Primerpaar 5205f/5469r, dann eine Lücke gefolgt von Positiv- und Negativkontrolle.
Nach der Basenleiter sind die gleichen 8 MNV-positiven Kotproben mit Positiv- und Negativkontrolle mit dem Primerpaar 5004f/5219r aufgetragen. Das Primerpaar 5205f/5469r weist bei allen Proben, die aus Kot isoliert wurden, Doppelbanden auf.
Nur die Positivkontrolle, die aus MNV-positivem Zellkulturüberstand isoliert wurde, hat eine Bande. Bei Probe 3 ist nur eine schwache Bande zu erkennen, Probe 5 zeigt keine Bande. Das Primerpaar 5004f/5219r hingegen zeigt bei jeder Probe eine starke Bande.
56
4.3 Sequenzierung des Virus
Als Template wurde die mit dem OligoDT-Primer umgeschriebene cDNA verwendet.
Um eine reproduzierbare Sequenzierung zu ermöglichen, wurden die RNA-Abschnitte als cDNA in Bakterienplasmide kloniert. Die Plasmid-DNA wurde per PCR vervielfältigt, anschließend über ein Gel laufen gelassen und dann ausgeschnitten und zur externen Sequenzierung verschickt. Die vollständige Sequenz wurde an die NCBI-Nukleotiddatenbank übermittelt. Sie wurde unter der Zugangsnummer EU854589 registriert. Das Isolat bekam die Bezeichnung Murine norovirus/Hannover1/2007/DEU. Der Stammbaum in Abbildung 8 zeigt die Verwandtschaft des Isolats mit anderen murinen Noroviren. Er wurde mit BLAST erstellt (ALTSCHUL et al. 1990).
57 Abbildung 8: Verwandschaft vom isolierten MNV-Stamm Hannover1/2007/DEU erstellt durch BLAST (ALTSCHUL et al. 1990).
58
4.4 Virusquantifizierung
Im Plaque-Test trat ein CPE auf. Der CPE war bereits an der Verfärbung des Mediums (Indikator Phenolrot gelb bei pH 0,9-6,4, rot bei pH >6,4) zu erkennen. Bei den lebenden Kontrollen war das Medium gelb, bei den toten Zellen rosarot. Die Einfärbung der Zellen mit Kristallviolett zeigte jedoch keine zählbaren Löcher im Zellrasen, sondern eine schlierige Veränderung des Zellrasens. Dies wird für einige MNV-Isolate beschrieben (THACKRAY et al. 2007). Daraufhin wurde ein TCID50-Test durchgeführt. Auch hier zeigte bereits der dem Zellmedium zugesetzte Indikator den CPE an (Abbildung 9). Abschließend wurde mit Kristallviolett angefärbt.
Abbildung 9: TCID50-Test; der Indikator des Mediums zeigt lebende Zellen (gelb) an;
zweites Bild nach der Anfärbung mit Kristallviolett (lebende Zellen stark lila).
Nach Auszählung der Vertiefungen mit lebenden/toten Zellen und Auswertung nach Spearmann und Kärber (siehe S. 38) ergab sich für die konfektionierte Viruscharge eine TCID50 von 2,5 x 108 TCID50/ml. Diese Charge wurde für die Infektionsversuche verwendet.
4.5 Indirekte Antikörpernachweisverfahren
4.5.1 IFA
Die Untersuchung von Mäuseseren auf Antikörper gegen MNV per IFA wurde bereits im Labor der Firma Biodoc etabliert und als Goldstandard für die Etablierung des ELISA sowie zur Untersuchung aller Tiere des Infektionsversuchs genutzt.
59 Bei der Herstellung der Objektträger ist eine maximal 25% Infektionsrate des Zellrasens angestrebt. Abbildung 10 zeigt ein MNV-positives Mausserum in der Immunfluoreszenz. Die infizierten Zellen zeigen eine cytoplasmatische Fluoreszenz im Randbereich mit einem „Polkappenphänomen“. Als Bewertung wurde ein semiquantitativer Schlüssel angewendet. Dazu wurde die Serumprobe mit einem deutlich positiven Kontrollserum verglichen.
Kennzeichnung Serumreaktion beurteilt anhand der Intensität
+++ Starke Reaktion
++ Mittelstarke Reaktion + Schwach positive Reaktion
- Keine Reaktion
+/- Grenzwertige Reaktion NSR Nicht spezifische Reaktion
Abbildung 10: MNV-positives Mausserum (+++) in der Immunfluoreszenz. MNV-infizierte Zellen sind grüngelblich markiert.
60
4.5.2 Antigenaufreinigung und ELISA
Die Aufreinigung per Ultrazentrifuge erfolgte angelehnt an die Publikation von Wobus et al. (WOBUS et al. 2004). Ziel war es, MNV-Antigen für einen ELISA und elektronenmikroskopische Aufnahmen zu gewinnen.
Nach der ersten Kissenzentrifugation war ein Pellet am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens auszumachen, welches in PBSM gelöst wurde.
Probeweise wurden bereits mit dem gelösten Pellet ELISA-Platten beschichtet und mit diversen Mäuseseren, die in der IFA postiv bzw. negativ für MNV reagiert hatten, erprobt. Hierbei zeigte sich eine Substratumsetzung bei IFA positiven Seren, während die meisten IFA negativen Seren nicht reagierten. Die Ausnahmen ließen eine Verunreinigung vermuten. Daher wurde mit dem gelösten Pellet eine Aufreinigung über einen Cäsiumchloridgradienten durchgeführt. Am Ende der Zentrifugation war eine deutliche Bande im Ultrazentrifugenröhrchen zu erkennen, die abgenommen wurde (Abbildung 11).
Abbildung 11: Kissenzentrifugation; Bande nach der Gradientenzentrifugation.
Eine Dialyse zur Entfernung des Cäsiumchlorids erfolgte nicht, da beim Coating der ELISA-Platten hoch verdünnt wurde. Doch auch hier reagierten einige negative Seren. Dies sprach für eine immer noch vorhandene Verunreinigung der Virusbande.
Da es sich bei der RAW-Zelllinie um Mäusezellen handelt, kam die Vermutung auf, dass die falsch positiven Seren mit RAW-Zellresten reagiert hatten, die trotz
61 Aufreinigung durch Zentrifugation und Ultrazentrifugation noch vorhanden waren. Um dies zu überprüfen wurden RAW-Zellen angezüchtet und nicht infiziert. Die weitere Behandlung und Aufreinigung entsprach jedoch der Behandlung infizierter RAW-Zellen. Nach der Kissenzentrifugation war ebenfalls ein Pellet am Boden auszumachen. Dieses wurde ebenfalls in PBSM gelöst und an ELISA-Platten gebunden. Hier reagierten die IFA-negativen Seren teilweise ebenfalls mit einer Substratumsetzung, dies bestätigte die Vermutung, dass einige Mäuse Antikörper gegen RAW-Zellbestandteile besitzen. Um die Mäuseseren zu erkennen, die mit RAW-Zellbestandteilen reagieren, wurde entschieden, eine parallele Zellkontrolle beim ELISA durchzuführen.
Damit die OD-Werte von MNV-Reaktionsvertiefungen, in denen vermutlich auch noch RAW-Bestandteile gebunden waren, vergleichbar zu Zellkontroll-Reaktionsvertiefungen waren, wurden gleichzeitig zur MNV-Anzucht RAW-Zellen der gleichen Passage ohne Infektion angezüchtet. Sobald die zur Infektion vorgesehene Hälfte der Zellkulturflaschen infiziert wurde, wurde die andere Hälfte (Kontrollcharge) eingefroren. Beim Coating der ELISA-Platten wurde für MNV-Antigen und RAW-Antigen die gleiche Verdünnung mit dem Coatingbuffer gewählt.
Zur Einschätzung, ob ein Serum Antikörper gegen MNV enthält, wurde der korrigierte OD-Wert eingeführt. Dieser ergibt sich aus der Differenz des OD-Werts der MNV-Antigen-beschichteten Kavität zur RAW-Antigen-beschichteten Kavität. Zur Bestimmung der Grenzwerte für die Serumbeurteilung und zur Überprüfung der Robustheit des ELISA wurde eine Validierung durchgeführt. Die einzelnen Messdaten sind im Anhang zu finden.
62
4.5.2.1 ELISA-Validierung
Zuerst wurde ein Positivkontroll- und ein Negativkontroll-Pool aus eindeutig in der IFA beprobten Seren zusammengestellt. Jeder Pool wurde gründlich durchmischt, sterilfiltriert und in kleinen Chargen bei -20° C bis zur Verwendung gelagert. Erst eine große Menge Serum erlaubte eine Validierung in entsprechender Proben-Anzahl.
Außerdem kann anhand dieser Pools eine Orientierung bei der Herstellung von neuen Chargen des ELISA stattfinden, um vergleichbare OD-Werte zu erhalten.
Beim alltäglichen Gebrauch des ELISA können die Pools genutzt werden, um Abweichungen beim Anwendungsprotokoll sowie Qualitätsmängel des antigen-beschichteten Materials aufzuzeigen.
Durch die Verwendung einer Differenz für den korrigierten OD-Wert wurden korrigierte OD-Werte kleiner null für die Berechnung von Mittelwert und Standardabweichung gleich null gesetzt und auf die Bildung eines Variationskoeffizienten verzichtet.
Für die Validierung des ELISA wurden folgenden Messungen durchgeführt:
4.5.2.2 Intraserielle Präzision des Positivkontroll- und des Negativkontroll-Pools Der Positivkontroll-Pool wurde in einem Reaktionsansatz zehnmal untersucht, der Negativkontroll-Pool im gleichen Ansatz sechsmal. Hierbei ergab sich aus den korrigierten OD-Werten des Positivkontroll-Pools ein Mittelwert von 2,76 bei einer Standardabweichung von 0,07. Der Variationskoeffizient betrug 2,59%. Für den Negativ-Kontroll-Pool betrug der Mittelwert 0,11 bei einer Standardabweichung von 0,04.
4.5.2.3 Interserielle Präzision des Positivkontroll- und des Negativkontroll-Pools Der Positivkontroll- als auch der Negativkontroll-Pool wurden an zehn verschiedenen Tagen als Einzelprobe getestet. Hierbei ergab sich aus den korrigierten OD-Werten des Positivkontroll-Pools ein Mittelwert von 2,82 bei einer Standardabweichung von
63 0,1. Der Variationskoeffizient betrug 3,63%. Für den Negativ-Kontroll-Pool betrug der Mittelwert 0,04 bei einer Standardabweichung von 0,04.
4.5.2.4 Linearität des Positivkontroll-Pools
Für die Bestimmung der Linearität wurde der Positivkontroll-Pool in den Verdünnungsstufen 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 und 1:800 als Dreifach-bestimmung gemessen. Die statistische Prüfung der Linearität erfolgte durch eine Regressionsanalyse. Die Analyse ergab folgende Gleichung, die in Abbildung 12 graphisch dargestellt ist: y = 2,559 – 0,001x.
Abbildung 12: Beziehung zwischen Extinktionswert und Verdünnung mit Regressionsgerade.
Das Bestimmtheitsmaß r² betrug 0,882, die ANOVA der Regression ergab einen p-Wert von <0,0001.
1,4
1,6 1,8 2,2
2,4
2,6
2,8
0
1:100
1:200
1:400
1:800
2,0
Verdünnung
Extinktionswert
64
4.5.2.5 Einzelmessungen an IFA positiven und negativen Seren
Um den ELISA als Testverfahren mit der IFA zu vergleichen, wurden 68 negative und 76 positive Seren in einem Versuchsansatz mit dem ELISA getestet. Hierbei ergab sich eine Verteilung der Messwerte, die in Abbildung 13 zu sehen ist.
65
Abbildung 13: Prozentuale Verteilung der Einzelmessungen von ausgewählten in der IFA positiven (n=76) und negativen (n=68) Mäuseseren.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
-0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0
Anteil in %
OD-Wert korrigiert
Negativ Positiv
66
Zusätzlich wurden anschließend weitere 205 Seren, die in der IFA negativ für MNV-Antikörper beurteilt worden waren, untersucht. Hierbei ergab sich ein Spektrum für den korrigierten OD-Wert eines MNV-negativen Serums von -0,385 bis 1,4. Die Verteilung ist in Abbildung 14 dargestellt.
Abbildung 14: Prozentuale Verteilung der Einzel-OD-Wertbestimmung von 205 in der IFA negativen Mäuseseren mit Hilfe des ELISA.
Anhand der Verteilung wurden folgende Grenzwerte für die hergestellte Charge festgelegt, um eine Bewertung von Testseren zu ermöglichen:
OD korrigiert < 0 bis 1 negativ OD korrigiert > 1 bis 1,5 fraglich OD korrigiert > 1,5 positiv
4.6 Elektronenmikroskopische Aufnahmen
Die Aufreinigung über den CsCl-Gradienten führte nicht zu auswertbaren Grids (Objektträger für elektronenmikroskopische Aufnahmen). Daher erfolgte wie beschrieben eine Aufreinigung durch wiederholte Pelletierung. Verschiedene Aufnahmen sind in Abbildung 15 zu sehen. Das Virus ist ca. 35 nm groß. In Abbildung 15a ist die Kelchstruktur der Oberfläche auszumachen, Pfeile weisen auf Virionen hin.
0 5 10 15 20 25
-0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,9 1 1,1 1,4
Anteil in %
OD-Wert korrigiert
Negativ
67 Abbildung 15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von MNV-Virionen
(durch schwarze Pfeile gekennzeichnet).
a b
d c
68
4.7 Serologische Untersuchung von Anzeigertieren des zentralen Tierlaboratoriums auf MNV
Um einen Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL zu erhalten, wurden Seren, die im Rahmen der Jahresuntersuchung 2008 von Anzeigertieren gewonnen worden waren, zusätzlich mittels IFA auf gegen MNV gerichtete Antikörper untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst.
Tabelle 12: Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL im Jahr 2008
Haltungssystem Anzahl Tiere
positiv/getestet
Prävalenzrate (%)
Isolator 0/13 0
SPF-Zuchtbarriere 0/6 0
Experimentelle Haltungsbarriere* 121/205 59
Vergleich von zwei Tierräumen der experimentellen Haltungsbarriere, in denen alle Mäuse getestet wurden
Raum mit offenen Käfigen 174/200 87
Raum mit Filterdeckelkäfigen 104/155 67
*enthält eine Einheit mit einzeln belüfteten Käfigsystemen - individually ventilated cages (IVC) - mit 22/40 (55%) positiven Anzeiger-Mäusen
4.8 Infekionsversuche
1. Tierversuch
Im ersten Infektionsversuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse beider Geschlechter infiziert. Um einen Überblick über den bisher unbekannten Infektionsverlauf zu bekommen, wurden Sektionen nach zwei, vier und acht Wochen durchgeführt.
69 2. Tierversuch
Im zweiten Infektionsversuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse sowie der jeweilige Wildtyp infiziert. Folgernd aus den Daten der INFγ-Messungen des ersten Versuchs wurden zwei Sektionstermine (zwei und vier Wochen nach Infektion) festgelegt.
3. Tierversuch
Im dritten Infektionsversuch wurden Mäuse infiziert, um Daten des zweiten Versuchs zu ergänzen. Außerdem wurden männliche B6-Il-10-/- - Mäuse sowie männliche und weibliche Mäuse des zugehörigen Wildtyps infiziert und nach einer Woche seziert, um Erkenntnisse über den Infektionsstatus (vor allem die Stimulation der Lymphozyten) der Tiere eine Woche nach der Infektion zu bekommen. Eine zusätzliche Tiergruppe B6-wt Weibchen wurde infiziert und nach 3, 6, 9 und 12 Tagen seziert. Durch diese Gruppe sollte Aufschluss darüber geschaffen werden, wo und ab wann das Virus per PCR nachzuweisen ist. Daher wurde der Mesenteriallymphknoten der Tiere für den PCR-Nachweis verwandt.
4. Tierversuch
Im vierten Infektionsversuch wurden keimfreie männliche und weibliche C3-Il10 -/-Mäuse, die aus einem Isolator des ZTL stammten, mit MNV infiziert und vier Wochen bis zur Sektion in einem Mikroisolator gehalten. Dieser Versuch sollte zeigen, welche Einflüsse MNV auf Tiere ohne jegliche natürliche mikrobiologische Flora hat.
5. Tierversuch
In fünften Versuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse zuerst mit MNV infiziert.
Zwei Wochen später erfolgte eine zusätzliche Infektion mit H. hepaticus. Die Kontrolltiere wurden nur mit H. hepaticus infiziert. Mit diesem Versuch sollte ein möglicher Einfluss der MNV-Infektion auf die spätere H. hepaticus-Infektion untersucht werden. Die Sektion erfolgte dann sechs Wochen nach Infektion mit H.
hepaticus.
70
4.8.1 Klinik
In Tierversuch 1 bis 4 zeigten die mit MNV infizierten Mäuse bis zum Versuchsende ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Zu den Kontrolltieren war kein Unterschied festzustellen. In Tierversuch 5 zeigten die Tiere bis 40 Tage nach Infektion mit H.
hepaticus keine Auffälligkeiten. Erst am Sektionstermin war sowohl bei der Doppelinfektionsgruppe als auch bei der Kontrollgruppe ein leicht aufgekrümmter Rücken festzustellen. Die Tiere fraßen und tranken noch.
4.8.2 Sektion
Die Sektion der Tiere aus Tierversuch 1 bis 4 ergab keinerlei makroskopische Hinweise auf ein Infektionsgeschehen. Es bestand kein feststellbarer Unterschied zu den Kontrolltieren. In Tierversuch 5 waren sowohl bei der Doppelinfektions- als auch bei der Kontrollgruppe makroskopische Veränderungen feststellbar. Es handelte sich hierbei um ein geschwollenes Kolon.
4.8.3 Serologie
Die Untersuchung der gewonnenen Seren zeigte in der Immunfluoreszenz bereits am Tag 7 nach Infektion (Tierversuch 3) eine positive Reaktion. Ab Tag 9 p.i. lag die Serokonversion aller mit MNV infizierten Tiere (Tierversuch 1 bis 5) bei 100 %. Die Kontrolltiere hatten keine nachweisbaren Antikörper gegen MNV. Dies galt auch für die Kontrolltiere, die in einem separaten Filterdeckelkäfig im Käfigregalschrank mit den infizierten Tieren gehalten wurden.
71 4.8.4 Lymphozytenstimulation
4.8.4.1 Versuch 1
Um sicher zu gehen, dass genügend Lymphozyten für eine Stimulation aus den Mesenteriallymphknoten der Tiere zu Verfügung standen, wurden im ersten Versuch die Mesenteriallymphknoten nach Stamm und Geschlecht gepoolt. Die Lymphozyten wurden sechsfach pro Pool aufgetragen. Die IFNγ-Messwerte des ersten Infektionsversuchs sind in Abbildung 16 graphisch dargestellt. Hierbei zeigte sich, dass B6-Il10-/--Mäuse im Allgemeinen geringere Werte in der Lymphozyten-stimulation aufwiesen als C3-Il10-/--Mäuse; ein geschlechtlicher Unterschied innerhalb der Stämme konnte nicht beobachtet werden. Acht Wochen nach Infektion war kein weiterer Anstieg von IFNγ festzustellen. Die Lymphozytenstimulation der weiblichen Kontrolltiere (C3-Il10-/-) war nicht effektiv.
Die Präparation eines einzelnen MLK lieferte genügend Lymphozyten für den Versuchsaufbau. Um mehr verwertbare Daten bezüglich der Lymphozyten-Stimulation zu erhalten, wurden ab dem 2. Tierversuch Einzelpräparationen der Mesenteriallymphknoten pro Tier angefertigt, die dreifach aufgetragen wurden.
Tabelle 13: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 1 mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA für die 4 Gruppen:
Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i., 8 Wochen p.i.
Maus-Stamm B6-Il10-/- w B6-Il10-/- m C3-Il10-/- w C3-Il10-/- m S; p<0,0001 S; p<0,0001 NS; p=07358 S; p<0,0001 S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05
72
Tabelle 14: Posthoc-Analyse zum Vergleich der Gruppen von Infektionsversuch 1 untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest)
Maus-Stamm B6-Il10-/- w B6-Il10-/- m C3-Il10-/- w C3-Il10-/- m Kontrolle vs.
2 Wochen p.i. S S NS NS
Kontrolle vs.
4 Wochen p.i. NS NS NS S
Kontrolle vs.
8 Wochen p.i. NS NS NS n.d.
2 Wochen p.i. vs.
4 Wochen p.i. S S NS S
2 Wochen p.i. vs.
8 Wochen p.i. S S NS n.d.
4 Wochen p.i. vs.
8 Wochen p.i. NS NS NS n.d.
S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; w: weiblich; m: männlich; n.d.:
nicht durchgeführt (keine Messwerte vorhanden, weil Tiere verstorben sind); vs.:
versus
Abbildung 16: Infektionsversuch 1, Mittelwert und SEM der IFNγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Proben pro Stamm, Geschlecht und Zeitpunkt gepoolt).
73 4.8.4.2 Versuch 2
Die IFNγ-Sekretion der Darmlymphozyten aller im 2. Tierversuch mit MNV infizierten Mäuse war zwei Wochen p.i. erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (signifikant bei B6-Il10-/- Mäusen und dem zugehörigen Wildtyp). Vier Wochen p.i. war die INFγ-Sekretion im Vergleich zur Kontrollgruppe ebenfalls erhöht, signifikant jedoch nur bei C3-Il10-/--Mäusen.
Tabelle 15: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 2 mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA für die 3 Gruppen:
Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i.
Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i.