Materialliste

Zellkultur

Zelllinie RAW 264.7, DKFZ Heidelberg, Deutschland

Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Sicherheitswerkbank MSC 1.8, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Zellkultur-Flaschen 75 cm² Vented Cap, Straight Neck, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

25 Zellschaber Cell Scraper, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Medium DMEM High Glucose 4,5 g/l, L-Glutamin, 500 ml, PAA, Parching, Österreich Antibiotikum Penicillin (5000IU/ml) Streptomycin 5000 µg/ml, MP Biomedicals, Eschwege, Deutschland

Fetales Kälberserum Ultra Low Endotoxin, PAA, Parching, Österreich

Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Glas-Gewindeflaschen mit flachem Boden und Deckel, Omnilab, Bremen, Deutschland

Gefrierschrank Premium No-Frost, Liebherr, Biberach an der Riss, Deutschland -80° C Truhe 6385, GFL, Großburgwedel, Deutschland

Identifizierung, Sequenzierung

Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

Primer Fermentas, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland PTC Thermocycler-200^TM, MJ Research, Watertown, MA, USA

Phusion™ Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase, Finnzymes, Maahantuonti, Finnland

Stratagene StrataClone PCR Cloning Kit, Agilent, La Jolla, CA, USA QIAprep Spin Miniprep Kit (50), Qiagen, Hilden, Deutschland

Sequenzierung: MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland Software zur Analyse der Sequenz:

DNA Dynamo, Blue Tractor Software, North Wales, UK BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Nachweisverfahren IFA

Wasserbad 1008, GFL, Großburgwedel, Deutschland

Objektträger Cel-Line Diagnostic Microscope Slides 8 Well 8mm, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

PBS PBSM

26

Diluter Microlab 500, Hamilton-Robotics, Martinsried, Deutschland

Antikörper Anti Mouse IGG-FITC F0257, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Evans Blue, Fluka, Buchs, Schweiz

Fluoreszenzmikroskop DM2000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland Lichtquelle EL6000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland

ELISA

Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ultrazentrifuge L7, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Ultrazentrifugenrotor SW 28, SW 32, SW 55, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Bechereinsätze Centrifuge Tubes Polyallomer 32683; 326819 (SW55), Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Sucrose analytical grade, Serva, Heidelberg, Deutschland Waage LA 2200S, Sartorius, Göttingen

Waage ALJ 120-4, Kern und Sohn, Balingen-Frommern, Deutschland PBSM

Coating Buffer

Immuno-Modules U8 Maxisorp 475078, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Multikanal-Pipette Eppendorf, Hamburg, Deutschland Washer Columbus Pro, Tecan, Männedorf, Schweiz PBS Tween

Zweitantikörper Anti Mouse IGG Peroxidase, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland ABTS-Substrat Tablets 11 112 422 001, Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland Photometer Sunrise, Tecan, Männedorf, Schweiz

Laptop Inspiron 6000, Dell Deutschland, Frankfurt, Deutschland Software Magellan 5.03, Tecan, Männedorf, Schweiz

PCR-Nachweis

Für die RNA-Isolierung: Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren, Deutschland

27 Für die DNA-Isolierung: PSP® Spin Stool DNA Kit, Invitek, Berlin, Deutschland

Photometer Nanodrop 1000, Peqlab, Erlangen, Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

REDExtract-N-AmpTM PCR ReadyMix, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Taq PCR Core-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

Primer, Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Primer, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

DNA-Leiter, Biozym Art.-Nr.: 850321 (50321), Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf PTC Thermocycler-200^TM, MJ Research, Watertown, MA, USA

Magnetrührer L81, Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland Agarose LE Agarose, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf

DNA-Farbstoff Gelstar Nucleic Acid Gel Stain, Lonza, Basel, Schweiz 10x TBE

Orange G Ladepuffer, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

Gelschlitten, Gelkammer Eigenkonstruktion der MHH, Hannover, Deutschland Gleichstromgerät, Omnilab, Bremen, Deutschland

UV-Transilluminator, PC+Kamera, INTAS, Göttingen, Deutschland

Virusquantifizierung

Mikroskop, Zeiss, Jena, Deutschland

Neubauer-Zählkammer 0,1mm Tiefe; 0,0025mm² Fläche, Brand, Wertheim, Deutschland

Kristallviolett-Indikator, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

Plaque-Test

Platten Multi Dish 6 Well 140675, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Agarose SeaPlaque, Lonza, Basel, Schweiz TCID50-Test

96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

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Elektronenmikroskopische Darstellung

Tischultrazentrifuge Airfuge® im Institut für Virologie der MHH, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Elektronenmikroskop Elektronenmikroskopie-Labor MHH, Tecnai 20, FEI Europe;

Eindhoven, Niederlande

Hauptversuche Infektionsversuche

Sicherheitswerkbank Klasse II, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ventilierter Haltungsschrank, Scantainer, Scanbur Technology, Karlslunde, Dänemark

Mini-Isolator „Gnotocage“ (Deckel: Eigenkonstruktion der technischen Werkstatt der MHH; Unterbau: Multifunktionstopf Nalgene DS5300-9212), Hannover, Deutschland bzw. Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Filterdeckelkäfige Typ II, III, UNO, Roestvaststaal BV, Niederlande

Futter, pelletiertes Altromin© 1324 total pathogen free (TPF) Haltungsfutter, Altromin, Lage, Deutschland

Autoklaviertes Trinkwasser

Einstreu, Weichholzgranulat, Fichten- und Tannenholz, Hahn & Co, Bredenbeck-Kronsburg, Deutschland

Spritze, Spritzenkolben, Knopfkanüle/Braunüle zur Gavage, Braun, Melsungen, Deutschland

Histocassetten, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Lymphozytenstimulation

3-Polysterene-Reaktionsgefäße-Gefäße 15 ml, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Petrischalen, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Gewebesieb, 40µm BD Falcon M, BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland

29 Lymphozytenmedium

Zellzählgerät scil Vet ABC, scil animal care company, Viernheim, Deutschland 96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Anti-mCD3 (145-2C11) 1µg/µl

ELISA zur IFNBestimmung (extern: Arbeitsgruppe Detlef Neumann, MHH)

mIFN Antikörper eingesetzt als Fänger (an ELISA-Platte gebunden) und späterer Detektor, Pierce Antibodies, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

P96 Immuno MaxiSorb Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Beschichtungspuffer: 100 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6

Blockpuffer: PBS mit 4 % BSA Lymphozytenmedium

Waschpuffer: PBS mit 0,005 % Tween 20 Streptavidin-HRP 0,5 mg/ml

Substrat: 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine (TMB) 1 mg/ml in DMSO Substratpuffer: 1,36 g Natriumacetat x 3 H2O +

2,1 g Zitronensäuremonohydrat in 100 ml H2O (pH 4,9) 3% H2O2

Isolation und Anzucht von H. hepaticus für den Doppelinfektionsversuch (ZTL) Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Impföse, Omnilab, Bremen, Deutschland

Wattetupfer, Omnilab, Bremen, Deutschland

Polypropylen-Röhrchen, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Brain-Heart-Infusion Medium, Merck, Darmstadt, Deutschland 0,45 µm Weißrandfilter, Schleicher & Schuell, Basel, Schweiz

Petrischale Ø 60 mm, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Columbiaagar, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

Amphotericin B, Biochrom, Berlin, Deutschland

Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Skirrow), Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

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Pferdeblut, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

Anaerobiertopf HP0011A, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

1,5 ml Schraubdeckelgefäß Twist Top Vial und Twist Top Vial Caps, Sorenson BioScience, Salt Lake City, UT, USA

Stereomikroskop zur histologischen Auswertung

Zur statistischen Auswertung wurden folgende Programme genutzt:

StatView D-4.5, Abacus Corporation

Graphpad Prism 5, Graphpad Software Inc., La Jolla, CA, USA Excel 2003, 2007, Microsoft, Redmond, WA, USA

31 3.2 Methoden

In den ersten Versuchen mussten grundlegende Erkenntnisse zum Virus gesammelt werden. Das Virus war bereits isoliert worden, jedoch nicht klassifiziert. Außerdem mussten direkte und indirekte Nachweismethoden und Virusquantifizierungs-verfahren für den Infektionsversuch etabliert werden. Im Anschluss erfolgten Infektionsversuche, die den Einfluss einer MNV-Infektion auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus erfassen sollten.

3.2.1 Zellkultur

Die RAW 264.7 Zellen wurden in 75 ml Filterdeckel-Zellkulturflaschen mit DMEM, 2%

Penicillin-Streptomycin und 10% low endotoxine fetalem Kälberserum bei 37° C und 5% CO2-Begasung in einem Brutschrank kultiviert. Zum Passagieren wurde der Zell-rasen mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden dann in 5 ml vorbereitetem Medium und anschließend anteilig je nach gewünschter Zelldichte in insgesamt 25 ml Medium pro Zellkulturflasche resuspendiert.

3.2.2 Virusisolation

Die Virusisolation wurde von Mitarbeitern der MHH und der Firma Biodoc (Hannover, Deutschland) durchgeführt. Aus vorhergehenden wissenschaftlichen Veröffent-lichungen war bekannt, dass MNV weit verbreitet in versuchstierkundlichen Einrichtungen ist. Klinische Symptome blieben jedoch abhängig vom infizierten Mausstamm aus. Mesenteriallymphknoten und Milz waren als Virusreservoir beschrieben. Eine Virusvermehrung gelang in RAW 264.7 Zellen. Mehrere genetische Sequenzen von MNV-Isolaten waren bereits beschrieben. Als potentielle Virusträger wurden NOD-Prkdc^scid-Mäuse, die als Anzeigertiere im ZTL verwendet wurden, eingeschätzt. Von ihnen wurden im Rahmen einer diagnostischen Routine-Sektion Mesenteriallymphknoten und Milz gewonnen. Diese wurden bei -80° C eingefroren. Eine kleine Probe der Organe wurde für eine PCR-Untersuchung mit dem Primerpaar 5004f/5219r verwandt. Die PCR-Untersuchung ergab für Milz und Mesenteriallymphknoten der Mäuse einen positiven Befund. Daraufhin wurde ein Viertel der PCR-positiven Milz mit einem Cell-Douncer in DMEM homogenisiert.

32

Nach einer Zentrifugation bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) wurde der Überstand filtriert. Mit dem aus dem Milz-Isolat gewonnenen Überstand wurde eine zu 75%

besiedelte RAW-Zellkulturflasche beimpft. Nach zwei Tagen trat ein cytopathischer Effekt >90% auf, der bei einer parallel bebrüteten Kontrollflasche nicht zu beobachten war. Die beimpfte Zellkulturflasche wurde daraufhin bei -20° C eingefroren, aufgetaut, erneut eingefroren (-20° C) und dann aufgetaut. Das Medium inklusive cryolysierter RAW 264.7 Zellen sowie vermeintlicher Viruspartikel wurde bei 6000 U/min für 10 min (2800 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und filtriert, das Pellet wurde verworfen. Das Filtrat wurde in 1 ml Portionen konfektioniert und bei -80° C tiefgefroren.

3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR 3.2.3.1 RNA-Isolation

Da es sich bei Noroviren um RNA-Viren handelt, musste zuerst die Virus-RNA aus dem Filtrat gewonnen werden. Hierzu wurde das Macherey Nagel Kit NucleoSpin RNA II mit dem Support-Protokoll zur Isolation von Gesamt-RNA aus Zellkulturüberstand eingesetzt (siehe Anhang S.97). Bei der RNA-Isolation aus Organen wurde ebenfalls das vom Hersteller empfohlene Protokoll angewandt (siehe Anhang S. 97). Zur Isolation von Gesamt-RNA aus Kot wurde erfolgreich ein modifiziertes Protokoll angewandt, das der Hersteller auf Anfrage übersandte. Es handelte sich hierbei um die Modifikation eines Kunden, dem es auf diese Art und Weise gelungen war, RNA aus Kot zu isolieren (siehe Anhang S. 99).

3.2.3.2 Reverse Transkription

Um die isolierte RNA weiter zu analysieren, wurde diese mit Hilfe des Quiagen Omniscript RT-Kits umgeschrieben. Für den Reaktionsansatz wurde der RNA-Gehalt der Proben photometrisch bestimmt. Es erfolgte eine Einstellung auf 500 ng RNA pro 10 µl Ansatz.

33 Ansatz pro Probe

RT-Buffer 2 µl

dNTPs 5 µM 2 µl

Oligo(dT)18 20 µM bzw. Random Hexamer 1 µl RNAse-Inhibitor 1:4 verdünnt 1 µl

Reverse Transkriptase 1 µl

Eingestellte RNA 13 µl

Summe 20 µl

Temperaturprofil für die reverse Transkription Temperatur Dauer

37° C 60 min

3.2.3.3 PCR

Die gewünschten cDNA-Abschnitte wurden nun entweder mit dem Redextract-Kit oder dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit vervielfältigt, je nach verwendetem Primerpaar.

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Anhand von bereits publizierten Sequenzen verschiedener MNV-Stämme (MNV 1 - 4) wurden passende Primerpaare in einer genetisch konservierten Region entwickelt, mit denen möglichst viele Varianten von MNV reagieren; zusätzlich wurden Primerpaarsequenzen aus Publikationen übernommen.

Tabelle 10: Primmerpaare zum Nachweis von MNV mit Hilfe des Quiagen-Taq PCR Core-Kit (Primersequenzen siehe S. 22f.)

Name des Primerpaars Länge des

Amplikon

5205f/5388r 183 bp

5004f/5219r 215 bp

Nach Sequenzierung getestet:

5004f/5277r 273 bp

5580f/5671r modifiziert (MÜLLER et al. 2007) 91 bp 4972f/5080r (BAERT et al. 2008) 608 bp

5205f/5469r 264 bp

5473/5659r modifiziert (HSU et al. 2006) 186 bp

Die Probenansätze wurden anschließend mit nachfolgendem Temperaturprofil im Thermocycler zur Reaktion gebracht.

Zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA wurde das Housekeeping-Gen RPS-9 mit Hilfe des Primerpaares RPSRPS-9f/RPSRPS-9r nachgewiesen. Hierbei wurde das Redextract-Kit verwendet.

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3.2.4 Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR

Die Gesamt-DNA wurde aus den im Infektionsversuch gewonnenen Kotproben mit Hilfe des Invitek PSP® Spin Stool DNA Kit gemäß Herstellerprotokoll isoliert. Für die Detektion kamen die Primerpaare H276f/H676r und B38/B39 zum Einsatz. Mit dem Primerpaar H276f/H676r lassen sich 16S rRNA Gensequenzen der Helicobacter spp.

nachweisen (RILEY et al. 1996). Alle Helicobacter spp. ergeben ein 374-Basenpaarfragment. Das Primerpaar B38/B39 weist eine H. hepaticus spezifische 16S rRNA-Gensequenz nach (SHAMES et al. 1995). Das Basenpaarfragment ist 417 bp groß. Für beide Primerpaare wurde das Redextract-Kit verwendet.

Ansatz pro Probe

Temperaturprofil für die Helicobacter spp.- / H. hepaticus - PCR Temperatur Dauer

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3.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese

Für ein 1,5%iges Gel wurden 2,25 g Agarosepulver in 150 ml 1x TBE-Puffer gegeben und in der Mikrowelle erhitzt. Unter ständigem Rühren mittels Magnetrührer wurde die Agaroselösung auf 50° C abgekühlt. Dann wurden der Lösung 6 µl Gelstar DNA-Farbstoff zugefügt. Die Flüssigkeit wurde dann bis zu einer Höhe von 0,5 cm in den mit bis zu zwei 25er-Taschen-Kämmen präparierten Gelschlitten gegossen. Nach einem Auskühlen von 30 min konnten die Kämme gezogen werden, und das Gel war einsatzbereit.

Für die Elektrophorese wurde das Gel in die mit 1x TBE-Puffer gefüllte Gelkammer gelegt. Danach wurden die dem Thermocycler entnommenen Proben mit 4 µl Orange G Ladepuffer versehen, sofern der PCR-Ansatz mit dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit erstellt wurde. Ein mit Redextract erstellter PCR-Ansatz enthält bereits Ladepuffer.

Je nach Ansatz wurden pro Tasche 10-14 µl Probenvolumen einpipettiert. Zur Größendifferenzierung der Basenfragmente wurde in mindestens eine Tasche pro Kamm 6 µl einer standardisierten Basenleiter gegeben. Die anschließende Laufzeit bei 180 V 250 mA betrug ca. 45 min. Zur Auswertung wurde das Gel abschließend mit einem UV-Transilluminator betrachtet und digital fotografiert.

3.2.5 Sequenzierung

Die Klonierung und Vorbereitung für eine externe Sequenzierung wurde durch Herrn Dr. Nils-Holger Zschemisch vom ZTL durchgeführt. Aus Zellkulturüberstand isolierte MNV-RNA wurde mit dem Oligo(dT)18-Primer zu cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wurde als Template verwandt. Die Primerpaare für die PCR-Produkte, die kloniert wurden, sind Tabelle 6 (S.23) zu entnehmen. Der Primer Noro Hannover rev 3 entspricht dem Primer 15T-aTAG (MÜLLER et al. 2007). Die Klonierung und Transformation erfolgte gemäß Anweisungen und gelieferten Materialien des StrataClone^TM PCR Cloning Kit von Agilent Technologies. Detaillierte Protokolle sind zusätzlich in der Dissertation von Herrn Dr. Zschemisch zu finden (ZSCHEMISCH 2004).

37 Die Bakterienkulturen mit erfolgreich klonierten Abschnitten des MNV-Genoms in Plasmidform wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit gemäß Anweisungen des Herstellers aufgearbeitet. Abschließend erfolgte eine PCR mit den Primerpaaren, die in Tabelle 7 (S.23) genannt werden. Die Sequenzierung der drei PCR-Produkte wurde extern durch die Firma MWG Biotech AG durchgeführt. Eine Analyse der erhaltenen Sequenzen erfolgte auf einem Macbook mit DNA Dynamo und internetbasiert mit BLAST (ALTSCHUL et al. 1990).

3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch

Eine Portion des Virusisolats wurde zweimal mit RAW-Zellen passagiert, von dieser Passage wurden für Infektionsversuche und weitere Virusanzucht erneut 1 ml Portionen in sterile Glasfläschchen abgefüllt und bei -80° C tiefgefroren.

3.2.7 Virus-Titer-Bestimmung 3.2.7.1 Plaque-Test

Um den Virus-Titer zu bestimmen, wurde ein Plaque-Test durchgeführt. Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen auf einer 6er-Zellkultur-Platte in einer Dichte von 6 x 10⁵ Zellen/ml ausgesät. Die Zelldichte pro ml wurde durch Auszählung mit einer Neubauer Zellzählkammer bestimmt. Pro Vertiefung der Platte wurden 2,5 ml aufgetragen, was einer Gesamtzellzahl von 1,5 x 10⁶ Zellen pro Vertiefung entsprach. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am nächsten Tag wurden Zehner-Verdünnungen der Virussuspension für den Infektionsversuch angefertigt. Das ursprüngliche Zellmedium wurde von den Platten abgesaugt. Danach wurden pro Verdünnung 2 Vertiefungen als Doppelbestimmung mit 500 µl der angefertigten Virusverdünnungsreihe beimpft. Die Platten wurden danach eine Stunde im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C bebrütet.

Währenddessen wurde eine Lösung aus 2,5% SeaPlaque Agarose und ergänztem DMEM-Medium (10% FKS LE, 2% Penicillin-Streptomycin) hergestellt. Nach der einstündigen Inkubation wurde die Virussuspension von den Vertiefungen abgesaugt und durch 2,5 ml der vorbereiteten Agarose-Medium-Mischung ersetzt. Nachdem die

38

Agarose-Mediummischung bei Raumtemperatur erstarrt war, wurden die Platten bei 5% CO2 und 37° C für 48h bebrütet. Um die Auswertung zu erleichtern, wurden die Platten mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.

3.2.7.2 Auswertung eines Plaque-Tests

Die Löcher im Zellrasen werden bei zwei bis drei auszählbaren Verdünnungsstufen der Virussuspension erfasst und mit dem Kehrwert der Verdünnungsstufe multipliziert. Hierbei erhält man die Anzahl von plaqueforming units pro inokkuliertes Volumen der Virussuspension.

3.2.7.3 TCID50-Test

Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen in der Konzentration von 3 x 10⁴ Zellen/Vertiefung auf eine Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Pro Vertiefung wurden 100 µl Zellsuspension aufgetragen, dies entspricht einer Zellkonzentration der Suspension von 3 x 10⁵ Zellen/ml. Die Vertiefungen am Plattenrand wurden mit 300 µl Medium befüllt, um einer Verdunstung im Randbereich vorzubeugen. Die Platten wurden über Nacht bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am folgenden Tag wurde eine Verdünnungsreihe der Virussuspension in Zehnerschritten angelegt. Je 200 µl einer Verdünnungsstufe der Virussuspension wurden pro Vertiefung auf der Reaktionsplatte zugegeben. Je eine Reihe mit 10 Vertiefungen wurde mit einer Verdünnungsstufe befüllt. Eine Kontrollreihe bekam statt der Virussuspension 200 µl Medium. Dies entsprach einem Gesamtvolumen von 300 µl Flüssigkeit pro Vertiefung. Danach erfolgte eine weitere Bebrütung bei 5% CO2 und 37° C über acht Tage.

3.2.7.4 Auswertung eines TCID50-Tests

Zur Auswertung wurde der CPE optisch erfasst. Bereits der dem Nährmedium zugesetzte Indikator Phenolrot ließ eine Unterscheidung zwischen toten (rosa) und lebenden (gelb) RAW-Zellen in den Vertiefungen zu, zur Erleichterung wurde jedoch auch hier mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.

39 Die Berechnung der Viruskonzentration erfolgt mit der Formel nach Spearmann und Kärber.

Zuerst wurde die Verdünnungsstufe bestimmt, in der noch ein vollständiger CPE in allen Vertiefungen zu ermitteln ist. Diese Verdünnungsstufe ergab die Variable a (bei 10^-6 ist diese gleich -6). Für die Variable b wurden die Anzahl Vertiefungen mit CPE der niedrigeren Verdünnungsstufen zu der Anzahl Vertiefungen der Verdünnungsstufe mit vollständigem CPE addiert (10+9+2+1=22). Die Variable c war gleich der Gesamtzahl an Vertiefungen pro Verdünnungsstufe (in diesem Fall c=10).

Dies entsprach 10^7,7 TCID50/200 µl oder 2,5 x 10⁸ TCID50/ml.

3.2.8 Immunofluorescence Assay (IFA)

Dieser Test dient dazu, in einem Mausserum möglicherweise vorhandene Antikörper gegen MNV nachzuweisen. Entwickelt und validiert wurde der Test bei der Firma Biodoc. Verdünntes Maus-Serum wird hierbei auf Objektträger aufgetragen, die mit fixierten MNV-infizierten Zellen beschichtet sind. Die Auswertung erfolgt optisch mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops.

3.2.8.1 Herstellung und Anwendung der Objektträger für die Immunfluoreszenz Für diesen Test wurden RAW-Zellen in der Flasche kultiviert. Bei einer Zelldichte von 75% wurden diese mit 0,5 ml der eingefrorenen Virussuspension infiziert. Nach einer flexiblen Inkubationszeit von 4 bis 8 Stunden wurde das Medium entfernt, die Zellen abgeschabt und in 25 ml neuem Medium (DMEM, 2% Penicilin-Streptomycin, 10%

LE-FKS) pro Flasche suspendiert. Diese Zellsuspension wurde in 50 µl-Tropfen auf teflonbeschichtete 8-Loch-Objektträger aufgetragen. Danach erfolgte eine weitere

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Inkubation der Objektträger für 4 bis 8 Stunden im Brutschrank, bis die erwünschte Infektionsrate von 10 - 30% infizierter Zellen im Zellrasen erreicht war. Die Infektionsrate wurde zwischendurch durch Anfertigen von Probeobjektträgern gemäß dem Anwendungsprotokoll (siehe weiter unten) kontrolliert. Bei Erreichen der gewünschten Infektionsrate wurde das Medium von den Objektträgern abgesaugt.

Die Objektträger wurden an der Luft getrocknet und dann in einem Aceton-Bad für 10 min fixiert. Danach erfolgte eine abschließende Lufttrocknung. Die Objektträger wurden bis zum Gebrauch bei -20° C gelagert.

Anwendungsprotokoll der Objektträger bei Raumtemperatur:

Es wurden 32 µl des 1:20 mit PBS verdünnten Mausserums pro Kavität aufgetragen.

Anschließend folgten 20 Minuten Inkubationszeit. Dann wurde das Serum abgesaugt, und es wurden 50 µl PBS pro Kavität zum Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das PBS abgesaugt. Erneut wurden 50 µl PBS pro Kavität zum 2. Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das PBS abgesaugt. Jetzt wurden 25 µl des in PBSM 1:3000 verdünnten Fluoreszenz Anti-Maus-IGG-Antikörpers pro Kavität aufgetragen und für 20 Minuten inkubiert. Nachdem die Antikörperlösung abgesaugt worden war, wurden 50 µl PBS pro Kavität zum Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das PBS abgesaugt. Pro Kavität wurden erneut 50 µl PBS zum 2.

Spülen aufgetragen und nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten abgesaugt.

Abschließend wurden 50 µl Evan´s Blue pro Kavität zum Anfärben des Zellhintergrunds aufgetragen, die nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten wieder abgesaugt wurden. Der Objektträger konnte dann mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 320 facher Vergrößerung optisch beurteilt werden.

3.2.9 Virusaufreinigung mittels Ultrazentrifugation

MNV wurde wie bereits beschrieben angezüchtet. Nach zwei Einfrier-Auftauzyklen wurde der Flascheninhalt bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet verworfen. Die weitere Aufreinigung

41 erfolgte dann mit der Ultrazentrifuge. Zum Einsatz kam hierbei ein SW32-Rotor mit sechs Bechern. In einem matten Ultrazentrifugenröhrchen wurden 25 ml Überstand mit 5 ml einer 30% Sucrose-Lösung unterschichtet. Danach wurde für drei Stunden bei 27000 U/min (89500 x g) und 4° C zentrifugiert. Nach sorgfältigem Abgießen des Überstandes und der Sucrose-Lösung war ein hauchdünnes Pellet am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens zu sehen, das in je 50 µl PBSM resuspendiert wurde.

3.2.9.1 Weitergehende Aufreinigung über einen CsCl-Gradienten im SW55-Rotor

Hierfür wurde eine CsCl-Lösung mit einer Dichte von 1,3393 g/cm³ angesetzt (5,15 g CsCl auf 10 g H2O). In 9,5 ml dieser Lösung wurden 0,5 ml der PBSM-MNV-Suspension gegeben. Je 5 ml wurden auf zwei klare Ultrazentrifugenröhrchen verteilt. Die Zentrifugation im SW55-Rotor erfolgte für 18 Stunden bei 35000 U/min (116000 x g) und 4° C. Die sichtbare Bande wurde im Gegenlicht mit einer Spritze abgenommen und bei -20° C für eine weitere Verwendung gelagert.

3.2.9.2 Aufreinigung für elektronenmikroskopische Aufnahmen

MNV wurde wie bereits beschrieben angezüchtet. Nach zwei Auftauzyklen wurde der Flascheninhalt bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) zentrifugiert. Insgesamt 50 ml des Zellkultur-Überstands wurden abgenommen, das Pellet verworfen. Nun kam ein anderes Aufreinigungsprotokoll zum Einsatz, da CsCl-Ionen eine elektronen-mikroskopische Aufnahme erschweren. Je 2 ml Zellkulturüberstand wurden bei

MNV wurde wie bereits beschrieben angezüchtet. Nach zwei Auftauzyklen wurde der Flascheninhalt bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) zentrifugiert. Insgesamt 50 ml des Zellkultur-Überstands wurden abgenommen, das Pellet verworfen. Nun kam ein anderes Aufreinigungsprotokoll zum Einsatz, da CsCl-Ionen eine elektronen-mikroskopische Aufnahme erschweren. Je 2 ml Zellkulturüberstand wurden bei

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