Die problemlose Anzucht von MNV ermöglicht neue Erkenntnisse zur Tenazität des Erregers, was gerade im Bereich Hygieneforschung genutzt werden kann, um gegen humane Noroviren wirksame Desinfektionsmittel und Hygienestrategien zu entwickeln (CANNON et al. 2006).
Im Zellkulturmodell lassen sich Pathomechanismen ergründen, wie Noroviren Zellen schädigen und sich in ihnen vermehren. Dies ermöglicht unter Umständen die Entwicklung einer Impfung oder Akut-Therapie gegen humane Noroviren. Erste
92
Antikörper wurden durch Müller et al. auf Kreuzreaktivität und Effizienz erprobt (MÜLLER 2009).
MNV in der Labortierhaltung
Die serologischen Testverfahren ermöglichen eine Routine-Überwachung der Hygiene in Labortierhaltungen aufgrund der vorhandenen serologischen Kreuzreaktivität bei verschiedenen murinen Noroviren (HSU et al. 2006). Der Nachweis per PCR ist möglich, jedoch gibt es bisher kein Primerpaar, mit dem alle murinen Noroviren detektiert werden können. Dies sollte bei Hygieneuntersuchungen bedacht werden. Ein negatives PCR-Ergebnis muss nicht zwangsläufig für einen negativen Bestand stehen (HENDERSON 2008).
MNV hat in der vorliegenden Arbeit keine klinischen Auswirkungen auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus gehabt. Jedoch kann zum Beispiel eine akute MNV-Infektion bei IL10-defizienten Mäusen im Tierversuch zu falschen Vergleichswerten bei einer in vitro Lymphozytenstimulation in der INFγ-Bestimmung führen. Auch leichte histologische Veränderungen sind möglich. Diese Effekte können Ergebnisse in Versuchen mit der IL10-defizienten Maus als Tiermodell für CED verändern. Ein Einfluss von MNV auf andere Mausmodelle kann nicht ausgeschlossen werden. Weitere Untersuchungen hierzu sind empfehlenswert und notwendig. Es wurden zudem MNV-Isolate mit unterschiedlichen Eigenschaften beschrieben. So kann MNV-1 bei schwer immundefizienten Mäusen (RAG2- und STAT1-defizient) zu tödlichen systemischen Erkrankungen führen (KARST et al.
2003).
Da eine Diagnostik im Rahmen der Routine-Überwachung möglich ist, sollte MNV daher im Tierbestand langfristig ausgeschlossen werden. Hygienemaßnahmen und Standardmethoden der Bestandssanierung haben Erfolg gezeigt (ARTWOHL et al.
2008; COMPTON 2008).
93
6 Zusammenfassung
Marcel Achard
„Charakterisierung eines murinen Norovirus – Auswirkungen des Virus auf die experimentelle chronisch entzündliche Darmerkrankung bei der IL10-defizienten Maus“
Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein murines Norovirus (MNV), das aus Anzeiger-Mäusen des Zentralen Tierlaboratoriums (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) isoliert wurde, charakterisiert. Die genetische Sequenz wurde bestimmt und wies eine 95% Übereinstimmung zu MNV-4 auf. Sie wurde unter der Zugangsnummer EU854589 veröffentlicht. Zusätzlich wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen der Virusstruktur erstellt.
Die erfolgreiche Anzucht und Vermehrung von MNV in RAW 264.7-Zellen ermöglichte die Etablierung diagnostischer Tests in Form von PCR und Serologie (ELISA). Mit Hilfe der serologischen Diagnostik wurde die Prävalenz für MNV im Zentralen Tierlaboratorium der MHH für den Überwachungszeitraum 2007/2008 erfasst. MNV-positive Anzeiger-Mäuse wurden nur in der experimentellen Barriere gefunden. Die Prävalenzrate bewegte sich je nach Tierraum zwischen 8% und 61%.
Die Auswirkung von MNV auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus (Il10-/-) wurde anhand von zwei genetischen Hintergrundstämmen, C3H/HeJBirZtm (C3) sowie C57BL/6JZtm (B6), im Infektionsversuch untersucht. Alle infizierten Mäuse wiesen eine Serokonversion auf. Es kam zu keiner klinischen Beeinträchtigung. MNV war bei den infizierten Mäusen nur in Organen des Gastrointestinaltraktes per PCR nachweisbar. Kot, Kolon und Mesenteriallymphknoten waren als Probenmaterial besonders geeignet für einen PCR-Erregernachweis.
94
Es konnten keine schwerwiegenden histologischen Veränderungen im Vergleich zu nicht mit MNV infizierten Kontrollmäusen ausgemacht werden. Bei einigen mit MNV infizierten C3-Il10-/--Mäusen wurden jedoch sehr milde fokale entzündliche Veränderungen im Kolon festgestellt. Die Interferon (INF)γ-Sekretion in vitro stimulierter Darmlymphozyten von mit MNV infizierten Mäusen war 2 Wochen nach der Infektion erhöht im Vergleich zur nicht infizierten Kontrollgruppe. Bei infizierten C3-Il10-/--Mäusen war die IFNγ-Sekretion 4 Wochen nach der Infektion weiterhin erhöht.
Keimfrei gehaltene C3-Il10-/--Mäuse, die mit MNV infiziert wurden, wiesen 4 Wochen nach der Infektion keine entzündlichen histologischen Veränderungen oder eine gesteigerte IFNγ-Sekretion auf. Demnach kann MNV nur in Verbindung mit einer endogenen bakteriellen Darmflora einen kolitogenen Stimulus erzeugen.
Ein Doppelinfektionsversuch mit MNV und 14 Tage später mit Helicobacter (H.) hepaticus sollte zeigen, ob eine vorhergehende Infektion mit MNV eine entzündliche Darmerkrankung, ausgelöst durch H. hepaticus, verstärken kann. Die Kontrollgruppe wurde nur mit H. hepaticus infiziert. Alle Mäuse wurden 6 Wochen nach der Infektion mit H. hepaticus seziert. Die Befunde der Klinik, Histologie und IFNγ-Sekretion wiesen keine deutlichen Unterschiede auf. Hieraus lässt sich folgern, dass MNV die Entwicklung einer durch H. hepaticus hervorgerufenen Entzündung bei der IL10-defizienten Maus nicht verstärkt. Dennoch zeigen die vorhergehenden Versuche, dass die Interaktion von MNV mit einer endogenen apathogenen Darmflora bei der IL10-defizienten Maus zu einer milden Entzündungsreaktion im Darm führen kann.
Dies macht MNV zu einem nicht zu vernachlässigenden Faktor im Tierversuch.
95
7 Summary
Marcel Achard
“Characterization of a murine norovirus – the impact of the virus on experimental inflammatory bowel disease in IL10-deficient mice”
Aim of this study was to characterize a murine norovirus (MNV) that was isolated from sentinel-mice of the Central Animal Facility (Ztm) at Hannover Medical School.
Genetic sequencing was performed and showed 95% identity with MNV-4. The sequence was published under the accession number EU85489. Additionally, the virus structure of MNV was depicted by electron microscopy.
The successful replication of MNV in RAW 264.7-cells allowed us to establish several diagnostic tests as PCR and serology (ELISA). Therefore, it was possible to determine the prevalence of MNV at the Ztm for the years of 2007 and 2008. MNV-positive mice were only found in the experimental barrier. Prevalence among animal rooms differed from 8% to 61%.
In order to analyse the influence of MNV on IL10-defficient mice (Il10-/-), Il10-/- mice on genetic background strains C3H/HeJBirZtm (C3) and C57BL/6JZtm (B6) were experimentally infected. Although seroconversion could be detected in all infected animals, no clinical effects were visible. The detection of MNV in infected mice was solely possible in organs of the gastro-intestinal tract. Faeces, colon and mesenteric lymph nodes were suitable material for the detection of MNV via PCR.
Histological examinations of MNV-positive mice did not show grave differences in comparison to control mice. Nevertheless, few individuals belonging to the C3-Il10 -/-group showed mild focal inflammations of the colon. In vitro stimulated intestinal lymphocytes of MNV-positive mice secreted significantly more interferon (IFN)γ two
96
weeks post infection (p.i.) than those of the control group. Infected animals belonging to the C3-Il10-/- group showed an increased IFNγ-secretion up to four weeks p.i.
Sterile housed C3-Il10-/--mice that were infected with MNV neither showed inflammatory changes of the colon nor an increased secretion of IFN-γ four weeks p.i. Therefore, MNV is only able to induce a colitogenic stimulus in combination with an endogenous bacterial intestinal flora.
A dual infection experiment with MNV and Helicobacter (H.) hepaticus (14 days subsequent to the MNV infection) was intended to clarify the question, whether a preceding infection with MNV aggravates inflammatory diseases of the bowel. A control group was only infected with H. hepaticus. All mice were sacrificed six weeks p.i. with H. hepaticus. No obvious differences in clinical signs, intestinal pathology or INFγ secretion were observed. Therefore, it is suggested that MNV does not exacerbate inflammatory diseases resulting from a H. hepaticus infection in IL10-deficient mice. Nevertheless, the preceding experiments demonstrate the interaction of MNV with the endogenous, non-pathogenic intestinal flora in IL10-deficient mice.
Thus, an infection with MNV should be considered as a confounding variable in animal experimentation using mouse models.
97
8 Anhang
Protokoll zur Isolation von RNA aus Zellkulturüberstand bzw. Organen (gemäß Hersteller Macherey-Nagel)
1) Bis zu 30 mg Gewebe werden zerkleinert bzw. homogenisiert und in ein steriles Eppendorfgefäß gegeben; bei Zellkulturüberstand ist dieser Schritt nicht nötig.
2) 350 µl RA1-Puffer und 3,5 µl ß-Mercaptoethanol werden hinzugegeben;
anschließend wird die Probe für 1 min gevortext.
3) Ein NucleoSpin®- Filter wird in ein Sammelröhrchen gesteckt; Sammelröhrchen gestellt. 350 µl Membrane Desalting Buffer werden auf die Säule gegeben, dann wird für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert.
7) 95 µl vorbereitete DNase-Reaktionsmixtur werden auf die Säule gegeben, danach erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
8) Ein erster Waschschritt erfolgt mit 200 µl RA2-Puffer, der auf die Säule gegeben wird. Dann wird für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gesetzt. Ein zweiter Waschschritt erfolgt mit 600 µl RA3-Puffer für 30 s bei 11000 x g. Die Flüssigkeit im Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in das Sammelröhrchen zurückgestellt. Ein dritter Waschschritt erfolgt mit 250 µl RA3-Puffer für 2 min bei 11000 x g. Anschließend wird die Säule in ein nukleasefreies Sammelröhrchen gesetzt.
98
9) Zum Abschluss wird die RNA mit 40 – 60 µl RNase-freiem Wasser eluiert, das auf die Säule gegeben wird. Es erfolgt ein letzter Zentrifugationsschritt bei 11000 x g für 1 min.
99 Protokoll zur Isolation von RNA aus Kot (gemäß Hersteller Macherey-Nagel, modifiziert durch Kunden)
1) Zur Kotprobe werden 350 µl des vorbereiteten ß-Mercaptoethanol-RA1 gegeben.
2) Anschließend wird die das Gemisch für 2 min gevortext.
3) Ein NucleoSpin®- Filter wird in ein Sammelröhrchen gesteckt;
anschließend wird das Gemisch auf den Filter aufgetragen und für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert.
4) Der Überstand wird in ein neues Gefäß überführt, das sichtbare Pellet verworfen.
5) Zum Überstand werden 350 µl 70% Ethanol gegeben.
6) Nach einer Inkubation von 5 min wird das Gemisch nach mehrmaligem Durchmischen mit der Pipette auf eine NucleoSpin® RNA II-Säule aufgetragen und für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert.
7) Das Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gestellt. 350 µl Membrane Desalting Buffer werden auf die Säule gegeben, dann wird für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert.
8) 95 µl vorbereitete DNase-Reaktionsmixtur werden auf die Säule gegeben, danach erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
9) Ein erster Waschschritt erfolgt mit 200 µl RA2-Puffer, der auf die Säule gegeben wird. Dann wird für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gesetzt.Ein zweiter Waschschritt erfolgt mit 600 µl RA3-Puffer für 30 s bei 11000 x g. Die Flüssigkeit im Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in das Sammelröhrchen zurückgestellt.Ein dritter Waschschritt erfolgt mit 250 µl RA3-Puffer für 2 min bei 11000 x g. Anschließend wird die Säule in ein nukleasefreies Sammelröhrchen gesetzt.
10) Zum Abschluss wird die RNA mit 40 – 60 µl RNase-freiem Wasser eluiert, das auf die Säule gegeben wird. Es erfolgt ein letzter Zentrifugationsschritt bei 11000 x g für 1 min.
100
101
3,438 0,876 2,562 2,44833333 0,19342268
1:100 2,741 0,527 2,214
2,327 0,335 1,992 2,02666667 0,22897671
1:800 1,826 0,248 1,578
1,725 0,244 1,481
1,693 0,237 1,456 1,505 0,06444377
102
Einzelmessungen
Negativ-Seren N=68
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 68 negativen Seren)
103
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 68 negativen Seren) 10083 - 0,577 0,586 -0,01
10099 - 0,265 0,273 -0,01 11152 - 0,26 0,267 -0,01
10084 - 0,258 0,26 0,00
10092 - 0,31 0,305 0,01
11155 - 0,146 0,126 0,02
10090 - 0,31 0,286 0,02
11151 - 0,324 0,298 0,03 10087 - 0,212 0,181 0,03 10086 - 0,611 0,578 0,03
11159 - 0,214 0,18 0,03
11154 - 0,296 0,26 0,04
10081 - 0,267 0,23 0,04
11160 - 0,217 0,177 0,04 10082 - 0,228 0,186 0,04 10085 - 0,303 0,253 0,05 11148 - 0,312 0,255 0,06 10100 - 0,319 0,231 0,09 4771 - 0,525 0,433 0,09
11157 - 1,54 1,441 0,10 1,47
10094 - 1,306 1,155 0,15 4,41
10091 - 0,822 0,653 0,17 4770 - 0,535 0,324 0,21
104
Positiv-Seren N=76
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 76 positiven Seren)
105
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 76 positiven Seren)
+: schwach positive Reaktion; ++: Mittelstarke positive Reaktion; +++: Stark positive Reaktion NSR: Nicht spezifische Reaktion; +/-: Grenzwertige Reaktion; EL+: Charles-River-ELISA positiv
106
Negativ-Seren N=205
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 205 Seren)
107
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 205 Seren)
108
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 205 Seren)
109
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 205 Seren)
110
Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil (von 205 Seren)
3007 - 1,482 0,845 0,637
3545 - 1,78 1,131 0,649
3120b - 1,515 0,854 0,661 2,44
3780 - 1,877 1,194 0,683
2966 - 1,802 1,117 0,685
3649 - 2,998 2,276 0,722
3008 - 3,578 2,832 0,746
3650 - 1,365 0,482 0,883 0,49
3647 - 4,636 3,653 0,983 0,49
3828 - 2,185 1,078 1,107 0,49
3798 - 2,428 1,006 1,422 0,49
111 Werte der Interferon γ-Messung (ng/ml) nach in vitro Stimulation
Infektionsversuch 1
112 0,9803333 5,724667 1,910667 2,636333 0,9276667 0,7946666 2,797 2,543333 1,611333 0,4786667 0,2743333 2,458667 2,001667 2,554 3,642333 0,4215 3,029 2,399333 3,100333 3,239667
1,141667 0,755 1,194667 2,242333
7,518667 1,182 5,492
C3-Il10-/- C3-wt
Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen 0,356 11,80267 13,99133 8,830667 8,487667 31,18133 6,646333 21,56933 21,15 3,773 24,67033 6,955 6,281333 19,142 38,412 2,569667 3,464667 9,635667 3,556667 17,75833 25,58133 2,814667 11,23733
3,849333 8,013 12,546 5,164667
0,9536667 3,396667 1,747 0,5966667 0,4835 2,374333 1,092333 1,172333 0,7356667 4,499 0,5336667 10,182 6,007 0,705 0,463 0,5565 3,774 0,429 1,819 2,051 3,633667
113 Infektionsversuch 4
C3-Il10-/- ( keimfrei)
Kontrolle 4 Wochen 0,9279273 0,756581 0,969763 1,001276 1,777933 1,445699 1,157028 0,830935 1,817827
Infektionsversuch 5
C3-Il10-/- B6-Il10-/-
H.hepaticus MNV + H.hepaticus H.hepaticus MNV + H.hepaticus
33,9378 26,05871 38,18218 46,39897
48,97928 50,26017 42,69127 9,08253
38,03638 45,06061 57,02307 24,43101
53,10282 54,62005 16,87314 12,40349
36,76929 55,69619 40,08938 36,34947
51,71358 50,76093 61,21308
114
TJL-Histologie-Werte für Infektionsversuch 5 Zäkum
C3-Il10-/- B6-Il10-/-
Helico Helico+MNV Helico Helico+MNV
5 4 8 6
6 4 6 5
5 5 7 5
6 6 5 5
5 5 7 7
7 7 5
Kolon
Helico Helico+MNV Helico Helico+MNV
11 10 15 18
14 7 14 12
11 10 14 6
12 12 11 12
10 7 17 13
10 11 12
Helico: Infektion mit H. hepaticus; Helico+MNV: Doppelinfektion mit MNV und H.
hepaticus
115
9 Literaturverzeichnis
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