Mäuse

In der Zeit vom 2.4.2008 bis 6.5.2009 wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Mäuseinzucht- und Defektmutantenstämme für den Infektionsversuch mit dem murinen Norovirus Stamm Hannover eingesetzt. Im Weiteren werden für eine übersichtlichere Gestaltung nur noch die entsprechenden Abkürzungen für die Mausstämme benutzt.

Tabelle 3: Verwendete Mausstämme und ihre Abkürzung

Stammbezeichnung Knockout/

Wildtyp Abkürzung

C3H/HeJBirZtm Wildtyp C3-wt

C57BL/6JZtm Wildtyp B6-wt

C3Bir.129P2-Il10^tm1Cgn/JZtm Knockout C3-Il10 -/-B6.129P2-Il10^tm1Cgn/JZtm Knockout B6-Il10 -/-3.1.2 Herkunft

Alle im Experiment eingesetzten Mäuse stammten aus Zuchten des ZTL der MHH.

Sie wurden dort regelmäßigen, mikrobiologischen Kontrolluntersuchungen entsprechend den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) unterzogen (NICKLAS et al. 2002). Die Versuchstiere entstammten aus Haltungsbereichen, die frei von bakteriellen, viralen (inklusive MNV) und parasitären Infektionserregern gemäß der Empfehlungsliste der FELASA waren.

19 3.1.3 Haltung im Experiment

Die experimentell infizierten Mäuse wurden im S2-Bereich des ZTL der MHH in einem belüfteten Käfigregalschrank (Scantainer) gehalten. Es wurden jeweils 1-5 Mäuse in Makrolon-Käfigen des Typs II oder III mit Filterdeckeln getrenntgeschlechtlich gehalten. Die Kontrolltiere wurden bis auf 5 Tiere in der Haltungsabteilung belassen, um eine mögliche Kontamination mit MNV zu vermeiden. Die 5 Kontrolltiere, die gesondert mit im Käfigregalschrank saßen, wurden daher zuerst umgesetzt und versorgt. Futter (Tabelle 4) und autoklaviertes Trinkwasser (über Tränkeflaschen) wurden ad libitum angeboten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal in der Woche erneuert. Die Reinigung der Käfige erfolgte routinemäßig. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2° C, die relative Luftfeuchte lag bei 55 ± 5%. Der Hell-Dunkel-Zyklus wurde automatisch geregelt; es herrschte ein Lichtrhythmus von 14 Stunden Helligkeit zu 10 Stunden Dunkelheit, wobei die Hellphase von 7 bis 21 Uhr mitteleuropäischer Zeit (MEZ) dauerte.

Tabelle 4: Zusammensetzung von Altromin 1324 TPF Inhaltsstoffe Prozent %

Rohprotein 19,0

Rohfett 4,0

Rohfaser 6,0

Rohasche 7,0

Kalzium 0,9

Phosphor 0,7

Zusatzstoffe je Kilogramm

Vitamin A 15000 I.E.

Vitamin D3 600 I.E.

Vitamin E 75 mg

Vitamin C 36 mg

Kupfer 5 mg

20

Verwendete Lösungen

Alle verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, über die Firma Carl Roth in Karlsruhe bezogen.

Phosphate buffered saline (PBS) (pH = 7,2)

Menge

NaCl (Natriumchlorid) 8,00 g

KCl (Kaliumchlorid) 0,20 g

Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) 1,15 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 0,20 g

Aqua bidest. 1,0 l

NaCl (Natriumchlorid) 8,00 g

KCl (Kaliumchlorid) 0,20 g

Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) 2,90 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 0,20 g

Aqua bidest. 1,0 l

Tween 20 0,5 ml

PBSM (pH = 7,2)

Menge

NaCl (Natriumchlorid) 8,00 g

KCl (Kaliumchlorid) 0,20 g

Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) 1,15 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 0,20 g

Aqua bidest. 800 ml

21 Coating Buffer (ph = 9,6)

Menge Na2CO3 (Natriumcarbonat, wasserfrei) 1,59 g NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat) 2,93 g

Aqua bidest. 1,0 l

Konjugate

Hersteller/

Artikelnummer Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-FITC Sigma / Art. F 0257 Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Peroxidase Sigma / Art. A 4416 10x TBE-Puffer

Dulbecco´s Modified Eagle´s medium (DMEM) 22 ml Fetales Kälberserum (FKS) Ultra Low Endotoxin (L.E.) 2,5 ml

Penicillin-Streptomycin 0,5 ml

22

FKS Ultra Low Endotoxin 25 ml

NEA (nicht essentielle Aminosäuren) 5 ml

L-Glutamin 5 ml

2-Mercaptoethanol 0,5 ml

Pyruvat 5 ml

Penicillin-Streptomycin 5 ml

Neutrales Formalin nach Sörensen (10%ig)

Puffer A Menge Hexamer Primer der Firma Fermentas vergleichend eingesetzt.

Die zur Detektion und Sequenzierung verwendeten Primer wurden von der Firma Sigma Aldrich bezogen.

Tabelle 5: Primer zur Detektion von MNV Sequenz von 5´ nach 3´

5205f AATTGACCCCTGGATCTTCC 5388r GACCAGCTGAACCTCCATGT 5469r AGTGGTGAGTGACCCTTTGG

23 Tabelle 6: Primer zur Klonierung von MNV

Sequenz von 5´ nach 3´

Noro Hannover for 1 GTGAAATGAGGATGGCAACG Noro Hannover rev 1 GTGATGACATCTGTGGCCAT Noro Hannover for 2 ATGGCCACAGATGTCATCAC Noro Hannover rev 2 GGAAGCATGTGATCTGAGCA Noro Hannover for 3 TGCTCAGATCACATGCTTCC

Noro Hannover rev 3 GCCAACGACCGGGAGGCCAGCTTTTTTTTTTTTTTTV Tabelle 7: Primer zur Sequenzierung von MNV

Sequenz von 5´ nach 3´

Tabelle 8: Primer zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA Sequenz von 5´ nach 3´

RPS9f TGACGTTGGCGGATGAGCACA RPS9r TTTTTGACAGGGGGAGTGG

Hierbei wurde das Housekeeping Gen RPS-9 nachgewiesen.

24

Tabelle 9: Primer zur Detektion von Helicobacter (H.) hepaticus Sequenz von 5´ nach 3´

H276f CTATGACGGGTATCCGGC H676r ATTCCACCTACCTCTCCCA B38 GCATTTGAAACTGTTACTCTG B39 CTGTTTTCAAGCTCCCCGAAG 3.1.5 Zelllinie

Zur Anzucht von MNV wurden RAW 264.7 Zellen verwendet (ATCC TIB-71™). Es handelt sich hierbei um eine Mausmakrophagenzelllinie, die vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde. Die Zelllinie wurde von der Firma QM Diagnostics (Nimwegen, Niederlande) per PCR negativ auf Mycoplasmen getestet.

3.1.6 Eingesetzter Virusstamm

Der im Experiment eingesetzte Virusstamm wurde aus NOD-Prkdc^scid-Mäusen des ZTL der MHH isoliert und nach genetischer Charakterisierung als Murines Norovirus/Hannover1/2007/DEU (MNV-h) bezeichnet.

3.1.7 Eingesetzter Bakterienstamm

Der im Experiment eingesetzte Bakterienstamm H. hepaticus wurde im ZTL der MHH von Mitarbeitern des mikrobiologischen Labors im Rahmen der wissenschaftlichen Arbeit von Frau Büchler isoliert und angezüchtet (BÜCHLER 2010).

3.1.8 Materialliste Vorversuche

Zellkultur

Zelllinie RAW 264.7, DKFZ Heidelberg, Deutschland

Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Sicherheitswerkbank MSC 1.8, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Zellkultur-Flaschen 75 cm² Vented Cap, Straight Neck, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

25 Zellschaber Cell Scraper, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Medium DMEM High Glucose 4,5 g/l, L-Glutamin, 500 ml, PAA, Parching, Österreich Antibiotikum Penicillin (5000IU/ml) Streptomycin 5000 µg/ml, MP Biomedicals, Eschwege, Deutschland

Fetales Kälberserum Ultra Low Endotoxin, PAA, Parching, Österreich

Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Glas-Gewindeflaschen mit flachem Boden und Deckel, Omnilab, Bremen, Deutschland

Gefrierschrank Premium No-Frost, Liebherr, Biberach an der Riss, Deutschland -80° C Truhe 6385, GFL, Großburgwedel, Deutschland

Identifizierung, Sequenzierung

Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

Primer Fermentas, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland PTC Thermocycler-200^TM, MJ Research, Watertown, MA, USA

Phusion™ Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase, Finnzymes, Maahantuonti, Finnland

Stratagene StrataClone PCR Cloning Kit, Agilent, La Jolla, CA, USA QIAprep Spin Miniprep Kit (50), Qiagen, Hilden, Deutschland

Sequenzierung: MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland Software zur Analyse der Sequenz:

DNA Dynamo, Blue Tractor Software, North Wales, UK BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Nachweisverfahren IFA

Wasserbad 1008, GFL, Großburgwedel, Deutschland

Objektträger Cel-Line Diagnostic Microscope Slides 8 Well 8mm, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

PBS PBSM

26

Diluter Microlab 500, Hamilton-Robotics, Martinsried, Deutschland

Antikörper Anti Mouse IGG-FITC F0257, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Evans Blue, Fluka, Buchs, Schweiz

Fluoreszenzmikroskop DM2000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland Lichtquelle EL6000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland

ELISA

Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ultrazentrifuge L7, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Ultrazentrifugenrotor SW 28, SW 32, SW 55, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Bechereinsätze Centrifuge Tubes Polyallomer 32683; 326819 (SW55), Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Sucrose analytical grade, Serva, Heidelberg, Deutschland Waage LA 2200S, Sartorius, Göttingen

Waage ALJ 120-4, Kern und Sohn, Balingen-Frommern, Deutschland PBSM

Coating Buffer

Immuno-Modules U8 Maxisorp 475078, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Multikanal-Pipette Eppendorf, Hamburg, Deutschland Washer Columbus Pro, Tecan, Männedorf, Schweiz PBS Tween

Zweitantikörper Anti Mouse IGG Peroxidase, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland ABTS-Substrat Tablets 11 112 422 001, Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland Photometer Sunrise, Tecan, Männedorf, Schweiz

Laptop Inspiron 6000, Dell Deutschland, Frankfurt, Deutschland Software Magellan 5.03, Tecan, Männedorf, Schweiz

PCR-Nachweis

Für die RNA-Isolierung: Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren, Deutschland

27 Für die DNA-Isolierung: PSP® Spin Stool DNA Kit, Invitek, Berlin, Deutschland

Photometer Nanodrop 1000, Peqlab, Erlangen, Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

REDExtract-N-AmpTM PCR ReadyMix, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Taq PCR Core-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

Primer, Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Primer, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

DNA-Leiter, Biozym Art.-Nr.: 850321 (50321), Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf PTC Thermocycler-200^TM, MJ Research, Watertown, MA, USA

Magnetrührer L81, Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland Agarose LE Agarose, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf

DNA-Farbstoff Gelstar Nucleic Acid Gel Stain, Lonza, Basel, Schweiz 10x TBE

Orange G Ladepuffer, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

Gelschlitten, Gelkammer Eigenkonstruktion der MHH, Hannover, Deutschland Gleichstromgerät, Omnilab, Bremen, Deutschland

UV-Transilluminator, PC+Kamera, INTAS, Göttingen, Deutschland

Virusquantifizierung

Mikroskop, Zeiss, Jena, Deutschland

Neubauer-Zählkammer 0,1mm Tiefe; 0,0025mm² Fläche, Brand, Wertheim, Deutschland

Kristallviolett-Indikator, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

Plaque-Test

Platten Multi Dish 6 Well 140675, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Agarose SeaPlaque, Lonza, Basel, Schweiz TCID50-Test

96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

28

Elektronenmikroskopische Darstellung

Tischultrazentrifuge Airfuge® im Institut für Virologie der MHH, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Elektronenmikroskop Elektronenmikroskopie-Labor MHH, Tecnai 20, FEI Europe;

Eindhoven, Niederlande

Hauptversuche Infektionsversuche

Sicherheitswerkbank Klasse II, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ventilierter Haltungsschrank, Scantainer, Scanbur Technology, Karlslunde, Dänemark

Mini-Isolator „Gnotocage“ (Deckel: Eigenkonstruktion der technischen Werkstatt der MHH; Unterbau: Multifunktionstopf Nalgene DS5300-9212), Hannover, Deutschland bzw. Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Filterdeckelkäfige Typ II, III, UNO, Roestvaststaal BV, Niederlande

Futter, pelletiertes Altromin© 1324 total pathogen free (TPF) Haltungsfutter, Altromin, Lage, Deutschland

Autoklaviertes Trinkwasser

Einstreu, Weichholzgranulat, Fichten- und Tannenholz, Hahn & Co, Bredenbeck-Kronsburg, Deutschland

Spritze, Spritzenkolben, Knopfkanüle/Braunüle zur Gavage, Braun, Melsungen, Deutschland

Histocassetten, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Lymphozytenstimulation

3-Polysterene-Reaktionsgefäße-Gefäße 15 ml, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Petrischalen, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Gewebesieb, 40µm BD Falcon M, BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland

29 Lymphozytenmedium

Zellzählgerät scil Vet ABC, scil animal care company, Viernheim, Deutschland 96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Anti-mCD3 (145-2C11) 1µg/µl

ELISA zur IFNBestimmung (extern: Arbeitsgruppe Detlef Neumann, MHH)

mIFN Antikörper eingesetzt als Fänger (an ELISA-Platte gebunden) und späterer Detektor, Pierce Antibodies, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

P96 Immuno MaxiSorb Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Beschichtungspuffer: 100 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6

Blockpuffer: PBS mit 4 % BSA Lymphozytenmedium

Waschpuffer: PBS mit 0,005 % Tween 20 Streptavidin-HRP 0,5 mg/ml

Substrat: 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine (TMB) 1 mg/ml in DMSO Substratpuffer: 1,36 g Natriumacetat x 3 H2O +

2,1 g Zitronensäuremonohydrat in 100 ml H2O (pH 4,9) 3% H2O2

Isolation und Anzucht von H. hepaticus für den Doppelinfektionsversuch (ZTL) Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Impföse, Omnilab, Bremen, Deutschland

Wattetupfer, Omnilab, Bremen, Deutschland

Polypropylen-Röhrchen, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Brain-Heart-Infusion Medium, Merck, Darmstadt, Deutschland 0,45 µm Weißrandfilter, Schleicher & Schuell, Basel, Schweiz

Petrischale Ø 60 mm, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Columbiaagar, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

Amphotericin B, Biochrom, Berlin, Deutschland

Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Skirrow), Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

30

Pferdeblut, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

Anaerobiertopf HP0011A, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

1,5 ml Schraubdeckelgefäß Twist Top Vial und Twist Top Vial Caps, Sorenson BioScience, Salt Lake City, UT, USA

Stereomikroskop zur histologischen Auswertung

Zur statistischen Auswertung wurden folgende Programme genutzt:

StatView D-4.5, Abacus Corporation

Graphpad Prism 5, Graphpad Software Inc., La Jolla, CA, USA Excel 2003, 2007, Microsoft, Redmond, WA, USA

31 3.2 Methoden

In den ersten Versuchen mussten grundlegende Erkenntnisse zum Virus gesammelt werden. Das Virus war bereits isoliert worden, jedoch nicht klassifiziert. Außerdem mussten direkte und indirekte Nachweismethoden und Virusquantifizierungs-verfahren für den Infektionsversuch etabliert werden. Im Anschluss erfolgten Infektionsversuche, die den Einfluss einer MNV-Infektion auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus erfassen sollten.

3.2.1 Zellkultur

Die RAW 264.7 Zellen wurden in 75 ml Filterdeckel-Zellkulturflaschen mit DMEM, 2%

Penicillin-Streptomycin und 10% low endotoxine fetalem Kälberserum bei 37° C und 5% CO2-Begasung in einem Brutschrank kultiviert. Zum Passagieren wurde der Zell-rasen mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden dann in 5 ml vorbereitetem Medium und anschließend anteilig je nach gewünschter Zelldichte in insgesamt 25 ml Medium pro Zellkulturflasche resuspendiert.

3.2.2 Virusisolation

Die Virusisolation wurde von Mitarbeitern der MHH und der Firma Biodoc (Hannover, Deutschland) durchgeführt. Aus vorhergehenden wissenschaftlichen Veröffent-lichungen war bekannt, dass MNV weit verbreitet in versuchstierkundlichen Einrichtungen ist. Klinische Symptome blieben jedoch abhängig vom infizierten Mausstamm aus. Mesenteriallymphknoten und Milz waren als Virusreservoir beschrieben. Eine Virusvermehrung gelang in RAW 264.7 Zellen. Mehrere genetische Sequenzen von MNV-Isolaten waren bereits beschrieben. Als potentielle Virusträger wurden NOD-Prkdc^scid-Mäuse, die als Anzeigertiere im ZTL verwendet wurden, eingeschätzt. Von ihnen wurden im Rahmen einer diagnostischen Routine-Sektion Mesenteriallymphknoten und Milz gewonnen. Diese wurden bei -80° C eingefroren. Eine kleine Probe der Organe wurde für eine PCR-Untersuchung mit dem Primerpaar 5004f/5219r verwandt. Die PCR-Untersuchung ergab für Milz und Mesenteriallymphknoten der Mäuse einen positiven Befund. Daraufhin wurde ein Viertel der PCR-positiven Milz mit einem Cell-Douncer in DMEM homogenisiert.

32

Nach einer Zentrifugation bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) wurde der Überstand filtriert. Mit dem aus dem Milz-Isolat gewonnenen Überstand wurde eine zu 75%

besiedelte RAW-Zellkulturflasche beimpft. Nach zwei Tagen trat ein cytopathischer Effekt >90% auf, der bei einer parallel bebrüteten Kontrollflasche nicht zu beobachten war. Die beimpfte Zellkulturflasche wurde daraufhin bei -20° C eingefroren, aufgetaut, erneut eingefroren (-20° C) und dann aufgetaut. Das Medium inklusive cryolysierter RAW 264.7 Zellen sowie vermeintlicher Viruspartikel wurde bei 6000 U/min für 10 min (2800 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und filtriert, das Pellet wurde verworfen. Das Filtrat wurde in 1 ml Portionen konfektioniert und bei -80° C tiefgefroren.

3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR 3.2.3.1 RNA-Isolation

Da es sich bei Noroviren um RNA-Viren handelt, musste zuerst die Virus-RNA aus dem Filtrat gewonnen werden. Hierzu wurde das Macherey Nagel Kit NucleoSpin RNA II mit dem Support-Protokoll zur Isolation von Gesamt-RNA aus Zellkulturüberstand eingesetzt (siehe Anhang S.97). Bei der RNA-Isolation aus Organen wurde ebenfalls das vom Hersteller empfohlene Protokoll angewandt (siehe Anhang S. 97). Zur Isolation von Gesamt-RNA aus Kot wurde erfolgreich ein modifiziertes Protokoll angewandt, das der Hersteller auf Anfrage übersandte. Es handelte sich hierbei um die Modifikation eines Kunden, dem es auf diese Art und Weise gelungen war, RNA aus Kot zu isolieren (siehe Anhang S. 99).

3.2.3.2 Reverse Transkription

Um die isolierte RNA weiter zu analysieren, wurde diese mit Hilfe des Quiagen Omniscript RT-Kits umgeschrieben. Für den Reaktionsansatz wurde der RNA-Gehalt der Proben photometrisch bestimmt. Es erfolgte eine Einstellung auf 500 ng RNA pro 10 µl Ansatz.

33 Ansatz pro Probe

RT-Buffer 2 µl

dNTPs 5 µM 2 µl

Oligo(dT)18 20 µM bzw. Random Hexamer 1 µl RNAse-Inhibitor 1:4 verdünnt 1 µl

Reverse Transkriptase 1 µl

Eingestellte RNA 13 µl

Summe 20 µl

Temperaturprofil für die reverse Transkription Temperatur Dauer

37° C 60 min

3.2.3.3 PCR

Die gewünschten cDNA-Abschnitte wurden nun entweder mit dem Redextract-Kit oder dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit vervielfältigt, je nach verwendetem Primerpaar.

34

Anhand von bereits publizierten Sequenzen verschiedener MNV-Stämme (MNV 1 - 4) wurden passende Primerpaare in einer genetisch konservierten Region entwickelt, mit denen möglichst viele Varianten von MNV reagieren; zusätzlich wurden Primerpaarsequenzen aus Publikationen übernommen.

Tabelle 10: Primmerpaare zum Nachweis von MNV mit Hilfe des Quiagen-Taq PCR Core-Kit (Primersequenzen siehe S. 22f.)

Name des Primerpaars Länge des

Amplikon

5205f/5388r 183 bp

5004f/5219r 215 bp

Nach Sequenzierung getestet:

5004f/5277r 273 bp

5580f/5671r modifiziert (MÜLLER et al. 2007) 91 bp 4972f/5080r (BAERT et al. 2008) 608 bp

5205f/5469r 264 bp

5473/5659r modifiziert (HSU et al. 2006) 186 bp

Die Probenansätze wurden anschließend mit nachfolgendem Temperaturprofil im Thermocycler zur Reaktion gebracht.

Zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA wurde das Housekeeping-Gen RPS-9 mit Hilfe des Primerpaares RPSRPS-9f/RPSRPS-9r nachgewiesen. Hierbei wurde das Redextract-Kit verwendet.

35

3.2.4 Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR

Die Gesamt-DNA wurde aus den im Infektionsversuch gewonnenen Kotproben mit Hilfe des Invitek PSP® Spin Stool DNA Kit gemäß Herstellerprotokoll isoliert. Für die Detektion kamen die Primerpaare H276f/H676r und B38/B39 zum Einsatz. Mit dem Primerpaar H276f/H676r lassen sich 16S rRNA Gensequenzen der Helicobacter spp.

nachweisen (RILEY et al. 1996). Alle Helicobacter spp. ergeben ein 374-Basenpaarfragment. Das Primerpaar B38/B39 weist eine H. hepaticus spezifische 16S rRNA-Gensequenz nach (SHAMES et al. 1995). Das Basenpaarfragment ist 417 bp groß. Für beide Primerpaare wurde das Redextract-Kit verwendet.

Ansatz pro Probe

Temperaturprofil für die Helicobacter spp.- / H. hepaticus - PCR Temperatur Dauer

36

3.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese

Für ein 1,5%iges Gel wurden 2,25 g Agarosepulver in 150 ml 1x TBE-Puffer gegeben und in der Mikrowelle erhitzt. Unter ständigem Rühren mittels Magnetrührer wurde die Agaroselösung auf 50° C abgekühlt. Dann wurden der Lösung 6 µl Gelstar DNA-Farbstoff zugefügt. Die Flüssigkeit wurde dann bis zu einer Höhe von 0,5 cm in den mit bis zu zwei 25er-Taschen-Kämmen präparierten Gelschlitten gegossen. Nach einem Auskühlen von 30 min konnten die Kämme gezogen werden, und das Gel war einsatzbereit.

Für die Elektrophorese wurde das Gel in die mit 1x TBE-Puffer gefüllte Gelkammer gelegt. Danach wurden die dem Thermocycler entnommenen Proben mit 4 µl Orange G Ladepuffer versehen, sofern der PCR-Ansatz mit dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit erstellt wurde. Ein mit Redextract erstellter PCR-Ansatz enthält bereits Ladepuffer.

Je nach Ansatz wurden pro Tasche 10-14 µl Probenvolumen einpipettiert. Zur Größendifferenzierung der Basenfragmente wurde in mindestens eine Tasche pro Kamm 6 µl einer standardisierten Basenleiter gegeben. Die anschließende Laufzeit bei 180 V 250 mA betrug ca. 45 min. Zur Auswertung wurde das Gel abschließend mit einem UV-Transilluminator betrachtet und digital fotografiert.

3.2.5 Sequenzierung

Die Klonierung und Vorbereitung für eine externe Sequenzierung wurde durch Herrn Dr. Nils-Holger Zschemisch vom ZTL durchgeführt. Aus Zellkulturüberstand isolierte MNV-RNA wurde mit dem Oligo(dT)18-Primer zu cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wurde als Template verwandt. Die Primerpaare für die PCR-Produkte, die kloniert wurden, sind Tabelle 6 (S.23) zu entnehmen. Der Primer Noro Hannover rev 3 entspricht dem Primer 15T-aTAG (MÜLLER et al. 2007). Die Klonierung und Transformation erfolgte gemäß Anweisungen und gelieferten Materialien des StrataClone^TM PCR Cloning Kit von Agilent Technologies. Detaillierte Protokolle sind zusätzlich in der Dissertation von Herrn Dr. Zschemisch zu finden (ZSCHEMISCH 2004).

37 Die Bakterienkulturen mit erfolgreich klonierten Abschnitten des MNV-Genoms in Plasmidform wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit gemäß Anweisungen des Herstellers aufgearbeitet. Abschließend erfolgte eine PCR mit den Primerpaaren, die in Tabelle 7 (S.23) genannt werden. Die Sequenzierung der drei PCR-Produkte wurde extern durch die Firma MWG Biotech AG durchgeführt. Eine Analyse der erhaltenen Sequenzen erfolgte auf einem Macbook mit DNA Dynamo und internetbasiert mit BLAST (ALTSCHUL et al. 1990).

3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch

Eine Portion des Virusisolats wurde zweimal mit RAW-Zellen passagiert, von dieser Passage wurden für Infektionsversuche und weitere Virusanzucht erneut 1 ml Portionen in sterile Glasfläschchen abgefüllt und bei -80° C tiefgefroren.

3.2.7 Virus-Titer-Bestimmung 3.2.7.1 Plaque-Test

Um den Virus-Titer zu bestimmen, wurde ein Plaque-Test durchgeführt. Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen auf einer 6er-Zellkultur-Platte in einer Dichte von 6 x 10⁵ Zellen/ml ausgesät. Die Zelldichte pro ml wurde durch Auszählung mit einer Neubauer Zellzählkammer bestimmt. Pro Vertiefung der Platte wurden 2,5 ml aufgetragen, was einer Gesamtzellzahl von 1,5 x 10⁶ Zellen pro Vertiefung entsprach. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am nächsten Tag wurden Zehner-Verdünnungen der Virussuspension für den Infektionsversuch angefertigt. Das ursprüngliche Zellmedium wurde von den Platten abgesaugt. Danach wurden pro Verdünnung 2 Vertiefungen als Doppelbestimmung mit 500 µl der angefertigten Virusverdünnungsreihe beimpft. Die Platten wurden danach eine Stunde im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C bebrütet.

Währenddessen wurde eine Lösung aus 2,5% SeaPlaque Agarose und ergänztem DMEM-Medium (10% FKS LE, 2% Penicillin-Streptomycin) hergestellt. Nach der einstündigen Inkubation wurde die Virussuspension von den Vertiefungen abgesaugt und durch 2,5 ml der vorbereiteten Agarose-Medium-Mischung ersetzt. Nachdem die

38

Agarose-Mediummischung bei Raumtemperatur erstarrt war, wurden die Platten bei 5% CO2 und 37° C für 48h bebrütet. Um die Auswertung zu erleichtern, wurden die Platten mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.

3.2.7.2 Auswertung eines Plaque-Tests

Die Löcher im Zellrasen werden bei zwei bis drei auszählbaren Verdünnungsstufen der Virussuspension erfasst und mit dem Kehrwert der Verdünnungsstufe multipliziert. Hierbei erhält man die Anzahl von plaqueforming units pro inokkuliertes Volumen der Virussuspension.

3.2.7.3 TCID50-Test

Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen in der Konzentration von 3 x 10⁴ Zellen/Vertiefung auf eine Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Pro Vertiefung wurden 100 µl Zellsuspension aufgetragen, dies entspricht einer Zellkonzentration der Suspension von 3 x 10⁵ Zellen/ml. Die Vertiefungen am Plattenrand wurden mit 300 µl Medium befüllt, um einer Verdunstung im Randbereich vorzubeugen. Die Platten wurden über Nacht bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am folgenden Tag wurde eine Verdünnungsreihe der Virussuspension in Zehnerschritten angelegt. Je 200 µl einer Verdünnungsstufe der Virussuspension wurden pro Vertiefung auf der Reaktionsplatte zugegeben. Je eine Reihe mit 10 Vertiefungen wurde mit einer Verdünnungsstufe befüllt. Eine Kontrollreihe bekam statt der Virussuspension 200 µl Medium. Dies entsprach einem Gesamtvolumen von 300 µl Flüssigkeit pro Vertiefung. Danach erfolgte eine weitere Bebrütung bei 5% CO2 und 37° C über acht Tage.

3.2.7.4 Auswertung eines TCID50-Tests

Zur Auswertung wurde der CPE optisch erfasst. Bereits der dem Nährmedium zugesetzte Indikator Phenolrot ließ eine Unterscheidung zwischen toten (rosa) und lebenden (gelb) RAW-Zellen in den Vertiefungen zu, zur Erleichterung wurde jedoch auch hier mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.

39 Die Berechnung der Viruskonzentration erfolgt mit der Formel nach Spearmann und Kärber.

Zuerst wurde die Verdünnungsstufe bestimmt, in der noch ein vollständiger CPE in allen Vertiefungen zu ermitteln ist. Diese Verdünnungsstufe ergab die Variable a (bei 10^-6 ist diese gleich -6). Für die Variable b wurden die Anzahl Vertiefungen mit CPE der niedrigeren Verdünnungsstufen zu der Anzahl Vertiefungen der

Zuerst wurde die Verdünnungsstufe bestimmt, in der noch ein vollständiger CPE in allen Vertiefungen zu ermitteln ist. Diese Verdünnungsstufe ergab die Variable a (bei 10^-6 ist diese gleich -6). Für die Variable b wurden die Anzahl Vertiefungen mit CPE der niedrigeren Verdünnungsstufen zu der Anzahl Vertiefungen der

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