Tierärztliche Hochschule Hannover
In vitro-Kontraktilität von Uterus und Eileiter bei Kühen und Färsen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Nilay Yücesoy Akbaş
aus Ankara, Türkei
Hannover 2019
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein Klinik für Reproduktionsmedizin
Vetsuisse-Fakultät, Universität Zürich
Univ.-Prof. Dr. med.vet. Ralph Brehm
Anatomisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med.vet. Heinrich Bollwein und
Univ.-Prof. Dr. med.vet. Ralph Brehm
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med.vet. Harald Sieme
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2019
Diese Studie wurde von MASTERRIND GmbH Rinderzucht und Vermarktung finanziert.
Meiner wunderbaren Familie gewidmet
YUECESOY, N., PIECHOTTA, M, EKHLASI-HUNDRIESER, M., ULBRICH, S. E, KASTELIC, J., GORRIZ, L., HETTEL, C., BREHM, R., FRESE, D., D. RATH u. H.
BOLLWEIN (2012):
In vitro spontaneous contractile activity of the oviduct in heifers versus cows.
Reprod Dom Anim 47:2, 158; Posterpresäntation auf der „47. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung, gleichzeitig 37. Veterinär- Hummanmedizinische Gemeinschaftstagung“, 29.02.-02.03.2012 in Berlin.
YUECESOY, N., ULBRICH, S., GORRIZ, L., RATH, D., BREHM, R., H. BOLLWEIN u.
M. PIECHOTTA (2013):
In vitro myometrial contractility is higher in pluriparous cows than in heifers.
Reprod Dom Anim 48:1, 113; Posterpresäntation auf der „17. Annual Conference of the European Society for Domestic Animal Reproduction (ESDAR)“, 12.09.- 14.09.2013 in Bologna.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... ... 7
2 Literaturübersicht... ... 8
2.1 Verminderte Fertilität ... 8
2.1.1 Metabolismus und follikuläres Mikromilieu ... 8
2.1.2 Genexpressionen im Corpus luteum, Endometrium, Eileiter und Embryo. ... 10
2.2 Anatomie und Histologie des Uterus ... 11
2.2.1 Uteruskontraktilität ... 12
2.2.2 Innervation und hormonelle Kontrolle der uterinen Kontraktilität 15 2.2.2.1. Östrogen und Progesteron ... 15
2.2.2.2. Oxytocin ... 17
2.2.2.3. Prostaglandin-F2α ... 17
2.3 Eileiter ... 19
2.3.1 Kontraktilität des Eileiters ... 20
2.3.2 Innervation und hormonelle Kontrolle des Eileiters ... 21
2.4 Follikelflüssigkeit ... 25
3 Material und Methoden. ... 26
3.1 Probenmaterial und Probenentnahme ... 26
3.2 Probenaufbereitung ... 26
3.3 Versuchsdurchführung ... 27
3.4 Gewinnung der Follikelflüssigkeit ... 28
3.5 Hormonanalysen ... 29
3.6 Bestimmung der Kontraktilität in vitro ... 30
3.6.1 Präparation der Myometriumproben für die Kontraktilitätsmessunge.32 3.6.2 Präparation der Eileiterproben ... 34
3.6.3 Quantifizierung der Kontraktilität ... 35
3.6.3.1 Myometriumkontraktilität ... 35
3.6.3.2 Kontraktilität des Eileiters ... 35
3.7 Real-Time PCR ... 35
4 Ergebnisse...37
4.1 Gewebeproben ... 37
4.1.1 Uteri ... 37
4.1.2 Eileiter ... 37
4.2 Hormonkonzentrationen in der Follikelflüssigkeit ... 38
4.2.1 Uterus ... 38
4.2.2 Eileiter ... 39
4.3 Kontraktilität ... 40
4.3.1 Myometriumkontraktilität ... 40
4.3.1.1 Spontankontraktion ... 40
4.3.1.2 Stimulation des Myometriums mittels Prostaglandin F2α ... 44
4.3.1.3 Stimulation des Myometriums mit Oxytocin ... 44
4.3.2 Kontraktilität des Eileiters ... 48
4.3.2.1 Spontankontraktilität in verschiedenen Abschnitten des Eileiters...48
4.3.2.2 Spontankontraktion ... 50
4.3.2.3 Stimulation der Eileiterkontraktion mit Prostaglandin-F2α ... 52
4.3.2.4 Stimulation der Eileiterkontraktion mit Oxytocin ... 52
4.4 Genexpression verschiedener Hormonrezeptoren ... 54
4.4.1 Uterus ... 54
4.4.2 Eileiter ... 56
4.4.3 Zusammenhänge zwischen Genexpression und Kontraktilität des Uterus...58
4.4.3.1 Spontankontraktilität des Uterus ... 58
4.4.3.2 Stimulierte Kontraktilität des Uterus ... 58
4.4.4 Zusammenhänge zwischen Genexpressionen und Kontraktilität des Eileiters ... 60
4.4.4.1 Spontane Kontraktilität des Eileiters ... 60
4.4.4.2 Stimulierte Kontraktilität des Eileiters ... 60
4.5 Zusammenfassung der Ergebnisse ... 62
5 Diskussion...63
5.1 Gewebeproben ... 63
5.2 Hormonkonzentrationen in der Follikelflüssigkeit ... 63
5.3 In vitro-Kontraktilitätsmessungen ... 64
5.3.1 Uterusexperiment ... 64
5.3.1.1 Spontankontraktion ... 65
5.3.1.2 Stimulation des Myometriums mit Prostaglandin F2α ... 67
5.3.1.3 Stimulation des Myometriums mit Oxytocin ... 68
5.3.2 Eileiterexperiment ... 69
5.3.2.1 Spontankontraktion ... 70
5.3.2.2 Stimulation mit PGF2α ... 71
5.3.2.3 Stimulation mit Oxytocin ... 71
5.4 Genexpression ... 72
5.4.1 Uterus ... 72
5.4.2 Eileiter ... 73
6 Zusammenfassung... 75
7 Summary... ... 78
8 Literaturverzeichnis... ... 81
9 Anhang... ... 120
9.1 Tabellenverzeichnis ... 120
9.2 Lösungen ... 140
Abkürzungsverzeichnis
AA Arachidonsäure
Aqua dest. destilliertes Wasser Amean Mittlere Amplitude Amin Minimale Amplitude
Amax Maximale Amplitude
AUC Fläche unter der Kurve
CL Corpus Luteum (Gelbkörper)
Cx-43 Connexin-43
E Östrogen
E2 17ß-Estradiol
EIA Enzyme Immunoassay (Enzymimmunassay)
ELISA Enzyme-linked immunosorbent-assay (Synonym für EIA) EPR Prostaglandin-E2-Rezeptor
ERα Östrogenrezeptor α
ERβ Östrogenrezeptor β
ESR1 Östrogenrezeptor-1
ET Endothelin-1
F Frequenz
FGF2 Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 FPR Prostaglandin-F2α-Rezeptor H2O2 Wasserstoffperoxid
ICC Interstitielle Cajalzellen (Pacemakerzellen) ICLC Interstitielle, den Cajalzellen ähnliche Zellen,
(Interstitielle Cajal-like Zellen, Telozyten)
IFNT Interferon-tau
IGF Insulinähnlicher Wachstumsfaktor
IGFBP IGF- Bindungsprotein
IL-1A Interleukin-1A
LH Luteinisierendes Hormon
MAD Medianabweichung
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
min Minute
MLCK Myosin-leicht-Ketten-Kinase
mRNA Messengerribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure)
mN Milinewton
n Anzahl
OT Oxytocin
OTR Oxytocinrezeptor
OXTR Oxytocin-Rezeptorgen
PCR Polymerase Chain Reaction
PG Prostaglandin
PGE2 Prostaglandin-E2
PGF2α Prostaglandin-F2α
PTGFR Prostaglandin-F2α-Rezeptorgen PTGER Prostaglandin-E2-Rezeptorgen PGH2 Prostaglandin-H2
PGT Prostaglandintransporter-Protein
P4 Progesteron
PR Progesteronrezeptor
PR-A Progesteronrezeptor-A
PR-B Progesteronrezeptor-B
r Korrelationskoeffizient
RIA Radioimmunoassay
SD Standard deviation (Standardabweichung) SEM Standard error of the mean
(Standardfehler des Mittelwertes)
TNFα Tumornekrosefaktor α
UTV Uterotubale Verbindung
Einleitung
7 1 Einleitung
In den letzten Jahrzehnten stieg die Milchleistung von Kühen stark an, während die Fertilität gleichzeitig deutlich abnahm (MACMILLAN et al. 1996; RIZOS et al. 2010).
Es wurden zahlreiche Hypothesen über die möglichen Ursachen dieser gegensätzlichen Entwicklung aufgestellt (WALSH et al. 2011). Vor allem die Tatsache, dass die Fertilität von Färsen konstant geblieben ist, während sie bei Milchkühen abnahm, war oftmals der Anhaltspunkt für Untersuchungen. Unter anderem wurden die Embryoqualität (LEROY et al. 2005a; MEIER u. BURKE 2010), die Trächtigkeitsrate (PURSLEY et al. 1997; KUHN et al. 2006; BRICKELL et al. 2009; DE VRIES 2009), das follikuläre Milleu (CHAGAS E SILVA et al. 2002; BENDER et al.
2010), die Fütterung und der Hitzestress (SARTORI et al. 2002) näher untersucht.
Ein Aspekt, dessen möglicher Einfluss auf die Fertilität bisher jedoch nur wenig überprüft wurde, ist die Kontraktilität von Uterus und Eileiter bei Kühen und Färsen. Es ist bekannt, dass die uterine Kontraktilität den Transport der Spermien zum Eileiter unterstützt und somit ein wichtiger Bestandteil für die Fertilität ist (LINDBLOM et al.
1979; LYONS et al. 2006; SUAREZ u. PACEY 2006). Neben der Uteruskontraktilität spielt auch die Kontraktionsfähigkeit des Eileiters eine bedeutende Rolle für den Spermientransport zur Oozyte. Im Eileiter steigt die Motilität 3 bis 5 Tage vor dem Beginn des Östrusverhaltens deutlich an und erreicht auf der ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Seite zum Zeitpunkt des Östrus ihren Höhepunkt (BENNETT et al. 1988).
Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob hinsichtlich der muskulären Kontraktilität und dem Gehalt von Hormonrezeptoren Unterschiede zwischen Färsen und Kühen bestehen und inwieweit diese auf endokrine Regulationsmechanismen zurückzuführen sind. Weiterhin sollten mögliche Zusammenhänge zwischen der Kontraktilität und der Hormonrezeptorexpression im Uterus und Eileiter bei Färsen und Kühen ermittelt werden.
8 2 Literaturübersicht
2.1 Verminderte Fertilität
In den letzten Jahrzehnten wurde eine Verminderung der Fertilität von Kühen beobachtet, welche unter anderem auf genetische und physiologische (HANSEN 2007) sowie ernährungs- und haltungsbedingte Aspekte (SARTORI et al. 2002) zurückgeführt werden kann. In ihrem Review beschrieben WALSH et al. (2011) zahlreiche Faktoren, die für die Verbesserung der Fertilität von Milchkühen eine Rolle spielen, so z.B. die Verringerung der negativen Energiebilanz während der Frühlaktation (MACMILLAN et al. 1996), die Befruchtung mit hochwertigem Sperma (FETROW et al. 2007; LINDEROTH 2008; DE VRIES 2009; PEIPPO et al. 2009), der Transfer von Embryonen guter Qualität (RIZOS et al. 2005; BENDER et al. 2010), der frühe Anstieg der Progesteron (P4)-Sekretion des Corpus Luteums (CL) (WOLFENSON et al. 2004) sowie ein ungestörtes uterines Milieu (MEIER u. BURKE 2010).
Laut MACMILLAN et al. (1996) weisen Milchkühe im Vergleich zu Färsen neben einer deutlicher ausgeprägten negativen Energiebilanz post partum auch niedrigere Plasma-P4-Konzentrationen auf, die wiederum negative Konsequenzen für die Ausprägung des Östrusverhaltens, die Blastozysten- (RIZOS et al. 2005) sowie die frühe Embryonalentwicklung (BENDER et al. 2010) und damit auch insgesamt für die Fertilität haben könnten (WOLFENSON et al. 2004).
2.1.1 Metabolismus und follikuläres Mikromilieu
Im Folgenden soll zusammengestellt werden, welche Faktoren die Fertilität von pluriparen Kühen gegenüber Färsen negativ beeinflussen. In der Follikelflüssigkeit von Kühen ist beispielsweise die Konzentration von gesättigten Fettsäuren, wie etwa Pal- mitin- und Stearinsäure, höher als bei Färsen. Diese beiden Fettsäuren haben einen negativen Effekt auf die Eizellreifung sowie die frühe Embryonalentwicklung und können daher zu den ausgeprägten Unterschieden bezüglich der Fertilität beitragen (BENDER et al. 2010).
Literaturübersicht
9
Laut WATHES et al. (2007) sind bei Kühen die erhöhten Konzentrationen von gesättigten Fettsäuren im Blut während der frühen Laktation auf die negative Energiebilanz zurückzuführen. Diese bedingt auch den Konzentrationsunterschied an Fettsäuren in der Follikelflüssigkeit (LEROY et al. 2005b).
Die präovulatorische Serum-17ß-Estradiol (E2)-Konzentration ist bei Kühen geringer als bei Färsen, auch wenn die ovulatorischen Follikel von Kühen größer sind als die von Färsen (WOLFENSON et al. 2004). Auch die zirkulierende Konzentration an insulinähnlichem Wachstumsfaktor-I (IGF-I) ist bei Kühen geringer als bei Färsen (SWANGCHAN-UTHAI et al. 2011). Die Autoren schlussfolgerten, dass die Unterschiede in der ovariell-follikulären Dynamik und in den Plasmakonzentrationen der Steroide und Gonadotropine sowie die IGF-Bioverfügbarkeit im Eileiter mit den ausgeprägten Unterschieden zwischen Kühen und Färsen die frühe embryonale Entwicklung negativ beeinflussen und die höhere Fertilität von Färsen bedingen könnten.
In einer weiteren Studie wurde eine geringere P4-Konzentration bei Kühen im Vergleich zu Färsen festgestellt, obwohl das Volumen des Lutealgewebes der Kühe größer war als das der Färsen (SARTORI et al. 2004). Die P4-Konzentrationen im Plasma von Kühen waren negativ mit der Futteraufnahme korreliert. Es wird diskutiert, dass Faktoren wie Futteraufnahme und Milchleistung den P4-Stoffwechsel verändern können und so gerade bei Hochleistungsmilchkühen zu einem erhöhten Metabolismus von Steroidhormonen wie P4 und E2 führen könnten (RABIEE et al. 2001).
WOLFENSON et al. (2004) und SAKHONG et al. (2011) beschrieben eine verlängerte Dominanz des Ovarfollikels bei Kühen gegenüber Färsen und brachten diesen Unter- schied ebenfalls in Zusammenhang mit der verringerten Fertilität der Kühe. Außerdem könnte laut WOLFENSON et al. (2004) der im Vergleich zu Färsen reduzierte präovulatorische E2- und LH-Anstieg während der Follikelphase bei Kühen in Verbindung mit einer geringeren P4-Produktion nach der Ovulation stehen und so ebenfalls zu einer verminderten Fertilität beitragen. Geringere P4-Konzentrationen sowohl vor und als auch nach artifizieller Insemination wirken sich laut WOLFENSON et al. (2004) negative auf die Fertilität von Kühen aus.
10
2.1.2 Genexpressionen im Corpus luteum, Endometrium, Eileiter und Embryo Viele Arbeitsgruppen haben sich mit dem CL und dessen Einfluss auf die Fertilität beschäftigt (LEYVA-OCARIZ et al. 1996; NISWENDER et al. 2000; PRETHEEBAN et al. 2010; THAVANEETHARAJAH 2012). Das CL von Färsen und Kühen wurde dazu histologisch bzw. mit molekularbiologischen Methoden wie z. B. der Polymerase Chain Reaction (PCR) vergleichend untersucht.
Laut THAVANEETHARAJAH (2012) zeigen histologische Untersuchungen und Genexpressionsanalysen des CLs, dass die Angiogenese und die Steroidogenese bei Färsen im Vergleich zu Kühen erhöht ist. Auch die mRNA-Expression des IGF-I, des Fibroblasten-Wachstumsfaktors-2 (FGF2), des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) sowie des Interleukin-1A (IL -1A) war bei Färsen ausgeprägter im Vergleich zu Kühen (THAVANEETHARAJAH 2012).
Expressionsunterschiede zwischen Kühen und Färsen zeigten sich auch im Endometrium [bzgl. IGF-I, FGF2, IL-1A und Tumornekrosefaktors α (TNFα)] und im Embryo [bzgl. Interferon-tau (IFNτ) und des Hitzeschock-Proteins 70]; die Expression dieser Gene war bei Färsen jeweils deutlich höher als bei laktierenden Milchkühen.
Der Autor vermutete, dass diese Unterschiede in der Genexpression im CL, Endometrium und Embryo für die verminderte Fertilität der Kühe mitverantwortlich sein könnten.
TANIKAWA et al. (2008) fanden heraus, dass das IL-1A, welches als ein luteotroper Faktor beschrieben wird, das Verhältnis von Prostaglandin-E2 (PGE2) zu Prostaglandin-F2α (PGF2α) im bovinen Endometrium erhöht. PGF2α fördert die Kontraktion des Uterus und die Luteolyse, weshalb es mit einer verminderten Fertilität in Zusammenhang gebracht wird (SINGH et al. 1979; STOLLA u. SCHMID 1990;
HIRSBRUNNER et al. 1998). PGE2 wird im Zyklus in Folge des LH-Anstiegs vermehrt im Ovar gebildet und spielt eine Rolle bei der Ovulation des Follikels (CARSTEN 1974;
ADLER 2011).
Die Kontrolle des Follikelwachstums und die Ovulation hängen nicht nur von den Sexualhormonen, sondern auch von Wachstumsfaktoren, wie z.B. dem IGF-I, ab (YOSHIMURA et al. 1996). Die Wachstumsfaktoren können dadurch auch die frühe Embryoentwicklung beeinflussen. Auch im Eileiter war die mRNA-Expression von IGF-I, IGF-Bindungsprotein-3 (IGFBP)-3 und IGFBP-6 bei Kühen geringer als bei Färsen (SWANGCHAN-UTHAI et al. 2011).
Literaturübersicht
11
Zusätzlich zeigte sich im Blut von Kühen eine verminderte Konzentration von IGF-I gegenüber derjenigen von Färsen (SWANGCHAN-UTHAI et al. 2011).
Diese beschriebenen hormonellen Divergenzen zwischen Färsen und Kühen könnten laut SWANGCHAN-UTHAI et al. (2011) die Ursache für die Abweichungen in der Embryonalentwicklung zwischen beiden Tiergruppen sein.
2.2 Anatomie und Histologie des Uterus
Der Uterus setzt sich anatomisch aus der Cervix, dem Corpus und zwei Cornua zusammen. Die Cornua uteri beim Rind sind widderhornartig gewunden (KÖNIG u.
LIEBICH 2018). Kühe weisen deutlich längere Uterushörner auf als Färsen (26.01 cm vs. 14.72 cm; MONTEIRO et al. 2001), während Färsen eine höhere Dichte der endometrialen Drüsen zeigen (DHALIWAL et al. 2002).
Die Uteruswand besteht histologisch aus drei Schichten, der Tunica mucosa (Endometrium), der Tunica muscularis (Myometrium) und der Tunica serosa (Perimetrium). Das Endometrium besteht aus der Lamina epithelialis und der Lamina propria mucosae und bildet den mütterlichen Teil der Plazenta (KÖNIG u. LIEBICH 2018). Die Lamina epithelialis besitzt ein einschichtiges hochprismatisches Epithel, wobei die luminalen Epithelzellen oberflächliche Kinozilien (Flimmerzellen) oder Mikrovilli (sezernierende Zellen) tragen. Die Lamina propria mucosae weist Fibroblasten und retikuläres Bindegewebe auf und enthält eine große Zahl tubulär verzweigter Uterindrüsen (KÖNIG u. LIEBICH 2018). Der gravide Uterus des Rindes verfügt makroskopisch über differenzierbare Karunkeln (SCHLAFER et al. 2000). Die Karunkeln sind mit Kotyledonen des Chorions zu Plazentomen verbunden (KÖNIG u.
LIEBICH 2018). Bei Rindern wurden Steroidhormon-Rezeptoren bzw. deren mRNA in der interplazentomalen Uteruswand lokalisiert (BOOS et al. 1996; ROBINSON et al.
1999; KIMMINS u. MACLAREN 2001; MEIKLE et al. 2001; ROBINSON et al. 2001).
Das Myometrium setzt sich aus einer dicken inneren, in der Regel zirkulären und einer äußeren longitudinalen Muskelschicht zusammen, die aus glatten Muskelzellen besteht. Zwischen diesen beiden Muskelschichten befindet sich das blut- und lymphgefäßreiche Stratum vasculosum. Das Perimetrium (Tunica serosa) ist fest mit dem Myometrium verwachsen und stellt die äußerste Schicht des Uterus dar. Die Tunica serosa wird von einer Tela subserosa und einer Stratum musculare longitudinale unterlagert (KÖNIG u. LIEBICH 2018).
12 2.2.1 Uteruskontraktilität
Die uterine Kontraktilität ist eine direkte Konsequenz der elektrischen Aktivität (Aktionspotential) in den myometrialen Zellen (GARFIELD u. MANER 2007). Die Kontraktion der glatten Muskelzellen wird hauptsächlich durch Hormonrezeptoren bzw. mechanisch-vermittelte Aktivierung der kontraktilen Proteine Myosin und Aktin verursacht (WEBB 2003).
Durch die elektro- und pharmakomechanische Kopplung kommt es zu einem Anstieg der Ca2+-Konzentration im Zytosol, bedingt durch vor allem aus dem Extrazellularraum und zu einem geringeren Anteil aus dem sarkoplasmatischen Retikulum einströmende Ca2+-Ionen. Bis zu vier Ca2+-Ionen binden sich an das Protein Calmadulin. Der entstandene Ca2+-Calmodulin-Komplex führt zu einer Aktivierung des Enzyms Myosin- Leicht-Ketten-Kinase (MLCK; HARTSHORNE u. SIEMANKOWSKI 1981; KIM et al.
1998; BERNAL 2003). Die Kontraktion der glatten Muskulatur wird durch den Ca2+- Influx (CARSTEN 1969; WRAY et al. 2005) und den sogenannten Rho-Kinase- Signalweg kontrolliert (BERRIDGE 2008). Der Rho-Kinase-Signalweg ist an verschiedenen Zellfunktionen beteiligt, einschließlich der Migration, Proliferation und Kontraktion der glatten Muskelzellen. Möglicherweise spielt er auch bei der durch Oxytocin (OT) induzierten Uteruskontraktion eine Rolle (TAHARA et al. 2002). Das sarkoplasmatische Retikulum fördert die Entspannung der Muskelzellen, indem es Ca2+-Ionen freisetzt (WEBB 2003; MATTHEW et al. 2004). Die Ca2+-Kanäle werden durch eine spontane Pacemakeraktivität (Schrittmacheraktivität) und durch hormonelle bzw. neuronale Stimulation geöffnet (WRAY et al. 2001). Somit wird die myometriale Kontraktion sowohl durch neuronale als auch durch endokrine Einflüsse gesteuert.
Schrittmacherpotenziale der interstitielle Cajalzellen (ICC) sorgen für langsame elektrische Wellen „slow waves“ (KÖNIG u. LIEBICH 2018). Die elektrische Aktivität langsamer Wellen wird durch Pacemaker ausgelöst, wobei es sich um ICC im Genitaltrakt handelt. Die neuronale Steuerung im Uterus erfolgt durch sogenannte interstitielle, den Cajalzellen-ähnliche Zellen (ICLC), welche hormonsensitive Zellen sein können, die womöglich an der Regulierung der myometrialen Kontraktion durch Gap junctions (SIMS et al. 1982) mit Myozyten und/oder durch parakrine Signale mitwirken (CRETOIU et al. 2006; POPESCU et al. 2007).
Die molekularen Mechanismen, die die Expression des myometrialen Nexusproteins Connexin-43 (Cx-43) regulieren, wurden von COOK et al. (2000) analysiert. Die Regulation der Cx-Expression geschieht unter anderem auf hormonellem Weg.
Literaturübersicht
13
Die Anstiege von Östrogenen (E) und P4 im Verlauf einer Trächtigkeit führen beispielsweise zu einer zunehmenden Expression des Cx-43 im Myometrium (LEFEBVRE et al. 1995). Die Rinder weisen eine erhöhte Cx-43-Protein-Konzentration in der zirkulären gegenüber der longitudinalen Schicht des Myometriums auf. Die zirkuläre myometriale Schicht ist ein bevorzugter Angriffsort für die Regulation der Kontraktion durch E (DOUALLA-BELL et al. 1995). Die myometriale Aktivität verläuft im Östrus in zerviko-tubaler Richtung und dient damit dem Spermientransport (ZEROBIN u. SPORRI 1972).
Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher Techniken zur Messung der uterinen Kontraktilität. Diese lassen sich in in vitro- und in vivo-Techniken unterteilen. Im Wesentlichen können zwei in vitro-Methoden unterschieden werden. Zum einen kann die Kontraktilität des Uterus an einzelnen isolierten Streifen untersucht werden und zum anderen kann das vollständige Organ zur Messung herangezogen werden.
Anhand der isolierten Uterusstreifen können nur kurzzeitig isotonische Längenänderungen an bestimmten Segmenten des Organs gemessen werden (PATIL et al. 1980; HIRSBRUNNER et al. 2002; 2003; BOCK 2004; KAUFMANN et al. 2008;
HIRSBRUNNER et al. 2010; GORRIZ-MARTIN 2013; GORRIZ-MARTIN et al. 2017) Der isoliert perfundierte Uterus wurde auch als ein in vitro-Modell für länger andauernde Kontraktilitätsmessungen verwendet (BULLETTI et al. 1993; DITTRICH et al. 2003; BOCK 2004; RICHTER et al. 2006; VOLLAND 2013; HEPPELMANN et al.
2018)
Demgegenüber kommen als in vivo-Techniken intrauterine Druckmessungen (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1987a; 1987b; 1987c; HIRSBRUNNER et al. 1998;
1999; 2000; BAJCSY et al. 2005) mit unterschiedlichen Messmethoden zum Einsatz, wie z. B. die Ballonmethode (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1987c), der Open-End- Katheter (ZEROBIN u. SPORRI 1972), die Verwendung von Elektroden (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975), die Mikrowandler (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1987a; 1987b; HIRSBRUNNER et al. 1998) und die Sechspunktsonde (ADLER 2011). Mit all diesen Messmethoden wird der intrauterine Druck und die uterine Kontraktilität bei Kühen untersucht.
14
Es wurden bereits einige Studien veröffentlicht, die die Auswirkungen von OT (CARSTEN 1974; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1987b) und von PGF2α (CARSTEN 1974; SINGH et al. 1979; COOPER u. FOOTE 1986; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al.
1987a; STOLLA u. SCHMID 1990) sowie PGF2α-Analoga (EILER et al. 1989; BAJCSY et al. 2005) auf die Uterusmotorik bei Rindern überprüften. Hierbei wurde gezeigt, dass PGF2α die Myometriumkontraktilität in vitro sowohl im Östrus als auch im Diöstrus steigert (PATIL et al. 1980). Die Applikation von PGF2α führte im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem signifikanten Anstieg der Kontraktionen, sowohl bezüglich der Frequenz (F) als auch der Amplitude (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1987a).
Oxytocin führte an post partum gewonnenen Uteri zu einem Anstieg der F und der Fläche unter der Kurve (AUC), während die Mittelwerte der Amplitude (Amean) und die Dauer der Kontraktionen keine signifikanten Änderungen zeigten (BAJCSY et al.
2005). Bei isolierten Muskelstreifen von Kühen, die sich im Östrus bzw. im Diöstrus befanden, wirkte sich die Gabe von OT stimulierend auf die Kontraktilität aus (PATIL et al. 1980). Auch in vivo bewirkte die exogene Gabe von OT während des gesamten Zyklus einen signifikanten Anstieg der uterinen Aktivität. Hierbei aber war die Erhöhung der Aktivität im Proöstrus am deutlichsten (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al.
1987b).
OT führt zu einem erhöhten intrazellulären Calciumanstieg, der die Muskelkontraktion aktiviert und zur Freisetzung von PGF2α und weiteren Ca+2-Ionen führt (CARSTEN 1974; ADLER 2011). Sowohl OT als auch PGF2α blockieren die Calciumbindung in den glatten Muskelzellen des Myometriums und führen zu einer erhöhten intrazellulären Calciumkonzentration, welche dann die Muskelkontraktion aktiviert (CARSTEN 1974).
ADLER (2011) maß den intrauterinen Druck im Östrus und im Diöstrus in vivo vor und nach der intramuskulären Applikation von OT und PGF2α mit einer Sechspunktsonde und konnte keine signifikanten Änderungen in der Kontraktilität feststellen. Der Autor folgerte daraus, dass OT und PGF2α als Uterotonika wenig effektiv sind.
Die spontanen physiologisch-mechanischen Aktivitätsmuster der longitudinalen uterinen glatten bovinen Muskelpräparate nahe der Corpus-Region wurden während des Östrus und Diöstrus mit denjenigen der zirkulären Schicht verglichen. Signifikante Unterschiede zwischen Östrus und Diöstrus wurden nur für die zirkuläre myometriale Schicht gefunden, nicht aber für die longitudinale Schicht. Kühe wiesen im Östrus eine erhöhte Amplitude auf (HIRSBRUNNER et al. 2002).
Literaturübersicht
15
Die Kontraktilität unterschied sich in der zervikalen zirkulären und longitudinalen glatten Muskelschicht des Myometriums in den verschiedenen Zyklusphasen im Östrus und im Diöstrus nicht bei Kühen. Allerdings war die maximale Amplitude (Amax) in der longitudinalen Muskelschicht tendenziell höher als in der zirkulären Muskel- schicht (HIRSBRUNNER et al. 2003). Ferner hatte der Ort der Probenentnahme im Uterus einen Einfluss auf die minimale Amplitude (Amin) und die AUC. Beide Parameter waren bei Muskelstreifen, die vom Uterushorn stammten, größer als bei denen, die vom Corpus uteri entnommen worden waren. Die Amin-Werte waren in der longitudinalen Muskelschicht höher als in der zirkulären (KAUFMANN et al. 2008).
Der uterine Druck war in vivo während des Diöstrus am geringsten, erhöhte sich während des Proöstrus und erreichte einen Höhepunkt im Östrus (RODRIGUEZ- MARTINEZ et al. 1987c; ADLER 2011). Im Gegensatz dazu hatte die Zyklusphase keinen signifikanten Einfluss auf die spontane myometriale Aktivität in vitro bei Kühen, die an Endometritis litten (HIRSBRUNNER et al. 2010)
2.2.2 Innervation und hormonelle Kontrolle der uterinen Kontraktilität
Der Uterus wird von adrenergen, cholinergen und peptidergen Nervenfasern innerviert (WROBEL et al. 1993; TANEIKE et al. 1994; HOUDEAU et al. 2003). Die longitudinale Muskelschicht wird von adrenergen Nerven und von peptidergen Nerven versorgt und die zirkuläre Muskelschicht von nicht-adrenergen und cholinergen Nerven (HOUDEAU et al., 2003).
Steroidhormone des Ovars, der Plazenta und der Nebenniere kontrollieren, wie bei vielen anderen Spezies auch, die Kontraktilität des bovinen Myometriums (RIZZO et al. 2011).
2.2.2.1. Östrogen und Progesteron
Steroidhormone, wie E2 und P4, binden an Rezeptoren im Zellkern (DEFRANCO 2002). Die entstehenden Ligand-Rezeptor-Komplexe dienen als Transkriptionsfaktoren, die direkt mit der DNA interagieren, und die Genexpression verschiedenster Gene regulieren (ARANDA u. PASCUAL 2001).
Sexualsteroidhormone kontrollieren auch das Ausmaß der Expression der eigenen Rezeptoren.
16
Es wird angenommen, dass die Östrogenwirkungen grundsätzlich durch Östrogenrezeptoren vermittelt werden. Von diesen Rezeptoren gibt es zwei Arten, den Östrogenrezeptor α (ERα) und den Östrogenrezeptor β (ERβ; MOWA u. IWANAGA 2000).
Immunhistochemische Studien zeigen, dass die ER- und PR-Konzentrationen im bovinen Endometrium während des Zyklus deutlichen Schwankungen unterliegen (MEYER et al. 1988; BOOS et al. 1996; KIMMINS u. MACLAREN 2001; ROBINSON et al. 2001; MARTIN et al. 2008). Die Intensität der PR-Färbung war zum Zeitpunkt des Proöstrus (Tag 17-20) im Stroma mittelgradig. Die Expression erhöhte sich während der Brunst und erreichte das maximale Niveau im Metöstrus (Tag 1-6 des Zyklus). Während des Diöstrus (Tage 7-16) war die PR-Expression herunterreguliert (KIMMINS u. MACLAREN 2001). Auch MARTIN et al. (2008) berichteten, dass die ER- und PR-Expressionen im gesamten Brunstzyklus variierten, in der Regel mit der höchsten Konzentration in der Brunst und der niedrigsten Konzentration in der Lutealphase.
Die Östrogenrezeptoren (BOOS et al. 1996) beziehungsweise ERα (ROBINSON et al.
2001) wurden in den luminalen und glandulären Epithelien sowie in den Stromazellen des Uterus während des gesamten Zyklus nachgewiesen, wobei die maximale Expression ebenfalls während des Östrus und Metöstrus auftrat. Ein transienter Anstieg der Expression war im luminalen Epithel an den Tagen 16–18 während des Diöstrus zu beobachten (ROBINSON et al. 2001). Während des Zyklus stimuliert E2
die Produktion von ERα und PR, wohingegen P4 beim Rind einen hemmenden Effekt auf die Synthese der PR- Rezeptoren zu haben scheint (MEIKLE et al. 2001).
Die mRNA-Expression von PGE2α-Rezeptoren (EPRs) und Prostaglandin-F2α-Rezeptoren (FPR) wird durch E2 herunterreguliert. Jedoch wird die
mRNA-Expression von EPR1 und EPR3 durch eine Kombination von E2 und P4
gesteigert. Es ist nicht bekannt, ob es eine dosis- oder zeitabhängige Regulierung der PG-Rezeptoren durch E2 allein oder in Kombination mit P4 gibt (BLESSON et al. 2012).
Die Konzentrationen des OT-Rezeptors (OTR) und P4 sind negativ miteinander korreliert. Dies stützt die Hypothese, dass die OTR-Konzentration ein wichtiger Faktor im Prozess der Luteolyse beim Rind ist (JENNER et al. 1991).
Literaturübersicht
17 2.2.2.2. Oxytocin
Der OTR ist im Gegensatz zu den im Zellkern vorkommenden Steroidhormonrezeptoren ein G-Protein-gekoppelter Transmembranrezeptor (BATHGATE et al. 1995). Er wird am stärksten im Östrus exprimiert (MEYER et al.
1988) und fördert die uterine Kontraktilität durch einen Anstieg von E2. Die Hauptquelle der E2-Produktion befindet sich in den Follikeln des Ovars (SHOHAM u. SCHACHTER 1996), es wird aber auch im bovinen CL während des Zyklus gebildet (OKUDA et al.
2001). Der stimulierende Effekt von E2 auf OT-induzierte Kontraktionen (LEUNG u.
WATHES 2000; RICHTER et al. 2004) wird durch die Östrogenrezeptoren im Uterus vermittelt (TSAI et al. 1997). Ferner stimulieren polychlorierte Biphenyle durch die Aktivierung von Glukokortikoidrezeptoren die OT-Sekretion von bovinen Granulosa- und Lutealzellen und tragen somit zum Kontraktionsanstieg des zyklischen bovinen Uterus und den OT-stimulierten Kontraktionen der Myometriumstreifen bei (KOTWICA et al. 2006).
2.2.2.3. Prostaglandin-F2α
Das luteolytische Hormon PGF2α beeinflusst ebenfalls die Kontraktilität des Uterus (MCCRACKEN et al. 1999); es wird in den luminalen und glandulären Epithelien des Endometriums synthetisiert. Arachidonsäure (AA), die in Membranphospholipiden gespeichert wird, ist der Vorläufer von PG. Sie wird mit Hilfe der Enzyme Cyclooxygenase (COX) 1 und 2 zu Prostaglandin-H2 (PGH2) konvertiert, wobei COX-2 diejenige Form ist, die vorwiegend im Endometrium exprimiert wird (GOFF 2004; SPENCER u. BAZER 2004).
Prostaglandin-H2 wird in PGF2α umgewandelt und zeigt seinen Effekt durch den G-Protein-gekoppelten Rezeptor FP (NARUMIYA et al. 1999; JABBOUR u. SALES
2004).
Am Ende des Diöstrus ist die Östrogenrezeptor-1-Expression (ESR1) erhöht und die FPR-Expression vermindert, wodurch E2 die OTR-Expression im Uterus induziert. Das vom Hypophysenhinterlappen und/oder dem CL stammende OT kann auf diese Weise die Ausschüttung von luteolytischen PGF2α-Pulsen induzieren (BAZER et al. 2012).
Die Stimulation von PGF2α durch OT führt zu einer zunehmenden PGF2α-Freisetzung im Endometrium. Das PGF2α gelangt auf dem Blutweg mithilfe des vaskulären uteroovariellen Plexus in hoher Konzentration an das Ovar und führt dort zur Luteolyse (BANU et al. 2003; LEE et al. 2010).
18
Bei Wiederkäuern wird der Transport von PGF2α vom Endometrium zum Ovar durch Mechanismen, die durch das Prostaglandintransporter-Protein (PGT) vermittelt werden, erleichtert (BANU et al. 2003; 2008; LEE et al. 2010). Dies könnte ein Indiz für eine auto- und parakrine Wirkung von PGs im endometrialen Stroma sein. Bovines PGT wird auch im Myometrium gleichmäßig auf niedrigem Niveau im Zyklus exprimiert und ist diffus verteilt in glatten Muskelzellen der zirkulären und longitudinalen Muskelschicht vorhanden. Die Expression von PGT in den myometrialen glatten Muskelzellen kann zum Transport von PGF2α beitragen, was die Relaxation und/oder Kontraktion des Uterus ermöglicht (BANU et al. 2003).
Im Gegensatz dazu hemmt Interferon-tau (IFNT), welches vom elongierten Conceptus
abgegeben wird, die ESR1-Expression, wodurch wiederum die E2-induzierte OTR-Expression ausbleibt. Dies verhindert die OT-induzierte Abgabe von
luteolytischem PGF2α durch Epithel- und Stromazellen im Endometrium (LAFRANCE u. GOFF 1990; DESNOYERS et al. 1994; BURNS et al. 1997; GOFF 2004).
Literaturübersicht
19 2.3 Eileiter
Der Eileiter (Tuba uterina, Salpinx) erstreckt sich vom Ovar nach kaudal und mündet an der uterotubalen Verbindung (UTV) in den Uterus. Der Eileiter ist bei Kühen signifikant länger als bei Färsen (17,6 cm vs 15,3 cm; MONTEIRO et al. 2001). Er besteht aus drei funktionell unterschiedlichen Teilen. Der erste ist der mit Fimbrien ausgestattete Teil des Infundibulums (Fimbriae tubae), der die Oozyten nach der Ovulation auffängt (KÖNIG u.
LIEBICH 2018). Der zweite Abschnitt ist die Ampulla, gefolgt von dem Isthmus, der in den Uterus mündet. Die Ampulla-Isthmus-Verbindung ist der Bereich, in dem die Fertilisation stattfindet. (YANIZ et al. 2000).
Der Eileiter besteht mikroskopisch von innen nach außen aus folgenden Schichten Tunica mucosa, Tunica muscularis, Tela subserosa und Tunica serosa. Die Tunica mucosa unterteilt sich ihrerseits in das Epithelium mucosae und die Lamina propria mucosae. Die Tunica muscularis unterteilt sich ihrerseits in die Stratum circulare und Stratum longitudinale (LIEBICH 2009).
Die Muskelschicht, Tunica muscularis, ist je nach Eileitersegment unterschiedlich entwickelt. Im Infundibulum und der Ampulla ist sie deutlich dünner als im Isthmus (AYEN et al. 2012). Der Eileiter ist mit Flimmerzellen ausgekleidet, die lange, ins Lumen ragende, bewegliche Zilien (Kinozilien) an der apikalen Zellmembran besitzen. Sie bewegen das Ovum vom Ovar in Richtung Uterus (ELLINGTON 1991). Die Mikrovilli der Flimmerzellen tragen durch die Vergrößerung der Zelloberfläche zur vermehrten Resorption von Eileiterflüssigkeit bei. Im Vergleich zu Färsen sinkt bei Kühen nach wiederholter Trächtigkeit die Zahl der Mikrovilli, weshalb bei ihnen eine größere Menge Eileiterflüssigkeit im Lumen verbleibt (BAGE et al. 2002). Während des Östrus weisen die Mikrovilli ihre maximale Länge auf.
20 2.3.1 Kontraktilität des Eileiters
Bei zyklischen Kühen wurde die Kontraktilität des Eileiters bereits sowohl in vivo (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975; BENNETT et al. 1988) als auch in vitro untersucht (ISLA et al. 1989; WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001a; WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b), aber diese bisher nicht zwischen Kühen und Färsen verglichen.
Die Kontraktilitätsmuster wurden in vivo während des gesamten Zyklus mithilfe sensibler Mikrowandler (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975) bzw. einer extrazellulär lokalisierten Multielektrode im Eileiter (BENNETT et al. 1988) aufgezeichnet oder aber in vitro im Organbad (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b) untersucht. In Ovulationsnähe sind sowohl die F als auch die Amplitude der Kontraktionen im Isthmus -besonders auf der ipsilateralen Seite– größer als in der Ampulla. Zwischen der longitudinalen und zirkulären Muskelschicht konnte hingegen während des Zyklus kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (BENNETT et al. 1988; ISLA et al. 1989).
Der Eileiter weist als Ort der Befruchtung die höchste Kontraktionsfrequenz während des Östrus und Metöstrus auf (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975). Sowohl die Amplitude als auch die F steigen während des Östrus graduell an und korrelieren negativ mit den Serum-P4-Konzentrationen vor dem Östrus. Laut BENNETT et al. (1988) sind die Amplitude und F der Spontankontraktionen des Eileiters während der Lutealphase deutlich geringer als im Östrus.
In vitro-Studien zur Kontraktilität des Eileiters und zur Wirkung verschiedener Hormone wurden beim Rind und auch bei anderen Spezies durchgeführt. Die Wirkung von OT (KOTWICA et al. 2003) und PG (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b) wurde beim Rind untersucht. Außerdem wurden die Effekte von Progestagenen (WANGGREN et al.
2008) und Prostacyclin beim Menschen (ARBAB et al. 2002) analysiert. Beim Rind steigerte OT die Kontraktionsfrequenz und -amplitude im Eileiter während des Östrus (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975). Laut KOTWICA et al. (2003) führt eine Dosis von 10−7 M OT zu einem Anstieg der AUC im Eileiter, der Kühen während der Follikelphase entnommen worden war. Nach WIJAYAGUNAWARDANE et al. (2001b) bleibt die OT- Konzentration des Eileiters während des gesamten Zyklus unverändert.
Andererseits berichteten WIJAYAGUNAWARDANE et al. (2001b), dass mit LH bzw.
Endothelin-1 (ET-1) kombiniertes OT (10−8 M), aber auch OT allein, die Kontraktionsamplitude im Eileiter von Kühen in der Follikel- und Postovulationsphase in vitro hemmte.
Literaturübersicht
21
In der Lutealphase hatte OT allein oder in Kombination mit LH bzw. ET-1 keine Auswirkung auf die Eileiterkontraktilität.
WIJAYAGUNAWARDANE et. al. (2001b) vermuten eine Blockade der Kontraktilität des Eileiters durch die OT Sekretion, die vom neu enstehenden CL ausgeht. Die Autoren sind der Ansicht, dass die Hemmung der Kontraktilität zu einem langsameren Transport des Embryos zum Uterus führen könnte.
Beim Menschen führte die Verabreichung von 0,1 µM OT zu einer tendenziellen Steigerung, während nach der Zugabe von 0,2 µM OT eine Abnahme der Kontraktionsfrequenz zu beobachten war. Diese Dosierungen wurden separat in 20 min- Intervallen nach Spülung der Kanäle mit Krebspuffer verabreicht. Ferner wurde durch die höhere Dosis von OT die AUC des Eileiters deutlich reduziert (WANGGREN et al. 2008).
Laut WILDT et al. (1998) könnte OT durch die gleichzeitig induzierte Entspannung des Isthmus und der Kontraktion des Uterus von Bedeutung sein für den schnellen Transport von Samenzellen (WANGGREN et al. 2008).
Prostaglandin-F2α erhöht die F der Kontraktionen an der isolierten glatten Muskelschicht des menschlichen (WANGGREN et al. 2006) und des bovinen Eileiters
(WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich FP-Rezeptoren in den bovinen glatten Muskelzellen des Eileiters befinden und damit
Prostaglandine an der Regulation der Eileiterkontraktilität beteiligt sind (HUANG et al.
2015). Der TNFα, ein Zytokin, das durch eine von Gap-junctions abhängige Kommunikation Signale vermittelt, stimuliert die PG-Sekretion während der periovulatorischen Phase (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2003). Auch Angiotensin II, ein Peptidhormon, das zu einer Vasokonstriktion und zu einer nachfolgenden Erhöhung des Blutdrucks führt, stimuliert die Sekretion von PG im mikrodialysierten bovinen Eileiter (DE GASPARO et al. 2000). Angiotensin II könnte ein lokaler Vermittler von TNFα sein und neben seiner direkten Wirkung auf die glatte Muskulatur des Eileiters die PG- Sekretion während der periovulatorischen Periode stimulieren (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001a).
2.3.2 Innervation und hormonelle Kontrolle des Eileiters
Der Eileiter von Kühen wird durch adrenerge (CZAJA et al. 1993), cholinerge und peptiderge Nervenfasern (WROBEL u. KUJAT 1993) innerviert, wobei vor allem das sympathische Nervensystem dominiert.
22
Adrenerge Nervenfasern sind sowohl in der longitudinalen als auch in der zirkulären Schicht der Tunica muscularis des bovinen Eileiters zu finden.
Die Dichte der adrenergen und cholinergen Nerven steigt vom Infundibulum zum Isthmus hin an (CZAJA et al. 1993).
Der Eileiter ist sowohl im Bereich des Infundibulums als auch im Bereich der Ampulla wenig, im Isthmus allerdings stark adrenerg innerviert (EL-BANNA u. HAFEZ 1970). Laut KOTWICA et al. (2003) ist der Noradrenalingehalt im Infundibulum am größten, gefolgt von der Ampulla und dem Isthmus. Der Noradrenalingehalt scheint die Kontraktilität im Eileiter der Kühe während der Follikel- und frühen Lutealphase deutlich zu modifizieren.
Noradrenalin vermindert die AUC und hat eine relaxierende Wirkung auf die Kontraktilität von Ampulle und Isthmus (KOTWICA et al. 2003).
Neben Noradrenalin modifizieren auch andere Hormone, die durch Epithelzellen des Eileiters produziert werden, die Spontanmotilität des bovinen Eileiters auf para- und autokrinem Weg. Hierzu gehören Prostaglandin-F2α und -E2 (WANGGREN et al. 2008), ET-1 (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b), Angiotensin II und das atriale natriuretische Peptid (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001a). Alle diese Hormone erhöhten die Amplitude der Kontraktionen isolierter Eileiter während der Follikel- und Postovulationsphase, hatten aber keinen kontraktilen Effekt während der Lutealphase.
WIJAYAGUNAWARDANE et al. (1998) stellten fest, dass die P4-, E2-, PG-, PGF2α- und ET-1-Konzentrationen während der Follikelphase in den ipsilateral zum dominanten Follikel gelegenen bovinen Eileiter höher waren als im kontralateralen Eileiter. Die zyklischen endokrinologischen Veränderungen im Eileiter bieten das optimale Umfeld für eine optimale Fertilität. Die Eileitersekrete, insbesondere die Eileiter-spezifischen Glykoproteine haben eine positive Wirkung auf die Fertilisation und die Entwicklung des frühen Embryos (KILLIAN 2004). Es wird daher vermutet, dass diese Hormone synergistisch an der Regulation der Kontraktionen des Eileiters beteiligt sind, um einen optimalen Embryotransport zum Uterus zu gewährleisten. Diese und die entgegengesetzte Bewegung von Gameten zum Isthmus spielen eine wichtige Rolle für die Entstehung einer Trächtigkeit (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 1998; KILLIAN 2011) Ein Anstieg von LH, im Graaf’schen Follikel ansteigende E2-Konzentrationen und basale P4-Konzentrationen stimulieren die Synthese von PG und ET-1, welche zu einer vermehrten Kontraktilität des Eileiters und somit zu einem schnellen Transport der Gameten führen (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b).
Literaturübersicht
23
Die durch ET-1 induzierte Kontraktion des bovinen Eileiters wird durch endogenes Stickstoffmonoxid (Nitric Oxide; NO) stimuliert (ROSSELLI et al. 1994).
ROSELLI et al. (1996) berichteten ferner, dass die basale Synthese von NO als lokaler Entspannungsfaktor eine zentrale Rolle spielt und zur rhythmischen Kontraktion des Eileiters beitragen könnte. Unter bestimmten pathologischen Zuständen, wie beispielsweise dem Vorliegen einer Endometriose, kommt es zur endogenen Freisetzung von ET-1 und/oder NO. Dies kann zu einer abnormen Relaxation und/oder Kontraktion des Eileiters führen und folglich zu einer verminderten Fertilität beitragen (ROSSELLI et al. 1996).
Auch ICLC wurden im Eileiter identifiziert. Diese Zellen haben eine sogenannte Schrittmacherfunktion. Sie sind mit den glatten Muskelzellen verbunden, bilden mit diesen zusammen ein enges Netzwerk und führen somit zu autorythmischen Kontraktionen der glatten Muskelzellen (POPESCU et al. 2007; DIXON et al. 2009; ABD- ELHAFEEZ u. SOLIMAN 2017). Die von diesen Zellen generierte Aktivität ist von den Konzentrationen intra- und extrazellulär vorhandener Ca²+-Ionen abhängig (DIXON et al.
2011). Durch Ca2+-Ionen werden Ca2+-aktivierte K+-Kanäle (KCa) stimuliert, dadurch kommt es zur Membranhyperpolarisation, welche die Kontraktion der glatten Muskelzellen ermöglicht. Außerdem exprimieren die ICLC den ER und PR. CRETOIU et al. (2009) schlussfolgerten, dass ICLC die Kontraktilität des Eileiters als Steroidsensoren über Gap junctions und/oder parakrine Mechanismen beeinflussen können.
Die Wirkungen von E2 und P4 werden durch intrazellulare Rezeptoren (ERα, ERβ und PR) vermittelt, die ein Teil der Kernrezeptorfamilie sind (ULBRICH et al. 2003; SARUHAN et al. 2011). Östrogene verursachen Kompositionsveränderungen der Eileiterflüssigkeit, wobei die höchste Eileiter-spezifische Glykoproteinsekretion während der Follikelphase des Zyklus erfolgt (BUHI et al. 2000). Ferner wirken E2 und P4 synergistisch und regulieren so Eileiterkontraktionen für einen optimalen Embryotransport während der postovulatorischen Periode (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 1998). Die Expression des ERα im Eileiter nimmt in der Follikelphase, also unter Östrogeneinfluss, zu. Der ERβ hingegen wird in der lutealen Phase (Tag 6-18) unter dem Einfluss von P4 verstärkt exprimiert, wenn im Blut P4 dominiert. Der ERα wird beim Rind vermehrt in der Ampulla exprimiert, wohingegen der ERβ im Isthmus dominant ist (ULBRICH et al. 2003).
Die unterschiedliche Lokalisation der beiden Subtypen (ERα und ERβ) lässt auf unterschiedliche physiologische Funktionen schließen (ULBRICH et al. 2003).
24
Die ERα-Isoform vermittelt in vivo zudem eine E-abhängige Produktion und Sekretion von IGF-I, welches als lokaler Wachstumsfaktor von Bedeutung ist (SHAO et al. 2007a).
Die ERβ-Expression und Lokalisation in der Ampulla im Ratteneileiter weisen auf eine biologische Funktion des ERβ im Zusammenhang mit Calcium-abhängigen Zilienschlägen hin (SHAO et al. 2007b).
Der PR wird beim Rind in der Follikelphase am stärksten exprimiert und ist ein im Kern lokalisierter Steroidhormonrezeptor mit typischer Domänenstruktur (GREENE et al.
1986). Das PR-A-Protein wird am stärksten in der Ampulla während der frühen lutealen Phase exprimiert. Die Expression von PR-B unterliegt hingegen keinen zyklischen Schwankungen. Es konnte nachgewiesen werden, dass beim Rind von diesem Rezeptor im Isthmus mehr vorhanden ist als in der Ampulla (ULBRICH et al. 2003).
Die Expression des OTR und der stimulierende Effekt von OT auf die Eileiterkontraktilität sind bei Kühen in der Follikelphase im Vergleich zur Lutealphase deutlicher ausgeprägt (KOTWICA et al. 2003).
Sowohl der Embryonentransport als auch die Kommunikation zwischen Embryo und dem Eileiter bedürfen der Wirkung von Prostaglandinen, welche durch EPRs und FPRs vermittelt werden. Zudem haben die Prostaglandine eine Wirkung auf das lokale vaskuläre System und die Eileiterkontraktilität (WANGGREN et al. 2006). Auch Spermien stimulieren die Prostaglandinsynthese in den bovinen Eileiterepithelzellen und fördern dadurch die Eileiterkontraktionen (KODITHUWAKKU et al. 2007).
Literaturübersicht
25 2.4 Follikelflüssigkeit
Die Follikelflüssigkeit setzt sich im Wesentlichen aus folgenden Bestandteilen zusammen: Hormonen, Wachstumsfaktoren, Interleukinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), anti-apoptotischen Faktoren, Proteinen, Peptiden und Aminosäuren, Zuckern und Prostanoiden (REVELLI et al. 2009)
Von follikulären Steroidhormonen ist bekannt, dass deren Konzentrationen innerhalb des Zyklus stark fluktuieren (HENDERSON et al. 1982). Sie sind für die Fertilität relevant (OLIVERIA et al. (2002) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Kontraktilität des Uterus und Eileiters (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b; RIZZO et al. 2011). Auch die Hormonkonzentrationen in der Follikelflüssigkeit des bovinen Ovars schwanken beträchtlich je nach Phase des Zyklus, Follikelgröße und Follikelstatus (FORTUNE u. HANSEL 1985). Die E2-Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit und im peripheren Blutserum korrelierten bei Rindern signifikant positiv (PLAINO et al. 2000).
Im Ovar wird E2 von Granulosazellen in Antralfollikeln, insbesondere aber im präovulatorischen Follikel synthesiert und sezerniert (DIELEMAN u. BEVERS 1987) Große Follikel (>8,1 mm Durchmesser) produzieren in vivo hohe E2-Konzentrationen, jedoch weniger P4 und Testosteron als kleinere Follikel (DIELEMAN et al. 1983).
ECHTERNKAMP et al. (1994) und IRELAND und ROCHE (1983) unterteilten Follikel in E2-aktive und E2-inaktive Follikel (E2 > 50 ng/mL und Verhältnis von E2 zu P4 > 1).
Granulosazellen von Wiederkäuern, sondern zusätzlich OT ab, welches in der Follikelflüssigkeit nachgewiesen werden kann (SCHAMS 1987; MEIDAN et al. 1993).
Laut OLIVERIA et al. (2002) und PFEIFER et al. (2012) gibt es einen Zusammenhang zwischen dem Follikeldurchmesser und der Fertilitätsrate von Kühen. Die optimale Größe von Follikeln liegt bei Kühen zum Zeitpunkt der Ovulation zwischen 13-15 mm im Durchmesser, d.h. sie ist mit einer relativ hohen Besamungserfolg von etwas 70 % verbunden (PFEIFER et al. 2012).
26 3 Material und Methoden
3.1 Probenmaterial und Probenentnahme
Es standen Uteri von je acht und Eileiter von je sechs Kühen bzw. Färsen zur Verfügung. Es handelte sich dabei um zwei unabhängige Versuchsserien und die jeweiligen Proben stammten nicht von denselben Tieren. Die Organe wurden innerhalb von 60 min nach Schlachtung der Tiere direkt vor Ort am Städtischen Schlachthof Hannover entnommen und anschließend zur Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover transportiert.
Für die Studie wurden nur Organe von Tieren, die sich im Proöstrus bzw. Östrus befanden, verwendet. Um dies sicherzustellen, wurden die Ovarien der Kühe makroskopisch nach der von WIJAYAGUNAWARDANE et al. (1996) beschriebenen Methode beurteilt und das Probenmaterial nach folgenden Kriterien ausgewählt: das Ovar wies kein CL auf und es musste wenigstens ein Follikel mit einem Durchmesser
> 10 mm aufweisen. Außerdem durften an den inneren Genitalorganen makroskopisch keine pathologischen Veränderungen sichtbar sein (IRELAND et al. 1980; DAHME u.
WEISS 2007; PFEIFER et al. 2012). Es wurden nur die ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushörner bzw. Eileiter für die Untersuchungen verwendet.
Für die Eileiterstudien wurde der Eileiter nach Abtrennung vom Uterus im Bereich der UTV und für die Uterusstudien das ipsilaterale Uterushorn an die Klinik für Rinder verbracht. Der Transport dauerte ca. 40 min. und erfolgte in einem 50 mL-Röhrchen (Falcon™, Greiner Bio One GmbH, Deutschland) mit Krebspufferlösung (pH 7.4; siehe Anhang), das sich in einer Thermoskanne bei 37 °C befand.
3.2 Probenaufbereitung
Vom jeweiligen Ovar wurde Follikelflüssigkeit und Gewebeproben der entsprechenden Uteri und Eileiter für spätere Genexpressionsanalysen entnommen. Für die Genexpressionsanalyse wurden vom Eileiter 5 mm im Querschnitt sowie vom Myo- und Endometrium jeweils drei 10 mm x 1 mm x 1 mm (Länge x Breite x Höhe) große Gewebestücke entnommen. Diese Uterus- und Eileiterproben wurden sofort nach der Gewinnung in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.
Material und Methoden
27
Ein weiteres Gewebestück für die Polymerase Chain Reaction (PCR)-Analyse wurde mittels Tissuetek (Sakura Finetek, Zoekerwounde, Niederlande) eingebettet, anschließend in Stickstoff tiefgefroren und ebenfalls bei -80°C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.
3.3 Versuchsdurchführung
In der hier vorliegenden Arbeit wurde in vitro die Kontraktilität des Myometriums und Eileiters vergleichend bei Färsen und Kühen untersucht (Abb. 1).
Die Fragestellung der Arbeit war, ob sich die Kontraktilität der Uteri und Eileiter von Färsen und Kühen um den Zeitpunkt des Östrus unterscheiden und eventuell zu beobachtenden Unterschieden endokrinologische Ursachen haben könnten. Anhand der makroskopischen Beurteilung der Ovarien und der Bestimmung des Östrogenspiegels in den präovulatorischen Follikeln wurde die Zyklusphase der Tiere definiert.
Die Bestimmungen der Kontraktilitäten des Myometriums und Eileiters der Kühe und Färsen erfolgten in vitro an den ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushörnern und Eileitern. Gemessen wurden sowohl die spontanen Kontraktionen als auch mittels steigender Konzentrationen von PGF2α und OT hormonell induzierte Kontraktionen.
Es wurden Follikelflüssigkeit vom präovulatorischen Follikel sowie Gewebeproben von den Uteri und den Eileitern der Tiere entnommen, um anhand des Östrogenspiegels in der Follikelflüssigkeit, sowie der Genexpression der Rezeptoren für E2, P4, PGF2α
und OT zu entscheiden, ob sich diese Parameter im endokrinologischen Status, in der Kontraktilität zwischen Kühen und Färsen unterscheiden.
28
Abb. 1: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs (PCR: Polymerase Chain Reaction)
3.4 Gewinnung der Follikelflüssigkeit
Die Entnahme der Flüssigkeit erfolgte erst nach dem Transport in die Klinik für Rinder an der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Flüssigkeit der präovulatorischen Follikel wurde mit sterilen Einwegkanülen an den exenterierten Ovarien (HSW FINE- JECT®, Deutschland) und Einmalspritzen (5 mL, HSW NORM-JECT®, Deutschland) entnommen. Die Menge der entnommenen Follikelflüssigkeit betrug pro Tier 1-2 mL.
Die Follikelflüssigkeit wurde mit 1500 x g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und bis zu den Hormonanalysen bei -80 °C gelagert.
Kühe (n=8)
Eileiter
In vitro-Kontraktilität Real–Time PCR
Follikelpunktion Uterus
Färsen (n=8)
Kühe (n=6)
Färsen (n=6)
Material und Methoden
29
3.5 Hormonanalysen
Die Östrogenkonzentration wurde mithilfe eines Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) auf einer Mikrotiterplatte unter Verwendung einer sekundären Antikörperbeschichtungstechnik und einer Horseradish-Peroxidase als Enzymmarkierung nach Extraktion der Follikelflüssigkeit (300 µL) mit Butylmethylether gemessen. Diese Tests wurden bereits von THURMAN et al. (1990) und PRAKASH et al. (1987) beschrieben.
Das verwendete Antiserum wurde gegen 17β-Estradiolhemisuccinat erzeugt (Technische Universität Weihenstephan, Freising, München; mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. S. E. Ulbrich zur Verwendung überlassen). Es wurde das Enzym 17β-Estradiolhemisuccinat-Horseradish-Peroxidase verwendet. Die ELISA- Methode wurde validiert, indem mit bekannten Mengen an E2 (20- und 40- pg/mL) versehene Follikelflüssigkeiten analysiert wurden und die Wiederfindung berechnet wurde. Die Intra-Assay- und die Inter-Assay-Variationskoeffizienten wurden durch wiederholte Messungen von bovinen Follikelflüssigkeiten ermittelt. Der Intra-Assay- Variationskoeffizient betrug 8,6 % und der Inter-Assay Variationkoeffizient lag bei 9,5 %. Die Wiederfindungsraten betrugen 87 % - 92 %.
Die Progesteronbestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (coat-a-count® RIA P4, PITKPG-9; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn, Deutschland) mit einer Sensitivität von 0,1 ng P4 pro mL. Die Durchführung des Radioimmunoassays erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Spezifitäten des verwendeten
Antikörpers waren 100 % für P4, 9,0 % für 5 α-Pregnan 3.20-dion, 3,2 % für
5 β-Pregnan-3.20-dion, 3,4 % für 17α Dihydroprogesteron, 2,2 % für 11-Deoxycorticosteron und 0,9 % für Corticosterone. Die Intra- sowie Inter-Assay-
Variationskoeffizienten betrugen 3,5 % und 3,9 %.
30 3.6 Bestimmung der Kontraktilität in vitro
Die Gewebestreifen des Uterus und Eileiters wurden in die Kammer eines Organbades (Modell Nr. LE 01-086, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.; Cornellá, Barcelona, Spanien) eingehängt. Dieses Organbad bestand aus acht Kammern, welche mit je 10 mL Krebspufferlösung (pH 7,4) gefüllt waren und mit einem Thermostat (Thermostat Unit LE 13206, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.;
Cornellá, Barcelona, Spanien) konstant auf 37 °C gehalten wurden. Es fand eine dauerhafte Begasung mit 95 % O2 und 5 % CO2 statt.
Während der Messung wurde die Krebspufferlösung bei 37 °C in einer Flasche (Schott Duran ®, Deutschland) aufbewahrt und mit 95 % O2 und 5 % CO2 begast. Die Myometriumstreifen und Eileiterproben wurden mit Fäden zwischen jeweils einem Häkchen und einem isometrischen Kraftaufnehmer (TRI 201, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l., Cornellá, Barcelona, Spanien, Abb. 2) eingespannt.
Vom Kraftaufnehmer wurde das analoge Signal transferiert, digitalisiert und die Daten auf einem Computer mittels einer speziellen Software (Power lab 7.0/8SP ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) gespeichert und anschließend die Messdaten mit dem Programm Peak-Analyse (Lab Chart 7.0, ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) ausgewertet.
Zwischen jeder Konzentrationssteigerung wurden die Uterus- und Eileiterproben während der eigentlichen Messung zweimal mit Krebspuffer gespült, nicht aber während der Aufnahme der Spontankontraktionen.
Nach Ende der Stimulation wurde die Krebspufferlösung in allen Kammern durch Aqua dest. ersetzt. Dies führt bei funktionsfähigen Muskelstreifen zu osmotischem Stress, der die Kontraktionsfähigkeit erhöht (BERG et al. 2013). Eine Kontraktion des Muskels nach Zugabe von Aqua dest. wurde daher als positive Kontrolle für die Funktionalität des Muskelstreifens gewertet.
Material und Methoden
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Abb. 2: Organbad zur Messung der in vitro Kontraktilität des Myometriums und des Eileiters (Modell Nr. LE 01-086, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.; Cornellá, Barcelona, Spanien; links) und präparierter Organstreifen in einer Kammer des Organbads (rechts).
1 cm
32
3.6.1 Präparation der Myometriumproben für die Kontraktilitätsmessungen Für die Messung der Myometriumskontraktionen wurde das Myometrium auf der Seite des ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushorns abpräpariert (HIRSBRUNNER et al. 2002; Abb. 3, rechts). Von der zirkulär und longitudinal verlaufenden Schicht des Myometriums wurde jeweils vier Muskelstreifen der Größe 10 mm x 3 mm x 2 mm (Länge x Breite x Tiefe) entnommen. Einer der vier Muskelstreifen wurde nicht hormonell behandelt und diente als Kontrolle.
An den frei präparierten Enden der Gewebestücke wurde jeweils ein Faden so befestigt, dass die Länge der Stücke von Fadenloch zu Fadenloch 10 mm betrug.
In die ersten vier Kammern des Organbads wurden die „zirkulären“ und in die anderen vier Kammern die „longitudinalen“ Myometriumsstreifen des jeweils selbes Tier eingespannt.
Die ersten 30 min, in denen sich die Muskelstreifen im Organbad befanden und keiner Vorspannung unterzogen wurden, dienten der Äquilibrierung. Anschließend wurde mit einem Gewicht von 1 g und nach weiteren 15 min mit 2 g vorgespannt. Nach weiteren 15 min begann die eigentliche Messung mit einer Dauer von 2,5 Stunden. Dieses Zeitintervall wurde für die spätere Auswertung in 5-mal 30 min lange Zeitabschnitte unterteilt, die als T1–T5 bezeichnet werden (HIRSBRUNNER et al. 2003).
Die Myometriumsstreifen wurden entweder mit steigenden Konzentrationen von OT (CP-Pharma, Burgdorf, Deutschland) oder von PGF2α (Dinoprost, Dinolytic®, Pfizer GmbH, Karlsruhe, Deutschland) stimuliert.
Die Konzentrationen während der für die Auswertung als T6–T9 bezeichneten Zeitabschnitte wurden für OT von 10-10 M über 10-9 M, 10-8 M auf 10-7 M gesteigert und für PGF2α von 10-7 M über 10-6 M, 10-5 M auf 10-4 M (vgl. Tab. 1, im Anhang).
Material und Methoden
33
Abb. 3: Uterushorn einer Färse in Krebspuffer (links); Präparation eines Myometriumsstreifens mit Hilfe von Stecknadeln und Befestigung des Fadens zur späteren Einbringung in die Kammer des Organbades (rechts).
34 3.6.2 Präparation der Eileiterproben
Zu Beginn des Kontraktionsversuchs mit Eileiterproben wurde ein etwa 6 cm langes Stück vom Isthmus des Eileiters in vier jeweils etwa 1,5 cm lange Streifen geteilt (Abb. 4). Diese wurden in einer mit Silikon beschichteten und mit 37 °C warmer, Krebspufferlösung (pH 7,4) gefüllten Petri-Schale fixiert. An den beiden Enden der Eileiterproben wurde jeweils ein Faden befestigt, so dass die UTV-Seite in der Organbadkammer war und die Abschnitte von Fadenloch bis Fadenloch ungefähr 10 mm lang waren.
Die Eileiterproben wurden so in die Kammer des Organbades eingehängt, dass sich die Seite, die ursprünglich näher zur UTV lag, unten befand und die Seite, die der Ampulla zugewandt war, oben lag. In jeweils vier benachbarte Kammern wurden die Gewebestücke vom Eileiter eines Tieres eingebracht. Da das Organbad aus 8 Kammern bestand, konnte gleichzeitig die Kontraktilität des Eileiters von zwei Tieren erfasst werden.
Innerhalb der ersten 3 x 10 min der Messung äquilibrierten die Eileiterproben ohne Vorspannung in der Organbadkammer. Die Zeitabschnitte wurden nachher für die Auswertung als T1, T2 und T3 bezeichnet (Tab. 2, im Anhang).
Nach der Äquilibrierung der Eileiterproben wurden diese zunächst mit einem Gewicht von 1 g und nach weiteren 15 min mit 2 g vorgespannt. Nach weiteren 15 min begann die eigentliche Messung. Während der folgenden 30 min wurden die Spontankontrak- tionen aufgezeichnet. Danach wurden mit Ausnahme der ersten und fünften Kammer, bei denen als Kontrollen die Spontankontraktionen gemessen wurden, die übrigen sechs Kammern über jeweils 10 min entweder mit OT oder PGF2α befüllt. Die Konzentrationen während des für die Auswertung als T4 bezeichneten Zeitabschnitts lagen für OT bei 10-10 M und für PGF2α bei 10-7 M (WIJAYAGUNAWARDANE et al.
2001b; WANGGREN et al. 2008).
6 cm
Abb. 4: Boviner Eileiter mit dem für den Versuch verwendeten 6 cm langen Teil des Isthmus. Der weiße Pfeil zeigt an, dass die Streifen für die Kontraktilitätsmessungen kranial der uterotubalen Verbindung (UTV) in Richtung Ovar entnommen wurden.
Material und Methoden
35 3.6.3 Quantifizierung der Kontraktilität
3.6.3.1 Myometriumkontraktilität
Nach der Bestimmung der myometrialen Kontraktilität wurden die Länge und das Gewicht der Myometriumstreifen bestimmt, um deren Querschnittsfläche zu berechnen. Dafür wurde folgende Formel benutzt: Fläche=Gewicht/(Dichte x Länge) (HIRSBRUNNER et al. 2002).
Die Dichte der Muskulatur beträgt nach (HIRSBRUNNER et al. 2002) 1,056 g/cm3. Für jeden Kanal des Organbads und jedes Zeitintervall wurden die mittlere F, die Amin und Amax sowie die Amean und AUC mittels Peak-Analyse erfasst (GORRIZ-MARTIN 2013).
Für die Berechnung der Spontankontraktion wurde der Mittelwert der 30-minütigen Zeitintervalle (T1-T5) sowohl der zirkulären als auch der longitudinalen Muskelschicht verwendet (GORRIZ-MARTIN 2013). Um die Spontankontraktilität mit derjenigen nach Stimulation mit OT bzw. PGF2α zu vergleichen, wurden jeweils die Zeitintervalle T5
einander gegenübergestellt.
3.6.3.2 Kontraktilität des Eileiters
Für die Bestimmung der Kontraktilität des Eileiters wurden von jedem Eileiterabschnitt zwischen dem 1. bis 4. cm von der UTV Richtung Ovar Stücke in die Organbadkammern eingehängt. Jeweils in Zeitintervallen von 10 min wurden dieselben Kontraktionsparameter wie bei den Messungen der myometrialen Kontraktilität mittels Peak Analyse bestimmt. Um den Unterschied zwischen der Spontankontraktilität und derjenigen nach Stimulation mit OT bzw. PGF2α miteinander zu vergleichen, wurden jeweils die Zeitintervalle T3 herangezogen.
3.7 Real-Time PCR
Die Genexpressionsanalysen des Uterus- und Eileitergewebes wurden mittels quantitativer Real-Time RT-qPCR am Lehrstuhl für Physiologie Weihenstephan der Technischen Universität München durchgeführt (ULBRICH et al. 2009). Im Myometrium und Endometrium wurde die mRNA-Expression für ERα, ERß, PTGFR und OXTR ermittelt und im Eileitergewebe neben den vorher genannten Faktoren zusätzlich PTGER quantifiziert (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001; HAMMERLE- FICKINGER et al. 2010).
