Die Östrogenkonzentration wurde mithilfe eines Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) auf einer Mikrotiterplatte unter Verwendung einer sekundären Antikörperbeschichtungstechnik und einer Horseradish-Peroxidase als Enzymmarkierung nach Extraktion der Follikelflüssigkeit (300 µL) mit Butylmethylether gemessen. Diese Tests wurden bereits von THURMAN et al. (1990) und PRAKASH et al. (1987) beschrieben.
Das verwendete Antiserum wurde gegen 17β-Estradiolhemisuccinat erzeugt (Technische Universität Weihenstephan, Freising, München; mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. S. E. Ulbrich zur Verwendung überlassen). Es wurde das Enzym 17β-Estradiolhemisuccinat-Horseradish-Peroxidase verwendet. Die ELISA-Methode wurde validiert, indem mit bekannten Mengen an E2 (20- und 40- pg/mL) versehene Follikelflüssigkeiten analysiert wurden und die Wiederfindung berechnet wurde. Die Intra-Assay- und die Inter-Assay-Variationskoeffizienten wurden durch wiederholte Messungen von bovinen Follikelflüssigkeiten ermittelt. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient betrug 8,6 % und der Inter-Assay Variationkoeffizient lag bei 9,5 %. Die Wiederfindungsraten betrugen 87 % - 92 %.
Die Progesteronbestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (coat-a-count® RIA P4, PITKPG-9; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn, Deutschland) mit einer Sensitivität von 0,1 ng P4 pro mL. Die Durchführung des Radioimmunoassays erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Spezifitäten des verwendeten
Antikörpers waren 100 % für P4, 9,0 % für 5 α-Pregnan 3.20-dion, 3,2 % für
5 β-Pregnan-3.20-dion, 3,4 % für 17α Dihydroprogesteron, 2,2 % für 11-Deoxycorticosteron und 0,9 % für Corticosterone. Die Intra- sowie
Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 3,5 % und 3,9 %.
30 3.6 Bestimmung der Kontraktilität in vitro
Die Gewebestreifen des Uterus und Eileiters wurden in die Kammer eines Organbades (Modell Nr. LE 01-086, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.; Cornellá, Barcelona, Spanien) eingehängt. Dieses Organbad bestand aus acht Kammern, welche mit je 10 mL Krebspufferlösung (pH 7,4) gefüllt waren und mit einem Thermostat (Thermostat Unit LE 13206, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.;
Cornellá, Barcelona, Spanien) konstant auf 37 °C gehalten wurden. Es fand eine dauerhafte Begasung mit 95 % O2 und 5 % CO2 statt.
Während der Messung wurde die Krebspufferlösung bei 37 °C in einer Flasche (Schott Duran ®, Deutschland) aufbewahrt und mit 95 % O2 und 5 % CO2 begast. Die Myometriumstreifen und Eileiterproben wurden mit Fäden zwischen jeweils einem Häkchen und einem isometrischen Kraftaufnehmer (TRI 201, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l., Cornellá, Barcelona, Spanien, Abb. 2) eingespannt.
Vom Kraftaufnehmer wurde das analoge Signal transferiert, digitalisiert und die Daten auf einem Computer mittels einer speziellen Software (Power lab 7.0/8SP ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) gespeichert und anschließend die Messdaten mit dem Programm Peak-Analyse (Lab Chart 7.0, ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) ausgewertet.
Zwischen jeder Konzentrationssteigerung wurden die Uterus- und Eileiterproben während der eigentlichen Messung zweimal mit Krebspuffer gespült, nicht aber während der Aufnahme der Spontankontraktionen.
Nach Ende der Stimulation wurde die Krebspufferlösung in allen Kammern durch Aqua dest. ersetzt. Dies führt bei funktionsfähigen Muskelstreifen zu osmotischem Stress, der die Kontraktionsfähigkeit erhöht (BERG et al. 2013). Eine Kontraktion des Muskels nach Zugabe von Aqua dest. wurde daher als positive Kontrolle für die Funktionalität des Muskelstreifens gewertet.
Material und Methoden
31
Abb. 2: Organbad zur Messung der in vitro Kontraktilität des Myometriums und des Eileiters (Modell Nr. LE 01-086, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.; Cornellá, Barcelona, Spanien; links) und präparierter Organstreifen in einer Kammer des Organbads (rechts).
1 cm
32
3.6.1 Präparation der Myometriumproben für die Kontraktilitätsmessungen Für die Messung der Myometriumskontraktionen wurde das Myometrium auf der Seite des ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushorns abpräpariert (HIRSBRUNNER et al. 2002; Abb. 3, rechts). Von der zirkulär und longitudinal verlaufenden Schicht des Myometriums wurde jeweils vier Muskelstreifen der Größe 10 mm x 3 mm x 2 mm (Länge x Breite x Tiefe) entnommen. Einer der vier Muskelstreifen wurde nicht hormonell behandelt und diente als Kontrolle.
An den frei präparierten Enden der Gewebestücke wurde jeweils ein Faden so befestigt, dass die Länge der Stücke von Fadenloch zu Fadenloch 10 mm betrug.
In die ersten vier Kammern des Organbads wurden die „zirkulären“ und in die anderen vier Kammern die „longitudinalen“ Myometriumsstreifen des jeweils selbes Tier eingespannt.
Die ersten 30 min, in denen sich die Muskelstreifen im Organbad befanden und keiner Vorspannung unterzogen wurden, dienten der Äquilibrierung. Anschließend wurde mit einem Gewicht von 1 g und nach weiteren 15 min mit 2 g vorgespannt. Nach weiteren 15 min begann die eigentliche Messung mit einer Dauer von 2,5 Stunden. Dieses Zeitintervall wurde für die spätere Auswertung in 5-mal 30 min lange Zeitabschnitte unterteilt, die als T1–T5 bezeichnet werden (HIRSBRUNNER et al. 2003).
Die Myometriumsstreifen wurden entweder mit steigenden Konzentrationen von OT (CP-Pharma, Burgdorf, Deutschland) oder von PGF2α (Dinoprost, Dinolytic®, Pfizer GmbH, Karlsruhe, Deutschland) stimuliert.
Die Konzentrationen während der für die Auswertung als T6–T9 bezeichneten Zeitabschnitte wurden für OT von 10-10 M über 10-9 M, 10-8 M auf 10-7 M gesteigert und für PGF2α von 10-7 M über 10-6 M, 10-5 M auf 10-4 M (vgl. Tab. 1, im Anhang).
Material und Methoden
33
Abb. 3: Uterushorn einer Färse in Krebspuffer (links); Präparation eines Myometriumsstreifens mit Hilfe von Stecknadeln und Befestigung des Fadens zur späteren Einbringung in die Kammer des Organbades (rechts).
34 3.6.2 Präparation der Eileiterproben
Zu Beginn des Kontraktionsversuchs mit Eileiterproben wurde ein etwa 6 cm langes Stück vom Isthmus des Eileiters in vier jeweils etwa 1,5 cm lange Streifen geteilt (Abb. 4). Diese wurden in einer mit Silikon beschichteten und mit 37 °C warmer, Krebspufferlösung (pH 7,4) gefüllten Petri-Schale fixiert. An den beiden Enden der Eileiterproben wurde jeweils ein Faden befestigt, so dass die UTV-Seite in der Organbadkammer war und die Abschnitte von Fadenloch bis Fadenloch ungefähr 10 mm lang waren.
Die Eileiterproben wurden so in die Kammer des Organbades eingehängt, dass sich die Seite, die ursprünglich näher zur UTV lag, unten befand und die Seite, die der Ampulla zugewandt war, oben lag. In jeweils vier benachbarte Kammern wurden die Gewebestücke vom Eileiter eines Tieres eingebracht. Da das Organbad aus 8 Kammern bestand, konnte gleichzeitig die Kontraktilität des Eileiters von zwei Tieren erfasst werden.
Innerhalb der ersten 3 x 10 min der Messung äquilibrierten die Eileiterproben ohne Vorspannung in der Organbadkammer. Die Zeitabschnitte wurden nachher für die Auswertung als T1, T2 und T3 bezeichnet (Tab. 2, im Anhang).
Nach der Äquilibrierung der Eileiterproben wurden diese zunächst mit einem Gewicht von 1 g und nach weiteren 15 min mit 2 g vorgespannt. Nach weiteren 15 min begann die eigentliche Messung. Während der folgenden 30 min wurden die Spontankontrak-tionen aufgezeichnet. Danach wurden mit Ausnahme der ersten und fünften Kammer, bei denen als Kontrollen die Spontankontraktionen gemessen wurden, die übrigen sechs Kammern über jeweils 10 min entweder mit OT oder PGF2α befüllt. Die Konzentrationen während des für die Auswertung als T4 bezeichneten Zeitabschnitts lagen für OT bei 10-10 M und für PGF2α bei 10-7 M (WIJAYAGUNAWARDANE et al.
2001b; WANGGREN et al. 2008).
6 cm
Abb. 4: Boviner Eileiter mit dem für den Versuch verwendeten 6 cm langen Teil des Isthmus. Der weiße Pfeil zeigt an, dass die Streifen für die Kontraktilitätsmessungen kranial der uterotubalen Verbindung (UTV) in Richtung Ovar entnommen wurden.
Material und Methoden
35 3.6.3 Quantifizierung der Kontraktilität
3.6.3.1 Myometriumkontraktilität
Nach der Bestimmung der myometrialen Kontraktilität wurden die Länge und das Gewicht der Myometriumstreifen bestimmt, um deren Querschnittsfläche zu berechnen. Dafür wurde folgende Formel benutzt: Fläche=Gewicht/(Dichte x Länge) (HIRSBRUNNER et al. 2002).
Die Dichte der Muskulatur beträgt nach (HIRSBRUNNER et al. 2002) 1,056 g/cm3. Für jeden Kanal des Organbads und jedes Zeitintervall wurden die mittlere F, die Amin und Amax sowie die Amean und AUC mittels Peak-Analyse erfasst (GORRIZ-MARTIN 2013).
Für die Berechnung der Spontankontraktion wurde der Mittelwert der 30-minütigen Zeitintervalle (T1-T5) sowohl der zirkulären als auch der longitudinalen Muskelschicht verwendet (GORRIZ-MARTIN 2013). Um die Spontankontraktilität mit derjenigen nach Stimulation mit OT bzw. PGF2α zu vergleichen, wurden jeweils die Zeitintervalle T5
einander gegenübergestellt.
3.6.3.2 Kontraktilität des Eileiters
Für die Bestimmung der Kontraktilität des Eileiters wurden von jedem Eileiterabschnitt zwischen dem 1. bis 4. cm von der UTV Richtung Ovar Stücke in die Organbadkammern eingehängt. Jeweils in Zeitintervallen von 10 min wurden dieselben Kontraktionsparameter wie bei den Messungen der myometrialen Kontraktilität mittels Peak Analyse bestimmt. Um den Unterschied zwischen der Spontankontraktilität und derjenigen nach Stimulation mit OT bzw. PGF2α miteinander zu vergleichen, wurden jeweils die Zeitintervalle T3 herangezogen.
3.7 Real-Time PCR
Die Genexpressionsanalysen des Uterus- und Eileitergewebes wurden mittels quantitativer Real-Time RT-qPCR am Lehrstuhl für Physiologie Weihenstephan der Technischen Universität München durchgeführt (ULBRICH et al. 2009). Im Myometrium und Endometrium wurde die mRNA-Expression für ERα, ERß, PTGFR und OXTR ermittelt und im Eileitergewebe neben den vorher genannten Faktoren zusätzlich PTGER quantifiziert (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001; HAMMERLE-FICKINGER et al. 2010).
36
Eine Quantifizierung von PTGER konnte im Myometrium und Endometrium nicht durchgeführt werden. Die verwendeten Primer sind in Tab. 3 (im Anhang) dargestellt (LÜTTGENAU 2010).
3.8 Statistische Auswertung
Die Daten der Kontraktilitätsmessungen, Genexpressionsanalysen und Hormonanalysen wurden in Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) dokumentiert. Die statistischen Auswertungen erfolgten mit dem Programm Statistical Analysis System (SAS ® Institute Inc., Cary/North Carolina, USA) der Versionen 8.2 und 9.2. Nach Prüfung der Ergebniss auf Normalverteilung der einzelnen Parameter von Kühen und Färsen mittels eines Kruskal Wallis Testes, wurden Mittelwerte und Standardabweichungen ( ±SD) bzw. die 5 % und 95 % Perzentile bestimmt.
Bei normalverteilten Daten wurde der Student‘s t-Test und bei nicht parametrischen Daten der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test durchgeführt. Änderungen der Parameter innerhalb einer Gruppe zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeiträumen wurden mit dem Wilcoxon signed-rank Test untersucht. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als signifikant, Ergebnisse mit p < 0,0001 als hochsignifikant und Ergebnisse zwischen 0.05 < p ≤ 0.10 als Tendenz bezeichnet.
Ob sich nach dem Zusatz von OT bzw. PGF2α gegenüber Kontrollproben ohne hormonelle Stimulation Änderungen in der Kontraktilität ergaben, wurde mit dem Dunkan’s multiplen Mittelwertvergleich geprüft. Die Kontraktilität nach der Zugabe von PGF2α und OT wurde anhand der Steigung mittels linearer Regression berechnet.
Die Korrelationen zwischen der relativen Menge der Genexpression von ausgewählten Gen-Rezeptoren und Muskelkontraktionsparametern wurden mittels Spearman Korrelationstest ausgewertet.
Die Korrelationen zwischen der relativen Menge der mRNA-Expression von ausgewählten Genen und der Kontraktilität (Muskelkontraktionsparameter) wurden vor und nach der Stimulation mit 10-10 M OT und 10-7 M PGF2α im Uterus und Eileiter berechnet.
X
Ergebnisse
37 4 Ergebnisse
4.1 Gewebeproben
4.1.1 Uteri
Die acht Uteri von Kühen und Färsen, die für die Entnahme von Myometriumsstreifen für die Kontraktilitätsversuche verwendet wurden, wiesen makroskopisch keine pathologischen Veränderungen auf. Auf dem ipsilateral zum untersuchten Uterushorn gelegenen Ovar befand sich in allen Fällen je ein Follikel mit einer durchschnittlichen Größe von 15 ± 5 mm (p < 0,05). Auf keinem der beiden Ovarien befand sich ein CL.
4.1.2 Eileiter
Die für den in vitro-Kontraktilitätsversuch verwendeten Eileiter von geschlachteten Kühen (n=6) und Färsen (n=6) zeigten keine pathologischen Veränderungen. Die Eileiter stammten nicht von denselben Kühen, von denen die Uteri untersucht worden waren. Die durchschnittliche Länge betrug 23 ± 0.6 cm bei Kühen und 17 ± 0.5 cm bei Färsen (p < 0,05). Auf dem ipsilateral zum untersuchten Eileiter gelegenen Ovar befand sich in allen Fällen je ein Follikel mit einer durchschnittlichen Größe von 15 ± 5 mm (p < 0,05). Auf keinem der beiden Ovarien befand sich ein CL.
38
4.2 Hormonkonzentrationen in der Follikelflüssigkeit
4.2.1 Uterus
Die E- und P4-Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit des dominanten Follikels waren bei Färsen und Kühen vergleichbar (p > 0.05; Abb. 5; Tab. 4).
Abb. 5: Konzentrationen an Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) in der für die Uterusexperimente gesammelten Follikelflüssigkeit von Färsen (n = 8) und Kühen (n = 8). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Wert sowie das 5 % und 95 % Perzentile.
350
Färsen 0
50 100 150 200 250 300
E (102 x ng/mL)
0 200 400 600 800 1000 1200
P4 (ng/mL)
Kühe
Färsen Kühe
Ergebnisse
39 4.2.2 Eileiter
Die E- und P4-Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit von Färsen und Kühen waren vergleichbar (p > 0.05; Abb. 6; Tab. 5).
Abb. 6: Konzentrationen an Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) in der für die Eileiterexperimente entnommenen Follikelflüssigkeit von Färsen (n = 6) und Kühen (n = 6). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Färsen Kühe
0 200 400 600 800 1000 1200
P4 (ng/mL) E(ng/mL)
Färsen Kühe
40 4.3 Kontraktilität
Die Parameter Amean und AUC waren während der Kontraktilitätsversuche des Myometriums und des Eileiters vergleichbar und korrelierten positiv miteinander (r=1,0, p<0,05). Deswegen werden bei den folgenden Auswertungen nur die Ergebnisse für Amean gezeigt.
4.3.1 Myometriumkontraktilität 4.3.1.1 Spontankontraktion
Die Auswertung der Spontankontraktionen der longitudinalen Muskelschicht ergab, dass sowohl die Amax- als auch die Amean-Werte bei Kühen höher (p < 0,05) waren als bei Färsen (Abb. 7). Auch die Amean-Werte der zirkulären Muskelschicht waren bei Kühen höher als bei Färsen (p < 0,05).
Die F der Spontankontraktionen war bei Kühen höher als bei Färsen. Dieses Ergebnis
galt sowohl für die zirkuläre als auch die longitudinale Muskelschicht (p < 0,05; Abb. 7). Ferner war bei Färsen F der longitudinalen Muskelschicht höher als
F der zirkulären Muskelschicht (p < 0,05). Bei Färsen war Amin in der zirkulären Muskelschicht tendenziell höher (p = 0,07) als in der longitudinalen Muskelschicht. Bei Kühen war Amax in der zirkulären Muskelschicht tendenziell höher (p = 0,09) als in der longitudinalen Muskelschicht (Tab. 6).
Ergebnisse
41
Abb. 7: Maximale Amplitude (Amax), mittlere Amplitude (Amean) einer Kurve und Frequenz (F) während der gesamten Untersuchungszeit von 150 Minuten der Spontankontraktionen der longitudinalen und zirkulären Muskelschicht bei Färsen (n = 8) und Kühen (n = 8). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit dem Symbol (*) differieren (p < 0,05) zwischen Färsen und Kühen. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b) differieren zwischen der longitudinalen und zirkulären Muskelschicht (p < 0,05).
42
Der Amean-Wert der longitudinalen Muskelschicht war in den Zeitabschnitten T1 und T2
bei Kühen signifikant höher als bei Färsen im gleichen Zeitabschnitt. Amax der zirkulären Muskelschicht unterschied sich nicht zwischen Färsen und Kühen (p > 0,05), war aber in der longitudinalen Muskelschicht im Zeitabschnitt T1 bei Kühen tendenziell höher als bei Färsen (p=0,06). Die Präparate der zirkulären Muskelschicht, die von Kühen entnommen worden waren, zeigten im Vergleich zu denjenigen von Färsen eine signifikant höhere Kontraktionsfrequenz während der gesamten Versuchsdauer (T1 – T5). In der longitudinalen Muskelschicht war diese bei Kühen in den Zeitintervallen T1 und T2 signifikant größer als bei Färsen (Abb. 8).
Ergebnisse
43
Abb. 8: Maximale Amplitude (Amax), mittlere Amplitude (Amean) einer Kurve und Frequenz (F) der Spontankontraktionen während der gesamten Untersuchungszeit von 150 Minuten der longitudinalen und zirkulären Muskelschicht bei Färsen (n = 8) und Kühen (n = 8). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit dem Symbol (*) differieren zwischen Kühen und Färsen (p < 0,05). T1 = Zeitabschnitt 0-30 min, T2 = Zeitabschnitt 31-60 min, T3 = Zeitabschnitt 61-90 min, T4 = Zeitabschnitt 91-120 min, T5 = Zeitabschnitt 121-150 min.
350
44
4.3.1.2 Stimulation des Myometriums mittels Prostaglandin F2α
Die Stimulation mit PGF2α bewirkte bei Färsen in der longitudinalen Muskelschicht einen signifikanten Anstieg der Amax- und Amean-Werte (Abb. 9).
Die Stimulation mit 10-7 M PGF2α führte bei Kühen zu einer tendenziell höheren Kontraktilität im Vergleich zu den Spontankontraktionen sowohl in der zirkulären (Amean: p = 0,06, Amax: p = 0,07) als auch in der longitudinalen (Amean und Amax: p = 0,07) Muskelschicht. Die Stimulation der Muskelstreifen aus der longitudinalen und zirkulären Muskelschicht in vitro mit 10-7 M PGF2α erbrachte weder bei Färsen noch bei Kühen eine Veränderung der myometrialen F (p > 0,05).
In der zirkulären Muskelschicht führte die Stimulation mit einer Konzentration von 10-4 M PGF2α zu einer signifikant stärkeren F der Myometriumstreifen als eine Konzentration von 10-7 M PGF2α bei Färsen und zu einer tendenziell stärkeren F als 10-7 M PGF2α bei Kühen (Abb. 10 und Abb. 11). Die PGF2α-Stimulation mit 10-7 M im Vergleich zu den Spontankontraktionen führte zu einer stärkeren (p < 0,05) Kontraktilität der Muskelstreifen aus der longitudinalen Muskelschicht (Amax, Amean und F bei Färsen sowie Amax und Amean bei Kühen) als die Zugabe von niedrigeren PGF2α -Konzentrationen (Tab. 7).
4.3.1.3 Stimulation des Myometriums mit Oxytocin
Die Stimulation mit unterschiedlichen OT-Konzentrationen führte im Vergleich zu der Kontrollgruppe (ohne Stimulation) zu keinen signifikanten Effekten auf die Kontraktilitätsparameter (Amax, Amean, und F), weder in der zirkulären noch in der longitudinalen Muskelschicht (Tab. 7).
Ergebnisse
45
Abb. 9: Maximale Amplitude (Amax), Mittlere Amplitude (Amean), Frequenz (F) der Spontankontraktionen der zirkulären und longitudinalen Muskelschicht ohne (K) sowie nach Stimulation mit 10-7 M Prostaglandin F2α (PGF2α) bzw. 10-10 M Oxytocin (OT) bei Färsen (n = 8) und Kühen (n = 8). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 %- sowie 95 % Perzentile der zirkulären und longitudinalen Muskelschicht über einen Untersuchungszeitraum von 30 Minuten.
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b) differieren signifikant (p < 0,05) bzw.
tendenziell (c, d: 0,05 ≤ p ≤ 0,10).
46
Abb. 10: Maximale Amplitude (Amax)-, Mittlere Amplitude (Amean) und Frequenz (F) der zirkulären Muskelschicht über die gesamte Untersuchungszeit von 120 Minuten ohne (K) der Spontankontraktion sowie mit Stimulation durch Zusatz von Prostaglandin-F2α
(PGF2α) in unterschiedlichen Konzentrationen (10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b, c) zeigen Unterschiede (p < 0,05) zwischen verschiedenen PGF2α-Konzentrationen.
Färsen Kühe
Ergebnisse
47
Abb. 11: Maximale Amplitude (Amax), Mittlere Amplitude (Amean), und Frequenz (F) der Kontraktionen der longitudinalen Muskelschicht ohne Stimulation (K) sowie nach Stimulation durch Zusatz von Prostaglandin-F2α (PGF2α) in unterschiedlichen Kon-zentrationen (10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b, c, d) zeigen Unterschiede (p < 0,05) zwischen verschiedenen PGF2α-Konzentrationen.
PGF2α
48 4.3.2 Kontraktilität des Eileiters
4.3.2.1 Spontankontraktilität in verschiedenen Abschnitten des Eileiters Die spontane Kontraktilität des Eileiters von Färsen und Kühen ist in Abb. 14 dargestellt. Im ersten Teil des Eileiters (1-1,5 cm) waren Amax und Amean bei Kühen signifikant höher als bei Färsen. Im zweiten Teil des Eileiters (1,5-3 cm) war die F bei Färsen signifikant höher als bei Kühen. Im dritten Teil (3-4,5 cm) war Amax bei Kühen signifikant höher im Vergleich zu Färsen. Im vierten Teil (4,5-6 cm) des Eileiters waren keine Unterschiede (p > 0,05) in den Kontraktilitätsmustern zwischen Färsen und Kühen zu finden (Abb. 12, Tab.8).
Ergebnisse
49
Abb. 12: Maximale Amplitude (Amax), Mittlere Amplitude (Amean), Frequenz (F) spontaner Kontraktionen der Eileiterabschnitte zwischen dem 1. bis 6. cm (4 gleich lange Abschnitte) kranial der uterotubalen Verbindung (UTV) bei Färsen (n = 6) und Kühen (n = 6). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Wert und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b) differieren zwischen Färsen und Kühen (p < 0,05).
Färsen
50 4.3.2.2 Spontankontraktion
Der Eileiter von Färsen zeigte in vitro spontan eine signifikant höhere F der Spontankontraktion im Vergleich zu dem der Kühe. Es konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Parameter Amax und Amean zwischen Färsen und Kühen gemessen werden (Abb. 13, Tab. 9).
Abb. 13: Maximale der Amplitude (Amax), Mittlere Amplitude (Amean) und Frequenz (F) spontaner Eileiterkontraktionen bei Färsen (n = 6) und Kühen (n = 6). Die dargestellten Boxplots zeigen Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b) differieren (p < 0,05).
0,16
Ergebnisse
51
Abb. 14: Spontane Eileiterkontraktionen (erste 15 min.) vier verschiedener Eileiterabschnitte (zwischen 1 bis 6 cm kranial der uterotubalen Verbindung) bei einer Färse und Kuh. Die Kanäle (Channel) 1 bis 4 zeigen Eileiterkontraktionen von einer Färse und die Kanäle 5 bis 8 Eileiterkontraktionen von einer Kuh.
1-1,5 cm
1,5-3 cm
cm
3-4,5 cm 4,5-6 cm
1-1,5 cm
1,5-3 cm
cm
3-4,5 cm
4,5-6 cm Kuh Färse
52
4.3.2.3 Stimulation der Eileiterkontraktion mit Prostaglandin-F2α
Die Zugabe von PGF2α zum Medium hatte im Vergleich zu den Spontankontraktionen keine Effekte (p > 0,05) auf die Kontraktilität (Amax, Amean und F) der Eileiter von Kühen und Färsen (Abb. 15, Tab.10).
4.3.2.4 Stimulation der Eileiterkontraktion mit Oxytocin
Die Kontraktionsamplituden (Amax, Amean) änderten sich weder bei Färsen noch bei Kühen (p > 0,05) durch die Stimulation mit OT und unterschieden sich auch nicht (p > 0,05) zwischen den Tiergruppen (Abb. 15, Tab. 10). Die Stimulation mit OT führte zu einem Anstieg von F bei Kühen (p < 0,05), aber nicht bei Färsen (p > 0,05).
Ergebnisse
53
Abb. 15: Maximale Amplitude (Amax), Mittlere Amplitude (Amean), Frequenz (F) der Kontraktionen des Eileiters ohne Stimulation (K) und mit Stimulation mit 10-7 M Prostaglandin-F2α (PGF2α) bzw. 10-10 M Oxytocin (OT) bei Färsen (n = 6) und Kühen (n = 6). Die dargestellten Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b) differieren zwischen K und OT (p < 0,05).
Färsen Kühe
54
4.4 Genexpression verschiedener Hormonrezeptoren 4.4.1 Uterus
Die mRNA-Expression des ERα war im Endometrium von Kühen tendenziell (p = 0,08) höher als im Endometrium von Färsen, nicht aber im Myometrium. Die mRNA-Expression der Hormonrezeptoren ERß, PR, OXTR und PTGFR im Endometrium und Myometrium differierte zwischen Färsen und Kühen nicht (p > 0,05; Abb. 16, Tab. 11).
Ergebnisse
55
Abb. 16: Relative (∆cq) mRNA-Expression des Östrogenrezeptors α (ERα), Östrogenrezeptors β (ERß), Progesteronrezeptors (PR), Oxytocinrezeptors (OXTR) und Prostaglandin-F2α-Rezeptors (PTGFR) im Endo- und Myometrium bei Färsen (n = 8) und Kühen (n = 8).
Die Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Werte und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b) differieren tendenziell (p = 0,08).
-1,5
56 4.4.2 Eileiter
Im Eileiter unterschied sich die mRNA-Expression von ERα, ERß, PR und PTGER nicht zwischen Färsen und Kühen (p > 0,05). Dagegen waren die mRNA-Konzentrationen des OXTR und PTGFR im Eileiter von Färsen höher als bei Kühen (p < 0,05; Abb. 17, Tab. 12).
Ergebnisse
57
Abb. 17: Relative mRNA-Expression von Östrogenrezeptor α (ERα), Östrogenrezeptor β (ERß), Progesteronrezeptor (PR), Oxytocinrezeptor (OXTR), Prostaglandin-E2-Rezeptor (PTGER) und Prostaglandin-F2α-Rezeptor (PTGFR) im Eileiter von Färsen (n = 6) und Kühen (n = 6). Die Boxplots zeigen die Median-, Maximum- und Minimum-Wert und 5 % sowie 95 % Perzentile. Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b) differieren (p < 0,05).
ERα (∆cq)
58
4.4.3 Zusammenhänge zwischen Genexpression und Kontraktilität des Uterus 4.4.3.1 Spontankontraktilität des Uterus
Es bestanden bei Färsen und Kühen (n = 16) positive Korrelationen zwischen den relativen mRNA-Mengen von myometrialem OXTR und der spontanen Kontraktionsamplitude (OXTR-Amean: r=0,53; p=0,04; (Tab. 13). Die mRNA-Expression des myometrialen ERβ und Amax korrelierten negativ miteinander (ERβ-Amax: r = -0, 62;
p = 0,01). Zwischen den Kontraktionsparametern von Amean, Amax und F und den Genexpressionen (ERα, PR und PTGFR) gab es keine signifikanten Korrelationen, weder bei gemeinsamer Betrachtung der Werte von den Färsen und Kühen (n=16) noch bei getrennter Auswertung der Werte der beiden Tiergruppen (Tab. 13).
Bei separater Analyse der Werte der Färsen und Kühe korrelierte die mRNA-Expression des myometrialen OXTR und die spontane Kontraktionsfrequenz negativ bei Kühen (OXTR-F: r=-0,90; p= 0,002); bei Färsen gab es dagegen tendenziell positive Korrelationen zwischen der myometrialen mRNA-Expression von OXTR und der spontanen Amean (OXTR-Amean: r=0,64; p= 0,09, Abb. 18) sowie zwischen der myometrialen mRNA-Expression von ERβ und F (ERβ -F: r= 0,64; p= 0,09; Abb. 18, Tab. 14).
4.4.3.2 Stimulierte Kontraktilität des Uterus
Es bestand weder bei gemeinsamer Auswertung der Daten von Färsen und Kühen (n=16) noch bei getrennter Betrachtung der beiden Tiergruppen (p> 0,05, Tab. 15 und Tab. 16) ein Zusammenhang zwischen der mit PGF2α stimulierten myometrialen Kontraktilität (Amean, Amax und F) und der myometrialen mRNA-Expression von PTGFR.
Es bestand weder bei gemeinsamer Auswertung der Daten von Färsen und Kühen (n=16) noch bei getrennter Betrachtung der beiden Tiergruppen (p> 0,05, Tab. 15 und Tab. 16) ein Zusammenhang zwischen der mit PGF2α stimulierten myometrialen Kontraktilität (Amean, Amax und F) und der myometrialen mRNA-Expression von PTGFR.