Prostaglandin-F 2α

Das luteolytische Hormon PGF2α beeinflusst ebenfalls die Kontraktilität des Uterus (MCCRACKEN et al. 1999); es wird in den luminalen und glandulären Epithelien des Endometriums synthetisiert. Arachidonsäure (AA), die in Membranphospholipiden gespeichert wird, ist der Vorläufer von PG. Sie wird mit Hilfe der Enzyme Cyclooxygenase (COX) 1 und 2 zu Prostaglandin-H2 (PGH2) konvertiert, wobei COX-2 diejenige Form ist, die vorwiegend im Endometrium exprimiert wird (GOFF 2004; SPENCER u. BAZER 2004).

Prostaglandin-H2 wird in PGF2α umgewandelt und zeigt seinen Effekt durch den G-Protein-gekoppelten Rezeptor FP (NARUMIYA et al. 1999; JABBOUR u. SALES

2004).

Am Ende des Diöstrus ist die Östrogenrezeptor-1-Expression (ESR1) erhöht und die FPR-Expression vermindert, wodurch E2 die OTR-Expression im Uterus induziert. Das vom Hypophysenhinterlappen und/oder dem CL stammende OT kann auf diese Weise die Ausschüttung von luteolytischen PGF2α-Pulsen induzieren (BAZER et al. 2012).

Die Stimulation von PGF2α durch OT führt zu einer zunehmenden PGF2α-Freisetzung im Endometrium. Das PGF2α gelangt auf dem Blutweg mithilfe des vaskulären uteroovariellen Plexus in hoher Konzentration an das Ovar und führt dort zur Luteolyse (BANU et al. 2003; LEE et al. 2010).

18

Bei Wiederkäuern wird der Transport von PGF2α vom Endometrium zum Ovar durch Mechanismen, die durch das Prostaglandintransporter-Protein (PGT) vermittelt werden, erleichtert (BANU et al. 2003; 2008; LEE et al. 2010). Dies könnte ein Indiz für eine auto- und parakrine Wirkung von PGs im endometrialen Stroma sein. Bovines PGT wird auch im Myometrium gleichmäßig auf niedrigem Niveau im Zyklus exprimiert und ist diffus verteilt in glatten Muskelzellen der zirkulären und longitudinalen Muskelschicht vorhanden. Die Expression von PGT in den myometrialen glatten Muskelzellen kann zum Transport von PGF2α beitragen, was die Relaxation und/oder Kontraktion des Uterus ermöglicht (BANU et al. 2003).

Im Gegensatz dazu hemmt Interferon-tau (IFNT), welches vom elongierten Conceptus

abgegeben wird, die ESR1-Expression, wodurch wiederum die E2-induzierte OTR-Expression ausbleibt. Dies verhindert die OT-induzierte Abgabe von

luteolytischem PGF2α durch Epithel- und Stromazellen im Endometrium (LAFRANCE u. GOFF 1990; DESNOYERS et al. 1994; BURNS et al. 1997; GOFF 2004).

Literaturübersicht

19 2.3 Eileiter

Der Eileiter (Tuba uterina, Salpinx) erstreckt sich vom Ovar nach kaudal und mündet an der uterotubalen Verbindung (UTV) in den Uterus. Der Eileiter ist bei Kühen signifikant länger als bei Färsen (17,6 cm vs 15,3 cm; MONTEIRO et al. 2001). Er besteht aus drei funktionell unterschiedlichen Teilen. Der erste ist der mit Fimbrien ausgestattete Teil des Infundibulums (Fimbriae tubae), der die Oozyten nach der Ovulation auffängt (KÖNIG u.

LIEBICH 2018). Der zweite Abschnitt ist die Ampulla, gefolgt von dem Isthmus, der in den Uterus mündet. Die Ampulla-Isthmus-Verbindung ist der Bereich, in dem die Fertilisation stattfindet. (YANIZ et al. 2000).

Der Eileiter besteht mikroskopisch von innen nach außen aus folgenden Schichten Tunica mucosa, Tunica muscularis, Tela subserosa und Tunica serosa. Die Tunica mucosa unterteilt sich ihrerseits in das Epithelium mucosae und die Lamina propria mucosae. Die Tunica muscularis unterteilt sich ihrerseits in die Stratum circulare und Stratum longitudinale (LIEBICH 2009).

Die Muskelschicht, Tunica muscularis, ist je nach Eileitersegment unterschiedlich entwickelt. Im Infundibulum und der Ampulla ist sie deutlich dünner als im Isthmus (AYEN et al. 2012). Der Eileiter ist mit Flimmerzellen ausgekleidet, die lange, ins Lumen ragende, bewegliche Zilien (Kinozilien) an der apikalen Zellmembran besitzen. Sie bewegen das Ovum vom Ovar in Richtung Uterus (ELLINGTON 1991). Die Mikrovilli der Flimmerzellen tragen durch die Vergrößerung der Zelloberfläche zur vermehrten Resorption von Eileiterflüssigkeit bei. Im Vergleich zu Färsen sinkt bei Kühen nach wiederholter Trächtigkeit die Zahl der Mikrovilli, weshalb bei ihnen eine größere Menge Eileiterflüssigkeit im Lumen verbleibt (BAGE et al. 2002). Während des Östrus weisen die Mikrovilli ihre maximale Länge auf.

20 2.3.1 Kontraktilität des Eileiters

Bei zyklischen Kühen wurde die Kontraktilität des Eileiters bereits sowohl in vivo (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975; BENNETT et al. 1988) als auch in vitro untersucht (ISLA et al. 1989; WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001a; WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b), aber diese bisher nicht zwischen Kühen und Färsen verglichen.

Die Kontraktilitätsmuster wurden in vivo während des gesamten Zyklus mithilfe sensibler Mikrowandler (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975) bzw. einer extrazellulär lokalisierten Multielektrode im Eileiter (BENNETT et al. 1988) aufgezeichnet oder aber in vitro im Organbad (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b) untersucht. In Ovulationsnähe sind sowohl die F als auch die Amplitude der Kontraktionen im Isthmus -besonders auf der ipsilateralen Seite– größer als in der Ampulla. Zwischen der longitudinalen und zirkulären Muskelschicht konnte hingegen während des Zyklus kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (BENNETT et al. 1988; ISLA et al. 1989).

Der Eileiter weist als Ort der Befruchtung die höchste Kontraktionsfrequenz während des Östrus und Metöstrus auf (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975). Sowohl die Amplitude als auch die F steigen während des Östrus graduell an und korrelieren negativ mit den Serum-P4-Konzentrationen vor dem Östrus. Laut BENNETT et al. (1988) sind die Amplitude und F der Spontankontraktionen des Eileiters während der Lutealphase deutlich geringer als im Östrus.

In vitro-Studien zur Kontraktilität des Eileiters und zur Wirkung verschiedener Hormone wurden beim Rind und auch bei anderen Spezies durchgeführt. Die Wirkung von OT (KOTWICA et al. 2003) und PG (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b) wurde beim Rind untersucht. Außerdem wurden die Effekte von Progestagenen (WANGGREN et al.

2008) und Prostacyclin beim Menschen (ARBAB et al. 2002) analysiert. Beim Rind steigerte OT die Kontraktionsfrequenz und -amplitude im Eileiter während des Östrus (RUCKEBUSCH u. BAYARD 1975). Laut KOTWICA et al. (2003) führt eine Dosis von 10⁻⁷ M OT zu einem Anstieg der AUC im Eileiter, der Kühen während der Follikelphase entnommen worden war. Nach WIJAYAGUNAWARDANE et al. (2001b) bleibt die OT-Konzentration des Eileiters während des gesamten Zyklus unverändert.

Andererseits berichteten WIJAYAGUNAWARDANE et al. (2001b), dass mit LH bzw.

Endothelin-1 (ET-1) kombiniertes OT (10⁻⁸ M), aber auch OT allein, die Kontraktionsamplitude im Eileiter von Kühen in der Follikel- und Postovulationsphase in vitro hemmte.

Literaturübersicht

21

In der Lutealphase hatte OT allein oder in Kombination mit LH bzw. ET-1 keine Auswirkung auf die Eileiterkontraktilität.

WIJAYAGUNAWARDANE et. al. (2001b) vermuten eine Blockade der Kontraktilität des Eileiters durch die OT Sekretion, die vom neu enstehenden CL ausgeht. Die Autoren sind der Ansicht, dass die Hemmung der Kontraktilität zu einem langsameren Transport des Embryos zum Uterus führen könnte.

Beim Menschen führte die Verabreichung von 0,1 µM OT zu einer tendenziellen Steigerung, während nach der Zugabe von 0,2 µM OT eine Abnahme der Kontraktionsfrequenz zu beobachten war. Diese Dosierungen wurden separat in 20 min-Intervallen nach Spülung der Kanäle mit Krebspuffer verabreicht. Ferner wurde durch die höhere Dosis von OT die AUC des Eileiters deutlich reduziert (WANGGREN et al. 2008).

Laut WILDT et al. (1998) könnte OT durch die gleichzeitig induzierte Entspannung des Isthmus und der Kontraktion des Uterus von Bedeutung sein für den schnellen Transport von Samenzellen (WANGGREN et al. 2008).

Prostaglandin-F2α erhöht die F der Kontraktionen an der isolierten glatten Muskelschicht des menschlichen (WANGGREN et al. 2006) und des bovinen Eileiters

(WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich FP-Rezeptoren in den bovinen glatten Muskelzellen des Eileiters befinden und damit

Prostaglandine an der Regulation der Eileiterkontraktilität beteiligt sind (HUANG et al.

2015). Der TNFα, ein Zytokin, das durch eine von Gap-junctions abhängige Kommunikation Signale vermittelt, stimuliert die PG-Sekretion während der periovulatorischen Phase (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2003). Auch Angiotensin II, ein Peptidhormon, das zu einer Vasokonstriktion und zu einer nachfolgenden Erhöhung des Blutdrucks führt, stimuliert die Sekretion von PG im mikrodialysierten bovinen Eileiter (DE GASPARO et al. 2000). Angiotensin II könnte ein lokaler Vermittler von TNFα sein und neben seiner direkten Wirkung auf die glatte Muskulatur des Eileiters die PG-Sekretion während der periovulatorischen Periode stimulieren (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001a).

2.3.2 Innervation und hormonelle Kontrolle des Eileiters

Der Eileiter von Kühen wird durch adrenerge (CZAJA et al. 1993), cholinerge und peptiderge Nervenfasern (WROBEL u. KUJAT 1993) innerviert, wobei vor allem das sympathische Nervensystem dominiert.

22

Adrenerge Nervenfasern sind sowohl in der longitudinalen als auch in der zirkulären Schicht der Tunica muscularis des bovinen Eileiters zu finden.

Die Dichte der adrenergen und cholinergen Nerven steigt vom Infundibulum zum Isthmus hin an (CZAJA et al. 1993).

Der Eileiter ist sowohl im Bereich des Infundibulums als auch im Bereich der Ampulla wenig, im Isthmus allerdings stark adrenerg innerviert (EL-BANNA u. HAFEZ 1970). Laut KOTWICA et al. (2003) ist der Noradrenalingehalt im Infundibulum am größten, gefolgt von der Ampulla und dem Isthmus. Der Noradrenalingehalt scheint die Kontraktilität im Eileiter der Kühe während der Follikel- und frühen Lutealphase deutlich zu modifizieren.

Noradrenalin vermindert die AUC und hat eine relaxierende Wirkung auf die Kontraktilität von Ampulle und Isthmus (KOTWICA et al. 2003).

Neben Noradrenalin modifizieren auch andere Hormone, die durch Epithelzellen des Eileiters produziert werden, die Spontanmotilität des bovinen Eileiters auf para- und autokrinem Weg. Hierzu gehören Prostaglandin-F2α und -E2 (WANGGREN et al. 2008), ET-1 (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b), Angiotensin II und das atriale natriuretische Peptid (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001a). Alle diese Hormone erhöhten die Amplitude der Kontraktionen isolierter Eileiter während der Follikel- und Postovulationsphase, hatten aber keinen kontraktilen Effekt während der Lutealphase.

WIJAYAGUNAWARDANE et al. (1998) stellten fest, dass die P4-, E2-, PG-, PGF2α- und ET-1-Konzentrationen während der Follikelphase in den ipsilateral zum dominanten Follikel gelegenen bovinen Eileiter höher waren als im kontralateralen Eileiter. Die zyklischen endokrinologischen Veränderungen im Eileiter bieten das optimale Umfeld für eine optimale Fertilität. Die Eileitersekrete, insbesondere die Eileiter-spezifischen Glykoproteine haben eine positive Wirkung auf die Fertilisation und die Entwicklung des frühen Embryos (KILLIAN 2004). Es wird daher vermutet, dass diese Hormone synergistisch an der Regulation der Kontraktionen des Eileiters beteiligt sind, um einen optimalen Embryotransport zum Uterus zu gewährleisten. Diese und die entgegengesetzte Bewegung von Gameten zum Isthmus spielen eine wichtige Rolle für die Entstehung einer Trächtigkeit (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 1998; KILLIAN 2011) Ein Anstieg von LH, im Graaf’schen Follikel ansteigende E2-Konzentrationen und basale P4-Konzentrationen stimulieren die Synthese von PG und ET-1, welche zu einer vermehrten Kontraktilität des Eileiters und somit zu einem schnellen Transport der Gameten führen (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b).

Literaturübersicht

23

Die durch ET-1 induzierte Kontraktion des bovinen Eileiters wird durch endogenes Stickstoffmonoxid (Nitric Oxide; NO) stimuliert (ROSSELLI et al. 1994).

ROSELLI et al. (1996) berichteten ferner, dass die basale Synthese von NO als lokaler Entspannungsfaktor eine zentrale Rolle spielt und zur rhythmischen Kontraktion des Eileiters beitragen könnte. Unter bestimmten pathologischen Zuständen, wie beispielsweise dem Vorliegen einer Endometriose, kommt es zur endogenen Freisetzung von ET-1 und/oder NO. Dies kann zu einer abnormen Relaxation und/oder Kontraktion des Eileiters führen und folglich zu einer verminderten Fertilität beitragen (ROSSELLI et al. 1996).

Auch ICLC wurden im Eileiter identifiziert. Diese Zellen haben eine sogenannte Schrittmacherfunktion. Sie sind mit den glatten Muskelzellen verbunden, bilden mit diesen zusammen ein enges Netzwerk und führen somit zu autorythmischen Kontraktionen der glatten Muskelzellen (POPESCU et al. 2007; DIXON et al. 2009; ABD-ELHAFEEZ u. SOLIMAN 2017). Die von diesen Zellen generierte Aktivität ist von den Konzentrationen intra- und extrazellulär vorhandener Ca²⁺-Ionen abhängig (DIXON et al.

2011). Durch Ca²⁺-Ionen werden Ca²⁺-aktivierte K⁺-Kanäle (KCa) stimuliert, dadurch kommt es zur Membranhyperpolarisation, welche die Kontraktion der glatten Muskelzellen ermöglicht. Außerdem exprimieren die ICLC den ER und PR. CRETOIU et al. (2009) schlussfolgerten, dass ICLC die Kontraktilität des Eileiters als Steroidsensoren über Gap junctions und/oder parakrine Mechanismen beeinflussen können.

Die Wirkungen von E2 und P4 werden durch intrazellulare Rezeptoren (ERα, ERβ und PR) vermittelt, die ein Teil der Kernrezeptorfamilie sind (ULBRICH et al. 2003; SARUHAN et al. 2011). Östrogene verursachen Kompositionsveränderungen der Eileiterflüssigkeit, wobei die höchste Eileiter-spezifische Glykoproteinsekretion während der Follikelphase des Zyklus erfolgt (BUHI et al. 2000). Ferner wirken E2 und P4 synergistisch und regulieren so Eileiterkontraktionen für einen optimalen Embryotransport während der postovulatorischen Periode (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 1998). Die Expression des ERα im Eileiter nimmt in der Follikelphase, also unter Östrogeneinfluss, zu. Der ERβ hingegen wird in der lutealen Phase (Tag 6-18) unter dem Einfluss von P4 verstärkt exprimiert, wenn im Blut P4 dominiert. Der ERα wird beim Rind vermehrt in der Ampulla exprimiert, wohingegen der ERβ im Isthmus dominant ist (ULBRICH et al. 2003).

Die unterschiedliche Lokalisation der beiden Subtypen (ERα und ERβ) lässt auf unterschiedliche physiologische Funktionen schließen (ULBRICH et al. 2003).

24

Die ERα-Isoform vermittelt in vivo zudem eine E-abhängige Produktion und Sekretion von IGF-I, welches als lokaler Wachstumsfaktor von Bedeutung ist (SHAO et al. 2007a).

Die ERβ-Expression und Lokalisation in der Ampulla im Ratteneileiter weisen auf eine biologische Funktion des ERβ im Zusammenhang mit Calcium-abhängigen Zilienschlägen hin (SHAO et al. 2007b).

Der PR wird beim Rind in der Follikelphase am stärksten exprimiert und ist ein im Kern lokalisierter Steroidhormonrezeptor mit typischer Domänenstruktur (GREENE et al.

1986). Das PR-A-Protein wird am stärksten in der Ampulla während der frühen lutealen Phase exprimiert. Die Expression von PR-B unterliegt hingegen keinen zyklischen Schwankungen. Es konnte nachgewiesen werden, dass beim Rind von diesem Rezeptor im Isthmus mehr vorhanden ist als in der Ampulla (ULBRICH et al. 2003).

Die Expression des OTR und der stimulierende Effekt von OT auf die Eileiterkontraktilität sind bei Kühen in der Follikelphase im Vergleich zur Lutealphase deutlicher ausgeprägt (KOTWICA et al. 2003).

Sowohl der Embryonentransport als auch die Kommunikation zwischen Embryo und dem Eileiter bedürfen der Wirkung von Prostaglandinen, welche durch EPRs und FPRs vermittelt werden. Zudem haben die Prostaglandine eine Wirkung auf das lokale vaskuläre System und die Eileiterkontraktilität (WANGGREN et al. 2006). Auch Spermien stimulieren die Prostaglandinsynthese in den bovinen Eileiterepithelzellen und fördern dadurch die Eileiterkontraktionen (KODITHUWAKKU et al. 2007).

Literaturübersicht

25 2.4 Follikelflüssigkeit

Die Follikelflüssigkeit setzt sich im Wesentlichen aus folgenden Bestandteilen zusammen: Hormonen, Wachstumsfaktoren, Interleukinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), anti-apoptotischen Faktoren, Proteinen, Peptiden und Aminosäuren, Zuckern und Prostanoiden (REVELLI et al. 2009)

Von follikulären Steroidhormonen ist bekannt, dass deren Konzentrationen innerhalb des Zyklus stark fluktuieren (HENDERSON et al. 1982). Sie sind für die Fertilität relevant (OLIVERIA et al. (2002) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Kontraktilität des Uterus und Eileiters (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b; RIZZO et al. 2011). Auch die Hormonkonzentrationen in der Follikelflüssigkeit des bovinen Ovars schwanken beträchtlich je nach Phase des Zyklus, Follikelgröße und Follikelstatus (FORTUNE u. HANSEL 1985). Die E2-Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit und im peripheren Blutserum korrelierten bei Rindern signifikant positiv (PLAINO et al. 2000).

Im Ovar wird E2 von Granulosazellen in Antralfollikeln, insbesondere aber im präovulatorischen Follikel synthesiert und sezerniert (DIELEMAN u. BEVERS 1987) Große Follikel (>8,1 mm Durchmesser) produzieren in vivo hohe E2-Konzentrationen, jedoch weniger P4 und Testosteron als kleinere Follikel (DIELEMAN et al. 1983).

ECHTERNKAMP et al. (1994) und IRELAND und ROCHE (1983) unterteilten Follikel in E2-aktive und E2-inaktive Follikel (E2 > 50 ng/mL und Verhältnis von E2 zu P4 > 1).

Granulosazellen von Wiederkäuern, sondern zusätzlich OT ab, welches in der Follikelflüssigkeit nachgewiesen werden kann (SCHAMS 1987; MEIDAN et al. 1993).

Laut OLIVERIA et al. (2002) und PFEIFER et al. (2012) gibt es einen Zusammenhang zwischen dem Follikeldurchmesser und der Fertilitätsrate von Kühen. Die optimale Größe von Follikeln liegt bei Kühen zum Zeitpunkt der Ovulation zwischen 13-15 mm im Durchmesser, d.h. sie ist mit einer relativ hohen Besamungserfolg von etwas 70 % verbunden (PFEIFER et al. 2012).

26 3 Material und Methoden

3.1 Probenmaterial und Probenentnahme

Es standen Uteri von je acht und Eileiter von je sechs Kühen bzw. Färsen zur Verfügung. Es handelte sich dabei um zwei unabhängige Versuchsserien und die jeweiligen Proben stammten nicht von denselben Tieren. Die Organe wurden innerhalb von 60 min nach Schlachtung der Tiere direkt vor Ort am Städtischen Schlachthof Hannover entnommen und anschließend zur Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover transportiert.

Für die Studie wurden nur Organe von Tieren, die sich im Proöstrus bzw. Östrus befanden, verwendet. Um dies sicherzustellen, wurden die Ovarien der Kühe makroskopisch nach der von WIJAYAGUNAWARDANE et al. (1996) beschriebenen Methode beurteilt und das Probenmaterial nach folgenden Kriterien ausgewählt: das Ovar wies kein CL auf und es musste wenigstens ein Follikel mit einem Durchmesser

> 10 mm aufweisen. Außerdem durften an den inneren Genitalorganen makroskopisch keine pathologischen Veränderungen sichtbar sein (IRELAND et al. 1980; DAHME u.

WEISS 2007; PFEIFER et al. 2012). Es wurden nur die ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushörner bzw. Eileiter für die Untersuchungen verwendet.

Für die Eileiterstudien wurde der Eileiter nach Abtrennung vom Uterus im Bereich der UTV und für die Uterusstudien das ipsilaterale Uterushorn an die Klinik für Rinder verbracht. Der Transport dauerte ca. 40 min. und erfolgte in einem 50 mL-Röhrchen (Falcon™, Greiner Bio One GmbH, Deutschland) mit Krebspufferlösung (pH 7.4; siehe Anhang), das sich in einer Thermoskanne bei 37 °C befand.

3.2 Probenaufbereitung

Vom jeweiligen Ovar wurde Follikelflüssigkeit und Gewebeproben der entsprechenden Uteri und Eileiter für spätere Genexpressionsanalysen entnommen. Für die Genexpressionsanalyse wurden vom Eileiter 5 mm im Querschnitt sowie vom Myo- und Endometrium jeweils drei 10 mm x 1 mm x 1 mm (Länge x Breite x Höhe) große Gewebestücke entnommen. Diese Uterus- und Eileiterproben wurden sofort nach der Gewinnung in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.

Material und Methoden

27

Ein weiteres Gewebestück für die Polymerase Chain Reaction (PCR)-Analyse wurde mittels Tissuetek (Sakura Finetek, Zoekerwounde, Niederlande) eingebettet, anschließend in Stickstoff tiefgefroren und ebenfalls bei -80°C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.

3.3 Versuchsdurchführung

In der hier vorliegenden Arbeit wurde in vitro die Kontraktilität des Myometriums und Eileiters vergleichend bei Färsen und Kühen untersucht (Abb. 1).

Die Fragestellung der Arbeit war, ob sich die Kontraktilität der Uteri und Eileiter von Färsen und Kühen um den Zeitpunkt des Östrus unterscheiden und eventuell zu beobachtenden Unterschieden endokrinologische Ursachen haben könnten. Anhand der makroskopischen Beurteilung der Ovarien und der Bestimmung des Östrogenspiegels in den präovulatorischen Follikeln wurde die Zyklusphase der Tiere definiert.

Die Bestimmungen der Kontraktilitäten des Myometriums und Eileiters der Kühe und Färsen erfolgten in vitro an den ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushörnern und Eileitern. Gemessen wurden sowohl die spontanen Kontraktionen als auch mittels steigender Konzentrationen von PGF2α und OT hormonell induzierte Kontraktionen.

Es wurden Follikelflüssigkeit vom präovulatorischen Follikel sowie Gewebeproben von den Uteri und den Eileitern der Tiere entnommen, um anhand des Östrogenspiegels in der Follikelflüssigkeit, sowie der Genexpression der Rezeptoren für E2, P4, PGF2α

und OT zu entscheiden, ob sich diese Parameter im endokrinologischen Status, in der Kontraktilität zwischen Kühen und Färsen unterscheiden.

28

Abb. 1: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs (PCR: Polymerase Chain Reaction)

3.4 Gewinnung der Follikelflüssigkeit

Die Entnahme der Flüssigkeit erfolgte erst nach dem Transport in die Klinik für Rinder an der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Flüssigkeit der präovulatorischen Follikel wurde mit sterilen Einwegkanülen an den exenterierten Ovarien (HSW FINE-JECT®, Deutschland) und Einmalspritzen (5 mL, HSW NORM-FINE-JECT®, Deutschland) entnommen. Die Menge der entnommenen Follikelflüssigkeit betrug pro Tier 1-2 mL.

Die Follikelflüssigkeit wurde mit 1500 x g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und bis zu den Hormonanalysen bei -80 °C gelagert.

Kühe (n=8)

Eileiter

In vitro-Kontraktilität Real–Time PCR

Follikelpunktion Uterus

Färsen (n=8)

Kühe (n=6)

Färsen (n=6)

Material und Methoden

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3.5 Hormonanalysen

Die Östrogenkonzentration wurde mithilfe eines Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) auf einer Mikrotiterplatte unter Verwendung einer sekundären Antikörperbeschichtungstechnik und einer Horseradish-Peroxidase als Enzymmarkierung nach Extraktion der Follikelflüssigkeit (300 µL) mit Butylmethylether gemessen. Diese Tests wurden bereits von THURMAN et al. (1990) und PRAKASH et al. (1987) beschrieben.

Das verwendete Antiserum wurde gegen 17β-Estradiolhemisuccinat erzeugt (Technische Universität Weihenstephan, Freising, München; mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. S. E. Ulbrich zur Verwendung überlassen). Es wurde das Enzym 17β-Estradiolhemisuccinat-Horseradish-Peroxidase verwendet. Die ELISA-Methode wurde validiert, indem mit bekannten Mengen an E2 (20- und 40- pg/mL) versehene Follikelflüssigkeiten analysiert wurden und die Wiederfindung berechnet wurde. Die Intra-Assay- und die Inter-Assay-Variationskoeffizienten wurden durch wiederholte Messungen von bovinen Follikelflüssigkeiten ermittelt. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient betrug 8,6 % und der Inter-Assay Variationkoeffizient lag bei 9,5 %. Die Wiederfindungsraten betrugen 87 % - 92 %.

Die Progesteronbestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (coat-a-count® RIA P4, PITKPG-9; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn, Deutschland) mit einer Sensitivität von 0,1 ng P4 pro mL. Die Durchführung des Radioimmunoassays erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Spezifitäten des verwendeten

Antikörpers waren 100 % für P4, 9,0 % für 5 α-Pregnan 3.20-dion, 3,2 % für

5 β-Pregnan-3.20-dion, 3,4 % für 17α Dihydroprogesteron, 2,2 % für 11-Deoxycorticosteron und 0,9 % für Corticosterone. Die Intra- sowie

Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 3,5 % und 3,9 %.

30 3.6 Bestimmung der Kontraktilität in vitro

Die Gewebestreifen des Uterus und Eileiters wurden in die Kammer eines Organbades (Modell Nr. LE 01-086, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.; Cornellá, Barcelona, Spanien) eingehängt. Dieses Organbad bestand aus acht Kammern, welche mit je 10 mL Krebspufferlösung (pH 7,4) gefüllt waren und mit einem Thermostat (Thermostat Unit LE 13206, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.;

Cornellá, Barcelona, Spanien) konstant auf 37 °C gehalten wurden. Es fand eine dauerhafte Begasung mit 95 % O2 und 5 % CO2 statt.

Während der Messung wurde die Krebspufferlösung bei 37 °C in einer Flasche (Schott Duran ®, Deutschland) aufbewahrt und mit 95 % O2 und 5 % CO2 begast. Die

Während der Messung wurde die Krebspufferlösung bei 37 °C in einer Flasche (Schott Duran ®, Deutschland) aufbewahrt und mit 95 % O2 und 5 % CO2 begast. Die

Im Dokument In vitro-Kontraktilität von Uterus und Eileiter bei Kühen und Färsen (Seite 21-0)