2.3 Eileiter
2.3.2 Innervation und hormonelle Kontrolle des Eileiters
Der Eileiter von Kühen wird durch adrenerge (CZAJA et al. 1993), cholinerge und peptiderge Nervenfasern (WROBEL u. KUJAT 1993) innerviert, wobei vor allem das sympathische Nervensystem dominiert.
22
Adrenerge Nervenfasern sind sowohl in der longitudinalen als auch in der zirkulären Schicht der Tunica muscularis des bovinen Eileiters zu finden.
Die Dichte der adrenergen und cholinergen Nerven steigt vom Infundibulum zum Isthmus hin an (CZAJA et al. 1993).
Der Eileiter ist sowohl im Bereich des Infundibulums als auch im Bereich der Ampulla wenig, im Isthmus allerdings stark adrenerg innerviert (EL-BANNA u. HAFEZ 1970). Laut KOTWICA et al. (2003) ist der Noradrenalingehalt im Infundibulum am größten, gefolgt von der Ampulla und dem Isthmus. Der Noradrenalingehalt scheint die Kontraktilität im Eileiter der Kühe während der Follikel- und frühen Lutealphase deutlich zu modifizieren.
Noradrenalin vermindert die AUC und hat eine relaxierende Wirkung auf die Kontraktilität von Ampulle und Isthmus (KOTWICA et al. 2003).
Neben Noradrenalin modifizieren auch andere Hormone, die durch Epithelzellen des Eileiters produziert werden, die Spontanmotilität des bovinen Eileiters auf para- und autokrinem Weg. Hierzu gehören Prostaglandin-F2α und -E2 (WANGGREN et al. 2008), ET-1 (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b), Angiotensin II und das atriale natriuretische Peptid (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001a). Alle diese Hormone erhöhten die Amplitude der Kontraktionen isolierter Eileiter während der Follikel- und Postovulationsphase, hatten aber keinen kontraktilen Effekt während der Lutealphase.
WIJAYAGUNAWARDANE et al. (1998) stellten fest, dass die P4-, E2-, PG-, PGF2α- und ET-1-Konzentrationen während der Follikelphase in den ipsilateral zum dominanten Follikel gelegenen bovinen Eileiter höher waren als im kontralateralen Eileiter. Die zyklischen endokrinologischen Veränderungen im Eileiter bieten das optimale Umfeld für eine optimale Fertilität. Die Eileitersekrete, insbesondere die Eileiter-spezifischen Glykoproteine haben eine positive Wirkung auf die Fertilisation und die Entwicklung des frühen Embryos (KILLIAN 2004). Es wird daher vermutet, dass diese Hormone synergistisch an der Regulation der Kontraktionen des Eileiters beteiligt sind, um einen optimalen Embryotransport zum Uterus zu gewährleisten. Diese und die entgegengesetzte Bewegung von Gameten zum Isthmus spielen eine wichtige Rolle für die Entstehung einer Trächtigkeit (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 1998; KILLIAN 2011) Ein Anstieg von LH, im Graaf’schen Follikel ansteigende E2-Konzentrationen und basale P4-Konzentrationen stimulieren die Synthese von PG und ET-1, welche zu einer vermehrten Kontraktilität des Eileiters und somit zu einem schnellen Transport der Gameten führen (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b).
Literaturübersicht
23
Die durch ET-1 induzierte Kontraktion des bovinen Eileiters wird durch endogenes Stickstoffmonoxid (Nitric Oxide; NO) stimuliert (ROSSELLI et al. 1994).
ROSELLI et al. (1996) berichteten ferner, dass die basale Synthese von NO als lokaler Entspannungsfaktor eine zentrale Rolle spielt und zur rhythmischen Kontraktion des Eileiters beitragen könnte. Unter bestimmten pathologischen Zuständen, wie beispielsweise dem Vorliegen einer Endometriose, kommt es zur endogenen Freisetzung von ET-1 und/oder NO. Dies kann zu einer abnormen Relaxation und/oder Kontraktion des Eileiters führen und folglich zu einer verminderten Fertilität beitragen (ROSSELLI et al. 1996).
Auch ICLC wurden im Eileiter identifiziert. Diese Zellen haben eine sogenannte Schrittmacherfunktion. Sie sind mit den glatten Muskelzellen verbunden, bilden mit diesen zusammen ein enges Netzwerk und führen somit zu autorythmischen Kontraktionen der glatten Muskelzellen (POPESCU et al. 2007; DIXON et al. 2009; ABD-ELHAFEEZ u. SOLIMAN 2017). Die von diesen Zellen generierte Aktivität ist von den Konzentrationen intra- und extrazellulär vorhandener Ca²+-Ionen abhängig (DIXON et al.
2011). Durch Ca2+-Ionen werden Ca2+-aktivierte K+-Kanäle (KCa) stimuliert, dadurch kommt es zur Membranhyperpolarisation, welche die Kontraktion der glatten Muskelzellen ermöglicht. Außerdem exprimieren die ICLC den ER und PR. CRETOIU et al. (2009) schlussfolgerten, dass ICLC die Kontraktilität des Eileiters als Steroidsensoren über Gap junctions und/oder parakrine Mechanismen beeinflussen können.
Die Wirkungen von E2 und P4 werden durch intrazellulare Rezeptoren (ERα, ERβ und PR) vermittelt, die ein Teil der Kernrezeptorfamilie sind (ULBRICH et al. 2003; SARUHAN et al. 2011). Östrogene verursachen Kompositionsveränderungen der Eileiterflüssigkeit, wobei die höchste Eileiter-spezifische Glykoproteinsekretion während der Follikelphase des Zyklus erfolgt (BUHI et al. 2000). Ferner wirken E2 und P4 synergistisch und regulieren so Eileiterkontraktionen für einen optimalen Embryotransport während der postovulatorischen Periode (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 1998). Die Expression des ERα im Eileiter nimmt in der Follikelphase, also unter Östrogeneinfluss, zu. Der ERβ hingegen wird in der lutealen Phase (Tag 6-18) unter dem Einfluss von P4 verstärkt exprimiert, wenn im Blut P4 dominiert. Der ERα wird beim Rind vermehrt in der Ampulla exprimiert, wohingegen der ERβ im Isthmus dominant ist (ULBRICH et al. 2003).
Die unterschiedliche Lokalisation der beiden Subtypen (ERα und ERβ) lässt auf unterschiedliche physiologische Funktionen schließen (ULBRICH et al. 2003).
24
Die ERα-Isoform vermittelt in vivo zudem eine E-abhängige Produktion und Sekretion von IGF-I, welches als lokaler Wachstumsfaktor von Bedeutung ist (SHAO et al. 2007a).
Die ERβ-Expression und Lokalisation in der Ampulla im Ratteneileiter weisen auf eine biologische Funktion des ERβ im Zusammenhang mit Calcium-abhängigen Zilienschlägen hin (SHAO et al. 2007b).
Der PR wird beim Rind in der Follikelphase am stärksten exprimiert und ist ein im Kern lokalisierter Steroidhormonrezeptor mit typischer Domänenstruktur (GREENE et al.
1986). Das PR-A-Protein wird am stärksten in der Ampulla während der frühen lutealen Phase exprimiert. Die Expression von PR-B unterliegt hingegen keinen zyklischen Schwankungen. Es konnte nachgewiesen werden, dass beim Rind von diesem Rezeptor im Isthmus mehr vorhanden ist als in der Ampulla (ULBRICH et al. 2003).
Die Expression des OTR und der stimulierende Effekt von OT auf die Eileiterkontraktilität sind bei Kühen in der Follikelphase im Vergleich zur Lutealphase deutlicher ausgeprägt (KOTWICA et al. 2003).
Sowohl der Embryonentransport als auch die Kommunikation zwischen Embryo und dem Eileiter bedürfen der Wirkung von Prostaglandinen, welche durch EPRs und FPRs vermittelt werden. Zudem haben die Prostaglandine eine Wirkung auf das lokale vaskuläre System und die Eileiterkontraktilität (WANGGREN et al. 2006). Auch Spermien stimulieren die Prostaglandinsynthese in den bovinen Eileiterepithelzellen und fördern dadurch die Eileiterkontraktionen (KODITHUWAKKU et al. 2007).
Literaturübersicht
25 2.4 Follikelflüssigkeit
Die Follikelflüssigkeit setzt sich im Wesentlichen aus folgenden Bestandteilen zusammen: Hormonen, Wachstumsfaktoren, Interleukinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), anti-apoptotischen Faktoren, Proteinen, Peptiden und Aminosäuren, Zuckern und Prostanoiden (REVELLI et al. 2009)
Von follikulären Steroidhormonen ist bekannt, dass deren Konzentrationen innerhalb des Zyklus stark fluktuieren (HENDERSON et al. 1982). Sie sind für die Fertilität relevant (OLIVERIA et al. (2002) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Kontraktilität des Uterus und Eileiters (WIJAYAGUNAWARDANE et al. 2001b; RIZZO et al. 2011). Auch die Hormonkonzentrationen in der Follikelflüssigkeit des bovinen Ovars schwanken beträchtlich je nach Phase des Zyklus, Follikelgröße und Follikelstatus (FORTUNE u. HANSEL 1985). Die E2-Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit und im peripheren Blutserum korrelierten bei Rindern signifikant positiv (PLAINO et al. 2000).
Im Ovar wird E2 von Granulosazellen in Antralfollikeln, insbesondere aber im präovulatorischen Follikel synthesiert und sezerniert (DIELEMAN u. BEVERS 1987) Große Follikel (>8,1 mm Durchmesser) produzieren in vivo hohe E2-Konzentrationen, jedoch weniger P4 und Testosteron als kleinere Follikel (DIELEMAN et al. 1983).
ECHTERNKAMP et al. (1994) und IRELAND und ROCHE (1983) unterteilten Follikel in E2-aktive und E2-inaktive Follikel (E2 > 50 ng/mL und Verhältnis von E2 zu P4 > 1).
Granulosazellen von Wiederkäuern, sondern zusätzlich OT ab, welches in der Follikelflüssigkeit nachgewiesen werden kann (SCHAMS 1987; MEIDAN et al. 1993).
Laut OLIVERIA et al. (2002) und PFEIFER et al. (2012) gibt es einen Zusammenhang zwischen dem Follikeldurchmesser und der Fertilitätsrate von Kühen. Die optimale Größe von Follikeln liegt bei Kühen zum Zeitpunkt der Ovulation zwischen 13-15 mm im Durchmesser, d.h. sie ist mit einer relativ hohen Besamungserfolg von etwas 70 % verbunden (PFEIFER et al. 2012).
26 3 Material und Methoden
3.1 Probenmaterial und Probenentnahme
Es standen Uteri von je acht und Eileiter von je sechs Kühen bzw. Färsen zur Verfügung. Es handelte sich dabei um zwei unabhängige Versuchsserien und die jeweiligen Proben stammten nicht von denselben Tieren. Die Organe wurden innerhalb von 60 min nach Schlachtung der Tiere direkt vor Ort am Städtischen Schlachthof Hannover entnommen und anschließend zur Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover transportiert.
Für die Studie wurden nur Organe von Tieren, die sich im Proöstrus bzw. Östrus befanden, verwendet. Um dies sicherzustellen, wurden die Ovarien der Kühe makroskopisch nach der von WIJAYAGUNAWARDANE et al. (1996) beschriebenen Methode beurteilt und das Probenmaterial nach folgenden Kriterien ausgewählt: das Ovar wies kein CL auf und es musste wenigstens ein Follikel mit einem Durchmesser
> 10 mm aufweisen. Außerdem durften an den inneren Genitalorganen makroskopisch keine pathologischen Veränderungen sichtbar sein (IRELAND et al. 1980; DAHME u.
WEISS 2007; PFEIFER et al. 2012). Es wurden nur die ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushörner bzw. Eileiter für die Untersuchungen verwendet.
Für die Eileiterstudien wurde der Eileiter nach Abtrennung vom Uterus im Bereich der UTV und für die Uterusstudien das ipsilaterale Uterushorn an die Klinik für Rinder verbracht. Der Transport dauerte ca. 40 min. und erfolgte in einem 50 mL-Röhrchen (Falcon™, Greiner Bio One GmbH, Deutschland) mit Krebspufferlösung (pH 7.4; siehe Anhang), das sich in einer Thermoskanne bei 37 °C befand.
3.2 Probenaufbereitung
Vom jeweiligen Ovar wurde Follikelflüssigkeit und Gewebeproben der entsprechenden Uteri und Eileiter für spätere Genexpressionsanalysen entnommen. Für die Genexpressionsanalyse wurden vom Eileiter 5 mm im Querschnitt sowie vom Myo- und Endometrium jeweils drei 10 mm x 1 mm x 1 mm (Länge x Breite x Höhe) große Gewebestücke entnommen. Diese Uterus- und Eileiterproben wurden sofort nach der Gewinnung in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.
Material und Methoden
27
Ein weiteres Gewebestück für die Polymerase Chain Reaction (PCR)-Analyse wurde mittels Tissuetek (Sakura Finetek, Zoekerwounde, Niederlande) eingebettet, anschließend in Stickstoff tiefgefroren und ebenfalls bei -80°C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.
3.3 Versuchsdurchführung
In der hier vorliegenden Arbeit wurde in vitro die Kontraktilität des Myometriums und Eileiters vergleichend bei Färsen und Kühen untersucht (Abb. 1).
Die Fragestellung der Arbeit war, ob sich die Kontraktilität der Uteri und Eileiter von Färsen und Kühen um den Zeitpunkt des Östrus unterscheiden und eventuell zu beobachtenden Unterschieden endokrinologische Ursachen haben könnten. Anhand der makroskopischen Beurteilung der Ovarien und der Bestimmung des Östrogenspiegels in den präovulatorischen Follikeln wurde die Zyklusphase der Tiere definiert.
Die Bestimmungen der Kontraktilitäten des Myometriums und Eileiters der Kühe und Färsen erfolgten in vitro an den ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushörnern und Eileitern. Gemessen wurden sowohl die spontanen Kontraktionen als auch mittels steigender Konzentrationen von PGF2α und OT hormonell induzierte Kontraktionen.
Es wurden Follikelflüssigkeit vom präovulatorischen Follikel sowie Gewebeproben von den Uteri und den Eileitern der Tiere entnommen, um anhand des Östrogenspiegels in der Follikelflüssigkeit, sowie der Genexpression der Rezeptoren für E2, P4, PGF2α
und OT zu entscheiden, ob sich diese Parameter im endokrinologischen Status, in der Kontraktilität zwischen Kühen und Färsen unterscheiden.
28
Abb. 1: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs (PCR: Polymerase Chain Reaction)
3.4 Gewinnung der Follikelflüssigkeit
Die Entnahme der Flüssigkeit erfolgte erst nach dem Transport in die Klinik für Rinder an der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Flüssigkeit der präovulatorischen Follikel wurde mit sterilen Einwegkanülen an den exenterierten Ovarien (HSW FINE-JECT®, Deutschland) und Einmalspritzen (5 mL, HSW NORM-FINE-JECT®, Deutschland) entnommen. Die Menge der entnommenen Follikelflüssigkeit betrug pro Tier 1-2 mL.
Die Follikelflüssigkeit wurde mit 1500 x g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und bis zu den Hormonanalysen bei -80 °C gelagert.
Kühe (n=8)
Eileiter
In vitro-Kontraktilität Real–Time PCR
Follikelpunktion Uterus
Färsen (n=8)
Kühe (n=6)
Färsen (n=6)
Material und Methoden
29
3.5 Hormonanalysen
Die Östrogenkonzentration wurde mithilfe eines Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) auf einer Mikrotiterplatte unter Verwendung einer sekundären Antikörperbeschichtungstechnik und einer Horseradish-Peroxidase als Enzymmarkierung nach Extraktion der Follikelflüssigkeit (300 µL) mit Butylmethylether gemessen. Diese Tests wurden bereits von THURMAN et al. (1990) und PRAKASH et al. (1987) beschrieben.
Das verwendete Antiserum wurde gegen 17β-Estradiolhemisuccinat erzeugt (Technische Universität Weihenstephan, Freising, München; mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. S. E. Ulbrich zur Verwendung überlassen). Es wurde das Enzym 17β-Estradiolhemisuccinat-Horseradish-Peroxidase verwendet. Die ELISA-Methode wurde validiert, indem mit bekannten Mengen an E2 (20- und 40- pg/mL) versehene Follikelflüssigkeiten analysiert wurden und die Wiederfindung berechnet wurde. Die Intra-Assay- und die Inter-Assay-Variationskoeffizienten wurden durch wiederholte Messungen von bovinen Follikelflüssigkeiten ermittelt. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient betrug 8,6 % und der Inter-Assay Variationkoeffizient lag bei 9,5 %. Die Wiederfindungsraten betrugen 87 % - 92 %.
Die Progesteronbestimmung erfolgte mittels Radioimmunoassay (coat-a-count® RIA P4, PITKPG-9; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn, Deutschland) mit einer Sensitivität von 0,1 ng P4 pro mL. Die Durchführung des Radioimmunoassays erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Spezifitäten des verwendeten
Antikörpers waren 100 % für P4, 9,0 % für 5 α-Pregnan 3.20-dion, 3,2 % für
5 β-Pregnan-3.20-dion, 3,4 % für 17α Dihydroprogesteron, 2,2 % für 11-Deoxycorticosteron und 0,9 % für Corticosterone. Die Intra- sowie
Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 3,5 % und 3,9 %.
30 3.6 Bestimmung der Kontraktilität in vitro
Die Gewebestreifen des Uterus und Eileiters wurden in die Kammer eines Organbades (Modell Nr. LE 01-086, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.; Cornellá, Barcelona, Spanien) eingehängt. Dieses Organbad bestand aus acht Kammern, welche mit je 10 mL Krebspufferlösung (pH 7,4) gefüllt waren und mit einem Thermostat (Thermostat Unit LE 13206, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.;
Cornellá, Barcelona, Spanien) konstant auf 37 °C gehalten wurden. Es fand eine dauerhafte Begasung mit 95 % O2 und 5 % CO2 statt.
Während der Messung wurde die Krebspufferlösung bei 37 °C in einer Flasche (Schott Duran ®, Deutschland) aufbewahrt und mit 95 % O2 und 5 % CO2 begast. Die Myometriumstreifen und Eileiterproben wurden mit Fäden zwischen jeweils einem Häkchen und einem isometrischen Kraftaufnehmer (TRI 201, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l., Cornellá, Barcelona, Spanien, Abb. 2) eingespannt.
Vom Kraftaufnehmer wurde das analoge Signal transferiert, digitalisiert und die Daten auf einem Computer mittels einer speziellen Software (Power lab 7.0/8SP ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) gespeichert und anschließend die Messdaten mit dem Programm Peak-Analyse (Lab Chart 7.0, ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) ausgewertet.
Zwischen jeder Konzentrationssteigerung wurden die Uterus- und Eileiterproben während der eigentlichen Messung zweimal mit Krebspuffer gespült, nicht aber während der Aufnahme der Spontankontraktionen.
Nach Ende der Stimulation wurde die Krebspufferlösung in allen Kammern durch Aqua dest. ersetzt. Dies führt bei funktionsfähigen Muskelstreifen zu osmotischem Stress, der die Kontraktionsfähigkeit erhöht (BERG et al. 2013). Eine Kontraktion des Muskels nach Zugabe von Aqua dest. wurde daher als positive Kontrolle für die Funktionalität des Muskelstreifens gewertet.
Material und Methoden
31
Abb. 2: Organbad zur Messung der in vitro Kontraktilität des Myometriums und des Eileiters (Modell Nr. LE 01-086, LETICA® Scientific Instruments; PanLab s. l.; Cornellá, Barcelona, Spanien; links) und präparierter Organstreifen in einer Kammer des Organbads (rechts).
1 cm
32
3.6.1 Präparation der Myometriumproben für die Kontraktilitätsmessungen Für die Messung der Myometriumskontraktionen wurde das Myometrium auf der Seite des ipsilateral zum präovulatorischen Follikel gelegenen Uterushorns abpräpariert (HIRSBRUNNER et al. 2002; Abb. 3, rechts). Von der zirkulär und longitudinal verlaufenden Schicht des Myometriums wurde jeweils vier Muskelstreifen der Größe 10 mm x 3 mm x 2 mm (Länge x Breite x Tiefe) entnommen. Einer der vier Muskelstreifen wurde nicht hormonell behandelt und diente als Kontrolle.
An den frei präparierten Enden der Gewebestücke wurde jeweils ein Faden so befestigt, dass die Länge der Stücke von Fadenloch zu Fadenloch 10 mm betrug.
In die ersten vier Kammern des Organbads wurden die „zirkulären“ und in die anderen vier Kammern die „longitudinalen“ Myometriumsstreifen des jeweils selbes Tier eingespannt.
Die ersten 30 min, in denen sich die Muskelstreifen im Organbad befanden und keiner Vorspannung unterzogen wurden, dienten der Äquilibrierung. Anschließend wurde mit einem Gewicht von 1 g und nach weiteren 15 min mit 2 g vorgespannt. Nach weiteren 15 min begann die eigentliche Messung mit einer Dauer von 2,5 Stunden. Dieses Zeitintervall wurde für die spätere Auswertung in 5-mal 30 min lange Zeitabschnitte unterteilt, die als T1–T5 bezeichnet werden (HIRSBRUNNER et al. 2003).
Die Myometriumsstreifen wurden entweder mit steigenden Konzentrationen von OT (CP-Pharma, Burgdorf, Deutschland) oder von PGF2α (Dinoprost, Dinolytic®, Pfizer GmbH, Karlsruhe, Deutschland) stimuliert.
Die Konzentrationen während der für die Auswertung als T6–T9 bezeichneten Zeitabschnitte wurden für OT von 10-10 M über 10-9 M, 10-8 M auf 10-7 M gesteigert und für PGF2α von 10-7 M über 10-6 M, 10-5 M auf 10-4 M (vgl. Tab. 1, im Anhang).
Material und Methoden
33
Abb. 3: Uterushorn einer Färse in Krebspuffer (links); Präparation eines Myometriumsstreifens mit Hilfe von Stecknadeln und Befestigung des Fadens zur späteren Einbringung in die Kammer des Organbades (rechts).
34 3.6.2 Präparation der Eileiterproben
Zu Beginn des Kontraktionsversuchs mit Eileiterproben wurde ein etwa 6 cm langes Stück vom Isthmus des Eileiters in vier jeweils etwa 1,5 cm lange Streifen geteilt (Abb. 4). Diese wurden in einer mit Silikon beschichteten und mit 37 °C warmer, Krebspufferlösung (pH 7,4) gefüllten Petri-Schale fixiert. An den beiden Enden der Eileiterproben wurde jeweils ein Faden befestigt, so dass die UTV-Seite in der Organbadkammer war und die Abschnitte von Fadenloch bis Fadenloch ungefähr 10 mm lang waren.
Die Eileiterproben wurden so in die Kammer des Organbades eingehängt, dass sich die Seite, die ursprünglich näher zur UTV lag, unten befand und die Seite, die der Ampulla zugewandt war, oben lag. In jeweils vier benachbarte Kammern wurden die Gewebestücke vom Eileiter eines Tieres eingebracht. Da das Organbad aus 8 Kammern bestand, konnte gleichzeitig die Kontraktilität des Eileiters von zwei Tieren erfasst werden.
Innerhalb der ersten 3 x 10 min der Messung äquilibrierten die Eileiterproben ohne Vorspannung in der Organbadkammer. Die Zeitabschnitte wurden nachher für die Auswertung als T1, T2 und T3 bezeichnet (Tab. 2, im Anhang).
Nach der Äquilibrierung der Eileiterproben wurden diese zunächst mit einem Gewicht von 1 g und nach weiteren 15 min mit 2 g vorgespannt. Nach weiteren 15 min begann die eigentliche Messung. Während der folgenden 30 min wurden die Spontankontrak-tionen aufgezeichnet. Danach wurden mit Ausnahme der ersten und fünften Kammer, bei denen als Kontrollen die Spontankontraktionen gemessen wurden, die übrigen sechs Kammern über jeweils 10 min entweder mit OT oder PGF2α befüllt. Die Konzentrationen während des für die Auswertung als T4 bezeichneten Zeitabschnitts lagen für OT bei 10-10 M und für PGF2α bei 10-7 M (WIJAYAGUNAWARDANE et al.
2001b; WANGGREN et al. 2008).
6 cm
Abb. 4: Boviner Eileiter mit dem für den Versuch verwendeten 6 cm langen Teil des Isthmus. Der weiße Pfeil zeigt an, dass die Streifen für die Kontraktilitätsmessungen kranial der uterotubalen Verbindung (UTV) in Richtung Ovar entnommen wurden.
Material und Methoden
35 3.6.3 Quantifizierung der Kontraktilität
3.6.3.1 Myometriumkontraktilität
Nach der Bestimmung der myometrialen Kontraktilität wurden die Länge und das Gewicht der Myometriumstreifen bestimmt, um deren Querschnittsfläche zu berechnen. Dafür wurde folgende Formel benutzt: Fläche=Gewicht/(Dichte x Länge) (HIRSBRUNNER et al. 2002).
Die Dichte der Muskulatur beträgt nach (HIRSBRUNNER et al. 2002) 1,056 g/cm3. Für jeden Kanal des Organbads und jedes Zeitintervall wurden die mittlere F, die Amin und Amax sowie die Amean und AUC mittels Peak-Analyse erfasst (GORRIZ-MARTIN 2013).
Für die Berechnung der Spontankontraktion wurde der Mittelwert der 30-minütigen Zeitintervalle (T1-T5) sowohl der zirkulären als auch der longitudinalen Muskelschicht verwendet (GORRIZ-MARTIN 2013). Um die Spontankontraktilität mit derjenigen nach Stimulation mit OT bzw. PGF2α zu vergleichen, wurden jeweils die Zeitintervalle T5
einander gegenübergestellt.
3.6.3.2 Kontraktilität des Eileiters
Für die Bestimmung der Kontraktilität des Eileiters wurden von jedem Eileiterabschnitt zwischen dem 1. bis 4. cm von der UTV Richtung Ovar Stücke in die Organbadkammern eingehängt. Jeweils in Zeitintervallen von 10 min wurden dieselben Kontraktionsparameter wie bei den Messungen der myometrialen Kontraktilität mittels Peak Analyse bestimmt. Um den Unterschied zwischen der Spontankontraktilität und derjenigen nach Stimulation mit OT bzw. PGF2α miteinander zu vergleichen, wurden jeweils die Zeitintervalle T3 herangezogen.
3.7 Real-Time PCR
Die Genexpressionsanalysen des Uterus- und Eileitergewebes wurden mittels quantitativer Real-Time RT-qPCR am Lehrstuhl für Physiologie Weihenstephan der Technischen Universität München durchgeführt (ULBRICH et al. 2009). Im Myometrium und Endometrium wurde die mRNA-Expression für ERα, ERß, PTGFR und OXTR ermittelt und im Eileitergewebe neben den vorher genannten Faktoren zusätzlich PTGER quantifiziert (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001; HAMMERLE-FICKINGER et al. 2010).
36
Eine Quantifizierung von PTGER konnte im Myometrium und Endometrium nicht durchgeführt werden. Die verwendeten Primer sind in Tab. 3 (im Anhang) dargestellt (LÜTTGENAU 2010).
3.8 Statistische Auswertung
Die Daten der Kontraktilitätsmessungen, Genexpressionsanalysen und Hormonanalysen wurden in Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) dokumentiert. Die statistischen Auswertungen erfolgten mit dem Programm Statistical Analysis System (SAS ® Institute Inc., Cary/North Carolina, USA) der Versionen 8.2 und 9.2. Nach Prüfung der Ergebniss auf Normalverteilung der einzelnen Parameter von Kühen und Färsen mittels eines Kruskal Wallis Testes, wurden Mittelwerte und Standardabweichungen ( ±SD) bzw. die 5 % und 95 % Perzentile bestimmt.
Bei normalverteilten Daten wurde der Student‘s t-Test und bei nicht parametrischen Daten der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test durchgeführt. Änderungen der Parameter innerhalb einer Gruppe zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeiträumen wurden mit dem Wilcoxon signed-rank Test untersucht. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als signifikant, Ergebnisse mit p < 0,0001 als hochsignifikant und Ergebnisse zwischen 0.05 < p ≤ 0.10 als Tendenz bezeichnet.
Ob sich nach dem Zusatz von OT bzw. PGF2α gegenüber Kontrollproben ohne
Ob sich nach dem Zusatz von OT bzw. PGF2α gegenüber Kontrollproben ohne