Aus der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover Direktor: Prof. Dr. med. Wolfgang Koppert
In vitro Charakterisierung von Propofolderivaten an heterolog exprimierten Strychnin-sensitiven 1-Glycin-Rezeptoren
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Jeanne de la Roche
aus Bremen Hannover 2009
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 12.05.2010 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. med. Gertrud Haeseler, Prof. Dr. med. Klaus Krampfl & PD Dr. med. Jörg Ahrens
Referent: Prof. Dr. med. Christoph Fahlke Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Ernst Ungewickell
Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. B. W. Urban
Tag der mündlichen Prüfung:
07.06.2010
1 EINLEITUNG 1
1.1IONENKANÄLE UND MEMBRANPOTENTIAL 1
1.2LIGANDENKONTROLLIERTE IONENKANÄLE 6
1.3DER GLYCIN-REZEPTOR 7
1.4GLYCIN-REZEPTORMUTATIONEN UND IHRE KLINISCHE BEDEUTUNG 10
1.5PROPOFOL UND SEINE DERIVATE 12
1.6SCHMERZ IN VERBINDUNG MIT GLYCIN-REZEPTOREN 19
1.7ZIEL DER ARBEIT 21
2 MATERIAL UND METHODEN 24
2.1PROPOFOLDERIVATE 24
2.2DNAAMPLIFIKATION 25
2.2.1AUSGANGSMATERIAL 25
2.2.2TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN KOMPETENTE ZELLEN 25
2.2.3VERMEHRUNG MIT SELEKTIONSMEDIEN 26
2.2.4DNA-PRÄPARATION 28
2.2.5KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 30
2.2.6GLYCERINSTOCKS 31
2.3ZELLKULTUR 31
2.4TRANSIENTE TRANSFEKTION DURCH ELEKTROPORATION 32
2.4.1THEORIE 32
2.4.2VORGEHENSWEISE 35
2.5PATCH-CLAMP-TECHNIK 36
2.6VERSUCHSABLAUF 39
2.7DATENAUSWERTUNG 43
3 ERGEBNISSE 45
3.1PROBENKOLLEKTIV 45
3.2AKTIVIERUNG DURCH GLYCIN AM WILDTYP UND DEN MUTANTEN 45
3.2.11- GLYR 45
3.2.21S267I-GLYR 47
3.2.31R271Q-GLYR 48
3.2.41R271L-GLYR 50
3.2.5ÜBERSICHT DER PHARMAKOLOGISCHEN EIGENSCHAFTEN VON GLYCIN AN DEN
UNTERSUCHTEN REZEPTOREN 52
3.3CO- UND DIREKT-AKTIVIERUNG MIT 4-CHLOR,-4-IOD- UND 4-BROMPROPOFOL AM WILDTYP
UND DEN MUTANTEN 53
3.3.11-GLYR 53
3.3.21R271Q-GLYR 59
3.3.31R271L-GLYR 62
3.3.41S267M-GLYR 66
3.3.51S267I-GLYR 70
4 DISKUSSION 79 4.14-CHLOR,-4-IOD- UND 4-BROMPROPOFOL AM 1-,1S267I- SOWIE 1S267M-GLYR 80 4.24-CHLORPROPOFOL AM 1R271Q- UND 1R271L-GLYR 85 5 ZUSAMMENFASSUNG 89 6 ABBILDUNGS-UND TABELLENVERZEICHNIS 91 7 LITERATURANGABEN 93
8 ABKÜRZUNGEN 111
9 ANHANG MATERIALIEN UND REAGENZIEN 113
9.1SUBSTITUIERTE PROPOFOLE (SIEHE 2.1) 113
9.2KOMPONENTEN FÜR DIE DNA-AMPLIFIKATION (SIEHE 2.2) 113 9.3KOMPONENTEN FÜR DIE ZELLKULTUR (SIEHE 2.3) 115 9.4KOMPONENTEN FÜR DIE TRANSFEKTION MITTELS ELEKTROPORATION (SIEHE 2.4) 116 9.5KOMPONENTEN FÜR DIE PATCH-CLAMP-EXPERIMENTE (SIEHE 2.5) 117
LEBENSLAUF 121
SCHRIFTENVERZEICHNIS 123 ERKLÄRUNG NACH § 2 ABS. 2 NRN. 7 UND 8 125
DANKSAGUNG 126
1 Einleitung
1.1 Ionenkanäle und Membranpotential
Die Zellmembran erregbarer Zellen wie Nerven- und Muskelzellen weist Membranproteine auf, die durch Öffnung (Kanalprotein/Poren) oder durch Aktivierung (Rezeptoren, Carrierproteine) als Transportmechanismen für die intra- und interzelluläre Signalübetragung verantwortlich sind und damit beispielsweise Wachstum, Differenzierung, Metabolismus und Verhalten des Organismus beeinflussen.
Die elektrische (intra- und interzelluläre) Signalübertragung im Nervensystem ist mit der Bewegung von Ionen verknüpft. Der Ionenfluss durch die neuronale Plasmamembran ist streng kontrolliert und wird durch verschiedene Faktoren gesteuert. Biomembranen nutzen vorwiegend drei Mechanismen, um Ionen zu verlagern: die einfache und die erleichterte Diffusion (beides passive Bewegungen) sowie den aktiven Transport. Hierbei spielen vorwiegend die nicht-organischen Ionen Na+, K+, Ca2+ und Cl- eine Rolle. Die neuronale Plasmamembran trennt durch ihre semipermeable Membran und Ionenselektivität zwei Kompartimente: den Intra- und den Extrazellularraum. Besonders die hydrophobe Region ihrer Lipid-Doppelschicht stellt eine Barriere für hydrophile Moleküle (Ionen und die meisten polaren Moleküle) dar. Die Verteilung von Ionen innerhalb dieser zwei Kompartimente ist verschieden.
K+-Kationen und anionische organische Moleküle (Proteine und Phosphate) liegen in einer deutlich höheren Konzentration intrazellulär vor. Na+-, Cl-- und Ca2+-Ionen dagegen überwiegen extrazellulär. Hydrophobe Moleküle, meist unpolare nicht- organische Gase (O2, N2, CO2) und organische Moleküle (z.B. Steroidhormone), aber auch Wassermoleküle können die Zellmembran durch einfache Diffusion passieren.
Neben dieser einfachen Diffusion erfolgt der passive Transport durch die Zellmembran durch erleichterte Diffusion. Hierbei werden hydrophile Moleküle (z.B.
nicht-organische Ionen und Wasser) durch die Plasmamembran entlang des elektrochemischen Gradienten durch spezielle Membrantransportproteine (überwiegend Kanalproteine/Poren) transportiert. Der elektrochemische Gradient ergibt sich aus dem Konzentrationsgradienten der Ionen und dem anliegenden
Membranpotential (Vm) zwischen dem Intra- und Extrazellularraum. Durch die gute Permeabilität der Membran für K+-Ionen (Na+/K+-Pumpe) sowie das Bestreben nach einem Konzentrationsausgleich werden positive Ladungen auf die Außenseite der Membran transportiert. Hierdurch wird eine Potentialdifferenz die innere ist negativer als die äußere Seite der Membran hervorgerufen, welche abhängig von der Art des Neurons zwischen -70 und -90 mV liegt. Wenn dieses negative Potential im Inneren der Zelle stabil bleibt und keine aktuelle elektrische Aktivität vorliegt, bezeichnet man das Membranpotential auch als Ruhemembranpotential (Vrest).
e Cl i Na i K
i Cl e Na
e K
m p K p Na p Cl
Cl p Na
p K
mV p
V [ ] [ ] [ ]
] [ ]
[ ]
log [
58
Goldmann-Hodgkin-Katz-Gleichung
pion= Permeabilitätskoeffizient (cm/s) der Ionenart, [Ion]=Konzentration des Ions (mM) intra- (i) und extrazellulär (e)
Mathematisch ausgedrückt ist der elektrochemische Gradient eines Ions die Differenz zwischen dem anliegenden Membranpotential (welches durch die unterschiedlichen Ionen bestimmt wird) und dem Gleichgewichtspotential des einzelnen Ions.
Elektrochemischer Gradient VmEion
Vm= Membranpotential, Eion= Gleichgewichtspotential des Ions
Das Gleichgewichtspotential eines Ions wird erreicht, wenn die treibende Kraft durch seinen Konzentrationsgradienten und die treibende elektrische Kraft gleich groß sind (der Nettofluss des Ions durch den offenen Kanal ist gleich Null) die Nernst- Gleichung beschreibt diesen Zusammenhang (1).
i e
ion Ion
Ion zF
E RT
] [
]
ln [ Nernst-Gleichung Beim Ruhezustand gilt Vm= Vrest und Vrest= EK+
(die Permeabilität für Na+ und Cl- ist sehr gering, die Goldmann-Gleichung ähnelt daher der Nernst-Gleichung für K+), mit RxT/F=25 mV, R=8,314 VC/Kmol, T=[273,16+25] K, F=96500 C/mol, z=Valenz des Ions (für K+=+1) ist Vm -Eion=0
Das Gleichgewichtspotential wird auch als Umkehrpotential bezeichnet, da die Richtung des durch den Konzentrationsgradienten bedingten Ionenflusses durch den elektrischen Gradienten umgekehrt wird, bis sich ein Gleichgewicht zwischen beiden
eingestellt hat. Die passive Diffusion von Ionen ist der wichtigste Prozess für die schnelle Regulierung des Membranpotentials. Ist das anliegende Membranpotential verschieden von dem Gleichgewichtspotential des Ions, so ermöglicht der daraus resultierende elektrochemische Gradient diesen passiven Ionen-Transport durch integrale Membranproteine. Für den passiven Transport mittels erleichterter Diffusion, sind Kanalproteine/Rezeptoren und Carrierproteine verantwortlich. Diesen passiven Bewegungen von Ionen durch die Zellmembran ist der aktive Ionentransport entgegengerichtet. Dieser benötigt allgemein Energie, um die Ionen entgegen des elektrochemischen Gradienten zu bewegen. Er kann den passiven Transport kompensieren und die ursprüngliche Ionen-Verteilung im Zytosol und Extrazellularraum aufrechterhalten. Spezielle Carrierproteine, sogenannte Pumpen, beziehen ihre Energie aus der ATP-Hydrolyse (z.B. Na+/K+-ATPase Pumpe, Ca2+- ATPase Pumpe).
Carrierproteine ermöglichen größeren und/oder polaren Molekülen bzw. Ionen den Durchtritt durch die Membran. Carrier sind in Transporter (Permeasen) und Pumpen zu unterteilen, wobei für die erleichterte Diffusion nur Uniporter, als Untergruppe der Transporter, für den passiven Transport ohne Energieaufwand zu nennen sind. Der Begriff Carrier-vermittelter Transport wird ansonsten überwiegend bei dem im Folgenden genannten aktiven Transport von Ionen erwähnt. Diese Transporter ermöglichen die Ionenbewegung über den elektrochemischen Gradienten (z.B.
Na+/Ca2+-Transporter oder Neurotransmitter Transporter). Carriermoleküle umfassen somit Transportmoleküle, die sowohl mit (aktiver Transport) als auch ohne Energieaufwand (erleichterte Diffusion) Ionen transportieren.
Kanalproteine (Ionenkanäle) können spezifisch für den Transport von bestimmten Ionen sein oder sie sind unspezifisch und lassen mehrere Ionenarten passieren.
Letzteres trifft für die meisten Porine zu. Porine sind offene, wassergefüllte Poren, durch die je nach Poren-Durchmesser unterschiedlich große Substratmoleküle hindurchpassen. Für einige Substratmoleküle (z.B. Zucker) gibt es auch selektiv wirkende Porine. Wassermoleküle werden spezifisch durch Aquaporinetransportiert.
Kanalproteine sind meist nicht konstant geöffnet, sondern öffnen als Antwort auf einen chemischen, mechanischen oder elektrophysiologischen Stimulus (gesteuerte Kanalproteine). Es gibt jedoch auch Ausnahmen: Kanalproteine, die nicht steuerbar, sondern kontinuierlich geöffnet sind und auch eine Bedeutung bei der Festlegung
des Ruhemembranpotentials haben können. Ein Beispiel hierfür sind die genannten Aquaporine.
Kanalproteine können als Rezeptoren fungieren. Rezeptoren binden spezifisch ein bestimmtes Wirkmolekül (Ligand), verändern in Folge dieser Bindung ihre Konformation beziehungsweise ihren Funktionszustand und rufen durch die Bindung des Liganden ein Transmembransignal hervor, soweit sie in der Biomembran vorliegen. Rezeptoren sind Zelloberflächenproteine, die Signalmoleküle vor allem außerhalb der Zelle mit hoher Affinität binden und dieses extrazelluläre Ereignis in ein oder mehrere intrazelluläre Signale umwandeln, die das Verhalten der Zelle verändern (2).
Ionenkanäle haben eine 3-D-Struktur, die eine hydrophile Pore beinhaltet, die die partielle Dehydrierung von Ionen katalysiert und dadurch spezifisch Ionen passieren lässt. Dies geschieht mit einer Übertragung von mehr als 106 Ionen pro s (maximal 3x107/s), damit sind sie beispielsweise den Carrierproteinen mit einer Übertragungsrate von <104 Ionen/s weit überlegen (3) (4). Carrierproteine binden zwar ebenso selektiv wie Kanalproteine ihren Liganden, der bei dem Transfer in die Zelle auch eine Information darstellt. Diese Bindung führt jedoch nicht zu einer Potentialänderung in Form eines Transmembransignals oder eines intrazellulären Signals, weshalb sie nicht als Rezeptoren gelten.
Man unterscheidet verschiedene Rezeptortypen: Metabotrope, ionotrope, enzymatische (zum Beispiel Rezeptoren mit Tyrosinkinase-Aktivität), Transkriptionsfaktor-gebundene (zum Beispiel für Steroidhormone) sowie Zelladhäsions-Rezeptoren.
Metabotrope Rezeptoren werden durch die Bindung eines Liganden oder durch ein sensorisches Signal aktiviert, dies führt über ein GTP(Guanosintriphosphat)- abhängiges Protein (G-Protein) zur Aktivierung einer metabolischen Signalkaskade mit der Bildung von sekundären Botenstoffen. Metabotrope Rezeptoren haben keine Pore. (Beispiele sind der muscarinische Acetylcholin-Rezeptor, der metabotrope GABAB-Rezeptor (-aminobutyric acid receptor B) sowie metabotrope Glutamat- Rezeptoren (5) (1)). Metabotrope Rezeptoren zählen zu den indirekt ligandengekoppelten Rezeptoren, die auf intrazelluläre Funktionen wirken.
Direkt ligandengekoppelte Rezeptoren wirken durch Kanalöffnung infolge der Ligandenbindung (3). Ionotrope Rezeptoren sind Ionenkanäle. Sie führen durch Interaktion mit einem Liganden (ligandenkontrollierter Ionenkanal), durch Änderung des Membranpotentials (spannungskontrollierter Ionenkanal), durch Druck oder Dehnung (mechanosensitiver Ionenkanal (6)), durch Änderung des Phosphorylierungszustands (7) oder durch Änderung des pH-Wertes (Protonenkanäle) zu einem Ionenfluss durch den Kanal. Spannungsgesteuerte Ionenkanäle sind unter anderem Kalium-, Natrium-, Calcium- sowie Protonenkanäle (8) (9) (10) (11).
Jeder Ionenkanal ist ein Protein, welches in Abhängigkeit eines Stimulus in mindestens zwei verschiedenen Stadien vorliegen kann: offen und geschlossen. Ihre Aktivierung erfolgt durch das Alles-oder-Nichts-Prinzip.
Das Öffnen der Ionenkanäle wird überwiegend durch die folgenden verschiedenen Stimuli gesteuert:
- Eine Veränderung des Mempranpotentials (diese werden als spannungsgesteuerte Ionenkanäle bezeichnet).
- Das Binden eines extrazellulären Ligandens, wie z.B. eines Neurotransmitters.
- Das Binden eines intrazellulären Liganden, wie z.B. G-Proteine oder andere sekundäre Botenstoffe wie z.B. Ca2+-Ionen. Solche Kanäle sind z.B. GIRK (G- Protein inwardly rectifying K+channels), die somit über G-Proteine mit anderen direkt an G-Protein-gekoppelten (metabotropen) Rezeptoren in Verbindung stehen. Ca2+-Kanäle sind ein weiteres Beispiel, für Ionenkanäle, die über intrazelluläre Liganden gesteuert werden können.
- Mechanorezeptoren (Stimulus: mechanischer Reiz wie z.B. Dehnen).
Ionenkanäle können in Plasmamembranen und in intrazelluären Organellen verschiedener Gewebe eingelagert sein und auf diese Weise auch die Signaltransduktion beeinflussen. Historisch gesehen, ist ihre Rolle in der Membran von elektrisch erregbaren Zellen am deutlichsten beschrieben. Neuronen sind erregbare, sowie sekretorische Zellen, da sie neben der Förderung der elektrischen Reizweiterleitung durch Ionen auch Neurotransmitter (neuronale Überträgerstoffe) im Bereich der Synapsen freisetzen. Die erregbaren Regionen eines Neurons, die mit dem Erhalt und der Weiterleitung elektrischer Signale durch das „Empfangen“
synaptischer Kontakte in Verbindung stehen, werden auch als sogenannte postsynaptische Elemente bezeichnet. Im Gegensatz dazu steht die präsynaptische Region, die synaptische Kontakte selbst hervorruft, in Verbindung mit der sektretorischen Funktion des Neurons (1).
Neurotransmitter werden durch Exozytose aus präsynaptischen Vesikeln der chemischen Synapse infolge einer Membranpotentialänderung und eines Ca2+- Einstroms in den synaptischen Spalt ausgeschüttet und binden an ligandenkontrollierte ionotrope sowie metabotrope Rezeptoren der postsynaptischen Membran. Dort rufen sie über die Öffnung dieser Membrankanäle eine postsynaptische Potentialänderung hervor, die ihrerseits wiederum Aktionspotentiale auslösen kann und damit die Information weiterleitet (12). Als Neurotransmitter gelten alle endogenen Substanzen, die Signale zwischen einem Neuron und einer anderen Zelle innerhalb des Nervenssystems vermitteln. Sie sind in Acetycholin als eigene Transmitterklasse, Monoamine (Adrenalin, Noradrenalin, Dopamin, Serotonin), Aminosäuren (z.B. Glutamat, GABA(-aminobutyric acid=- Aminobuttersäure), Glycin, Aspartat) sowie Neuropeptide (Substanz P, Met- Enkephalin) zu unterteilen. Man unterscheidet Überträgerstoffe für hemmende (inhibitorische) Neuronen, wie GABA, Glycin, meist auch Serotonin, von erregenden (exzitatorischen) Neurotransmittern wie Glutamat, Acetylcholin, Substanz P, überwiegend auch Dopamin (13).
1.2 Ligandenkontrollierte Ionenkanäle
Ligandengesteuerte Ionenkanäle sind ionotrope Rezeptoren. Zu ihnen gehören 4 Superfamilien (14), die Cystein-loop(Cys-loop)-Rezeptoren, Glutamat-Rezeptoren (N- methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren und nicht-NMDA-Rezeptoren) (15), ATP(P2X)-Rezeptoren (16) sowie TRP-Rezeptoren (17). Es handelt sich hierbei um multimere integrale Membran-Glycoproteine, welche zusammengesetzt aus verschiedenen Untereinheiten Komplexe in Form von Homo- und Heteromeren bilden. Die Mitglieder der erstgenannten Cys-loop-Superfamilie besitzen eine ähnliche molekulare Struktur (18) (14). Ihre Untereinheiten sind als Pentamer um die Ionenpore angeordnet und weisen eine deutliche Homologie zueinander auf (19).
Jede Untereinheit setzt sich aus einer N-terminalen, extrazellulären Liganden-Binde- Domäne mit Cystein Schleife, 4-transmembranären Regionen, sowie einer intrazellulären Region zusammen. Als ligandengesteuerte Cys-loop-Rezeptoren sind
der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor, der 5-HT3-Serotonin-Rezeptor, sowie Zink- aktivierte Kanäle als Kationen-Rezeptoren, der anionische GABAA-Rezeptor (- aminobutyric acid receptor A=GABAAR), GABAC-Rezeptor (-aminobutyric acid receptor C=GABACR) und Glycin-Rezeptor bei Vetebraten bekannt (20).
Ligandenkontrollierte Ionenkanäle vermitteln im Nervensystem im Vergleich zu anderen Transportproteinen eine äußerst schnelle Reizweiterleitung (Zeitverzögerung der Signalübertragung in weniger als 1 ms (19) (21)) und erlauben somit Zellen sehr schnell auf Veränderungen in dem sie umgebenden Milieu zu reagieren. Direkt ligandenkontrollierte Ionenkanäle besitzen spezifische Bindungsstellen für zumindestens zwei oder mehrere Moleküle des Überträgerstoffes (z.B.Glycin). Sie werden auf diese Weise aktiviert und ermöglichen durch ein Öffnen des Kanals überwiegend nur einer bestimmten Ionenart die Passage durch die zentrale Pore. Diese besteht aus -Helices. Die Ionenselektivität ligandenkontrollierter Ionenkanäle kann sowohl kationisch (meist nicht-selektiv und für K+, Na+, Ca2+ zugleich zugänglich) als auch anionisch selektiv für Cl- sein (22).
1.3 Der Glycin-Rezeptor
Glycin ist die einfachste Aminosäure, ist jedoch neben -Aminobuttersäure (GABA) im ZNS der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter auf Hirnstamm- und Rückenmarksebene (23) (24). Als ligandengesteuerter Chlorid-Ionenkanal (25) ist der Strychnin-sensitive Glycin-Rezeptor (GlyR) in der neuronalen Zellmembran im Rückenmark, Stammhirn, Kleinhirn und in der Retina in unterschiedlicher Anzahl und Stereotype zu finden (26) (27) (28). Bedingt durch eine abnehmende intrazelluläre Chlorid-Ionenkonzentration im Verlaufe der Entwicklung, sind embryonale Glycin- Rezeptoren zunächst exzitatorisch, übernehmen jedoch später die bekannte inhibitorische Funktion (29) (30). Als inhibierender Überträgerstoff der Renshaw- Zellen hemmt er -Motoneuronen (31) und spielt auch bei der Koordination spinaler Reflexantworten und der Verarbeitung von Schmerzreizen eine bedeutende Rolle (32) (33) (30). Der anionische GlyR ist im Rückenmark und Kleinhirn vorwiegend an der postsynaptischen Membran von Neuronen zu finden. Innerhalb zentraler Neurone liegt er an der präsynaptischen Endigung oder auch extrasynaptisch vor, wobei er nicht im Großhirn auftritt (34). Außerhalb des neuronalen Gewebes ist sein Vorkommen in Spermien und Kupffer Zellen der Leber beschrieben (27).
Bestehend aus 5 Untereinheiten, 1-4 und -Untereinheiten, bildet er als Pentamer einen integralen Transmembrankomplex, der in seiner -Untereinheitenzusammen- setzung ein räumliches und entwicklungsabhängiges Muster aufweist (35). Die - Untereinheit hat eine Größe von 48 kDa, die Größe der -Untereinheit beträgt 58 kDa (36). Der adulte pentamere GlyR liegt entgegen des in postnatalen Stadien und während der Embryonalentwicklung exprimierten homomeren 2-Glycin-Rezeptors als 1-heteromerer Komplex im Rückenmark vor (37) (38) (39). Der 1-GlyR konnte bereits 1989 rekombinant in einer embryonalen menschlichen Nierenzelllinie (Human embryonal kidney cells, HEK 293-Zellen) exprimiert werden (40). Die 1- Untereinheit des Glycin-Rezeptors kann als homopentamerer funktioneller Rezeptor exprimiert werden (40) (41) (42), die β-Untereinheit hat aber auch entscheidenden Einfluss auf das Bindungsverhalten verschiedener Agonisten (43).
Im Vergleich mit dem adulten heteromeren 1-GlyR zeigt der 1-homomere GlyR in Patch-Clamp-Experimenten an HEK 293-Zellen mit Phenolderivaten sowie Propofol ein ähnliches pharmakologisches Profil (44) (45). Der 3-GlyR kommt spezifisch im dorsalen Horn des adulten Rückenmarks vor und spielt eine Rolle in der inflammatorischen Sensitisierung gegenüber Schmerzreizen beispielsweise bei einer Entzündungsreaktion nach Gewebsverletzung, woraus eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Schmerzen resultiert (32). Für den heteromeren 1-GlyR wurde in ersten Studien eine Stöchiometrie von 3:2 Untereinheiten angenommen (46) (47).
Eine neuere Studie hingegen bestätigt eine Zusammensetzung von 2:3 (43).
Abb. 1 Struktur der -Untereinheit des Glycin-Rezeptors (30)
Die - und -Untereinheiten des Glycin-Rezeptors bestehen jeweils aus einer großen extrazellulären N-terminalen Domäne, 4 hydrophoben Transmembranregionen (TM1- TM4) mit Verbindungen zwischen TM1 und TM2 sowie zwischen TM2 und TM3, einer langen intrazellulären Schleife zwischen TM3 und TM4 sowie einer kurzen extrazellulären C-terminalen Region (27). Die N-terminale Domäne ist hauptsächlich in der Bindung des Agonisten involviert, die transmembranären Domänen sind verantwortlich für die Bildung der Ionopore (20). Der Ligand bindet an der Kontaktstelle zwischen zwei Aminosäurebereichen innerhalb der extrazellulären N- terminalen Domäne der 1-Untereinheit (48) (49). Das TM2-Segment spielt als ausschlaggebendes Element für die Chlorid-Leitfähigkeit eine funktionelle Rolle (35).
Studien, die eine Bindung des 93 kD großen Membranproteins Gephyrin (50) an die
-Untereinheit sowie an Mikrotubuli belegen, verweisen auf eine Verankerung des Glycin-Rezeptors in der postsynaptischen Membran mittels dieser Bindung (51) (52).
Der Ionenstrom durch den Strychnin-sensitiven GlyR fließt sobald sich ein Ligand z.B. Glycin in die Bindungstasche der Ionopore gesetzt hat. Es folgt eine Konformationsänderung in den aktivierten Zustand des Rezeptors, bei dem Cl--Ionen diesen passieren. Für die Ionopore des Glycin-Rezeptors ist ein Durchmesser von 5,2 Ǻ bekannt (53). Die Aminosäuren, die den Eingang und Ausgang des Kanals definieren, sind für den GlyR durch die basische Aminosäure (AS) Arginin besetzt, während die Gate-Region die unpolare AS Leucin beinhaltet (54). Die Bindung des Liganden führt durch eine allosterische Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten zu mehreren Konformationsänderungen, die die Öffnung des Ionenkanals begünstigen (55). Der Kanal öffnet sich in weniger als 1 Millisekunde und bleibt nur wenige Millisekunden offen, bis er danach nicht aktivierbar und somit refraktär ist (19) (56). Diese hochfrequenten Konformationsänderungen bilden zusammen mit der auf den pentameren Rezeptor treffenden Anzahl an Liganden die verschiedenen wechselnden Zustände in denen der ligandenkontrollierte Ionenkanal vorliegen kann. Für den GlyR werden drei Agonistenmoleküle benötigt um eine Konformationsänderung hervorzurufen (47) (57) (46). Die Zahl der offenen Kanäle, ihre Öffnungsdauer sowie die Leitfähigkeit des Kanals bestimmen das Ausmaß des Ionenflusses. Die Kinetik der Stromantwort an inhibitorischen ligandenkontrollierten Glycin-Rezeptoren ist durch einen raschen Anstieg <1 ms und einen
monophasischen Abfall gekennzeichnet (58). Durch die Aktivierung des Rezeptors und den dadurch ermöglichten Ionenfluss wird das Ruhemembranpotential von -70 mV (bei menschlichen Neuronen) hyperpolarisiert (59). Die Weiterleitung von Informationen innerhalb von Nervenzellen erfolgt mit Aktionspotentialen über eine Depolarisation des Membranpotentials der nachfolgenden Zelle. Wird nun die Zelle hyperpolarisiert, kann die Weiterleitung von Aktionspotentialen unterbunden werden.
Man spricht von hemmenden (inhibitorischen) Synapsen, da die Reizweiterleitung gehemmt ist.
1.4 Glycin-Rezeptormutationen und ihre klinische Bedeutung
Ionenkanal-Defekte (Kanalopathien) sind Ursache für verschiedenste Krankheiten.
Die erbliche Hyperekplexie ist bis jetzt das einzige bekannte Krankheitsbild, welches auf eine Mutation innerhalb des Glycin-Rezeptors zurückzuführen ist (60). Sie wird auch als „startle disease“ bezeichnet und wird zu 80% (61) mit einer Punktmutation einer einzigen Aminosäure in der 1-Untereinheit des Glycin-Rezeptors assoziiert (62) (63) (64) (65) (66). Sie ist als neurologische Fehlfunktion durch Episoden krampfartiger Muskeltonussteigerung sowie eine abnormale Schreckhaftigkeit gegenüber milden auditorischen, visuellen oder taktilen Stimuli besonders im Säuglingsalter („stiff baby syndrome“) gekennzeichnet (67) (68) (69) (70). Die Betroffenen leiden vermehrt unter Nabel- und Leistenbrüchen, stürzen und verletzen sich in Stresssituationen leicht, da ihnen Abstützbewegungen durch Verkrampfungen in Armen und Händen nur eingeschränkt möglich sind (69) (71) (72) (73) (74) (75) (76) (61) (77). Die gegenwärtige Therapie besteht in einer indirekten Behandlung der Symptomatik mit antiepileptischen GABAA-Rezeptor-aktivierenden Substanzen, wie Clonazepam oder Valproinsäure (70) (78) (79).
Die natürlich vorkommenden, autosomal dominant vererbbaren 1-GlyR-Mutationen R271Q und R271L werden durch eine Substitution des Arginins an Aminosäureposition 271 (welche sich am extrazellulären Ende des TM2-Segmentes befindet (80) (81)) durch die Aminosäuren Glutamin (R271Q) und Leucin (R271L) hervorgerufen. Sie sind in klinischen Studien vermehrt als genetische Ursache der erblichen Hyperekplexie festgestellt worden (62) (63) (64) (82) und als die beiden am häufigsten auftretenden Mutationen bei mehr als 12 Familien beschrieben (62) (83) (82) (84) (85) (78) (74).
Abb. 2 Startle Mutationen am humanen 1-GlyR (86)
Punktmution, die sich in einer Teilstörung (grau) oder aber in einer kompletten Störung des Phänotyps äußert (schwarz)
Insgesamt wurde die erbliche Hyperekplexie bisher in 70 Familien unterschiedlicher Herkunft identifiziert (87) (67). Diese Mutationen führen zu einer reduzierten Bindung von Glycin sowie einer verminderten Einzelkanal-Leitfähigkeit. Dies geht aus Untersuchungen mit rekombinanten Expressionssystemen hervor (88) (89) (90). Die Folge dieser Punktmutation ist eine insgesamt reduzierte glycinerge Inhibition.
Weitere Mutationen in den humanen -Untereinheiten (27) sowie in der - Untereinheit (91) aber auch in den Glycintransportern (92) (93) und in den Rezeptor verankernden Proteinen, wie beispielsweise Gephyrin, (94) verursachen motorische Störungen. Spastische Bewegungsdefekte und Krämpfe sind folglich mit dem Krankheitsbild der Hyperekplexie assoziiert.
Studien an Mäusen widmen sich besonders drei natürlich auftretenden Mutationen, die sich in einem Hyperekplexie-Phänotyp äußern. Sie werden nach ihren unterschiedlichen Genotypen in spastic (spa), spasmodic (spd) und oscillator (osc) unterschieden (95). Ihnen gemeinsam sind eine autosomal rezessive Vererbung, ein reduziertes GlyR-Level (96) (97) und eine reduzierte Agonistensensitivität (98) (99).
Transgene R271Q-Mauslinien besitzen eine ähnliche Charakteristik hinsichtlich der verminderten glycinergen Inhibition und ihrer phänotypischen Ausprägung (100) (88).
Eine weitere Mutation in der TM2 der 1-Untereinheit des Glycin-Rezeptors an der Aminosäureposition 267 führt nicht zur Ausbildung eines Krankheitsbildes, zeigt aber durch den Einbau des Isoleucins (S267I) und des Methionins (S267M) anstelle des
Serins eine deutlich reduzierte Empfindlichkeit gegenüber dem Anästhetikum Propofol (101). Der 1S267I-GlyR weist verminderte Glycin-induzierte Ströme auf, verglichen mit denen des Wildtyps, was sowohl an HEK 293-Zellen (101) sowie an Xenopus Oozyten (102) belegt ist. Diese Mutation zeigt einen kompletten Velust in der Potenzierung glycinerger Ströme durch Ethanol wie auch der Sensitivität gegenüber Enfluran in HEK 293-Zellen und ist daher für Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen von Anästhetika interessant (103).
Eine Korrelation zwischen der molekularen Größe der Aminosäure an Position 267 und der Aktivität von Ethanol wird beschrieben (104). Größere Aminosäuren begünstigen demnach eine Hemmung Glycin-induzierter Ströme durch Ethanol.
Lipophilie und Ladung der Aminosäure an Position 267 der mutierten Rezeptoren ist für die Aktivität von Ethanol weniger entscheidend (104). Ebenso scheint die Kettenlänge der Alkohole hinsichtlich der Aktivierung von Glycinströmen am
1S267I-GlyR auschlaggebend (105). Der 1S267I-GlyR ist gegenüber Ether- Anästhetika empfindlich, wohingegen alle ebenso untersuchten halogenierten tertiären Alkohol-Anästhetika sowie die meisten halogenierten primären Alkohol- Anästhetika die Glycin-induzierten Ströme am mutierten 1S267I-GlyR nicht potenzieren. Damit besitzt die Aminosäure an Position 267 des 1-Glycin-Rezeptors eine entscheidende Rolle bei der molekularen Interaktion mit Propofol, Ethanol sowie halogenierten Anästhetika (106).
1.5 Propofol und seine Derivate
Die ersten klinischen Versuche mit Propofol erfolgten 1977. In den frühen 80er- Jahren etablierte sich der Einsatz des kurz wirksamen, intravenös verabreichten Anästhetikums in der klinischen Praxis als Öl-in-Wasser-Emulsion sowohl für die Einleitung als auch die Aufrechterhaltung einer Narkose (107). Eine in vivo Studie zur Untersuchung der anästhetischen Aktivität bei Mäusen und Ratten zeigte für Propofol (2,6-Diisopropylphenol) eine, verglichen mit anderen Phenolderivaten, besonders günstige Struktur-Wirkungsbeziehung (108).
Anästhetika sind Medikamente, die vorwiegend das Bewusstsein durch Hypnose reversibel vermindern und ausschalten. Der Begriff Narkose ist seit Anfang des 20.
Jahrhunderts durch Bewusstlosigkeit (Hypnose) einhergehend mit Erinnerungslosigkeit (Amnesie), Schmerzlosigkeit (Analgesie) sowie
Muskelrelaxation (Immobilisierung) definiert (109). Hierfür werden Anästhetika mit Analgetika und Muskelrelaxantien kombiniert. Anästhetika unterdrücken oder erschweren die Auslösung eines Aktionspotentials im postsynaptischen Bereich.
Zum Einsatz kommen Hypnotika, die als volatile (dampfförmige) Anästhetika (z.B.
Sevofluran, Desfluran) sowie Injektionsanästhetika (z.B. Barbiturate, Propofol, Etomidat) appliziert werden können. Sie beeinflussen die Funktion verschiedener Rezeptoren an mehreren Wirkorten. Als Wirkorte gelten dabei Zellmembranen ebenso wie Membranproteine und darin enthaltende lipophile Proteindomänen. Die Interaktion mit den inhibitorischen GABAA- und Glycin-Rezeptoren gilt als wahrscheinlich bei der Aufklärung des anästhetischen Wirkmechanismus.
Anästhetische Effekte werden vermutlich eher durch ligandenkontrollierte als durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle vermittelt (110) (111).
Zurzeit sind drei Handelspräparate erhältlich (Disoprovan, Recofol und Klimofol). Sie enthalten jeweils 1% Propofol, 10% Sojaöllösung, 2,25% Glycerin sowie 1,2%
Eigelblecithin und unterscheiden sich nur in den antimikrobiellen Zusätzen EDTA (Ethylendiamintetraacetat), Metabisulfit oder Benzylakohol (112). Um die Narkose am gesunden, nicht vorbehandelten Patienten einzuleiten, wird eine Dosis von 2,0-2,5 mg/kg empfohlen (113) (114). Auf Grund seiner geringen Akkumulation im Körper eignet sich Propofol auch für längere Operationen (113). Außerdem bewirkt das lipophile Propofol, bedingt durch die hohe Lipidlöslichkeit, einen raschen Wirkeintritt und ein rasches Erwachen des Patienten und ist damit besonders gut für den ambulanten Einsatz geeignet. Die kurze Wirkdauer macht jedoch eine Infusion unerlässlich. Die Metabolisierung von Propofol findet hauptsächlich in der Leber statt (115). Propofol hat sedierende, hypnotische, anxiolytische, neuroprotektive und antioxidative (116) sowie muskelrelaxierende Effekte (117). So ist bei Propofolgabe eine reduzierte Verarbeitung sensorischer Informationen und eine verminderte Erregbarkeit von -Motoneuronen festzustellen (117) (118) (119). Studien belegen eine verstärkte Schmerzempfindung und damit hyperalgetische Effekte durch Propofol (120) (121) (122). Einige aktuelle Studien zeigen aber auch eine analgetische Wirkung von Propofol (123) (124). Vorwiegend werden die intravenösen Anästhetika wie Propofol jedoch mit einer verminderten analgetischen Potenz in Zusammenhang gebracht (125) (126) (127) (128) (129) (130). Zu den Nebenwirkungen zählen kardiorespiratorische Depression, Hypotonie (113) (131), außerdem besteht der Nachteil des Injektionsschmerzes (132) (133).
Zum molekularen Wirkmechanismus des zentral dämpfend wirkenden Propofols ist eine Involvierung von spannungskontrollierten und insbesondere ligandenkontrollier- ten Ionenkanälen vielfach bestätigt (134).
Die hypnotische Wirkung des Propofols wird überwiegend auf die Potenzierung von GABAA-Rezeptoren zurückgeführt, wobei hierbei die β-Untereinheit eine entscheidende Rolle spielt (135) (136) (137) (138) (139) (110). Weitere Studien für Propofol am GABAAR bestätigen zum einen eine positive Modulation in Form einer Potenzierung GABAAR-vermittelte Chlorid-Ionenströme (140), zum anderen eine Verlangsamung der Rezeptordeaktivierung und -desensitisierung des GABAA- Rezeptors durch Propofol (141). Die direkte Aktivierung durch Propofol am GABAAR (140) (142) (143) sowie dessen entscheidende Rolle bei der Vermittlung der sedierend-hypnotischen Wirkkomponente des Propofols über den GABAAR sind ebenso beschrieben (144). Eine weitere Studie, die aufzeigt, dass sein nicht anästhetisch wirksames Strukturanalogon 2,6-Ditertbutylphenol keine Direkt- Aktivierung des GABAA-Rezeptors im Patch-Clamp-Experiment auslöst, unterstützt diese Annahme (145). Für die Interaktion mit Propofol scheinen überwiegend Aminosäurereste innerhalb der TM2 und TM3 der -Untereinheit des GABAA- Rezeptors verantwortlich zu sein, wohingegen -Untereinheiten hierbei vermutlich eine untergeordnete Rolle spielen (146) (147) (135) (148). Knock-in-Mäuse mit einer Punktmutation innerhalb der 2-und 3-Untereinheit des GABAA-Rezeptors erwiesen sich als unempfindlich gegenüber Propofol (147) (146) (149) und Etomidat (150).
Neben der positiven Modulation am GABAAR interagiert Propofol ebenso mit dem Strychnin-sensitiven GlyR. Eine Potenzierung glycinerger Chlorid-Ionenströme durch Propofol konnte in Rückenmarksneuronen der Ratte (151), in isolierten hypothalamischen Neuronen der Ratte (152), in kultivierten murinen Rückmarksneuronen (140), am humanen 1- oder 1β-GlyR in Xenopus laevis Oozyten (153) und in HEK 293-Zellen (101) gezeigt werden. Neben der Potenzierung glycinerger Chlorid-Ionenströme ist eine veränderte Rezeptorkinetik hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der induzierten Stromamplituden durch Co-Applikation von Propofol feststellbar (151) (101). Der GlyR-Antagonist Strychnin blockiert nur teilweise (10-12%) mit einem deutlich geringeren Ausmaß im Vergleich zur Inhibition GABAAR-vermittelter Ströme durch Bicucullin (88-90%) die durch
Propofol induzierten Ströme in spinalen (151) und hypothalamischen Neuronen des paraventrikulären Nucleus (154).
Bei der Interaktion von Propofol mit dem GlyR ist die Aminosäure 267 in der TM2 der
1-Untereinheit des Glycin-Rezeptors vermutlich in die Propofolbindung involviert.
Elektrophysiologische Untersuchungen an 1S267M- und 1S267I-Glycin- Rezeptoren in HEK 293 zeigen eine reduzierte Co-Aktivierung von Propofol, wobei dieser Effekt besonders deutlich durch den Einbau des verzweigten, unpolaren und stark hydrophoben Isoleucins in Form der 1S267I-Mutante zu erkennen ist. Der Einbau des ebenso unpolaren aber deutlich weniger hydrophoben Methionins (1S267M) an Stelle des hydrophilen und polaren Serins an der Position 267 zeigt im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte allosterische Modulation durch Propofol wenn auch mit einem geringfügigerem Effekt als die 1S267I-Mutante. Methionin sowie Isoleucin sind hinsichtlich ihrer molekularen Struktur lipophiler und größer als Serin. Zusätzlich weist diese Studie für beide S267-Mutanten einen kompletten Verlust der direkt-aktivierenden Effekte von Propofol nach (101). Daher gilt Serin an Position 267 als mitbestimmend für die Interaktion und möglicher Teil der Bindungstasche von Propofol (101). Die Aminosäure Serin an Position 267 der TM2 wird auch als ausschlaggebend für die allosterischen Effekte von Alkoholen, volatilen sowie Alkyl-Anästhetika am GlyR erachtet (106) (104) (105) (103) (siehe auch 1.4).
Da die Co-Aktivierung am GlyR durch Propofol sowie 2,6-Ditertbutylphenol gleich ist (44), aber letzteres im Gegensatz zu Propofol in vivo keinen hypnotischen Effekt zeigt, ist anzunehmen, dass die Co-Aktivierung des Glycin-Rezeptors nicht als alleiniger Mechanismus für die anästhetische Wirkung von Propofol entscheidend ist.
Eine aktuelle Studie belegt, dass durch Strychnin eine Verkürzung des Propofol- induzierten Aufstehreflexverlusts beziehungsweise des hypnotischen Effekts bei Ratten erzielt werden kann (152). Ebenso wird in dieser Studie eine konzentrationsabhängige Verminderung des Prozentsatzes der Anzahl an Ratten, die einen durch Propofol induzierten Austehreflexverlust aufweisen, sowohl bei Gabe von Strychnin als auch eines GABAAR-Antagonisten belegt (152). Eine weitere Studie an Mäusen zeigt hingegen, dass nach Gabe von volatilen Anästhetika mit gleichzeitiger Gabe des GlyR-Antagonisten Strychnins kein signifikanter Effekt bei der Schlafzeit im Vergleich zur Kontrollgruppe vorliegt, jedoch die Schmerzschwelle dieser Mäuse sinkt (155). Damit wird gezeigt, dass der Strychnin-sensitive GlyR eine
bedeutende Rolle bei der Vermittlung antinozizeptiver (analgetischer), nicht aber hypnotischer Effekte von volatilen Anästhetika spielt. Die Annahme, dass die sedierenden Wirkkomponente von Anästhetika durch GABAA-Rezeptoren und nicht durch Glycin-Rezeptoren vermittelt wird, ist auch durch die folgende in vivo Studie mit Propofol an einer β3N265M-GABAAR-Maus bestätigt (147). Jurd et al. belegen eine verkürzte Zeit für den Aufstehreflex bei Propofolgabe an dieser Mausmutante mit einer Mutation innerhalb der TM2 der β3-Untereinheit des GABAA-Rezeptors.
Dies wird auf eine verringerte GABAAR-vermittelte Inhibition zurückgeführt, da Propofol nicht mehr an diesem mutierten GABAAR der Maus angreifen kann. Der GlyR bei dieser Mausmutante ist aber intakt. Würde die Sedierung ausschließlich über den GlyR ausgelöst, wäre diese GABAAR-Maus-Mutante weiterhin sediert. Dies ist aber nicht der Fall, wie Jurd et al. beweisen (147). Die Propofolgabe an einer normalen Maus (144) oder auch an Kaulquappen führt zur Sedierung (156). In vivo Studien zur Propofolgabe an GlyR-Mutanten müssten demnach mit einem intakten GABAAR eine Sedierung zeigen, wenn der GABAAR verstärkt zu den hypnotischen Effekten von Propofol beiträgt. Die Entwicklung von bisher nicht verfügbaren
1S267I-GlyR-Knock-in-Mäusen könnte die Untersuchung dieses Zusammenhangs vorantreiben. Dass neben GABAA-Rezeptoren Glycin-Rezeptoren einen Beitrag zur hypnotischen Wirkung von Anästhetika zeigen, ist denkbar. Eine alleinige Vermittlung der Sedierung über den GlyR ist aber unwahrscheinlich. Diese Annahme wird auch durch die nur partielle Inhibition von Propofol-induzierten Strömen bei Strychnin- Gabe an Neuronen bestätigt (151) (154).
Neben den genannten Effekten am GABAA- und Glycin-Rezeptor zeigt Propofol außerdem eine potente Blockade spannungkontrollierter Natrium-Ionenkanäle (157) (158) (159). Eine fehlende Modulation der 5-HT3A-Rezeptor-Funktion (160) (161) könnte die Ursache für das geringe Auftreten von Übelkeit und Erbrechen nach Propofolanästhesie erklären. In vitro Versuche zeigten, dass Propofol Glutamat- Rezeptoren insbesondere NMDA-Rezeptoren inhibiert (162) (163). Effekte am AMPA (-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propion-acid)-Rezeptor sind ebenso beschrieben (164). Veränderungen von nicotinischen Acetylcholin-Rezeptoren sowie cholinergen muscarinischen Rezeptoren werden mit der Vermittlung der Propofol induzierten Bewusstlosigkeit assoziiert (132) (165).
Im Folgenden sei auf Propofolderivate eingegangen, auf die das Hauptaugenmerk dieser Arbeit gerichtet ist und die durch chemische Modulation dahingehend verändert sind, dass sie veränderte pharmakologische Eigenschaften aufweisen.
Abb. 3 Strukturformel von Propofol
Experimente an Xenopus laevis Oozyten unterstreichen die Bedeutung der Größe der Substituenten an Position 2,6 des aromatischen Rings bezüglich der anästhetischen Wirkung von Propofolderivaten (156). So ist bekannt, dass eine Verlängerung bis hin zu 7 oder 8 C-Atomen der Seitenketten an der Position 2,6 des Phenolrings des Propofols zu einem Anstieg seiner anästhetischen Wirksamkeit und einer Verkürzung des Wirkungseintritts im Maus- und Rattenmodell führt. Eine weitere Verlängerung über 8 C-Atome hinaus führt zu einer verminderten Wirksamkeit, einem langsameren Wirkungseintritt und längeren Erholungszeiten nach der Anästhesie (108). Die Fähigkeit von Phenolderivaten, GABAA-Rezeptoren zu aktivieren, wird auch in einer weiteren Studie mit einer 2,6-di-alkyl-Substitution assoziiert (166) und verdeutlicht damit ihre Rolle bei der Interaktion mit den inhibitorischen Rezeptoren.
Von besonderer Bedeutung für die anästhetische Aktivität ist auch die phenolische Hydroxylgruppe (108) (145). Als ausschlaggebend für die anästhetische Aktivität wird die Wasserstoffbindung der Hydroxyl- oder Anilingruppe beschrieben, da Propofolderivate, die als Amid, mono- oder di-methylanilin vorliegen, eine verminderte anästhetische Potenz aufweisen (167). Letztere in vivo Studie an Mäusen mit para-methyl-amino-substituierten wasserlöslichen Propofolderivaten zeigt eine vergleichbare oder bessere hypnotische Aktivität im Vergleich zu Propofol.
Neben der phenolischen Hydroxylgruppe und der Substitution an Position 2,6 des Phenolrings ist die para-Position interessant. Die meisten Substitutionen in para- Position beeinflussen die anästhetische Wirkung kaum. Die chemische Modulation in para-Position durch diverse Substituenten geht ohne einen Verlust der
anästhetischen Aktivität dieser Propofderivate einher (143) (156). Die in dieser Arbeit untersuchten Propofolderivate sind in Position 4 des aromatischen Rings (para- Position) substituiert.
Die Einführung von Halogenen in Phenol- beziehungsweise Propofolderivate führt in vorausgehenden Studien an skelett-muskulären Natrium-Ionenkanälen zu einer Steigerung in ihrer Wirkung gegenüber Propofol (157) und zeigt sich als wirksamer gegenüber dem nicht-halogenierten Lidocain (168) (169) (170). Die Halogenierung in para-Position führt jedoch zu keiner bedeutenden Steigerung der Co-Aktivierung im Vergleich zu Propofol bezogen auf ihre Aktivität am GABAAR (143) (156).
Für das halogenierte Propofolderivat 4-Iodpropofol wird an Xenopus Oozyten, die den humanen 1β22GABAAR exprimieren, eine reduzierte Direkt-Aktivierung im Vergleich zu Propofol belegt (143) (144). In vivo Studien zeigen, dass 4-Iodpropofol ähnlich wie Propofol zu einer reduzierten neuronalen Inhibition hinsichtlich der Co- Aktivierung am GABAAR und der Acetycholinfreisetzung im Hippocampus führt (143) (144), jedoch in vivo keine anästhetischen Effekte nach intraperitonealer Injektion an Ratten (144) und an Mäusen (171) aufweist. Inwieweit 4-Iodpropofol im Vergleich zu Propofol den homomeren Strychnin-sensitiven GlyR moduliert und durch die verminderte Direkt-Aktivierung am GABAAR weniger sedierend aber eventuell verstärkt analgetisch wirksam ist, ist derzeit noch nicht bekannt.
Propofolderivate mit einer verstärkten Potenzierung des Glycin-Rezeptors und einer ähnlichen oder verminderten Aktivierung am GABAAR wie Propofol könnten die Grundlage bilden für die Entwicklung von Substanzen mit einem günstigen analgetischen Wirkprofil. Hiermit sollen Derivate des Propofols entstehen, die den GlyR stärker potenzieren als Propofol. Diese sollten mehr selektiv für den GlyR sein und auf Grund der weniger ins Gewicht fallenden GABAAR-vermittelten Wirkkomponente weniger eine Sedierung aber verstärkt analgetische Effekte zeigen.
Damit könnte die Sedierung als bisherige unerwünschte Nebenwirkung in der Behandlung von chronischen Schmerzen und GlyR-Krankheiten durch die Gabe von GABAAR-aktivierenden Medikamenten möglicherweise reduziert werden.
1.6 Schmerz in Verbindung mit Glycin-Rezeptoren
Pathologische Schmerzzustände, wie inflammatorische Krankheiten und neuropathische Verletzungen, sind häufig von starken Schmerzen begleitet, die chronisch werden können und schlecht auf eine konventionelle analgetische Behandlung ansprechen (172). Neuropathische Schmerzen werden unter anderem durch eine primäre Läsion oder Fehlfunktion des peripheren oder zentralen Nervensystems, wie z.B. direkte Verletzungen am Nerv oder Rückenmark, Herpes Zoster Infektion, Multiple Sklerose, hervorgerufen und treten hiermit bei verschiedensten Krankheitsbildern in Erscheinung (173). Der neuropathische Schmerz wird mit einer peripheren sowie zentralen nozizeptiven Hypererregbarkeit spinaler Neurone im Hinterhorn des Rückenmarks in Verbindung gebracht (174), wobei die Therapie auf die Reduktion dieser gerichtet ist (175). In erster Linie werden hierzu antiepileptische Medikamente wie Gabapentin und Pregabalin, sowie Trizyklische Antidepressiva eingesetzt. Opioide und andere Analgetika finden ebenso besonders als, im Gegensatz zu den systemisch applizierten Analgetika, nebenwirkunsärmere topische Analgetika Anwendung (173) (176).
Chronische Schmerzen treten in den verschiedensten Formen auf. Für ihre Entstehung und Aufrechterhaltung sind plastische Veränderungen in der Verarbeitung neuronaler sensorischer Stimuli im ZNS verantwortlich (177). Hierbei ist der Verlust der postsynaptischen Inhibition spinaler Neurone im Hinterhorn des Rückenmarks infolge einer Entzündung oder Nervenverletzung ausschlaggebend.
Diese inhibitorischen Neuronen kontrollieren die Verschaltung nozizeptiver Signale aus der Peripherie ins ZNS (178) (179) (180) (32). Der Verlust der Hemmung nozizeptiver Bahnen, kann zu Hyperalgesie (verstärktes Schmerzempfinden) oder Allodynie (Schmerzempfindung infolge nicht schmerzhafter Reize) führen. Der Strychnin-sensitive GlyR ist im Vergleich zum GABAAR hauptsächlich in die neuronale Inhibition auf Hirnstamm-und Rückenmarksebene involviert (181) (182) (183) (24). Er wird als molekularer Angriffspunkt für analgetisch wirksame Therapeutika innerhalb aufsteigender nozizeptiver Bahnen sowie innerhalb der Modulation des Schmerzempfindens beschrieben (184) (23) (33) (24). Eine bedeutende Rolle kommt vermehrt dem spinalen 3-GlyR zu, der im Hinterhorn des Rückenmarks durch eine Prostaglandin E2-(PGE2)-vermittelte Inhibition in direkter Verbindung mit der Sensibilisierung gegenüber Schmerzen steht (185) (32) (180).
Eine Inaktivierung des 3-GlyR-Gens führte zu einem Verlust der PGE2-vermittelten Inhibition und des Schmerzempfindens bei Mäusen (32). Das Ausbleiben der spinalen Inhibition bei entzündlichem oder neuropathischem Schmerz wird aber auch auf eine Veränderung der inhibitorischen Wirkung von GABAAR-aktivierbaren Interneuronen zurückgeführt, die funktionell afferente nozizeptive Bahnen hemmen.
Vermutlich beeinflusst eine veränderte Expression der Kationen-abhängigen Chlorid- Cotransporter Na+-K+-Cl--Cotransporter 1 (NKCC1) (hochreguliert) sowie K+-Cl-- Cotransporter 2 (KCC2) (herunterreguliert) durch eine veränderte intrazelluären Cl-- Konzentration diese GABAAR-vermittelte Inhibition (186).
GABAA- und Glycin-Rezeptoren sind als die wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter für den Prozess der schnellen synaptischen Inhibition innerhalb des vollendet entwickelten Zentralennervensystmems (ZNS) verantwortlich (187). GABA ist vorwiegend für die neuronale Inhibition im ZNS verantwortlich, Glycin dagegen vermehrt auf Hirnstamm- und Rückenmarksebene (181) (182) (183) (24). Strychnin- sensitive glycinerge Interneuronen führen zu einer Hemmung spinaler nozizeptiver, motorischer und sensibler Reflexantworten, welche die Schmerzweiterleitung und den Muskeltonus beeinflussen (24). Eine maximale Potenzierung des Strychnin- sensitiven Glycin-Rezeptors in Form einer Hemmung aufsteigender nozizeptiver Bahnen ist daher als einer der möglichen Ansatzpunkt interessant für die Entwicklung neuer analgetisch und spasmolytisch wirksamer Substanzen in der Behandlung von chronischen neurophatischen Schmerzen. Entgegen den GABAA- Rezeptoren sind Glycin-Rezeptoren in ihrer Rolle bei der Schmerzverarbeitung bislang wenig untersucht.
Zu der genannten Blockade von ligandenkontrollierten Ionenkanälen bei der neuronalen Sensibilisierung gegenüber neuropathischem Schmerz sind auch der TRP-Vanilloid1-Rezeptor und die TRPM8-Rezeptoren zu nennen. Purinrezeptoren, Cannabinoid-Rezeptoren sowie Glutamatrezeptoren werden ebenso mit neuropathischem Schmerz assoziiert (188). Die veränderte Expression spannungsgesteuerter Rezeptoren, wie beispielsweise die der Natrium-Ionenkanäle, spielen eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von neuropathischen wie auch inflammatorischen chronischen Schmerzen (189). Neben der beschriebenen synaptischen Enthemmung durch die Ionenkanäle sind auch inflammatorische Mediatoren und Immunzellen (177), G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (190) sowie
nachgeschaltete Regulatoren der Protein-Phosphorylierung, die die spinale Erregbarkeit modulieren, an dem Mechanismus der chronischen Neuropathie beteiligt (188). Der Mechanismus des chronischen Schmerzes infolge diverser neuropathischer, sowie inflammatorischer pathologischer Schmerzzustände ist folglich komplex. Die positive Modulation der glycinergen Inhibition ist daher nur einer der vielen möglichen Ansatzpunkte, um die neuronale Hypererregbarkeit direkt auf spinaler Ebene zu reduzieren.
1.7 Ziel der Arbeit
Glycin-Rezeptoren sind neben GABAA-Rezeptoren die wichtigsten inhibitorischen Rezeptoren auf Hirnstamm- und Rückenmarksebene. Spezifische GlyR-Agonisten, die spinale Interneurone positiv modulieren und auf diese Weise die Entstehung und das Empfinden von chronischen Schmerzen in höheren Regionen des ZNS möglicherweise schon auf Rückmarksebene unterbinden, sind bisher noch nicht verfügbar. Sie könnten somit neue Substanzen darstellen, die vermehrt am GlyR angreifen und weniger beziehungsweise nicht mehr GABAAR-vermittelt wirken als Propofol selbst und auf diese Weise weniger sedierend wirksam sind.
Neben der wichtigen Rolle bei der Koordination der spinalen Reflexantwort und der Verarbeitung von Schmerzsignalen wird mit dem GlyR auch das Krankheitsbild der erblichen Hyperekplexie assoziiert. Der direkte Zusammenhang zwischen einer Punktmutation des Glycin-Rezeptors und der erblichen Hyperekplexie stellt einen möglichen Angriffspunkt für neue Therapeutika dar. Eine positive Modulation der klinisch relevanten Mutanten 1R271Q und 1R271L durch spezifische GlyR- Modulatoren ist eine interessante Option zur bisherigen Therapie mit GABAAR- aktivierenden Medikamenten.
Entgegen der durch den GABAA-Rezeptor vermittelten Sedierung sind für den GlyR kürzlich nur analgetische, nicht aber hypnotische Effekte durch emulsierte volatile Anästhetika beschrieben worden. Dieses macht spezifische GlyR-Agonisten ebenso für die Behandlung von neuropathischen Schmerzen als auch für die Therapie der erblichen Hyperekplexie interessant.
Basierend auf vorausgegangenen Studien, die eine deutliche Potenzierung glycinerger Chlorid-Ionenströme durch Phenolderivate mit einem Chlorid in para- Position zeigen, widmet sich diese Arbeit neuen, in para-Position halogenierten
Propofolderivaten, welche den hemmenden glycinergen Effekt maximal potenzieren und somit möglichst spezifisch und effektiv den GlyR modulieren könnten.
Im Rahmen dieser Arbeit werden hierzu 4-Chlor, 4-Iod- und 4-Brompropofol auf ihre Co- und Direkt-Aktivierung am 1-GlyR Wildtyp untersucht. Eine der Substanzen, die ein gutes pharmakologisches Profil (sowohl in ihrer effektiven Wirkkonzentration als auch ihrer maximalen Potenzierung) zeigt, wird an den bei erblicher Hyperekplexie relevanten GlyR-Mutationen R271Q und R271L untersucht. Zur Aufklärung der beteiligten Aminosäuren als Teil der möglichen Bindungsstelle der drei verwendeten halogenierten Propofole folgen Studien am 1S267M- und 1S267I-GlyR. Die Co- Applikation soll die physiologischen Gegebenheiten im Organismus widerspiegeln, während die Direkt-Aktivierung Aussagen über die direkte Substanz-Rezeptor- Wechselwirkung zulässt. Die Substanzen werden folglich entweder mit einer submaximalen Glycinlösung co- oder (ohne Glycin) direkt-appliziert. Hierbei liegt das Hauptaugenmerk auf einer Potenzierung glycinerger Ströme durch die genannten neuen Substanzen. Diese Co-Aktivierungsexperimente werden im Rahmen eines in vitro Screenings als präklinische Studie bei der Entwicklung potentieller neuer, spezifischer Wirksubstanzen am Strychnin-sensitiven GlyR durchgeführt.
4-Chlorpropofol
4-Iodpropofol
4-Brompropofol
Abb. 4 Strukturformeln der in para-Position substituierten Propofolderivate
2 Material und Methoden
2.1 Propofolderivate
Die Reinsubstanzen aller Propofolderivate sind in fester oder in Pulver-Form vorhanden und werden als Stammlösung (100 mM/1 M) in 99,9% Ethanol (EtOH) angesetzt. Ziel bei der Herstellung der Stammlösungen ist es, die Reinsubstanzen so in EtOH aufzunehmen, dass mindestens 200 µl Endvolumen (einer mindestens 100 mM Stammlösung) vorliegen, um ausreichend Material für etwa 20 Ansätze pro Phenolderivat zu gewährleisten. Die Propofolderivate wurden von Herrn Prof. Paul M. O´Neill (University of Liverpool, England) zur Verfügung gestellt. 4-Chlor, 4-Iod und 4-Brompropofol wurden als fertige Lösung in EtOH bezogen und bei -20°C in einem 2,5 ml Schraubröhrchen lichtdicht verschlossen und gelagert.
R1= Cl, I, Br
Abb. 5 Substituiertes Propofol in para-Position
Für die Patch-Clamp-Experimente werden die entsprechenden Verdünnungen der Propofolderivate in lichtdichten Schraubgläsern angesetzt und mindestens 30 min (erste Verdünnung) bzw. 15 min (alle weiteren Verdünnungen) auf einem Magnetrührer gemischt.
Für die Patch-Clamp-Experimente entspricht die maximal eingesetzte EtOH- Konzentration der am höchsten untersuchten Propofolderivatkonzentration (100 µM) und damit 17,15 mM EtOH, für die stärker verdünnten Testkonzentrationen ist die EtOH-Konzentration entsprechend niedriger. In vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass EtOH selbst in Konzentrationen von 34 mM keinen Effekt am Glycin-Rezeptor zeigt weder auf die Co-Aktivierung noch auf seine Direkt-Aktivierung (44). Der fehlende Effekt von 30 mM EtOH auf Glycin- Rezeptoren wurde ebenso anderweitig belegt (191).
2.2 DNA Amplifikation 2.2.1 Ausgangsmaterial
Die humane 1GlyR-cDNA des Klons hGly wird in pCIS2 (Invitrogen, San Diego, USA) kloniert und von Herrn Prof. Dr. med. Heinrich Betz (Max-Planck-Institut für Hirnforschung, Frankfurt am Main) zur Verfügung gestellt (41).
Die cDNA der humanen Glycin-Rezeptormutanten (1R271Q-, 1R271L-, 1S267I- und 1S267M-GlyR) liegt als Plasmid-DNA (in pcDNA1 amp) vor und wird von Prof.
Dr. med. Jeremy J. Lambert (Ninewells Hospital and Medical School, Dundee, Schottland) bereitgestellt.
Für die EGFP-cDNA wird der Expressionsvektor pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, USA) kommerziel erworben, der die EGFP-cDNA als Insert beinhaltet.
2.2.2 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente Zellen
Die Plasmid-DNA wird zunächst mittels Transformation in E.coli eingebracht, um im Anschluss auf speziellen Agar- und Selektionsmedien vermehrt zu werden (siehe 2.2.3). Als Transformation versteht man die Aufnahme von freier DNA in kompetente Bakterienzellen, im Gegensatz zur Transfektion (der Aufnahme von DNA in eukaryotische Zellen). Bakterienzellen werden dann als kompetent bezeichnet, wenn sie die generelle Fähigkeit haben, DNA aus dem sie umgebenden Medium aufzunehmen. Dies wird durch spezielle Methoden erreicht, die die Zellwand dieser Organismen temporär durchlässig für größere Moleküle (z.B. die Plasmid-DNA) machen. Bei den kompetenten Zellen handelt es sich hier um einen Sicherheitsstamm, der E.coli K12-Stamm LK111 () (192), dem die Pathogenitätsgene fehlen, so dass er im S1-Labor verwendbar ist.
Es gibt verschiedene Methoden um DNA zu transformieren, hier wird die physikalische Methode durch Hitzeschock angewandt. Zu Beginn werden 100 µl der kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut, dann wird 1 µl der Plasmid-DNA-Lösung (100 ng/µl) zu den kompetenten Zellen geben. Die kompetenten Zellen sollen während dieser Prozedur keinesfalls erwärmt werden. Der Ansatz wird mit der Pipette vorsichtig gemischt. Wegen der entstehenden Scherkräfte wird hier nicht auf- und abpipettiert, sondern es werden nur Kreisbewegungen mit der Pipettenspitze
vorgenommen. Danach wird der Ansatz für 30 min auf Eis inkubiert. Im Eisbad setzt sich die Plasmid-DNA auf die Löcher der porösen Zellwand der kompetenten Bakterien (mittels TSS-Methode (193) hergestellt). Im Anschluss wird der Transformationsansatz für 45 s bei 42°C in einen Thermoblock gesetzt und danach wieder 2 min auf Eis gestellt. Dieser Hitzeschock bewirkt, dass sich die Löcher in der Zellwand kurzfristig vergrößern und die DNA in die Zelle eintreten kann. Durch anschließendes Abkühlen verkleinern sich die Löcher und die Plasmid-DNA befindet sich im Inneren der Zelle. Für Plasmid-DNA mit anderer Antibiotikaresistenz als Ampicillin sind die vier folgendene Schritte nötig. Es werden 900 µl eines LB- Mediums (siehe 2.2.3 ohne Antibiotikum und auf 37°C vorgewärmt) zum Transformationsansatz gegeben. Der Ansatz wird für 1 h bei 37°C inkubiert und vorsichtig geschüttelt. Danach wird der Ansatz 1 min bei „low speed“ (6xg= 254 rpm) kurz anzentrifugiert. Beim Abnehmen des Überstands soll eine geringe Menge LB zurückbleiben. Das Zellpellet wird in mindestens 100 µl des LB-Mediums (ohne Antibiotikum) resuspendiert. Diese Schritte haben sich etabliert, um die kompetenten Zellen zunächst an ihr neues Medium zu gewöhnen. Für Bakterienzellen mit Plasmid-DNA und Ampicillinresistenz ist dies nicht erforderlich. 100 µl der Bakteriensuspension werden dann auf eine LB-Agarplatte (siehe 2.2.3) mit dem geeigneten Antibiotikum (z.B. 100 µg/ml Amp) gebracht und nach der 13-Strich- Methode zur Vereinzelung der Kolonien in der Bakterienkultur ausgestrichen. Die beimpfte Agarplatte wird mit dem Boden nach oben über Nacht für 16 h bei 37°C inkubiert. Es ist wichtig, die Agarplatten im Anschluss bis zum Animpfen im Kühlschrank zu lagen, um eine Vereinzelung der Klone zu gewährleisten.
2.2.3 Vermehrung mit Selektionsmedien
Plasmide können in Bakterien vermehrt werden. Die Selektion der erfolgreich transformierten Bakterien erfolgt mit Hilfe eines im Vektor enthaltenen Antibiotikaresistenz-Gens. Hierzu wird ein LB-Agar-Medium für 20 LB-Agarplatten angesetzt. LB und Agar werden entsprechend der Anleitung (siehe 9.2) in einem Erlenmeyerkolben abgewogen, mit destilliertem Wasser versetzt und anschließend mit Aluminiumfolie verschlossen. Der Kolben wird bei 121°C für 20 min autoklaviert.
Das autoklavierte LB-Medium wird in einem Wasserbad auf mindestens 55°C abgekühlt, damit im Anschluss das hitzeempfindliche Antibiotikum unter der Sterilbank hinzugegeben werden kann.
Antibiotikum Stammkonzentration Pipettiertes Volumen Endkonzentration Ampicillin 100 mg/ml 400 µl + 400 ml LB-Agar 100 µg/ml
Kanamycin 10 mg/ml 4 ml + 400 ml LB-Agar 100 µg/ml
Tabelle 1 LB-Agar und Antibiotikazusätze
Der Erlenmeyerkolben wird gut geschwenkt, um das Antibiotikum homogen zu verteilen. Dann wird je eine Petrischale zu 2/3 mit LB-Agar gefüllt und geschwenkt, um Luftblasenbildung zu vermeiden. Die LB-Agarplatten werden mindestens für 30 min durch Abkühlen unter der Sterilbank zum Aushärten gebracht. Die festen Agarplatten werden verschlossen und mit dem Boden nach oben in einer Plastiktüte bei 4°C gelagert (damit entstandenes Kondenswasser nicht auf den Agar gelangt).
Mindestens 30 min vor Beginn des Animpfens der bereits transformierten Bakterienzellen (siehe 2.2.2) beziehungsweise der zuvor hergestellten Glycerin- Stocks (siehe 2.2.5) werden die Agarplatten bei Raumtemperatur (RT) gelagert. Für Letzteres werden die eingefrorenen Glycerin-Stocks (-70°C) auf Eis zum Antauen gebracht und dann 50-100 µl eines Stocks beziehungsweise 100 µl des Transformationsansatzes auf die jeweilige Agar-Platte pipettiert. Der Glycerin-Stock wird umgehend wieder auf Eis gestellt. Die pipettierte Menge wird mit einer Impföse nach der 13-Strich-Methode auf dem Agar ausgestrichen. Für die Glycerin-Stock gilt es, zügig zu arbeiten, damit dieser so wenig wie möglich im aufgetauten Zustand verweilt und im Anschluss direkt wieder bei -70°C eingefroren werden kann. Die angeimpfte Agar-Platte wird mit dem Boden nach oben bei 37°C im Inkubator über Nacht bebrütet.
Nach Rezeptur (siehe 9.2) werden für den Folgetag LB-Flüssigkulturen im Erlenmeyerkolben angesetzt. Hierbei wird der pH auf 7,5 eingestellt (mit ca. 1ml NaOH (1mol/l) für eine 250 ml Kultur), um optimale physiologische Bedingungen für das Wachstum von E.coli zu gewähren. Im Anschluss werden die LB-Medien für 20 min bei 121°C autoklaviert. Nach Abkühlen der Lösung auf ≤55°C wird das jeweilige Antibiotikum unter der Sterilbank hinzugegeben.
