Übersicht der pharmakologischen Eigenschaften von Glycin an den untersuchten Rezeptoren

Berechnungen aus allen gemessenen Zellen Mittelwerte ± Standardabweichung

Berechnung nach Anpassung an die Hill-Funktion Mittelwerte ± Standardabweichung

Zellzahl EC50 nH EC20theoretisch EC20empirisch

₁-GlyR  n=7 37,7854,89 µM 0,821,11 7 µM 20 µM*

1S267I-GlyR  n=4 116,95105,04 µM 1,060,37 32 µM 30 µM

1R271Q-GlyR  n=6 26,3043,34 mM 0,991,54 7 mM 10 mM

1R271L-GlyR  n=5 102,1433,63 mM 1,751,62 47 mM 30 mM Tabelle 3 Pharmakologische Eigenschaften von Glycin an den untersuchten Rezeptoren

*(Der Wert für EC20empirisch ist aus den praktischen Experimenten zur Glycin-Konzentrations-Wirkungskurve berechnet. Die EC₂₀ wurde hier an 3 Zellen mit 3 µM, an 1 Zelle mit 10 µM, an 2 Zellen mit 30 µM sowie an 1 Zelle mit 40 µM erzielt).

∑zellzahl=Gesamtzellzahl; Imax=anfängliche maximal induzierte Glycin-Stromantwort;

I_max[%]=prozentuale Stromamplitude bezogen auf die Stromamplitude des ₁-Glycin-Rezeptors;

CImax=Glycin-Konzentration, die Imax erzielt; Anstiegszeit=Anstiegszeit für 10-90% der Maximalstromamplitude; EC50=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors;

nH=Hill-Koeffizient; EC20=submaximale Glycinkonzentration, die 20% der Maximalstromamplitude induziert; EC20theoretisch=Wert, der aus der Konzentrations-Wirkungskurve ermittelt ist;

EC20emipirisch=experimenteller Wert, der appliziert wird, um die EC₂₀ zu erzielen.

Die Unterschiede in der Gesamtzellzahl und der Anzahl der Zellen, die zur EC50 -Berechnung miteinbezogen werden, resultieren daraus, dass die Gesamtzellzahl auch Zellen beinhaltet, die einen zu hohen beziehungsweise zu niedrigen (5% und

40% der maximal induzierten Stromamplitude Imax) EC20-Wert aufweisen, die damit als Ausreisser gelten oder an denen nur 2 Testkonzentrationen appliziert werden können. Für eine vollständige Messreihe, bei der alle Testkonzentrationen appliziert werden können, ist ein durchgehend stabiler Seal erforderlich. Für die Messungen am 1-GlyR wird ersichtlich, dass bei dieser geringen Glycinkonzentration die Glycinempfindlichkeit stark von der jeweiligen Zelle abhängt und daher der Nullwert auf die Zelle abgestimmt eingestellt wird. Für die anderen Rezeptoren (S267I-, R271Q- und R271L-GlyR) ist es möglich mit der angegebenen empirischen

(experimentellen) EC20 einen zuverlässigen Nullwert zu induzieren. Der EC20-Wert dieser Rezeptoren liegt höher und ist zellunabhängig.

3.3 Co- und Direkt-Aktivierung mit 4-Chlor,- 4-Iod- und 4-Brompropofol am Wildtyp und den Mutanten

Abb. 20 4-Chlorpropofol Abb. 21 4-Iodpropofol Abb. 22 4-Brompropofol

3.3.1 1-GlyR

4-CHLORPROPOFOL

Coaktivierung mit 4-Chlorpropofol am 1-GlyR

Am 1-GlyR wird der co-aktivierende Effekt von 4-Chlorpropofol mit einer submaximalen Glycinlösung (EC20) im Konzentrationsbereich von 0,01 nM-1000 µM untersucht. Wie die repräsentativen Stromspuren zeigen, ist eine konzentrationsabhängige Potenzierung der Co-Aktivierung einer submaximalen Glycinkonzentration im Konzentrationsbereich von 0,015-15 nM für 4-Chlorpropofol messbar (siehe Abb. 23). Für die 1 mM Glycin-Kontrolllösung ist eine geringfügige Desensitisierung erkennbar.

Die mittlere Aktivierung für Glycin (EC20) liegt bei 28,0±11,4%, für die Co-Applikation von 1 nM 4-Chlorpropofol wird eine maximale Aktivierung von im Mittel 84,0±32,3 % als Stromantwort erzielt. Die mittlere maximale Potenzierung liegt bei Emax=268,8±176,2%. Diese Prozentzahlen (Übersicht siehe Tabelle 4) ergeben sich aus den in Kapitel 2.7 beschriebenen Formeln. Zur Berechnung der mittleren Aktivierung werden bei diesen Messungen am 1-GlyR die absoluten Stromamplituden auf die maximale Stromamplitude einer 1 mM Glycin-Kontrolllösung bezogen. Die Maximalamplitude der durch eine 1 mM Glycinlösung (CImax) induzierten Ströme liegt im Mittel bei Imax=778±295 pA. Aus der Konzentrations-Wirkungskurve ergibt sich eine EC50 von 0,08±0,04 nM mit nH=2,03±5,60 (siehe Abb.

24).

3µM Glycin

Abb. 23 Repräsentative Stromspuren zur Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α1-GlyR Gezeigt ist die Co-Aktivierung des Effekts einer submaximalen Glycinkonzentration von 3 µM (EC20) durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 0,015-15 nM, mit 1 mM Glycin als Kontrolllösung.

Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Chlorpropofol eine maximale Potenzierung im Konzentrationsbereich zwischen 1,5-15 nM erreicht (n=4).

0,0

0,00 0,01 0,10 1,00 10,00

4-Chlorpropofol [nM]

0,00 0,01 0,10 1,00 10,00

4-Chlorpropofol [nM]

Inorm

Co-Aktivierung (1) EC₅₀ 0,08 ± 0,04 nM n_H2,03 ± 5,60

Abb. 24 Konzentrations-Wirkungskurve für die Coaktivierung von 4-Chlorpropofol am α1-GlyR Die Symbole (Kreise) zeigen gemittelte Einwärtsströme aus 4 Experimenten (MW±SD), die durch eine submaximale Glycinlösung (EC₂₀) und die Testsubstanz im angegebenen Konzentrationsbereich induziert und auf den jeweils maximalen Chlorid-Einwärtsstrom (CImax=1 mM Glycin) normalisiert werden. Die durchgezogene Linie zeigt die Anpassung einer Hill-Funktion (Inorm=[1+(EC50/[C])^nH]^-1) an die Datenpunkte mit den in der Abbildung gezeigten gemittelten Parametern.

C_Imax=Konzentration, die die maximale Stromamplitude induziert; EC₅₀= Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; nH=Hill-Koeffizient; [C]=jeweilige Konzentration;

Inorm=Stromantwort, die direkt durch die Substanz bei der jeweiligen Konzentration ausgelöst wird, relativiert auf die maximale Stromantwort einer Messung; MW=Mittelwert, SD=Standardabweichung.

4-IODPROPOFOL

Co-Aktivierung mit 4-Iodpropofol am α¹-GlyR

Die Co-Aktivierung von 4-Iodpropofol mit einer submaximalen Glycinlösung (EC20) am 1-GlyR wird im Konzentrationsbereich zwischen 0,1 nM-100 µM untersucht. An den repräsentativen Stromspuren ist eine konzentrationsabhängige Potenzierung der Co-Aktivierung im Konzentrationsbereich zwischen 0,1-100 nM zu erkennen, mit einer maximalen Potenzierung im Bereich von 1-100 nM (siehe Abb. 25). Für die 1 mM Glycin-Kontrolllösung ist eine geringfügige Desensitisierung vorhanden. Die mittlere Aktivierung im genannten Konzentrationsbereich durch eine submaximale Glycinlösung (EC20) liegt bei 17,613,0%. Für die Co-Applikation von 10 nM 4-Iodpropofol ergibt sich eine maximale Aktivierung von im Mittel 53,220,1%. Die mittlere maximale Potenzierung liegt bei Emax=409,9±288,0%. Nach Anpassung der Hill-Funktion an die Messdaten zeigt die Konzentrations-Wirkungskurve eine EC50

von 0,23±0,07 nM mit nH 0,78±0,73 (siehe Abb. 26). Der Maximalstrom, induziert durch eine 1 mM Glycinlösung (CImax), liegt im Mittel bei Imax=484±295 pA.

500.ms

Abb. 25 Repräsentative Stromspuren zur Co-Aktivierung von 4-Iodpropofol am α¹-GlyR

Gezeigt ist die Co-Aktivierung des Effekts einer submaximalen Glycinkonzentration von 10 µM (EC20) durch 4-Iodpropofol im Konzentrationsbereich von 0,1-100 nM, mit 1 mM Glycin als Kontrolllösung.

Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Iodpropofol die maximale Potenzierung der durch eine 10 µM Glycinlösung induzierten Stromantwort im Bereich von 1-100 nM erkennbar (n=4).

0,0

0,000 0,001 0,010 0,100 1,000 10,000 100,000

4-Iodpropofol [nM]

0,000 0,001 0,010 0,100 1,000 10,000 100,000

4-Iodpropofol [nM]

Inorm

Co-Aktivierung (1) EC₅₀ 0,23 ± 0,07 nM n_H 0,78 ± 0,73

Abb. 26 Konzentrations-Wirkungskurve für die Coaktivierung von 4-Iodpropofol am α1-GlyR Die Symbole (Kreise) zeigen gemittelte Einwärtsströme aus 4 Experimenten (MW±SD), die durch eine 10 µM Glycinlösung und die Testsubstanz in den angegebenenen Konzentrationen induziert und auf den jeweils maximalen Chlorid-Einwärtsstrom (CImax= 1 mM Glycin) normalisiert werden. Die durchgezogene Linie zeigt die Anpassung einer Hill-Funktion (Inorm=[1+(EC50/[C])^nH]-1) an die Datenpunkte mit den in der Abbildung gezeigten gemittelten Parametern.

CImax=Konzentration, die die maximale Stromamplitude induziert; EC50=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; nH=Hill-Koeffizient; [C]=jeweilige Konzentration;

Inorm=Stromantwort, die direkt durch die Substanz bei der jeweiligen Konzentration ausgelöst wird, relativiert auf die maximale Stromantwort einer Messung; MW=Mittelwert, SD=Standardabweichung.

4-BROMPROPOFOL

Co-Aktivierung mit 4-Brompropofol am α1-GlyR

Die Co-Aktivierung der Substanz 4-Brompropofol wird am 1-GlyR im Konzentrationsbereich von 0,1 nM-100 µM untersucht. Die Maximalstrom, induziert durch eine 1mM Glycinlösung (CImax), liegt hierfür im Mittel bei Imax=1336994 pA.

Eine Potenzierung der durch eine submaximale Glycinlösung induzierten Stromantwort zeigt sich durch die Co-Applikation von 4-Brompropofol im Konzentrationsbereich von 0,1-1nM (siehe Abb. 27).

Die mittlere maximale Aktivierung für die Co-Applikation mit 4-Brompropofol (0,5 nM) liegt bei 44,915,3% im Vergleich zur EC20 von 23,511,8%. Aus der Konzentrations-Wirkungskurve ergibt sich eine EC50 von 0,090,15 nM mit nH 1,10,8 (siehe Abb.

28). Die mittlere maximale Potenzierung von 4-Brompropofol mit Emax=133,4±91,0%

ist insgesamt kleiner als diejenige für die Co-Aktivierung von Chlor- sowie 4-Iodpropofol am 1-GlyR (siehe Tabelle 4).

10µM Glycin in 10µM Glycin 4-Brompropofol

Abb. 27 Repräsentative Stromspuren zur Co-Aktivierung von 4-Brompropofol am α¹-GlyR Gezeigt ist die Co-Aktivierung des Effekts einer submaximalen Glycinkonzentration von 10 µM (EC20) durch 4-Brompropofol im Konzentrationsbereich von 0,1-1 nM, mit 1 mM Glycin als Kontrolllösung.

Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Brompropofol die maximale Potenzierung der durch eine 10 µM Glycinlösung induzierten Stromantwort im Bereich von 1 nM erkennbar, bei 0,1 nM wird in etwa die EC50 erreicht (n=6).

Abb. 28 Konzentrations-Wirkungskurve für die Co-Aktivierung von 4-Brompropofol am 1-GlyR Die Symbole (Kreise) zeigen gemittelte Einwärtsströme aus 6 Experimenten (MW±SD), die durch eine submaximale Glycinlösung (EC20) und die Testsubstanz in den angegebenenen Konzentrationen induziert und auf den jeweils maximalen Chlorid-Einwärtsstrom (C_Imax=1 mM Glycin) normalisiert werden. Die durchgezogene Linie zeigt die Anpassung einer Hill-Funktion (Inorm=[1+(EC50/[C])^nH]-1) an die Datenpunkte mit den in der Abbildung gezeigten gemittelten Parametern.

CImax=Konzentration, die die maximale Stromamplitude induziert; EC50=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; n_H=Hill-Koeffizient; [C]=jeweilige Konzentration;

Inorm=Stromantwort, die direkt durch die Substanz bei der jeweiligen Konzentration ausgelöst wird, relativiert auf die maximale Stromantwort einer Messung; MW=Mittelwert, SD=Standardabweichung.

Übersicht der pharmakologischen Eigenschaften der untersuchten halogenierten Propofolderivate am α¹-GlyR

Co-Aktivierung

Mittelwerte ± Standardabweichung Nach Hill-Funktion Aktivierung [%] Potenzierung Substanz

Zell-zahl EC50

[nM]

n_H EC_{20 Gly} Maximum E_max [%]

∑ zell-zahl

Imax [pA]

4-Chlor-propofol n=4 0,08±0,04 2,035,60 28,0±11,4 84,0±32,3 268,8±176,2 n=6 778295 4-Iod-

propofol n=4 0,23±0,07 0,780,73 17,6±13,0 53,2±20,1 409,9±288,0 n=8 484295

4-Brom-propofol n=6 0,09±0,15 1,100,77 23,5±11,8 44,9±15,3 133,4±91,0 n=10 1336994 Tabelle 4 Pharmakologische Eigenschaften von 4-Chlor-, 4-Iod-, 4-Brompropofol am α¹-GlyR EC₅₀=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; n_H=Hill-Koeffizient;

Aktivierung[%]=die durch den Agonisten induzierte absolute Stromamplitude bezogen auf den Mittelwert der Kontrollstromamplituden in Prozent; EC20Gly=submaximale Glycinkonzentration, die 20%

der Maximalstromamplitude induziert; Emax=maximaler Effekt beziehungsweise maximale Potenzierung der Stromantwort einer submaximalen Glycinlösung durch die jeweilige Testsubstanz;

∑zellzahl=Gesamtzellzahl; Imax=anfängliche maximal induzierte Glycin-Stromantwort.

Die Unterschiede in der Gesamtzellzahl und der Anzahl der Zellen, die zur EC50 -Berechnung miteinbezogen werden, resultieren daraus, dass die Gesamtzellzahl auch Zellen beinhaltet, die einen zu hohen beziehungsweise zu niedrigen (5% und

40% der maximal induzierten Stromamplitude Imax) EC20-Wert aufweisen, die damit als Ausreißer gelten oder an denen nur 2 Testkonzentrationen appliziert werden können. Für eine vollständige Messreihe, bei der alle Testkonzentrationen appliziert werden können, ist ein durchgehend stabiler Seal erforderlich.

3.3.2 1R271Q-GlyR 4-CHLORPROPOFOL

Co-Aktivierung mit 4-Chlorpropofol am ₁R271Q-GlyR

Am 1R271Q-GlyR wird die Co-Aktivierung durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 0,01-1000 µM gemessen. Die Maximalstromantwort mit im Mittel Imax=15690 pA, wird durch eine 300 mM Glycinlösung (CImax) erreicht. Es liegt keine Desensitisierung, wie bereits in 3.2.3. festgestellt, vor. Die Detektion dieser Ströme erfolgt mit einer größeren Verstärkung (20 mV/pA) im Vergleich zu den bisherigen Messungen mit einer Verstärkung von 5 mV/pA. Die abgebildeten repräsentativen Stromspuren veranschaulichen diese geringen Ströme und demonstrieren die damit verbundenen erschwerten Detektionsbedingungen (siehe Abb. 29). Eine konzentrationsabhängige Potenzierung für 4-Chlorpropofol ist im Konzentrationsbereich von 0,01-100 µM gezeigt. Bei 1000 µM 4-Chlorpropofol übersteigt die Stromamplitude teilweise die der Kontrolle (300 mM Glycin), dieser Konzentrationswert ist nicht mit in die Konzentrationswirkungskurve einbezogen. Es sei jedoch auf die hoch ausfallende Potenzierung in diesem Konzentrationsbereich hingewiesen. Die mittlere Aktivierung durch die submaximale Glycinkonzentration (EC20) liegt bei 17,2±5,2% und bei 97,0±63,3% durch die Co-Applikation von 4-Chlorpropofol (30 µM), mit Emax=260,1±101,2%. Hieraus ergibt sich die abgebildete Konzentrations-Wirkungskurve bei einer Potenzierung der Co-Aktivierung am

1R271Q-GlyR im niedrig mikromolaren Konzentrationsbereich mit einer EC50 von 1,21,4 µM mit nH 0,92,8 (siehe Abb. 30).

300mM Glycin

Abb. 29 Repräsentative Stromspuren zur Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α¹ R271Q-GlyR

Gezeigt ist die Co-Aktivierung des Effekts einer submaximalen Glycinkonzentration von 10 mM (EC20) durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 3-30 µM, mit 300 mM Glycin als Kontrolllösung.

Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Chlorpropofol eine starke Potenzierung der durch eine 30 mM Glycinlösung induzierten Stromantwort zwischen 3-30 µM detektierbar, wobei hier keine Desensitsierung erkennbar ist (n=5). Der duch eine 10 mM Glycinlösung induzierte Strom fällt an dieser abgebildeten Zelle sowie die insgesamt niedrigen Maximalströme gering aus.

0,0

0,00 0,01 0,10 1,00 10,00 100,00

4-Chlorpropofol [µM]

0,00 0,01 0,10 1,00 10,00 100,00

4-Chlorpropofol [µM]

Inorm

Co-Aktivierung (1R271Q) EC₅₀ 1,20 ± 1,39µM n_H 0,91 ± 2,81

Abb. 30 Konzentrations-Wirkungskurve zur Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α¹ R271Q-GlyR

Die Symbole (Kreise) zeigen gemittelte Einwärtsströme aus 5 Experimenten (MW±SD), die durch eine 10 mM Glycinlösung und die Testsubstanz in den angegebenen Konzentrationen induziert und auf den jeweils maximalen Chlorid-Einwärtsstrom (CImax=300 mM Glycin) normalisiert werden. Die durchgezogene Linie zeigt die Anpassung einer Hill-Funktion (Inorm=[1+(EC50/[C])^nH]^-1) an die Datenpunkte mit den in der Abbildung gezeigten gemittelten Parametern.

C_Imax= Konzentration, die die maximale Stromamplitude induziert; EC₅₀=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; nH=Hill-Koeffizient; [C]=jeweilige Konzentration;

Inorm=Stromantwort, die direkt durch die Substanz bei der jeweiligen Konzentration ausgelöst wird, relativiert auf die maximale Stromantwort einer Messung; MW=Mittelwert, SD=Standardabweichung.

Direkt-Aktivierung mit 4-Chlorpropofol am ₁R271Q-GlyR

4-Chlorpropofol wird am 1R271Q-GlyR im Konzentrationsbereich von 0,01-1000 µM untersucht. 4-Chlorpropofol zeigt im genannten Konzentrationsbereich eine geringfügige Direkt-Aktivierung bei 0,01-10 µM 4-Chlorpropofol. Die abgebildeten repräsentativen Stromspuren zeigen eine geringfügige Direkt-Aktivierung bei der Co-Applikation von 10 nM, 100 nM sowie 10 µM 4-Chlorpropofol (siehe Abb. 31). Diese repräsentative Zelle zeigt eine insgesamt höhere Maximalstromamplitude (343 pA) im Vergleich zu mittlerer Maximalstromamplitude (Imax=139±89 pA). An weiteren Zellen (n=5), die jeweils eine geringere Maximalstromamplitude  ähnlich der des Mittelwerts  aufweisen, ist keine Direkt-Aktivierung nachweisbar. Damit lässt sich ein Zusammenhang zwischen der Höhe der maximalen Stromamplitude und der Nachweisgrenze vermuten. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Schwierigkeiten in Verbindung mit der Detektion minimaler Effekte am 1R271Q-GlyR, die auf eine insgesamt stark reprimierte Glycinantwort und der damit einhergehenden reduzierten Nachweisgrenze zurückzuführen sind.

500.ms 100.pA

300mM Glycin

10nM

100nM

10µM

4-Chlorpropofol

500.ms 100.pA

500.ms 100.pA

300mM Glycin

10nM

100nM

10µM

4-Chlorpropofol

Abb. 31 Repräsentative Stromspuren zur Direkt-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α1 R271Q-GlyR

Gezeigt sind die repräsentativen Stromspuren zur Direkt-Aktivierung durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich 0,01-10 µM mit 300 mM Glycin als Kontrolllösung. Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich zwischen 0,01-10 µM eine geringfügige Direkt-Aktivierung feststellbar (n=3).

Übersicht der pharmakologischen Eigenschaften von 4-Chlorpropofol am α¹ R271Q-GlyR

Co-Aktivierung Substanz

Mittelwerte ± Standardabweichung Nach Hill-Funktion Aktivierung [%] Potenzierung

n=5 1,20±1,39 0,912,80 17,2±5,2 97,0±63,3 260,1±101,2 n=12 15690,2

Direkt-Aktivierung

n=5 keine Direkt-Aktivierung -

4-Chlor-propofol

n=3 min.Direkt-Aktivierung (10nM) 27,1±17,4

n=8 13989,2

Tabelle 5 Pharmakologische Eigenschaften von 4-Chlorpropofol am α1R271Q-GlyR EC50=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; nH=Hill-Koeffizient;

Aktivierung[%]=die durch den Agonisten induzierte absolute Stromamplitude bezogen auf den Mittelwert der Kontrollstromamplituden in Prozent; EC20Gly=submaximale Glycinkonzentration, die 20%

der Maximalstromamplitude induziert; E_max=maximaler Effekt beziehungsweise maximale Potenzierung der Stromantwort einer submaximalen Glycinlösung durch die jeweilige Testsubstanz;

∑zellzahl=Gesamtzellzahl; Imax=anfängliche maximal induzierte Glycin-Stromantwort.

Die Unterschiede in der Gesamtzellzahl und der Zellzahl, die zur EC50-Berechnung einbezogen werden, resultieren daraus, dass die Gesamtzellzahl auch Zellen beinhaltet, die einen zu hohen beziehungsweise zu niedrigen (5% und 40% der maximal induzierten Stromamplitude) EC20-Wert aufweisen, die damit als Ausreißer gelten oder an denen nur 2 Testkonzentrationen appliziert werden können. Für eine vollständige Messreihe, bei der alle Testkonzentrationen appliziert werden können, ist ein durchgehend stabiler Seal erforderlich.

3.3.3 1R271L-GlyR 4-CHLORPROPOFOL

Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am 1R271L-GlyR

Für 4-Chlorpropofol wird die Co-Aktivierung einer submaximalen Glycinlösung mit EC20=30 mM am 1R271L-GlyR im Konzentrationsbereich zwischen 0,01-1000 µM untersucht. Die Aktivierung durch die submaximale Glycinlösung (EC20) liegt bei 18,8±8,1% und durch die Co-Applikation von 100 µM 4-Chlorpropofol bei 39,2±14,0%. Die maximale Potenzierung liegt bei 152,8±102,4%.

Nach Anpassung der Hill-Funktion ergibt sich eine EC50 von 0,10±0,39 µM mit nH

0,7±0,6 (siehe Abb. 33).

Abb. 32 Repräsentative Stromspuren zur Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α¹ R271L-GlyR

Gezeigt ist die Co-Aktivierung des Effekts einer submaximalen Glycinkonzentration von 30 mM (EC20) durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 0,1-100 µM an 6 Zellen, mit jeweils 300 mM Glycin als Kontrolllösung. Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Chlorpropofol eine deutliche Potenzierung der durch eine 30 mM Glycinlösung induzierten Stromantwort zwischen 0,1-100 µM detektierbar, wobei hier keine Desensitsierung erkennbar ist (n=6).

0,0

0,000 0,001 0,010 0,100 1,000 10,000 100,000

4-Chlorpropofol [µM]

0,000 0,001 0,010 0,100 1,000 10,000 100,000

4-Chlorpropofol [µM]

Inorm

Co-Aktivierung (1R271L) EC50 0,10 ± 0,39 µM n_H 0,71 ± 0,61

Abb. 33 Konzentrations-Wirkungskurve zur Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α¹ R271L-GlyR

Die Symbole (Kreise) zeigen gemittelte Einwärtsströme aus 6 Experimenten (MW±SD), die durch eine 30 mM Glycinlösung und die Testsubstanz in den angegebenen Konzentrationen induziert und auf den jeweils maximalen Chlorid-Einwärtsstrom (CImax=300 mM Glycin) normalisiert werden. Die durchgezogenen Linien zeigen die Anpassung einer Hill-Funktion (Inorm=[1+(EC50/[C])^nH]^-1) mit den in der Abbildung gezeigten gemittelten Parametern.

CImax=Konzentration, die die maximale Stromamplitude induziert; EC50=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; nH=Hill-Koeffizient, [C]=jeweilige Konzentration;

Inorm=Stromantwort, die direkt durch die Substanz bei der jeweiligen Konzentration ausgelöst wird, relativiert auf die maximale Stromantwort einer Messung; MW=Mittelwert, SD=Standardabweichung.

Direkt-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am ₁R271-LGlyR

Für den 1R271L-GlyR wird 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 0,01-1000 µM untersucht. Für 1R271L-GlyR liegt die Maximalstromamplitude bei im Mittel Imax=290118 pA, induziert durch 300 mM Glycinlösung (CImax). Es liegt keine Direkt-Aktivierung durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 0,01-1000 µM vor (siehe Abb. 34).

Abb. 34 Repräsentative Stromspuren zur Direkt-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α1 R271L-GlyR

Gezeigt ist die Direkt-Aktivierung durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 0,01-1000 µM mit 300 mM Glycin als Kontrolllösung. Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich zwischen 0,01-1000 µM keine Direkt-Aktivierung feststellbar (n=7).

Übersicht der pharmakologischen Eigenschaften von 4-Chlorpropofol am α1R271LGlyR

Co-Aktivierung mit 4-Chlorpropofol Substanz

Mittelwerte ± Standardabweichung Nach Hill-Funktion Aktivierung [%] Potenzierung

n=6 0,10±0,39 0,710,61 18,8±8,1 39,2±14,0 152,8±102,4 n=17 441263

Direkt-Aktivierung

Tabelle 6 Pharmakologische Eigenschaften von 4-Chlorpropofol am α1R271L-GlyR EC50=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; nH=Hill-Koeffizient;

Aktivierung[%]=die durch den Agonisten induzierte absolute Stromamplitude bezogen auf den Mittelwert der Kontrollstromamplituden in Prozent; EC20Gly=submaximale Glycinkonzentration, die 20%

der Maximalstromamplitude induziert; E_max=maximaler Effekt beziehungsweise maximale Potenzierung der Stromantwort einer submaximalen Glycinlösung durch die jeweilige Testsubstanz;

∑zellzahl=Gesamtzellzahl; Imax=anfängliche maximal induzierte Glycin-Stromantwort.

Die Unterschiede in der Gesamtzellzahl und der Zellzahl, die zur EC50-Berechnung einbezogen werden, resultieren daraus, dass die Gesamtzellzahl auch Zellen beinhaltet, die einen zu hohen beziehungsweise zu niedrigen (5% und 40% der maximal induzierten Stromamplitude) EC20-Wert aufweisen, die damit als Ausreißer gelten oder an denen nur 2 Testkonzentrationen appliziert werden können. Für eine vollständige Messreihe, bei der alle Testkonzentrationen appliziert werden können, ist ein durchgehend stabiler Seal erforderlich.

3.3.4 1S267M-GlyR 4-CHLORPROPOFOL

Direkt-Aktivierung mit 4-Chlorpropofol am ₁S267M-GlyR

Am 1S267M-GlyR ist mit 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 1-1000 µM keine Direkt-Aktivierung feststellbar (siehe Abb. 35). Die Maximalstromamplitude, induziert durch eine 1 mM Glycinlösung (CImax), liegt im Mittel bei Imax=1311±688 pA.

500.ms 200.pA

1mM Glycin

1µM 10µM 30µM 100µM

300µM 1mM

4-Chlorpropofol

500.ms 200.pA

500.ms 200.pA

1mM Glycin

1µM 10µM 30µM 100µM

300µM 1mM

4-Chlorpropofol

Abb. 35 Repräsentative Stromspuren zur Direkt-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α¹ S267M-GlyR

Gezeigt ist die Direkt-Aktivierung durch 4-Chlorpropofol im Konzentrationsbereich von 1-1000 µM, mit 1 mM Glycin als Kontrolllösung. Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Chlorpropofol zwischen 1-1000 µM keine Direkt-Aktivierung erkennbar (n=8).

4-IODPROPOFOL

Direkt-Aktivierung mit 4-Iodpropofol am 1S267M-GlyR

4-Iodpropofol wird am 1S267M-GlyR im Konzentrationsbereich von 1-1000 µM untersucht. Die mittlere maximale Stromamplitude, induziert durch eine 1 mM Glycinlösung (CImax) liegt bei Imax=1662±1577 pA. Im genannten Konzentrationsbereich von 1-1000 µM 4-Iodpropofol ist keine Direkt-Aktivierung festzustellen (siehe Abb. 36).

500.ms 1.00nA

1mM Glycin

1µM 10µM 30µM

100µM 300µM 1mM

4-Iodpropofol

500.ms 1.00nA

500.ms 1.00nA

1mM Glycin

1µM 10µM 30µM

100µM 300µM 1mM

4-Iodpropofol

Abb. 36 Repräsentative Stromspuren zur Direkt-Aktivierung von 4-Iodpropofol am α¹ S267M-GlyR

Gezeigt ist die Direkt-Aktivierung durch 4-Iodpropofol im Konzentrationsbereich von 1-1000 µM, mit 1 mM Glycin als Kontrolllösung. Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Iodpropofol zwischen 1-1000 µM keine Direkt-Aktivierung erkennbar (n=4).

4-BROMPROPOFOL

Direkt-Aktivierung mit 4-Brompropofol am 1S267M-GlyR

4-Brompropofol wird am 1S267M-GlyR im Konzentrationsbereich von 1-1000 µM auf seine Direkt-Aktivierung untersucht. Die an diesen Zellen gemessene Maximalstromamplitude, induziert durch eine 1 mM Glycinlösung (CImax), liegt im Mittel bei Imax=18831574 pA. Wie an den repräsentativen Stromspuren ersichtlich, zeigt sich im genannten Konzentrationsbereich keine Direkt-Aktivierung für 4-Brompropofol am 1S267M-GlyR (siehe Abb. 37).

500.ms 500.pA

1mM Glycin

1µM

10µM 30µM 100µM 300µM

1mM

4-Brompropofol

500.ms 500.pA

500.ms 500.pA

1mM Glycin

1µM

10µM 30µM 100µM 300µM

1mM

4-Brompropofol

Abb. 37 Repräsentative Stromspuren zur Direkt-Aktivierung von 4-Brompropofol am α¹ S267M-GlyR

Gezeigt ist die Direkt-Aktivierung durch 4-Brompropofol im Konzentrationsbereich von 1-1000 µM, mit 1 mM Glycin als Kontrolllösung. Während der 2 s dauernden Applikation ist für 4-Brompropofol zwischen 1-1000 µM keine Direkt-Aktivierung erkennbar (n=5).

Übersicht der pharmakologischen Eigenschaften der untersuchten halogenierten Propofolderivate am α¹S267M-GlyR

Direkt-Aktivierung

Mittelwerte ± Standardabweichung Nach Hill-Funktion

Substanz

Zell-zahl

EC50 nH

Aktivierung [%] ∑zellzahl Imax [pA]

4-Chlorpropofol n=8 keine Direkt-Aktivierung - n=8 1311688 4-Iodpropofol n=4 keine Direkt-Aktivierung - n=4 16621577 4-Brompropofol n=5 keine Direkt-Aktivierung - n=5 18831574 Tabelle 7 Pharmakologische Eigenschaften von 4-Chlor-, 4-Iod-, 4-Brompropofol am α1 S267M-GlyR

EC50=Konzentration für eine halbmaximale Aktivierung des Rezeptors; nH=Hill-Koeffizient;

Aktivierung[%]=die durch den Agonisten induzierte absolute Stromamplitude bezogen auf den Mittelwert der Kontrollstromamplituden in Prozent; ∑zellzahl=Gesamtzellzahl; Imax=anfängliche maximal induzierte Glycin-Stromantwort.

3.3.5 1S267I-GlyR 4-CHLORPROPOFOL

Co-Aktivierung mit 4-Chlorpropofol am ₁S267I-GlyR

Für 4-Chlorpropofol wird die Co-Aktivierung im Konzentrationsbereich von 0,01-1000 µM am 1S267I-GlyR untersucht. An der repräsentativen Stromspuren ist im Konzentrationsbereich von 0,1-1000 µM eine konzentrationsabhängige Potenzierung erkennbar (siehe Abb. 38). Der durch eine 1 mM Glycinlösung (CImax) induzierte mittlere Maximalstrom liegt bei 479671 pA. Die Aktivierung am 1S267I-GlyR liegt für die submaximale Glycinlösung (EC20=30µM) im Mittel bei 23,6±4,8%, für die Co-Applikation von 1000 µM 4-Chlorpropofol bei 53,9±12,9%. Hieraus resultiert eine mittlere maximale Potenzierung von Emax=128,1±28,7%. Aus der Konzentrations-Wirkungskurve ergibt sich eine EC50 von 55,156,8 µM mit nH=0,70,6 (siehe Abb.

39).

Abb. 38 Repräsentative Strompspuren zur Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α1

Abb. 38 Repräsentative Strompspuren zur Co-Aktivierung von 4-Chlorpropofol am α1

Im Dokument In vitro Charakterisierung von Propofolderivaten an heterolog exprimierten Strychnin-sensitiven [alpha] 1-Glycin-Rezeptoren (Seite 56-95)