Transiente Transfektion durch Elektroporation .1 Theorie

Das Aufnehmen von DNA in eukaryotische Zellen wird als Transfektion bezeichnet.

Es ist beschrieben, dass es sich bei dem Transfer von Makromolekülen (wie der DNA) durch die Zellmembran mittels Elektroporation um einen elektrophoretisch

angetriebenen Prozess handelt. Bevor die DNA mit der Zellmembran interagiert, sammelt sie sich dort elektrophoretisch-getrieben durch das elektrische Feld an (195). Wie der Name Elektroporation andeutet, weisen einige Studien darauf hin, dass durch das Anlegen eines elektrischen Feldes vermutlich Poren in der Zellmembran gebildet werden, die hydrophile und damit sonst nicht-permeable Makromoleküle, wie die DNA, passieren lassen (196). Die Porengröße wird hierbei mit 0,39-5,8 nm angenommen, welches 0,01-0,1% der Membranfläche entspricht (197) . Diese Größe der Poren ist zu gering um die DNA passieren zu lassen, jedoch können sie auf diese Weise die Permeabilisierung der Membran begünstigen (198).

Andere Arbeiten belegen eine Umorientierung der Phospholipide, die die überwiegend hydrophobe Eigenschaft der Zellmembran prägen (199) (200) (201).

Berichte zur kurzweiligen Komplexbildung zwischen DNA und dem hydrophilen Teil positiv geladener Monoalkyl-Membranlipide wie beispielsweise den Sphingolipiden, weisen auf eine Adsorption der DNA und die anschließende Bildung von hydrophoben Poren hin (202). Eine mögliche endozytotische Internalisierung der DNA durch bestimmte Plasmamembran-Microdomainen (Lipid rafts (203) (204)), die diese Sphingolipide und Cholesterol enthalten, ist denkbar. Die genauen molekularen Mechanismen zwischen Nucleinsäuren und der Zellmembran sind noch nicht erforscht.

Bei der Elektroporation werden elektrische Feldimpulse durch ein Hochspannungspulsgerät induziert, die in hochleitenden Porationsmedien für eine Pulsdauer im Millisekundenbereich an darin enthaltenden Zellen appliziert werden.

Die angelegte elektrische Feldstärke E bewirkt eine Veränderung des Ruhemembranpotentials der Zellen und muss einen für verschiedene Zelltypen jeweils spezifischen Schwellenwert (für eukaryotische Zellen liegt der Wert bei 1 V/cm (205)) übersteigen, damit es zur Permeabilisierung der Membran kommt. Das durch die angelegte elektrische Potentialdifferenz entstehende Transmembran-potential Vm ist abhängig von Form und Größe der Zelle: Vm=f E rcos (206).

Dementsprechend ist die anzulegendene elektrische Feldstärke auf den Zelltyp abzustimmen, um eine geeignete Permeabilisierung der Membran zu erreichen. Der Formfaktor f beschreibt die Auswirkung der Zelle auf die extrazelluläre Feldverteilung. Für das Vm zweier verschieden großer Zellen ist E umso größer desto kleiner der Zellradius r ist. Die Höhe der elektrisch induzierten Feldstärke

bestimmt den Bereich der zu permeablisierenden Membran. Die Pulsdauer  und die Anzahl der elektrischen Pulse definieren dagegen das Ausmaß der Permeablisierung. Die Pulszeit  (gemessen in Millisekunden) beginnt, wenn das Maximum E0 der elektrischen Feldstärke erreicht ist und endet, wenn das elektrische Feld auf den Wert e^-1 (0,368) des Anfangwertes E0 abgefallen ist (207).

Es hat sich gezeigt, dass eine lange Pulsdauer im Millisekundenbereich bei geringer elektrischer Feldstärke zu einem hohen Transfektionserfolg führt (208) (209) (210) Vermutlich besteht ein Zusammenhang zwischen dem Anlegen eines elektrischen Pulses und der kurzzeitigen Ausbildung von Komplexen zwischen DNA und der Zellmembran. Hierbei ist die Stabilität dieser Komplexe und der elektrophoretisch angetriebene Transfer abhängig von der Pulsdauer, daher ist eine lange Pulsdauer (20-40 ms) von Vorteil (210) (211) (195).

Um den Zelltod zu vermeiden, ist es demnach besonders wichtig, die geeigneten physikalischen, aber auch chemischen Parameter für die jeweilige Elektroporation zu wählen. Als chemischer Parameter ist die Zusammensetzung des Elektroporationspuffers ausschlaggebend für das Überleben der permeabilisierten Zellen. Die Zugabe von MgSO4 zum Elektroporationspuffer hat sich als positiv für die Transfektionseffizienz erwiesen. Mg²⁺-Ionen werden in diesem Zusammenhang als positiv geladener „Klebstoff“ zwischen dem negativ geladenen Äußerem der Zelle und dem Polyanion DNA beschrieben (209) und scheinen die Osmolarität des Suspensionsmediums (Elektroporationspuffer) zu stabilisieren und die Transfektions-effizienz zu erhöhen (212).

Der Elektroporationsprozess setzt sich aus 3 Phasen zusammen:

1. Vor dem Anlegen des elektrischen Felds: die Zellmembran bildet eine Barriere und unterbindet die Aufnahme von hydrophilen Molekülen.

2. Während des elektrischen Pulses: nach Überschreiten eines Schwellenwertes (s.o.) steigt das Membranpotential an und induziert die Bildung von transient permeablen Strukturen, die den Austausch von Molekülen erlauben. Die negativ geladene DNA migriert in die der Kathode zugewandeten Seite der Plasmamembran und wird an speziellen Domänen eingeschleust.

3. Nach dem elektrischen Puls: nach dem erneuten Abdichten der Zelle sind die aufgenommen Moleküle in der Zelle enthalten. Die Plasmid-DNA diffundiert durch das Zytoplasma zum Nucleus, die Genexpression findet statt (213).

Hat die DNA die Zellmembran passiert, so liegt sie im Zytoplasma vor und kann sich vermutlich elektrophoretisch getrieben Richtung Nucleus bewegen, wo sie in Kern-DNA eingebaut und hiermit über einen längeren Zeitraum exprimiert wird (stabile Transfektion). Wird sie nicht in die Kern-DNA eingebaut, liegt sie als Plasmid-DNA frei im Zytoplasma vor und verweilt hier nur kurzweilig zur Expression innerhalb der Zelle (transiente Transfektion). Für die heterologe Expression der hier zu untersuchenden rekombinanten membranständigen Rezeptorproteine erwies sich die Methode der Elektroporation zur transienten Transfektion als effektiv und zuverlässig (214).

2.4.2 Vorgehensweise

HEK 293-Zellen werden für die Elektroporation unter dem Mikroskop ausgewählt.

Nach Entfernen des Mediums werden die Zellen mit 3 ml PBS gewaschen und anschließend mit 2 ml 0,05% Trypsin mit 0,02% EDTA für 3 min bei 37°C vom Flaschenboden gelöst. Die Reaktion wird mit 3 ml Medium (siehe 9.3) abgestoppt und die Zellen resuspendiert. Das Splitten der Zellen erfolgt im Verhältnis 1:10 (siehe 2.3), wobei 15 ml frisches Medium zur 75 cm²-Zellkulturflasche hinzugegeben werden. Die restlichen 4,5 ml werden in einem 15 ml Röhrchen bei 1000 rpm (173,6xg) und 12°C für 5 min zentrifugiert. Während der Zentrifugierzeit werden 5 µg der Rezeptor-cDNA mit 2,5 µg EGFP-cDNA in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß gemischt. Die EGFP-cDNA dient als Kontrolle für die Transfektionseffizienz (215) (216). Das Zellpellet wird für die Transfektion eines Rezeptors mit 400 µl Elektroporationspuffer (50 mM K2HPO4, 20 mM Kaliumacetat, pH 7.35) und 10 µl MgSO4 (1M MgSO4) aufgenommen und resuspendiert. Anschließend werden 400 µl dieser Zellsuspension zum Rezeptor-EGFP-cDNA-Gemisch gefügt, gemischt und in die Elektroporationsküvette gegeben. Die Elektroporation erfolgt mit 4 mm Elektroporationsküvetten (Peqlab) mit Hilfe eines Elektroporators (Equibio) bei 250 V, 750 µF, 335  und einem angelegten elektrischen Feld von E= 625 V/cm sowie einer Pulszeit  von 15-30 ms. Die elektroporierten Zellen werden anschließend auf einer 24 Well-Platte ausgesät, die pro Well etwa 0,75 ml Medium enthält. Dazu werden pro Well 20-60 µl der Zellensuspension zügig auf Glasdeckgläser (Ø 12 mm) pipettiert.

Das pipettierte Zellsuspensionsvolumen ist abhängig von der Größe des Zellpellets.

Die Deckgläser wurden zuvor für 4 h bei 180°C sterilisiert. Für den Fall, dass die Zellen schlecht an der Glasoberfläche anheften, wurden die Deckgläser mit 100 µl Kollagen oder Poly L-Lysin pro Deckglas für 5 min bei 37°C inkubiert, danach mindestens 20 min unter der Sterilbank luftgetrocknet. Die befüllte 24-Well-Platte wird für 16 h (-24h) bei 37°C in einem 5%CO2/95%Luft-Inkubator kultiviert, bis die ersten Patch-Clamp-Messungen erfolgen.