9 Anhang Materialien und Reagenzien
9.5 Komponenten für die Patch-Clamp-Experimente (siehe 2.5)
Glasspritze, Gasdichte Mikroliterspritze,10ml, MS*GLLX00, Art.Nr.E136.1, Roth Einmal-Injektions-Kanüle, Sterican®, 0,90x 40 mm BL/LB, 20Gx1 ½ , REF 4657519 B.Braun Melsungen
Materialien für das Ansetzen der Substanzen Analysenwaage, Analytik AC 210 P, Sartorius
Mehrstellenmagnetrührer, RO 15 power, IKAMAG, 5720207, Omnilab Magnetrührer 30*7 mm Tefllon, 5197530, Omnilab
Aluminiumfolie, Spatel
125 ml Glasflaschen, Biochrom KG, Berlin Bechergläser, Duran Schott
Pipettus, Hirschmann Laborgeräte /Pileusball Omnilab Pipetten, Pipettenspitzen
Serological pipette 5/10 ml, No. 86.1253.001/No.86.1254.001, Sarstedt serological pipette, Nümbrecht
Serological pipette 50 ml, #768180, Cellstar, Greiner bio-one 10 mM Glycinlösung:
0,0115 g Glycin (Mw=111,5 g/mol, G-2879, Lot 25H5723, 100 g, Sigma) +10 ml P1-Puffer (filtriert)
1 mM Glycin-Kontrolllösung 45 ml P1 Puffer (filtriert) +5 ml 10mM Glycinlösung
+Spatelspitze blauer Farbstoff (Brilliant-Säure-Grün), mit Spatel gut mischen
Brilliant-Säure-Grün (Lebensmittelfarbstoff E142, Eurocert Green S, Ref.Nr.2517, Batchnr.06161M1, Goldmann)
Konzentrat Bad-Lösung (5 l)
NaCl (Mw=58,44 g/mol, 0278, 1 kg, J.T.Baker) 473,4 g [1,62 M]
KCl (Mw=74,55 g/mol,1.04936.0500, 500 g, Merck) 19,8 g [53,12 mM]
Na2HPO4 (Mw=142,0 g/mol, S-3264, 250 g, Sigma) 6,0 g [8,45 mM]
KH2PO4 (Mw=136,09 g/mol, 1.04873, 1 kg, Merck) 1,5 g [2,2 mM]
Hepes (Mw=238,2 g/mol, 25245, 1 kg, Serva) 178,5 g [149,87 mM]
D-Glucose (Mw=180,16 g/mol, G7528, 250 g, Sigma) 55 g [61,06 mM]
->à 500 ml eingefroren (-20°C) Bad-Lösung /P1-Puffer (5 l), pH 7,4:
500 ml Bad-Lösung-Konzentrat +4500 ml Aqua dest.
mit NaOH auf pH= 7,4 einstellen (Osmolarität: 290-300 mOsmol) +1,11 g CaCl2 [2mM] (Mw= 110,99 g/mol, C1016, 100 g, Sigma) Intrazellularlösung (Pipettenlösung) 1l, pH 7,3:
KCl (Mw=74,55 g/mol, 1.04936.0500, 500 g, Merck) 10,437 g [140 mM]
EGTA (Titriplex, Mw=380,35 g/mol, 1.08435.0025, 25 g, Merck) 4,183 g [11 mM]
Hepes (Mw=238,2 g/mol, #25245, 1 kg, Serva) 2,382 g [10 mM]
D-Glucose (Mw=180,16 g/mol, G7528, 250 g, Sigma) 1,982 g [11 mM]
MgCl-Hexahydrat (Mw=203,30 g/mol, 5832.1000, 1 kg, Merck) 0,4066 g [2 mM]
CaCl2 (Mw= 110,99 g/mol, C1016, 100 g, Sigma) 0,111 g [1 mM]
Ad 1 l Aqua dest. mit KOH auf pH=7,3 einstellen (Osmolarität: 290-300 mOsmol) Kaliumchloridlösung 3 mol/l, 1.04818.0100, 100 ml, Merck
Kalilauge 1 mol/l, 1.09108.1000, 1 l, Merck Salzsäure 1 mol/l, 1.095057.1000, 1 l, Merck Natronlauge 1 mol/l, 1.09137.1000, 1 l, Merck
Folded Filters (Qual.), Grade: 3 hw, Dia 240 mm, 65 g/m², 5049406, Omnilab Osmometer, Jürgens roebling
Komponenten für den Patch Clamp Messstand
Elektrodendraht, AG-8W, Science Products GmbH, Hofheim
Aufbewahrungslösung für die Elektrodendrähte (15% FeCl3 in 10% HCl):
15 g FeCl3 (Eisen (III)-chlorid FeCl3, wasserfrei zur Synthese, Mw=162,21 g/mol, 803945, Lot 44015562, 500 g, Merck)
+ 40 ml 25% HCl (Mw=36,45 g/mol, 1.00316.1000, Lot 7111916816,1 l, Merck) ad 100 ml H2O
Glaskapillaren, Borosilicate glass capillaries, 1,5 mm O.D.1,17 mm I.D., No.30-0066 GCI50TF-10, Havard Part
DMZ-Universal Puller, Serial.no:26256/0108, Typ:FAN, Volt:230, Amp:2.0, Zeitz-Instrumente GmbH
Heizdrähte: Filaments 3.0 mm, Zeitz-Instruments
Kanüle zur Spinal-Anästhesie (zum Befüllen der Glaskapillaren), Atraucan, 04504739, B.Braun Melsungen
Cellstar Tissue culture dishes, Cat.no.627160, Greiner bio-one Pasteurpipetten aus Polyethylen, #1-6155, Neolab
Fisherbrand 25 mm Syringe Filter 0,22 µm, MCE, sterile, Cat.no.09-719A, Lot R8DN57934, Fisher Scientific
Infusionsschlauch Intrafix Primeline Comfort, 180 cm, 15 µm Filter, 4062981L, B.Braun Melsungen AG
Infusionslösung Ringer-Acetat-Lösung, 500 ml, Zul-Nr.1839.99.99 Ch.-B.7214°242 B.Braun Melsungen AG
Messkammer
Glaskapillarröhrchen in der Messkammer, AD 0,5 mm , ID 0,15 mm, Artikelnr.1409271, Hilgenberg GmbH
10, 20 ml Spritze, Injekt, Einmalspritze, REF 4606108V and 4606295V, B.Braun Melsungen
Applikationssschlauch, 30M Tube Tygon S54HL (ID 0,25 mm, AD 0,76 mm)
50 ml Spritze, Perfusor-Spritze OPS, Einmalspritze, REF 8728810F, ohne Kanüle verwendet, B.Braun Melsungen
Pumpe, Reglo-Z, Ismatec Manometer, 08W30, Rexroth
Piezokristall-gesteuerter Ticker, Ticker Amplifier, D.Beyer Instrumente Pipettenhalter, D=1,5 mm, MTE001, Science Products
Vorverstärker Patch Clamp EPC9 und ab 20.10.08 Patch Clamp EPC10 USB, HEKA Verstärker Patch Clamp EPC9 und ab 20.10.08 Patch Clamp EPC10 USB, HEKA Invertiertes Mikroskop mit UV-Lampe,Axiovert 10,Zeiss, UV-LampeZeissVHW 50f-2b Mikromanipulator, Narishige, Japan
Lupe (Stereo-Makroskop), M5-93979, Heerbrugg, Wild, Switzerland Farradaykäfig
Silikon-Schläuche, Dreiwegehähne Lötkolben, WTCP-S, Weller
Lötzinn Sn60
Pulse/Pulsefit Software (Jan 2007-Okt 2008), HEKA Elektronics Patchmaster/Fitmaster (seit Okt 2008), HEKA Elektronics
Schriftenverzeichnis
PUBLIKATIONEN
de la Roche, J, Buchholz V, Krampfl K, Haeseler G, Leuwer M, Dengler R, Ahrens J.
4-chloropropofol enhances effectively the reduced chloride currents of mutated glycine receptors in human hereditary hyperekplexia (Manuskript eingereicht)
Ahrens J, de la Roche J, Foadi N, Krampfl K, Leuwer M, Haeseler G. A novel class of positive allosteric modulators of strychnine-sensitive glycine receptors.
Anästhesiologie & Intensivmedizin 2009; 50 Supplement 7:421-463.
Demir R, Leuwer M, de la Roche J, Krampfl K, Foadi N, Karst M, Dengler R, Haeseler G, Ahrens J. Modulation of glycine receptor function by synthetic cannabinoid HU210 Pharmacology 2009;83(5):270-4.
Ahrens J, Demir R, Leuwer M, de la Roche J, Krampfl K, Foadi N, Karst M, Haeseler G. The nonpsychotropic cannabinoid cannabidiol modulates and directly activates
1- and 1β-glycine receptor function Pharmacology 2009; 83(4):217-22.
Ahrens J, Leuwer M, de la Roche J, Foadi N, Krampfl K, Haeseler G.
The non-anaesthetic propofol analogue 2,6-di-tert-butylphenol fails to modulate GABA(A) receptor function Pharmacology 2009; 83(2):95-8.
Ahrens J, Leuwer M, Demir R, Krampfl K, de la Roche J, Foadi N, Karst M, Haeseler G. Positive allosteric modulatory effects of ajulemic acid at strychnine-sensitive glycine 1- and 1β-receptors Naunyn Schmiedenbergs Arch. Pharmacol. 2009; 379 (4): 371-8.
VORTRÄGE
de la Roche J. Erbliche Hyperekplexie Ein Defekt des inhibierenden Glycin-Rezeptors /Vorstellung der abgeschlossenen Ergebnisse zur R271Q-Mutante
Anästhesiologische Kollequien im Rahmen der Frühfortbildung der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Hannover, 10. August 2009
de la Roche J. Hyperekplexie Ein Defekt des inhibierenden Glycin-Rezeptors Unincorporated Channel Meeting (UCM 2008), Berlin, 20. September 2008 POSTERPRÄSENTATIONEN
de la Roche J, Buchholz V, Foadi N, Pilawski I, Krampfl K, Dengler R, Haeseler G, Leuwer M, Ahrens J.
Charakterisierung von 4-Chloropropofol an „startle disease“ mutierten 1R271L- und
1R271K-Glycin-Rezeptoren
Deutscher Anästhesie Kongress (DAC 2010), Nürnberg, 19.-22. Juni 2010, PO 4.4.5 Buchholz V, Foadi N, Haeseler G, Leuwer M, Campos de Oliveira Ulrich R, de la Roche J, Krampfl K, Dengler R, Ahrens J.
Blockade des spannungskontrollierten Natriumkanals NaV1.2 durch die topischen Antiseptika Hexylresorcinol, Amylmetacresol und Dichloro-Benzylalkohol
HAI 2009-Hauptstadtkongress der DGAI für Anästhesiologie und Intensivtherapie, Berlin, 17.-19. September 2009
Buchholz V, Foadi N, Haeseler G, Leuwer M, Campos de Oliveira Ulrich R, de la Roche J, Krampfl K, Dengler R, Ahrens J.
Blockade des spannungskontrollierten Natriumkanals NaV1.2 durch die topischen Antiseptika Hexylresorcinol, Amylmetacresol und Dichloro-Benzylalkohol
HAI 2009-Hauptstadtkongress der DGAI für Anästhesiologie und Intensivtherapie, Berlin, 17.-19. September 2009
de la Roche J, Krampfl K, Haeseler G, Leuwer M, Buchholz V, Foadi N, Campos de Oliveira Ulrich R, Dengler R, Ahrens J.
Potenzierung der Co-Aktivierung durch Chloropropofol am Startle disease-assozierten 1R271Q-Glycin-Rezeptor
HAI 2009-Hauptstadtkongress der DGAI für Anästhesiologie und Intensivtherapie, Berlin, 17.-19. September 2009
Foadi N, Campos de Oliveira Ulrich R, Buchholz V, de la Roche J, Krampfl K, Dengler R, Leuwer M, Haeseler G, Ahrens J. Koapplikation der topischen Antiseptika Amylmetacresol und Dichlorbenzylalkohol am spannungsgesteuerten neuronalen Natriumkanal
HAI 2009-Hauptstadtkongress der DGAI für Anästhesiologie und Intensivtherapie, Berlin, 17.-19. September 2009
Campos de Oliveira Ulrich R, Foadi N, Buchholz V, de la Roche J, Krampfl K, Dengler R, Leuwer M, Haeseler G, Ahrens J.
Effekte der Koapplikation der topischen Antiseptika Amylmetacresol und Dichlorbenzylalkohol am spannungsgesteuerten neuronalen Natriumkanal Deutscher Anästhesie Kongress (DAC 2009), Leipzig, 11.-14. Mai 2009, Abstract-CD PO 3.9.8
Ahrens J, Demir R, Foadi N, de la Roche J, Leuwer M, Haeseler G.
Das Cannabinoid Cannabidiol beeinflusst die glycinerge Inhibition
Deutscher Anästhesie Kongress (DAC 2009), Leipzig, 11.-14. Mai 2009, PO 3.9.11 Ahrens J, de la Roche J, Foadi N, Buchholz V, Leuwer M, Krampfl K, Haeseler G.
Wirkungsvolle Modulation von Glycin-Rezeptoren durch halogeniertes Propofol.
Deutscher Anästhesie Kongress (DAC 2009), Leipzig, 11.-14. Mai 2009, PO 3.9.12 de la Roche J, Krampfl K, Leuwer M, Haeseler G, Ahrens J.
Chloropropofol moduliert effektiv den bei Hyperekplexie mutierten 1R271Q Glycin-Rezeptor Deutscher Anästhesie Kongress (DAC 2009), Leipzig, 11.-14. Mai 2009, PO 3.9.2
Demir R, de la Roche J, Ahrens J, Krampfl K, Leuwer M, Haeseler G.
The anaesthetic steroid alphaxalone activates inhibitory glycine receptors Brainstorming IV-Neuroscience Congress, Hannover, 26.-27. September 2008
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 7 und 8
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel
In vitro Charakterisierung von Propofolderivaten an heterolog exprimierten Strychnin-sensitiven 1-Glycin-Rezeptoren
in der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. med. Wolfgang Koppert in Zusammenarbeit mit der Klinik für Neurologie und Neurophysiologie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. med. Reinhard Dengler mit Betreuung durch Frau Prof. Dr. med. Gertrud Haeseler und Herrn Prof. Dr. med.
Klaus Krampfl ohne sonstige Hilfe selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort angeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe bisher an keiner in- oder ausländischen Medizinischen Fakultät ein Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.
Für die Veröffentlichung der Ergebnisse dieser Dissertation wird zurzeit das Manuskript für eine Publikation eingereicht.
Hannover, den 20.11.2009
(Jeanne de la Roche)
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. med. Gertrud Haeseler für die engagierte Supervision dieser Arbeit und die konstruktiven wissenschaftlichen Diskussionen. Ihre stets hilfreiche und fortwährende Unterstützung sowie ihre innovativen Ideen lieferten eine gute Grundlage für diese Dissertation. Ich danke ihr, Herrn Prof. Dr. med. Martin Leuwer und Herrn Prof. Dr. med. Siegfried Piepenbrock vielmals für die Überlassung des Themas dieser Arbeit. Ausdrücklich möchte ich mich auch bei Herrn PD Dr. med. Jörg Ahrens für die Einarbeitung in das komplexe Gesamtsystem der Patch Clamp Technik bedanken sowie für seine fachlichen Anregungen, seinen kompetenten Rat bei Fortführung der Projektleitung, seine durchgehende Ansprechbarkeit und seinen Einsatz, ohne diesen diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Einen ganz herzlichen Dank richte ich an Herrn Prof. Dr. med. Klaus Krampfl und Herrn Prof.
Dr. med. Reinhard Dengler für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die Möglichkeit, auf diese Weise vielfältige Kontakte zu einer offenen, interaktiven und internationalen Arbeitsgruppe der Klinik für Neurologie und Neurophysiologie der MHH knüpfen zu dürfen.
Herrn Prof. Dr. med. Klaus Krampfl danke ich vielmals für seinen richtungsweisenden Rat bei elektrophysiologischen und neurobiologischen Fragestellungen.
Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. med. Wolfgang Koppert und Herrn Prof. Dr. med. Gregor Theilmeier für ihre Hilfestellung und Anregungen auf Kongressen, der Abteilung für Experimentelle Anästhesie sowie Frau Heide Schulze für die immer freundliche Hilfe. Ich möchte mich auch bei der Abteilung für Biophysikalische Chemie bedanken, deren Kooperation und fachliche Hilfe hervorzuheben ist. Meinen Dank möchte ich auch den Gutachtern aussprechen, die sich Zeit für die Beurteilung dieser Arbeit genommen haben.
Nicht zu vergessen ist der fast tägliche Kontakt zu Herrn Andreas Niesel und Herrn Jobst Kilian bei Fragen zur EDV oder zur Technik. Vielen Dank für die ausdauernde, herausragende technische Expertise.
Meinen Laborkollegen, vor allem Vanessa Buchholz, Daniela Ragancokova, Yunping Song und Sarah Knippenberg, aber auch Regina de Campos Oliveira Ulrich und Frau Dr. med.
Nilufar Foadi danke ich für die angenehme, freundschaftliche Arbeitsatmosphäre und ihre große Hilfsbereitschaft.
Abschließend möchte ich mich ganz besonders bei meiner Familie sowie meinen Freunden bedanken, die mich auch in schwierigen Phasen wieder aufgemuntert haben und immer ein offenes Ohr für mich hatten.