DNA-Präparation

Die Plasmid-DNA–Isolierung erfolgt mit einem QIAGEN-Kit, es handelt sich um eine Maxipräparation (>100 ml).

Zur Herstellung der Glycerinstocks wird 1 ml der LB-Flüssigkultur (E.coli inkl.

Plasmid-DNA) abgenommen. Der restliche Inhalt der Bakteriensupension aus den 250 ml Erlenmeyerkolben wird in die Zentrifugengefäße gegeben und für die Zentrifuge austariert (mit demselben LB-Medium). Die Bakteriensuspension wird dann für 10 min bei 6000xg und 4°C zentrifugiert, so dass sich ein Zellpellet am Boden der Gefäße bildet.

In der Zwischenzeit werden das Eisbad und die Säulen vorbereitet, sowie der Neutralisationspuffer (Lösung P3) in dem Eisbehälter vorgekühlt. Bei den Säulen handelt es sich um Anionenaustauscher-Resin-Säulen, die die negativ geladene DNA bei niedrigen Salzkonzentrationen binden. 150 ml Bechergläser werden jeweils darunter als Auffangbehälter positioniert. Kleine Zentrifugenröhrchen werden beschriftet und jeweils ein Glastrichter mit einem Filter darauf auf jedes Röhrchen gesetzt.

Nach dem ersten Zentrifugierschritt werden die Zentrifugiergefäße aus der Zentrifuge genommen und der Überstand in die Erlenmeyerkolben zurückgegeben. Dieser Überstand, der überwiegend Medium und Stoffwechselprodukte enthält, wird als Abfall autoklaviert. Bei mehreren Zellpellets (z.B. 500 ml Bakteriensuspension für einen Rezeptor) muss die Bakteriensuspension auf zwei Zentrifugengefäße aufgeteilt werden und die Zellpellets mit derselben DNA werden in einem kleinen Zentrifugenröhrchen gepoolt. Zu dem Zellpellet werden je 10 ml Lysepuffer (Lösung

P1) hinzugegeben und mit einem Enzym-Spatel und einer 1000 µl Pipette gut resuspendiert (20-30x). Der Resuspensionspuffer ist ein Tris-Cl-Puffer (pH 8,0), welcher EDTA (destabilisiert die Bakterienzellwand durch Komplexierung zweiwertiger Kationen (Mg²⁺u.Ca²⁺)) und RNAase A enthält, wobei letzteres die bakterielle RNA degradiert. Nun werden je Pellet 10 ml (Lösung P2) hinzugegeben, die Röhrchen mit Parafilm abgedichtet und diese 4-5x leicht geschwenkt. P2 enthält NaOH und 1% SDS. Während P1 überwiegend der RNAase-Entfernung dient, ist der alkalische Lysepuffer P2 für die Denaturierung von genomischer DNA und Proteinen verantwortlich (194). SDS löst hierbei die Phospholipide und Proteinkomplexe in der Zellwand. Anschließend lässt man das Gemisch maximal 5 min stehen, damit die Zellen denaturieren und die Plasmid-DNA freigesetzt wird.

Danach werden 10 ml Neutralisationspuffer (Lösung P3) hinzugegeben, das Gemisch wiederum 4-5x geschwenkt und dann für 20 min ins Eisbad gesetzt. P3 besteht aus einem Kaliumacetat-Puffer (pH 5,5) und führt mit dem P1+P2-Gemisch zum Ausfall von Kaliumdodecylsulfat. Hierbei trennen sich die genomische DNA und die Proteine von den Plasmiden. Die denaturierten Proteine und genomische DNA fallen im Gegensatz zu den zwar auch denaturierten aber kleineren niedermolekularen Plasmidmolekülen als Präzipitat aus und bilden einen weißen Überstand. Die Plasmidmoleküle können im Neutralisationspuffer renaturieren.

Wichtig ist, dass das Präzipitat weiß ist und keine brauen Rückstände mit nicht lysierten Zellen enthält. Ist dies der Fall, muss das Präzipitat erneut gut geschwenkt und nochmals für mindestens 10 min auf Eis gestellt werden. Die Zentrifugenröhrchen mit Lysat werden nun mit Neutralisationspuffer austariert.

Dieses Lysat wird im Anschluss 20 min bei 20000xg und 4°C zentrifugiert, so dass sich die Plasmid-DNA im späteren Überstand befindet. Der Überstand wird filtriert und das Filtrat wird erneut 5 min bei 6000xg und 4°C zentrifugiert. Dieser Schritt ist nicht zwingend notwendig, wenn der Überstand sehr klar ist, kann man auf den zusätzlichen Filtrierschritt verzichten. Parallel werden die vorbereiteten Säulen mit 10 ml eines Äquilibrierungspuffers (QBT) mit pH 7.0, der eine geringe Salzkonzentration enthält, äquilibriert (hierfür müssen 10 min einkalkuliert werden und daher sollte damit schon parallel zu Beginn des obigen Filtrierschritts oder 10 min vor Ablauf des Zentrifugierschnitts begonnen werden). Der Überstand mit der enthaltenden Plasmid-DNA wird auf eine entsprechend beschriftete Säule gegeben. Nach dem er die Säule

passiert hat, wird er zur Erhöhung der Ausbeute nochmals auf die Säule gegeben.

Jetzt werden die Säulen je mit 2x mit 30 ml Waschpuffer (Lösung QC), der eine höhere Salzkonzentration als QBT enthält, gewaschen, so dass unspezifische Bindungen unterbunden werden.

Mit 15 ml Elutionspuffer (Lösung QF, höchste Salzkonzentration verglichen mit QBT und QC) wird die Plasmid-DNA in je 10,5 ml Isopropanol von der Säule eluiert. Die Röhrchen mit dem Eluat werden mit Isopropanol tariert und durch 2-3 maliges Schwenken gut gemischt. Die ausgefällte Plasmid-DNA wird in Form von dünnen, weißliche Fäden sichtbar. Das Eluat wird 30 min bei 6000xg und 4°C zentrifugiert.

Der Überstand wird möglichst schnell abgegossen und in einem Röhrchen zur Sicherheit bei Verlust des Pellets aufgefangen, ein kleiner Rückstand kann bleiben.

Das Pellet wird mit einem Filzstift auf den Glasröhrchen markiert. Mit 5 ml 70% EtOH wird die DNA (im markierten Bereich) im Anschluss vom Glasröhrchen abgespült, damit von präzipitierten Salzen gereinigt und Isopropanol durch EtOH ersetzt, um die DNA einfacher wieder zu lösen. Abschließend wird sie dann 10 min bei 6000xg zentrifugiert, das EtOH wird durch vollständiges Abgiessen entfernt und das Pellet 1-3 min im Exikator getrocknet. Jedes Pellet wird in 100-200 µl Tris-EDTA (TE)-Puffer aufgenommen. Hierbei wird mit TE vorsichtig die DNA vom Glasrand abgespült und etwa 5 min stehen gelassen (DNA löst sich) bevor die Konzentrationsbestimmung erfolgt.

2.2.5 Konzentrationsbestimmung

Die Konzentrationsbestimmung erfolgt zunächst per Jasco-Photometer mit Spectra Manager-Software. Grundlage der DNA-Konzentrationsmessung mittels Spektralphotometrie ist das Lambert-Beersche-Gesetz, nach dem monochromatisches Licht von einer Substanz in Abhängigkeit von ihrer Konzentration absorbiert wird.

Doppelsträngige DNA absorbiert UV-Licht mit einem Absorbtionsspektrum bei 260 nm, während die Absorbtion bei 320 nm den OD-Nullwert der Kurve wiederspiegelt.

Nach dem die Messparameter festgelegt wurden, erfolgt die Aufnahme eines Spektrums im Wellenlängenbereich von 220-320 nm. Als Referenzprobe (Blank) wird TE verwendet, für die Proben wird die DNA-Lösung (1:100 und 1:50) verdünnt.

Hierbei ist darauf zu achten, dass die Verdünnungen gut gemischt und keine

Luftblasen in den Quarzküvetten vorhanden sind. Die Messwerte einer DNA-Lösung (Abs260nm-Abs320nm) werden gemittelt und daraus dann wie folgt die DNA-Konzentration bestimmt:

DNA-Konzentration [µg/ml]= (Abs260nm-Abs320nm) x Verdünnungsfaktor x 50 µg/ml

Im Verlaufe dieser Arbeit wurde die Konzentrationsbestimmung mittels Nanophotometer (Implen) ermöglicht, wobei 1 µl der DNA direkt eingesetzt werden können (keine Verdünnung nötig) und der Konzentrationswert nach richtiger Einstellung (Lidfaktor 50=Pfadlänge 0,2 mm, Verdünnungsfaktor 1, DNA-Koeffizient 50 µg/ml) und nach Messung des „Blank-Werts“ (TE) sofort ablesbar ist. Hierfür werden keine Küvetten verwendet, anstelle dieser dient ein Probenhalter mit Messfenster, auf den verschiedene Deckel mit Spiegel (Lid) gesetzt werden können.

Die DNA wird auf 1 µg/µl mit TE verdünnt, zu je 50 µl alliquotiert und bei -20°C gelagert.

2.2.6 Glycerinstocks

75 µl Glycerin werden zu 425 µl LB-Flüssigkultur hinzupipettiert. Die LB-Flüssigkultur wird vorab auf Eis bei 4°C gelagert und das vorgekühlte, beschriftete Einfrierröhrchen direkt nach Zugabe des Glycerins bei -20°C gelagert. Die Glycerinstocks dienen als DNA-Reserve zur DNA-Amplifikation.

2.3 Zellkultur

Menschliche embryonale Nierenzellen (Human embryonal kidney cells, HEK 293-Zellen) werden als eukaryotische Zelllinie verwendet. Morphologie und Dichte der Zellen werden per Mikroskop mit Phasenkontrastausstattung kontrolliert. Ausläufer der HEK 293-Zellen können sich in Form eines konfluenten Monolayers zwar berühren, jedoch sollte zwischen ihnen genügend Freiraum erhalten sein, damit sie sich nicht durch Kontakthemmung in ihrem Wachstum inhibieren. 2-3-mal pro Woche erfolgt der Mediumwechsel beziehungsweise das Umsetzen (Splitten). Für das Umsetzen werden die Zellen mit 3 ml 1x PBS gewaschen, mit 2 ml 0,05% Trypsin/

0,02% EDTA bei 37°C für 3 min abgelöst, die Reaktion mit 3 ml Medium (siehe 9.3) abgestoppt und resuspendiert. 0,5 ml der 5 ml Zellsuspension werden in eine neue Zellkulturflasche überführt, die Zellen werden somit im Verhältnis 1:10 umgesetzt.

Anschließend wird jede Zellkulturflasche mit 15 ml frischem Medium versetzt, bei 37°C im 5% CO2/ 95% Luft-Inkubator inkubiert.

Das Einfrieren der Zellen sollte möglichst schonend und daher stufenweise langsam erfolgen. Hierzu werden adhärente HEK 293-Zellen einer dicht gewachsenen 75 cm² -Zellkulturflasche, wie bereits zuvor beschrieben mit 1x PBS gewaschen, abtrypsiniert und die Reaktion mit 15 ml Medium abgestoppt. Das Einfriermedium und die Kryoröhrchen werden auf Eis vorgekühlt. Die Zellsuspension wird in ein 50 ml Falkonröhrchen überführt und bei 1200 rpm (250xg) und 12°C für 10 min zentrifugiert. Anschließend wird das Pellet in 1 ml Medium aufgenommen und resuspendiert. 20 µl der Zellsuspension werden mit 180 µl Trypanblau versetzt (1:10) und die enthaltenen Zellen mittels Neubauer-Kammer gezählt. Die Zellsupension wird erneut für 5 min bei 1200 rpm (250xg) und 12°C zentrifugiert. Das Pellet wird zunächst in einer geringen Menge, dann in der für die Verdünnung nötigen restlichen Menge Enfriermedium (10% DMSO, siehe 9.3) aufgenommen, resuspendiert und zu je 1 ml mit 1x10⁶ Zellen/ml in die Kryoröhrchen gegeben. Die Kryoröhrchen werden sofort im Eisbad zum Vorfrieren gebracht, dann in Zellstoff eingedeckt und für mindestens 24 h bei -70°C, danach bei -196°C in Flüssigstickstoff konserviert.

Für das In-Kultur-Bringen und Auftauen der Zellen hat sich ein schnelles Vorgehen etabliert, so dass das DMSO seine zelltoxische Wirkung möglichst nicht entfalten kann. Die eingefrorenen Kryoröhrchen werden im Wasserbad bei 37°C aufgetaut, in ein 15 ml Falkonröhrchen überführt, mit 8 ml Kulturmedium versetzt und für 5 min bei 1200 rpm (250xg) und 12°C zentrifugiert. Das Pellet wird in 5 ml frischem Medium aufgenommen, in eine 25 cm²-Zellkulturflasche überführt und bei 37°C im 5% CO2/ 95% Luft-Inkubator kultiviert. Nachdem Bilden eines konfluenten Monolayers können die Zellen in eine 75 cm²-Zellkulturflasche überführt werden. Die Zellen werden auf diese Weise in einem 3 Monats-Rythmus aufgetaut und mit Passagenzahlen <50 in Kultur gehalten.

2.4 Transiente Transfektion durch Elektroporation