Bachelorarbeit. zur Erlangung des akademischen Grades Bachelor of Science. an der Karl-Franzens-Universität Graz. vorgelegt von

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Stimulated Emission Depletion-Mikroskopie

Bachelorarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades Bachelor of Science

an der Karl-Franzens-Universit¨ at Graz

vorgelegt von

Lorenz HUBER

Mat.Nr.11706594

am Institut f¨ur Physik

Begutachter: Ao.Univ.-Prof. Mag. Dr.rer.nat. Ulrich Hohenester

Graz, 2020

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis I

Abstract II

1 Einleitung 1

2 Grundlegende Eigenschaften von Wellen 2

2.1 Eindimensionale Wellen . . . 2

2.2 Dreidimensionale Wellen . . . 4

2.3 Evaneszente Wellen . . . 5

2.4 Licht als elektromagnetische Welle . . . 8

2.5 Interferenz . . . 9

3 Beugungtheorie 10 3.1 Huygenssches Prinzip . . . 10

3.2 Skalare Beugungstheorie . . . 13

3.2.1 Fraunhofer-N¨aherung . . . 17

3.2.2 Beugung an der Kreisblende . . . 18

4 Beugung als Grenze des Aufl¨osungsverm¨ogen eines Mikroskops 21 4.1 Abbe-Theorie der Abbildung . . . 22

4.2 Rayleigh-Kriterium der Aufl¨osung . . . 24

5 STED Mikroskopie 27 5.1 Funktionsweise der STED Mikroskopie . . . 27

5.2 Begrenzung der STED-Methode . . . 31

5.3 Ausblick auf weitere Entwicklungen um die STED-Mikroskopie . . . 32

6 Fazit 33

Abbildungsverzeichnis 34

Literatur 35

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Abstract

In dieser Bachelorarbeit wird anhand des Beugungsphänomens von Wellen beschrieben, wie und warum das Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops beschränkt ist. Dazu werden Welleneigenschaften, im speziellen die Beugung vorgestellt. Mit diesen Erkenntnissen kann eine bestmögliche Auflösung für ein Lichtmikroskop berechnet werden. Trotz dieser physikalischen Grenze und ohne diese zu durchbrechen, ist es gelungen, mit der Metho- de der STED-Mikroskopie, für die 2014 der Nobelpreis in Chemie vergeben wurde, eine bessere Auflösung mit einem Lichtmikroskop zu erzielen.

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1 Einleitung

Wie gut kann ein Mikroskop sein? Das ist die zentrale Fragestellung dieser Arbeit. Gemeint ist damit: Wie gut kann das Auflösungsvermögen eines Mikroskops sein? Unter Auflösungs- vermögen versteht man den kleinstmöglichen Abstand ∆xmin, den zwei Objekte haben können, um sie noch getrennt voneinander mit Hilfe eines Mikroskops abbilden zu können.

Diese Fragestellung wird in Bezug auf Lichtmikroskopie diskutiert. Aus diesem Grund werden einleitend die Eigenschaften und die Ausbreitung von Wellen, insbesondere Licht, als Welle beschrieben. Als zentrales Problem der Lichtmikroskopie erweist sich das Phänomen der Beugung elektromagnetischer Wellen. Aufgrund von Beugungsphänomenen ist das Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops begrenzt und kann durch das Abbe Limit an- gegeben werden [1].

∆xmin > λ nsinα

Die Wellenl¨ange des verwendeten Lichts wird mit λ bezeichnet, n ist der Brechungsin- dex des Mediums zwischen der Linse und dem beobachteten Objekt und α ist der halbe Offnungswinkel zwischen Objekt und Linse.¨

Um zu verstehen, wie diese Formel zustande kommt und wie weitreichend ihre Aussage ist, wird die Theorie der Beugung von Licht als Welle genau betrachtet. Besonders wird dabei auf die skalare Beugungstheorie und die Fraunhofer-N¨aherung eingegangen. Mit Hilfe dieser N¨aherung kann die Beugung des Fernfelds bei vielen Objekten wie einer Kreisblende, eines Spalts oder Doppelspalts beschrieben werden.

Mit Hilfe eines modernen Verfahrens, der STED-Mikroskopie, ist es gelungen, ein Mikro- skop zu realisieren, das Strukturen von Objekten unterhalb der Beugungsgrenze erkennbar machen kann. F¨ur diese auf Fluoreszenz-Mikroskopie basierende Methode wurde 2014 Ste- fan Hell der Nobelpreis in Chemie verliehen [2]. Das STED-Mikroskop durchbricht dabei nicht die Beugung, sondern umgeht sie.

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2 Grundlegende Eigenschaften von Wellen

2.1 Eindimensionale Wellen

Kern dieser Arbeit ist es zu zeigen, wie ein Objekt mit Hilfe eines optischen Instruments abgebildet und vergr¨oßert wird. Das Bild entsteht aus dem Licht, das vom betrachteten Ob- jekt ausgesendet beziehungsweise durch Bescheinen mit einer externen Lichtquelle reflek- tiert wird. Das Licht wird als elektromagnetische Welle beschrieben. Hier sollen einf¨uhrend die Eigenschaften von Wellen besprochen werden [3, S.1-14].

Eine Welle breitet sich in Raum und Zeit aus und kann als Funktion f(~r, t) oder im eindimensionalen Fall als f(x, t) beschrieben werden. Eine Welle, die sich in x-Richtung

über die Zeit mit der Geschwindigkeit v ausbreitet, erfährt eine räumliche Verschiebung um vt. Das kann wie folgt formuliert werden:

f(x,0) =g(x), f(x, t) = g(x−vt)

Das Minuszeichen vor demvtbedeutet eine Ausbreitung in Richtung der positivenx-Achse.

Eine positives Vorzeichen w¨urde eine Ausbreitung in die negative x-Richtung beschreiben.

Substituiert man u = x −vt, kann die Funktion f(x, t) folgendermaßen umgeschrieben werden.

f(x, t) = g−(u−) +g₊(u₊), u± =x±vt Man findet dadurch:

∂

∂x + 1 v

∂

∂t

∂

∂x − 1 v

∂

∂t

f(x, t) = ∂²

∂x² − 1 v²

∂²

∂t²

f(x, t) = 0 (2.1) Das ist die Wellengleichung in einer Dimension. Eine einfache L¨osung der Wellengleichung ist die harmonischen Welle

f(x, t) = Acos (kx−wt+δ) (2.2) mit der Amplitude A, der Wellenzahlk, der Kreisfrequenz ω und der Phasenverschiebung δ. Wellenzahl und Kreisfrequenz sind mit Wellenl¨angeλ und Periode T folgend verkn¨upft:

k = 2π

λ , ω = 2π T

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Abb. 2.1 Darstellung einer sinusf¨ormigen Welle: Die obere Welle ist zeitlich konstant, die unte- re ist ¨ortlich konstant abgebildet.

Bild von [4, S.24]

Uber die Euler-Identit¨¨ at kann diese Funktion Glg.(2.2) auch als Realteil einer komplexen Funktion dargestellt werden.

f(x, t) = Re

Ae^i(kx−ωt)e^iδ

= Reh

Ae˜ ^i(kx−ωt)i

, A˜=Ae^iδ

Aus der Wellengleichung folgt ein Zusammenhang zwischen Wellenzahl und Kreisfrequenz.

ω(k) =vk (2.3)

Die Kreisfrequenz ω wird als Funktion von Wellenzahl k mit dem Faktor v als Geschwin- digkeit, mit der sich die Welle ausbreitet, angesehen. Dieser Zusammenhang wird Disper- sionsrelation in einer Dimension genannt.

Fourier Transformation

Das Theorem der Fourier Transformation sagt aus, dass sich jede Funktion, die integrierbar ist, in harmonische Wellen zerlegen l¨asst:

f(x) = (2π)⁻¹ Z ∞

−∞

e^+ikxf˜(k)dk (2.4)

f˜(k) = Z ∞

−∞

e^−ikxf(x)dx (2.5)

(7)

Man bezeichnet ˜f(k) als die fouriertransformierte Funktion von f(x). Durch Glg.(2.5) kann ˜f(k) wieder zu f(x) r¨ucktransformiert werden. Beide Funktionen enthalten dieselbe Information.

Wellenausbreitung

Mit Hilfe der Fouriertransformation kann man die Ausbreitung von Wellen, auch Pro- pagation genannt, berechnen. Kennt man zum Beispiel die Welle f(x,0) zum Zeitpunkt null, kann man eine Fouriertransformation durchführen. Mit der Zeit entwickelt sich jede sinusförmige Welle wie Glg.(2.2). Daraus folgt für die propagierende Welle:

f(x, t) = (2π)⁻¹ Z ∞

−∞

ei[kx−ω(k)t]f˜(k)dk (2.6)

2.2 Dreidimensionale Wellen

Wellen, die sich in drei Dimensionen ausbreiten, k¨onnen mit Funktionen der Form

f(~r, t) =Aexp [i(~k·~r−ωt+δ)] (2.7) beschrieben werden. Darin enthalten ist der Wellenvektor~k. Die Richtung des Vektors entspricht der Ausbreitungsrichtung~e_k der Welle und sein Betrag h¨angt von der Wellenl¨ange λ ab.

~k =





 k_x k_y k_z





, ~k=|~k|e~_k, |~k|= 2π λ

Die Wellengleichung ¨andert sich folgendermaßen:

∇²− 1 v²

∂²

∂t²

f(~r, t) = 0 (2.8)

Die Fouriertransformation ¨andert sich zu einem dreidimensionalen Raumintegral und nimmt folgende Form an:

f(~r) = (2π)⁻³ Z ∞

−∞

e^+i~^k·~^rf(~k)d˜ ³k (2.9)

f(~k) =˜ Z ∞

−∞

e^−i~^k·~^rf(~r)d³r (2.10)

(8)

2 Grundlegende Eigenschaften von Wellen Aquivalent zu Glg.(2.3) findet sich durch Einsetzen der ebenen Welle in die Wellengleichung¨ Glg.(2.8) folgender Zusammenhang:

k_x²+k²_y+k_z²− ω² v² = 0 Darauf aufbauend ergibt sich die Dispersionsrelation

ω(~k) = v|~k|=v q

k_x²+k_y²+k²_z (2.11) Das ist die Dispersionsrelation f¨ur die skalare Wellengleichung Glg.(2.8). Diese Relation ist immer erf¨ullt.

Eine Eigenschaft der Wellengleichung ist ihre Linearität. Das hat zur Folge, dass zwei Einzellösungenfundgin Summe alsf+g wieder eine Lösung der Wellengleichung ergeben.

Die Fouriertransformation einer ebenen Welle wie in Glg.(2.7) ist dabei ein Spezialfall, weil die Welle in einfache ebene Wellen zerlegt wird. Das ist immer m¨oglich, weil die ebenen Wellen eine vollst¨andige Basis bilden.

Zeitharmonische Wellen und auch Felder mit einer einzigen Kreisfrequenz ω k¨onnen in der Form

f(~r, t) =e^−iωtf(~r) (2.12) als Produkt von rein zeitabh¨angigen und rein ortsabh¨angigen Faktoren beschrieben werden.

Diese Gleichung in die Wellengleichung Glg.(2.1) eingesetzt liefert:

(∇² +k²)f(~r) = 0 (2.13)

Hier wurde der Term e^iωt herausgek¨urzt.

2.3 Evaneszente Wellen

Es soll nun beschrieben werden, wie sich ein bekanntes skalares Feld an der Position f(x, y,0) mit konstanter Kreisfrequenz ω in z-Richtung ausbreitet, und wie das Feld in wachsender z-Richtung berechnet werden kann.

Das bekannte Feld soll dazu zuerst in ebene Wellen zerlegt werden.

f(x, y,0) = (2π)⁻² Z ∞

−∞

e^i(k^x^x+k^y^y)f(k˜ _x, k_y)dk_xdk_y

(9)

F¨ur die Ausbreitung in z-Richtung wird der allgemeine Ansatz f(x, y, z) = (2π)⁻³

Z ∞

−∞

e^i(k^x^x+k^y^y+k^z^z)f˜(k_x, k_y, k_z)dk_xdk_ydk_z

gemacht. Dabei ist jetzt darauf zu achten, dass die Dispersionsrelation Glg.(2.11) erfüllt ist. Es können ω und k_x, k_y, k_z nicht unabhängig voneinander gewählt werden. Für eine Ausbreitung in z-Richtung unter Berücksichtigung der quadrierten Dispersionsrelation Glg.(2.3) folgt daher fürkz:

kz =±q

k² −k²_x−k²_y, k = ω

v (2.14)

F¨urk_x²+k_y² ≤k² ist diez-Komponente des Wellenvektors eine reelle Zahl, die zu einer sich ausbreitenden Welle f¨uhrt. Wenn k_x²+k²_y ≥k² ist, wird k_z zu einer komplexen Zahl.

k_z =±q

k²−k_x²−k²_y =±iq

k_x²+k²_y −k² ≡ ±iκ (2.15) Das f¨uhrt zu einem komplexen Wellenvektor. Wellen mit diesem Wellenvektor nennt man evaneszente Wellen. Um die Ausbreitung dieser evaneszenten Wellen zu bestimmen, wird die komplexe Wellenzahl k_z in den Ansatz einer ebenen Welle eingesetzt.

exp [i(k_xx+k_yy±ik_zz)] = exp [i(k_xx+k_yy)∓κz]

Es ist zu erkennen, dass die evaneszentent Wellen exponentiell in z-Richtung anwachsen oder abfallen, wobei physikalisch nur die abfallende L¨osung sinnvoll ist.

Dieses Verständnis für die Ausbreitung von evaneszenten Wellen führt direkt zum Beu- gungslimit von Licht. Zum Beschreiben eines Feld inz-Richtung (z ≥0) kann nun folgende Formel herangezogen werden:

f(x, y, z) = (2π)⁻² Z

k²>k²_x+k_y²

eⁱ(^k^x^x+k^y^y+√

k²−k_x²−k²_yz) ˜f(k_x, k_y)dk_xdk_y + (2π)⁻²

Z

k²<k²_x+k_y²

e^i(k^x^x+k^y^y)−

√

k_x²+k²_y−k²zf˜(kx, ky)dkxdky

(2.16)

Die erste Zeile dieser Formel beschreibt dabei die sich ausbreitende Welle und die zweite Zeile beschreibt die evaneszente Welle.

(10)

Abb. 2.2 Nur der innere Teil derk-Vektoren f¨uhrt zu propagierenden Wellen.

vgl.[3, S.12]

Nur Wellenvektoren innerhalb des Kreises in Abb. 2.2 führen zu sich ausbreitenden Wel- len. Die restlichenk-Vektoren gehören zu evaneszenten Wellen, welche exponentiell in Aus- breitungsrichtung verschwinden. Diese höheren Wellenzahlen enthalten Informationen der feinen räumlichen Details des Feldes. Diese Details gehen bei Ausbreitung in z-Richtung verloren. Auf optische Bilder bezogen, führt dies zu einem Verlust von Auflösung des Bildes und somit zu einer Begrenzung der Auflösung ∆ im Fernfeld.

Man erkennt, dass nur kleine Wellenzahlen zu sich ausbreitenden Wellen führen. Unter der Annahme, dass sich die höchste räumliche Auflösung aus der größtmöglichen Wellenzahl k_max ergibt, kann folgenden Abschätzung getroffen werden:

∆≈ 2π k_max

Diese gr¨oßtm¨ogliche Wellenzahl ergibt sich aus der Dispersionsrelation.

sup (k²_x+k_y²) =k_max= ω v

Durch Zusammenführung dieser beiden Gleichungen kann man das Auflösungsvermögen

(11)

der skalaren Wellengleichung absch¨atzen.

∆≈ 2πv

ω =λ (2.17)

Räumliche Auflösung beschreibt in diesem Kontext den kleinstmöglichen Abstand, bei dem zwei Punkte noch voneinander unterschieden werden können.

Diese erste Abschätzung des Auflösungsvermögens wird sich im späteren Kapitel 4 bestätigen.

Eine wichtige Aussage kann daraus jedoch gewonnen werden. Die Auflösung ist proportio- nal zur Wellenlänge und somit durch eine minimale Wellenlänge begrenzt. Da diese Arbeit sich mit Lichtmikroskopie beschäftigt, handelt es sich um einen Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichts von ca. 380 bis 780 nm.

Abb. 2.3 Der sichtbare Bereich des elektromagnetischen Spektrums Bild und Bildunterschrift von [5, S.4]

2.4 Licht als elektromagnetische Welle

Im vorhergehenden Abschnitt wurde allgemein über Wellen gesprochen, die als Skala- re Funktionen f(x, y, z) oder f(x, y, z, t) = f(~r, t) beschrieben werden können [4, S.23- 28]. Licht ist eine elektromagnetische Welle, mit den vektoriellen Größen der elektrische Feldstärke E~ und der magnetische Feldstärke H. Bei einer ebenen, periodischen, elektro-~ magnetischen Welle sind sowohl das elektrische als auch das magnetische Feld zeitlich und räumlich periodisch. Beide Felder stehen normal zur Ausbreitungsrichtung der Welle und zusätzlich stehen elektrisches und magnetisches Feld normal zueinander, wie in Abb. 2.4 gezeigt wird.

Elektromagnetische Felder erfüllen die Maxwell-Gleichungen. Das sei hier der Vollständigkeit halber erwähnt, jedoch wird nicht genauer darauf eingegangen [3, S.27].

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Abb. 2.4 Darstellung der Feldst¨arke in einer elektromagnetischen Welle Bild und Bildunterschrift von [4, S.23]

2.5 Interferenz

Unter Interferenz versteht man eine ungestörte Überlagerung von zwei oder mehreren Wel- len, wobei sich jede Einzelwelle so ausbreitet, als ob keine andere Welle anwesend wäre [6, S.301,302]. Das resultierende Feld ergibt sich aus der vektoriellen oder im eindimensionalen Fall aus der skalaren Addition der Einzelwellen.

Die Gesamtintensität der resultierenden Welle ist nicht eine einfache Addition, weil die Intensität aus dem Betragsquadrat der Amplitude der überlagerten Wellen gebildet wird.

I ∝ |E|² (2.18)

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3 Beugungtheorie

Im vorherigen Kapitel wurde allgemein das Verhalten und die Ausbreitung elektromagnetischer Wellen besprochen. Mittels Fouriertransformation kann die Propagation einer Welle beschrieben werden. In diesem Kapitel soll ein anderer Zugang, das Huygenssche Prinzip vorgestellt werden, mit dem das Ph¨anomen der Beugung anschaulich und mathematisch gut erkl¨art werden kann.

3.1 Huygenssches Prinzip

Das Huygenssche Prinzip beschreibt eine Theorie zur Ausbreitung von Wellen. Es be- sagt, dass jeder Punkt einer Wellenfront ein Erreger einer Kugelwelle, einer sogenannten Elementarwelle, ist [4, S.34, 35]. Die Ausbreitung von Wellen ist ¨Uberlagerung dieser Ele- mentarwellen.

Abb. 3.1 Huygenssches Prinzip Bild und Bildunterschrift von [4, S.34]

In Abb. 3.1 ist die Ausbreitung einer Kugelwelle von PunktP aus dargestellt. Die Elemen- tarwellen (kleiner gestrichelter Kreis um PunktP⁰) selbst werden nicht beobachtet, sondern nur die einhüllende Wellenfront (durchgezogene Kreise umP). Dies wird so erklärt, dass die Elementarwelle sich nur in Richtung der Gesamtwellenfläche ausbreiten kann. In alle anderen Richtungen löschen sich die Elementarwellen durch destruktive Interferenz aus. Die ErregerzentrenP⁰ der einzelnen Elementarwellen werden dabei als infinitesimal betrachtet und die Interferenz findet im kleinsten Bereich statt. Diese Theorie ist sehr bewährt zur Beschreibung der Ausbreitung von Wellen.

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3 Beugungtheorie

Huygenssches Prinzip zum Beschreiben der Beugung an einem Spalt

In Abb. 3.2(a) ist eine ebene Welle dargestellt, die sich von links nach rechts ausbreitet [5, S.303-306]. Durch Interferenz der Elementarwellen breitet sich die Welle aus. Jede Wellenfront kann wieder als Ausgangspunkt neuer Elementarwellen angesehen werden. Im Abschnitt C der Abbildung trifft die Welle auf einen Spalt. Am Rand des Spalts besitzt eine Elementarwelle keinen Nachbar mehr. Dies f¨uhrt zu einer Situation wie in Abb. 3.2(b).

Zur Ausbreitung der Welle unter dem Winkel θ muss die Elementarwelle, die vom unteren Punkt ausgeht, einen um ∆s längeren Weg zurücklegen. Dies führt zu einer Phasenver- schiebung ∆ϕ der Welle, die wie folgt beschrieben werden kann.

∆ϕ= 2π

λ ∆s= 2π

λ dsinθ (3.1)

(a) Ausbreitung der Wellenfront (b) Gangunterschied zwischen benachbarten Elementarwellen

Abb. 3.2 Beschreibung der Beugung am Spalt durch das Huygenssche Prinzip Bilder und Bildunterschriften von [5, S.304]

Es wird nun angenommen, dass sich N Elementarwellen im Spalt mit der Breite D ausbreiten. Der Abstand der Entstehungspunkte der Elementarwellen ist d = ^D_N. Die einzelnen Elementarwellen werden durch die FunktionE(~~ r, t) = ^E_N^~⁰e^i(ωt−^k^~^θ^·~^r+ϕⁿ⁾ beschrieben. Hier ist k~θ der Wellenvektor in Richtung θ, und ϕn die Phase bezogen auf die erste Welle ϕ0 mit ϕ_n=ϕ₀+n∆ϕ. Die resultierende Welle ergibt sich als Summe der Elementarwellen.

E~ =

N−1

X

n=0

E~_n= E~₀

N

N−1

X

n=0

e^i(ωt−^k^~^θ^·~^r+ϕ⁰^+n∆ϕ)

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3 Beugungtheorie

= E~₀

N e^i(ωt−^k^~^θ^·~^r+ϕ⁰⁾

N−1

X

n=0

(e^i∆ϕ)ⁿ (3.2)

Die Summe entspricht einer geometrischen Reihe.

N−1

X

n=0

aⁿ = aⁿ−1 a−1 Daraus folgt:

E(~~ r, t) = E~0

N eî(ωt−^k^~^θ^·~^r+ϕ⁰⁾eîN∆ϕ−1 eî∆ϕ−1

= E~₀

N e^i(ωt−^k^~^θ^·~^r+ϕ⁰⁾eⁱ^N²^∆ϕ

eⁱ¹²^∆ϕ · eⁱ^N²^∆ϕ−e⁻ⁱ^N²^∆ϕ eⁱ¹²^∆ϕ−e⁻ⁱ¹²^∆ϕ

= E~0

N e^i(ωt−^k^~^θ^·~^r+ϕ⁰⁾eⁱ^N−1² ^∆ϕsin (N^∆ϕ₂ ) sin (^ϕ₂)

=E~₀e^i(ωt−^k^~^θ^·~^r+ϕ⁰⁾eⁱ^N−1² ^∆ϕ 1 N

sin (^{N πd}_λ sinθ)

sin (^πd_λ sinθ) (3.3) Aus dem Feld kann durch Bildung des Betragsquadrat die Intensit¨atI(θ) mitI =c₀|E(~~ r, t)|² berechnet werden.(I0 =c0|E~0|²)

I(θ) =I₀ 1 N²

sin²(^{N πd}_λ sinθ)

sin²(^πd_λ sinθ) (3.4)

Abschließend wird ein Grenzübergang N → ∞ für unendlich viele Elementarwellen gemacht, was zur Folge hat, dass der Abstand der Elementarwellen d → 0 geht. Man betrachtet folgend N d = D und nähert im Nenner sin (x) ≈ x. Daraus ergibt sich folgende Intensität:

I(θ) =I₀sin²(^πD_λ sinθ)

(^πD_λ sinθ)² (3.5)

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3 Beugungtheorie

-π/2 -π/4 0 π/4 π/2

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

θ I/I0

D = 700 nm D = 2000 nm D = 20000 nm

Abb. 3.3 Intensit¨atsverteilung hinter einem Spalt

Man erkennt, dass bei einem sehr dünnen Spalt von 700nm eine weit gestreute Inten- sitätsverteilung vorliegt, jedoch bei größer werdender Spaltbreite ein schärferes Inten- sitätsmuster entsteht. Der Spalt wird nicht mehr als Spalt, sondern verzerrt abgebildet.

Das Intensitätsmaximum wird nullte Beugungsordnung oder Hauptmaximum genannt. Es befindet sich beiθ = 0. Die Maxima höherer Ordnung folgen aus einer Weglängendifferenz und befinden sich beim Winkel θ_m, wofür gilt ^πD_λ sinθ = ^2m+1₂ π.

3.2 Skalare Beugungstheorie

Ziel ist es, das Huygenssche Prinzip mit Hilfe einer skalaren Näherung mathematisch zu formulieren [7, S.63-69]. Das bedeutet, man ersetzt vektorielle durch skalare Felder. Es wird zeitliche und räumliche Kohärenz vorausgesetzt und es werden ausschließlich mono- chromatische Wellen betrachtet. Man betrachtet dazu das LichtfeldE(~~ r), an einem Punkt P(Abb.3.4), das sich aus der Summe von Beiträgen einzelner Lichtquellen Q, Q⁰, ...super- positioniert.

(17)

3 Beugungtheorie

Abb. 3.4 Das Lichtfeld bei P wird von den QuellenQ,Q⁰,Q⁰⁰ ... gespeist.

Bild und Bildunterschrift von [7, S.64]

Dazu werden die Felder von Punktquellen mit der Gleichung E =E_Qe^ikr

kr als skalare Funktion beschrieben.

Man betrachtet die Felder am Punkt P, indem man die Quellen auf einer Fl¨ache S und deren Wirkung auf einem kleinen Volumen mit Fl¨ache S⁰ um P beobachtet(Abb. 3.5a).

(a) Wahl der Fl¨achen zu Glg.(3.7) (b) Die Fl¨acheSwird von der Quelle Q erregt und strahlt auf den Punkt P

Abb. 3.5 Kirchhoffs Theorem

Bilder und Bildunterschriften von [7, S.65]

Im weiteren Schritt wird das Greensche Integraltheorem f¨ur zwei L¨osungen ψ und φ der Helmholtzgleichung verwende [8, S.43-44] [9, S.25-26]:

I Z

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3 Beugungtheorie

Es werden ψ = e^ikr/kr und φ = E(r_p) in Glg.(3.6) eingesetzt. Weiters wird eine sehr kleine Kugel mit dem kleinen Radius r⁰ und dem Oberfl¨achenelement d ~S⁰ = r²dΩ⁰e~_r um den Punkt P ausgeschnitten und zusammengezogen (Abb. 3.5(a)).

I

S

d ~S+ I

S⁰

d ~S⁰ e^ikr

r ∇E−E∇e^ikr r

= 0

In der Umgebung von P gilt d ~S ke~_r worauf folgt ∇E ·d ~S = (∂E/∂r)r²dΩ⁰. Weiters wird benutzt: −∇e^ikr/r = (1/r²−ik/r)e^ikre~_r

Man gelangt darauf zu:

I

S

e^ikr

d ~S =

I

S⁰

E(1−ikr) +r∂E

∂r

e^ikrdΩ⁰ (3.7) Nun wird der Radius r des Volumens um P gegen null geschickt.

I

S⁰

E−ikrE+r∂E

∂r

e^ikrdΩ⁰ r→0 4πE r=0

= 4πE(~rp) Dieser Grenz¨ubergang f¨uhrt zum Kirchhoffischen Integraltheorem.

E(~r_p) = 1 4π

I

S

e^ikr

d ~S (3.8)

Darauf aufbauend wird eine weitere N¨aherung gemacht. Dazu wird eine Punktquelle Q, siehe Abb. 3.5(b), auf das Theorem angewendet. Die Quelle wird als skalare Kugelwelle der Form

E(ρ, t) = EQ

kρe^i(kρ−ωt)

angenommen. Es werden Kugelkoordinaten verwendet und das Feld der Quelle in Glg.(3.8) eingesetzt.

E(~rp) = E_Q 4πk

I

S

e^ikr r

∂

∂ρ e^ikρ

ρ

~eρ− e^ikρ ρ

∂

∂r e^ikr

r

~ er

d ~S

Nun wird folgende N¨aherung verwendet.

∂

∂ρ e^ikρ

ρ =k²e^ikρ i

kρ − 1 (kρ)²

'e^ikρik

ρ (3.9)

Die Näherung ist im Abstand von wenigen Wellenlängen sehr gut erfüllt. Dadurch verein-

(19)

3 Beugungtheorie

facht sich das Kirchhoff-Integral.

E(~r_p) = −iE_Q 2π

I

S

e^ik(r+ρ)

rρ N(~r, ~ρ)dS (3.10)

In dieser Gleichung tritt der Neigungsfaktor N(~r, ~ρ) bzw. Stokes Faktor auf.

N(~r, ~ρ) =−~e_r~e_s−~e_ρ~e_s

2 =−1

2(cos (~r, ~e_s)−cos (~ρ, ~e_s)) (3.11) Seine Bedeutung wird anhand der Abb. 3.6 n¨aher gebracht.

(a) Geometrische Relationen (b) Winkelabh¨angigkeit von N(^(~r, ~ρ)ke~_s)

Abb. 3.6 Interpretation des Neigungsfaktors Bilder und Bildunterschriften von [7, S.66]

In der Realit¨at wird sich der einfallende Strahl ~ρ in der N¨ahe der Verbindungsachse von Q nach P ausbreiten. Dabei wird der Winkel zwischen ~ρ und QP~ zu 0 und der Neigungsfaktor zu N(^(~r, ~ρ) k e~s) = (1 + cosφ)/2. Die Erregung von dS ausgehend kann mit dE_S = (E_Q/kρ) exp(ikρ) cos (^(~e_r, ~e_S))dS und der Beitrag am Punkt P mit dE_p =dE_Scos (^(~e_r, ~e_S)) exp(ikr)/r beschrieben werden.

Aus dem Neigungsfaktor folgt das Verschwinden von Strahlen in Rückwärtsrichtung we- gen N → 0 für e~_ρ → e~_r. Für annähernd parallel zur Achsen einfallende Strahlen in Vorwärtsrichtung wird dagegen N →1.

(20)

3 Beugungtheorie

3.2.1 Fraunhofer-N¨aherung

Im Weiteren wird n¨aher auf den Fall N '1 und die Fraunhofer-Beugung eingegangen.

Abb. 3.7 Fraunhofer-Beugung f¨urN '1 Bild und Bildunterschriften von [7, S.67]

Eine Fläche S wird mit einer ebenen Welle bestrahlt. Für die konstante Feldstärke gilt E_S 'E_Q/kρ. Die Intensitätsverteilung kann durch eine Transmissionsfunktion τ(ξ, η) beschrieben werden. Die Feldstärke am Punkt P ergibt sich nach Glg.(3.10)

E(~r_p) =−iE_S λ

I

S

τ(ξ, η)e^ikr

r dξdη (3.12)

Zur weiteren Behandlung dieser Gleichung wird die N¨aherung gemacht, dass der Abstand des Objekts vom Beobachter groß gegen die Wellenl¨angeλund der transversalen Dimension (hier als Radius a in Abb. 3.7 dargestellt) ist.

Die Abst¨ande r und r₀ werden in den Koordinaten der jeweiligen Ebene ausgedr¨uckt.

r² = (x−ξ)²+ (y−η)²+z² , r²₀ =x²+y²+z² r wird als Funktion von r₀ dargestellt

r² =r₀²

1−2(xξ+yη)

r₀² + ξ²+η² r²₀

(21)

3 Beugungtheorie

und mit κ_x =kx/r₀ und κ_y =−ky/r₀ entwickelt.

r=r0

s

1 + 2 (κxξ+κyη)

kr₀ + ξ²+η² r²₀ 'r0

1 + κxξ+κyη

kr₀ + ξ²+η² 2r₀²

Dabei wird die Taylorentwicklung √

1 +x ' 1 + ^x₂ f¨ur x 1 verwendet. Das ist hier anwendbar, weil ξ, ηr0 ist [9, S.33].

Dadurch l¨asst sich der Phasenfaktor in Glg.(3.12) in drei Teile zerlegen.

exp(ikr)→exp(ikr₀) exp(i(κ_xξ+κ_yη)) exp(ik(ξ²+η²)

2r₀ ) (3.13)

F¨ur a² λz/π wird der Beugungstyp Fraunhofer-Beugung genannt. Er ist f¨ur das Fern- feld nach Beugung an einem Objekt bedeutend. Der erste Faktor in Glg.(3.13) ist ein Phasenfaktor, der dritte Faktor ist im Fall der Fraunhofer-Beugung nahezu 1.

F¨ur das Fernfeld wird nun eine Fraunhofer-N¨aherung gemacht. Dazu wird der Faktor 1/r ' 1/r0 '1/z ersetzt und in Glg.(3.12) eingesetzt. Daraus folgt diese Gleichung.

E(~r_P) = −iE_Se^ikr⁰ λz

I

S

τ(ξ, η)e^i(κ^x^ξ+κ^y^η)dξdη (3.14) 3.2.2 Beugung an der Kreisblende

Als ein wichtiges Beispiel der Fraunhofer-Beugung sei hier die Beugung einer Kreisblende angef¨uhrt. Dies entspricht allen kreisf¨ormigen optischen Elementen [7, S.71, 72].

Zur Berechnung der Abbildung wird das Beugungsintegral aus Glg.(3.14) berechnet. Dazu werden die Polarkoordinate (ρ, φ) in der (η, ξ)-Ebene (Abb. 3.8) der Blende und (r, ϕ) in der (x, y)-Ebene des Schirms eingef¨uhrt. Das auszuwertende Integral zur Bestimmung des Feldes am Schirm lautet:

E(r) =~ −i ~E_Se^ikr⁰ λz

Z a 0

ρdρ Z 2π

0

dψe−i(krρ/z) cos(φ−ψ)

Das Integral kann ¨uber Bessel-Funktionen¹ ausgewertet werden. Das Ergebnis lautet:

E(r) =~ −i ~E_Se^ikr⁰ka² z

J₁(kar/z) (kar/z)

1J0(x) = ¹ R2π

exp(ixcos(ψ))dψund Rx

dx⁰x⁰J0(x⁰) =xJ1(x)

(22)

3 Beugungtheorie

Daraus kann die Intensit¨atsverteilung berechnet werden.

I(r) =I₀·

2J₁(kar/z) kar/z

2

Abb. 3.8 Beugung an der kreisf¨ormigen Lochblende Bild und Bildunterschriften von [7, S.71]

Das zentrale Beugungsmaximum wird Airy-Scheibchen genant. Sein Radius wird ¨uber die Nullstelle der BesselfunktionJ₁(x= 3.83) = 0 definiert und auskar_Airy/r₀ = 1.22π = 3.83 kann der Radius berechnet werden.

r_Airy = 1.22zλ

2a (3.15)

Diese Aussage ist ¨aquivalent zum Rayleighkriterium (2a →, D, z →f) r_Airy = 1.22f λ

D (3.16)

mit dem Linsendurchmesser D und der Brennweite f. Man sieht, dass die Kreisöffnung, welche im Grenzfall einem Punkt entspricht, nicht mehr scharf abgebildet werden kann, sondern sich eine radial abhängige Intensitätsverteilung ergibt. Die Kreisöffnung wird ge- spreizt dargestellt.

(23)

3 Beugungtheorie

(a) Beugung an der

kreisf¨ormigen ¨Offnung

(b) Intensit¨at bei der Beugung am Kreis

Abb. 3.9 Beugung an der kreisf¨ormigen ¨Offnung Bilder und Bildunterschriften von [4, S.145, 146]

(24)

4 Beugung als Grenze des Aufl¨osungsverm¨ogen eines Mikroskops

4 Beugung als Grenze des Aufl¨ osungsverm¨ ogen eines Mikroskops

In den vorherigen Kapiteln wurde das Beugungsphänomen von Wellen erklärt. Es wurde gezeigt, dass sich Licht durch einen Spalt nicht geradlinig, wie man es von einem Lichtstrahl erwarten würde, ausbreitet. Licht als Welle wird am Spalt gebeugt. Die Abbil- dung des Spalts ist nicht mehr ein klar definierter Spalt, sondern entspricht einer Inten- sitätsverteilung. Räumliche Auflösung bedeutet, dass zwei voneinander getrennte Objekte noch als zwei separate Objekte abgebildet werden können. Exemplarisch dafür soll hier gezeigt werden, wie die Beugung von Licht an einem Doppelspalt aussieht [7, S.184-185].

Abb. 4.1 Beugung an einem Doppelspalt als Beispiel f¨ur die Beugung von Licht an zwei r¨aumlich getrennten Objekten

Bild von [7, S.184]

Zur Berechnung der Intensit¨atsverteilung soll die Fraunhofer-N¨aherung aus Glg.(3.14) verwendet werden.

Um nun diese Formel auf den Doppelspalt anzuwenden, wird die Transmissionsfunktion τ(ξ) für den Bereich der beiden Spalten mit Breite D als 1 und sonst 0 gewählt. Weiters wird der Spalt umξ₀ =±d/2 =±ξ₀ positioniert. Für das Beugungsintegral folgt dann mit κ_x = 2πx/λz:

E ∝ I

S

τ(ξ−ξ₀)e^iκ^x^ξ+τ(ξ+ξ₀)

e^iκ^x^ξdξ =

= I

S

τ(ξ)eîκ^x^ξdξ eîκ^x^ξ⁰ +e^−iκ^x^ξ⁰ Daraus kann die Intensität mitI =c₀|E|/2 bestimmt werden.

I = I₀ 2

sin²(πxD/λz) (πxD/λz)²

1 + cos 2πd

λ x z

(4.1)

(25)

Eine L¨osung sieht grafisch folgendermaßen aus:

Abb. 4.2 Intensit¨atsverteilung bei Beugung am Doppelspalt f¨urD=d/10

Hierbei wurde eine Entfernung zwischen dem Doppelspalt und dem Schirm (d, xz) angenommen. Das Interferenzmuster entsteht durch Interferenz der beiden gebeugten Wellen, die separat als Beugung am Einzelspalt wie in Abb. 3.3 aussehen würden. Das Hauptma- ximum befindet sich bei θ = 0, die Nebenmaxima befinden sich bei den Winkeln θ_m, für die gilt dsinθ_m =mλ, (m = 1,2, ...). Nachdem Beugung nun ausreichend beschrieben ist, soll die Bedeutung von Beugung bei der Auflösung eines Mikroskops vorgestellt werden.

4.1 Abbe-Theorie der Abbildung

Betrachtet wird ein Objekt bestehend aus zwei Spalten S₁ und S₂ [10, S.359]. Dies entspricht dem bereits vorgestelltem Doppelspalt. Die nullte Beugungsordnung erscheint in Ausbreitungsrichtung des Lichts, θ = 0. Daraus kann aber keine Information ¨uber den Abstanddder beiden SpaltenS₁ und S₂ gewonnen werden. Die h¨oheren Beugungsmaxima treten bei den Winkelnθm zur Einfallsrichtung des Lichts ein. Es gilt:

dsinθ_m =mλ, (m= 1,2, ...)

(26)

Die h¨oheren Bergungsordnungen geben deshalb Auskunft ¨uber den Abstand der beiden Spalte.

Abb. 4.3 Abbe’sche Theorie zur Bildentstehung im Mikroskop Bild und Bildunterschrift von [10, S.359]

Die Situation ist in Abb. 4.3 dargestellt. Zur Entstehung der beiden Bilder B₁ und B₂ ist sowohl die +1. als auch die −1. Beugungsordnung notwendig. Daraus folgt, das die ObjektivlinseL₁ groß genug sein muss, um das±1.Beugungsmaxima, dass mit dem Winkel θ₁ zur Ausbreitungsrichtung des einfallenden Lichts entsteht, einzufangen.

Um dieses Kriterium zu erfüllen, muss die Numerische Apertur NA des Mikroskops mit einem Brechungsindex n und dem halben Öffnungswinkel des Objektives α folgendes Kri- terium erfüllen:

NA =nsinα > nsinθ₁ = λ d

Die Aufl¨osung eines optischen Instruments ergibt sich dann aus dem kleinstm¨oglichen Ab- stand ∆x_min =d.

d> λ

nsinα = λ

NA (4.2)

Dieser minimale Abstand wird als Abbe-Limit bezeichnet. Strukturen unter dieser Grenze

(27)

k¨onnen durch konventionelle Lichtmikroskopie nicht mehr aufgel¨ost werden.

Das Auflösungsvermögen ist abhängig von der Wellenlänge des verwendeten Lichts und der Numerischen Apertur beziehungsweise des Brechungsindex n eines verwendeten Immersi- onsöls und dem Winkel α_max, unter dem Licht von der Linse noch eingefangen werden kann.

An dieser Stelle sei ein Beispiel angeführt. Der Brechungsindex eines Immersionsöls beträgt n= 1.5. Der Einfallswinkelα_maxseiα= 53^◦. Damit beträgt das Auflösungsvermögen nach Glg.(4.2):

∆x_min = λ

1.5 sin (53^◦) ≈ λ 1.19

Die bestmögliche Auflösung liegt in einem Bereich der verwendeten Wellenlänge die Lichts.

Für eine Wellenlänge vonλ= 500nmwäre das Auflösungsvermögen bei ∆xmin = 417.4nm.

4.2 Rayleigh-Kriterium der Aufl¨ osung

Nach dem Rayleigh-Kriterium ist die räumliche Auflösungsgrenze durch Beugung wie folgt definiert [11]. Eine beobachtete punktförmige Lichtquelle bildet ein radialsymmetrisches Beugungsmuster wie in Abschnitt 3.2.2 vorgestellt wurde. Das Beugungsmaximum null- ter Ordnung, das Airy-Scheibchen genannt wird, besitzt einen Radius ∆x = r_Airy nach Glg.(3.15). Durch Einführen der Numerischen Apertur NA =nsinα mit D = 2·sinα·f und Multiplizieren mit dem Brechungsindex n kann diese Gleichung auf folgende Form gebracht werden:

∆x= 0.61 λ

nsinα = 0.61 λ

NA (4.3)

Die Numerische Apertur ist das Produkt aus dem Brechungsindexndes optischen Mediums zwischen Objekt und Linse und dem Sinus vom Winkel α, der den halben maximalen Offnungswinkel des Objektives angibt.¨

Nach Rayleigh sind zwei Punktquellen noch r¨aumlich trennbar, wenn das Maximum der Airy-Scheibe der einen Punktquelle, in das Airy-Minimum der anderen Punktquelle f¨allt.

Werden die zwei Punkte näher zueinander geführt, überlappen sich die beiden Airy-Scheibchen und interferieren. Dies soll in Abb. 4.4 dargestellt werden.

(28)

Abb. 4.4 Die Lichtquelle, die die blaue Intensitätsverteilung darstellt, bewegt sich immer näher in Richtung der Lichtquelle, die durch die schwarze Intensitätsverteilung dargestellt wird. Die rote Intensitätsverteilung ergibt sich aus der Interferenz der beiden Lichtquellen und ist als ein- zige beobachtbar.

In der untersten Grafik aus Abb. 4.4 sind noch deutlich zwei Peaks im roten Graph zu erkennen und deshalb beide Punkte getrennt beobachtbar. In der mittleren Grafik sind im roten Graph gerade noch zwei Peaks zu erkennen und die zwei Punkte k¨onnen gerade noch aufgel¨ost werden. In der obersten Grafik haben die beiden Punkte den Mindestabstand

∆xmin nach Glg.(4.3) unterschritten. Es gibt nur noch einen Peak im roten Graph und die beiden Punkte k¨onnen nicht mehr getrennt wahrgenommen, also aufgel¨ost werden.

In Abb. 4.5 ist dieses Zusammenführen von zwei Punktquellen erneut illustriert. Im Bild C sind beide Punkte noch getrennt wahrnehmbar. In Bild B ist die Unterscheidung der beiden Punkte gerade noch möglich, während in Bild C nur mehr ein Punkt erkennbar ist.

(29)

Abb. 4.5 Beugungsscheibchen zweier Punkte in der Beobachtungsebene. Der Abstand der beiden Beugungsscheibchen voneinander betr¨agt 0.6λ/D (A), 1.2λ/D (B) und 2.4λ/D (C) Bild und Bildunterschrift von [5, S.353]

(30)

5 STED Mikroskopie

Eine Motivation f¨ ur Fernfeld-Lichtmikroskopie

Es wurden im Kapitel 4 beschrieben, dass die bestmögliche Auflösung, die mit einem Mikroskop erreicht werden kann, durch Beugung zirka auf die halbe Wellenlänge von Licht begrenzt ist [1]. Das entspricht einer Auflösung von ungefähr 200nm. Dieser Wert berechnet sich aus der Abbe Theorie.

d= λ

2nsinα (5.1)

Diese Formel wurde bereits in Abschnitt 4.1 als Glg.(4.2) vorgestellt, unterscheidet sich allerdings dadurch, dass im Nenner der Faktor 2 dazugekommen ist. Das kann durch einige Manipulationen erreicht werden [12].

Eine bessere Auflösung kann durch Elektronenmikroskopie erreicht werden. Die Bildgebung dabei beschränkt sich jedoch auf Oberflächen und sehr dünne Proben. Des Weiteren ist diese Art der Mikroskopie nicht für die Untersuchung lebender Zellen geeignet. Selbiges Pro- blem ergibt sich bei der Verwendung eines Rastertunnelmikroskops. Licht als Trägerwelle der Information wird bei der Nahfeldmikroskopie eingesetzt. Um jedoch das Nahfeld, also die evaneszenten Wellen eines Objekts zu detektieren, muss man sich dem Objekt auf Bruchteile der Wellenlänge nähern. Das führt jedoch dazu, dass kleinste Unebenheiten eines zu untersuchenden Objekts zum Versagen der Methode führen. Will man kürzere Wellenlängen verwenden und dadurch nach der Formel der Abbe-Theorie aus Glg.(5.1) die Auflösung verbessern, landet man im Spektrum der höherenergetischen Strahlung.

Röntgenmikrokopie wäre ein Beispiel dafür. Jedoch ist auch diese Methode nicht geeignet, um lebende Organismen zu untersuchen, weil Röntgenstrahlung zum sofortigen Zelltod führt. Zur Untersuchung feinster Strukturen organischer Zellen ist es daher erstrebenswert, eine Methode zu finden, die auf Licht-Fernfeld-Mikroskopie basiert.

5.1 Funktionsweise der STED Mikroskopie

Mit Hilfe der STED-Mikroskopie ist dies gelungen. STED steht f¨ur Stimulated Emission Depletion-Mikroskopie. Diese Methode funktioniert mit Hilfe von Fluoreszenz.

Bestimmte Zellteile lassen sich mit fluoreszierenden Markermolekülen versehen, die ein spe- zifisches Fluoreszenzsignal aussenden. Mit einem Laser werden diese Markermoleküle zur Aussendung von Photonen angeregt. Die Markermoleküle können sogar zelleigene Moleküle sein.

(31)

5 STED Mikroskopie

Fluoreszenz

Abb. 5.1 Fluoreszenz eines Markermolek¨uls Bild von [1]

Die Anregung des Fluoreszenzmoleküls geschieht mit Hilfe eines Lasers, hier in Abb. 5.1 grün dargestellt. Das Molekül wird vom niederenergetischen Zustand S₀ in ein Vibra- tionsniveau des höherenergetischeren Zustands S₁ gebracht. Strahlungslos geschieht ein Ubergang in das niedrigste Vibrationsniveau von¨ S₁. Durch spontane Emission kehrt das Molekül wieder in den Grundzustand zurück. Durch diesen Übergang, der in der Abbildung gelb eingezeichnet ist, wird ein Fluoreszenzphoton ausgesendet und das Molekül leuchtet.

Dadurch kann noch keine Verbesserung der Auflösung erreicht werden, denn der Laser, der zur Anregung der Fluoreszenzmoleküle verwendet wird, unterliegt ebenfalls der Beugungs- grenze und kann dadurch maximal auf einen Bereich von zirka der halben Wellenlänge λ/2 des verwendeten Laserlichts fokussiert werden. Es wird nun ein zweiter Laser, der in Abb. 5.2 rot dargestellt ist, verwendet, welcher eine doughnutförmige Intensitätsverteilung besitzt. Das bedeutet, dass die Intensitätsverteilung genau in der Mitte des Strahls eine Nullstelle besitzt. Dieser Laser wird auf die Mitte des grünen Laserpunktes gerichtet, wie in Abb. 5.2 dargestellt ist.

(32)

5 STED Mikroskopie

Abb. 5.2 Aufbau eines STED Mikroskops Bild von [1]

Dieser rote Laser, der als STED-Strahl bezeichnet wird, bewirkt bei den Markermolekülen eine stimulierte Emission. Seine Energie reicht jedoch nicht aus, um ein Molekül vom Zustand S0 in einen angeregten Zustand S1 zu bringen. Es werden also Moleküle, die durch den grünen Laser in den Zustand S1 gebracht wurden, durch den roten Laser sofort wieder in den Zustand S₀ gebracht. Diese stimulierte Emission findet jedoch nicht in der Mitte des roten Lasers statt, da dort durch seine doughnutförmige Intensitätsverteilung keine Energie zur Anregung der Emission vorhanden ist. Es befinden sich nun nur noch in der Mitte des roten Laserstrahls Moleküle in einem fluoreszierenden hellen Zustand Aund außerhalb diese Bereichs nicht fluoreszierende dunkle Moleküle im Zustand B.

Diese An- und Abregung wird mit synchronisierten Lichtpulsen, die eine Länge zwischen 100 und 300pshaben, realisiert. Nach der stimulierten Abregung befinden sich die Moleküle in einem höheren Vibrationsniveau von S0 und fallen in einer Femtosekunde weiter in ein niedrigeres Vibrationsniveau von S0. Abgeregte Moleküle können also nicht sofort wieder angeregt werden.

Um durch diese Methoden mit dem doughnutförmigen Laser eine hohe Auflösung zu erhalten, wird nun versucht, das Intensitätsminimum räumlich möglichst klein zu halten, damit nur ein kleiner Bereich der Probe fluoresziert. Der Doughnut wird mit Hilfe eines helika- len Phasenspiegels wie in Abb. 5.2 angedeutet erzeugt. Doch auch die Halbwertsbreite des Doughnutlochs unterliegt der Beugung. Es ist nicht einfach möglich, die Halbwertsbreite unter 150 nm zu bringen. Um diesen Bereich dennoch klein zu halten, wird die Intensität des roten Doughnutlasers verändert.

(33)

5 STED Mikroskopie

In Abb. 5.1 ist in der rechen Seite des Bilds eine Besetzungswahrscheinlichkeit vom fluo- reszenzfähigen Zustand S₁ in Abhängigkeit der Intensität des STED-Strahls dargestellt.

Man erkennt eine nahezu exponentielle Abnahme der Besetzungswahrscheinlichkeit mit steigender Intensität des STED-Strahls. Wenn die Intensität des roten Doughnut-Lasers nun erhöht wird, steigt die Intensität auch zur Mitte des Rings an, bleibt in der Mitte selbst aber nahezu null. Durch diesen Vorgang kann das Intensitätsminimum verkleinert werden und somit der Bereich, in dem die Probe fluoresziert, räumlich verkleinert werden.

Alle Lichtwellen werden weiterhin gebeugt. Durch Rasterung der Probe also Bewegen der beiden Laserstrahlen über die Probe werden Bereiche einzeln detektiert und später als Gesamtbild zusammengesetzt. Vorstellen kann man sich das wie in Abb. 4.4. Zwei Teilchen werden einzeln detektiert und ihre Position zeitlich getrennt voneinander bestimmt. Beide ausgesendeten Lichtwellen unterliegen einzeln der Beugung. Ihre Position kann jedoch sehr genau durch das Maximum ihrer Intensitätsverteilung bestimmt werden. Weil die Wellen einzeln betrachtet werden können, gibt es keine Interferenz mit einer benachbarten Welle.

Deshalb kann das Intensit¨atsmaximum als Position des Teilchens oder Molek¨uls, von dem die Lichtwelle ausgesendet wurden, angesehen werden.

Die Auflösung ist nicht mehr durch die Interferenz des ausgesendeten Lichts benachbarter Teilchen begrenzt, sondern nur noch durch die Größe des Rings des Doughnut-Lasers. Der Physiker Stefan Hell, der die STED Methode entwickelt und dafür 2014 den Nobelpreis in Chemie erhalten hat, gibt für die Auflösung eines STED-Mikroskops folgende Formel an:[2]

∆xmin = λ

2nsinαp

1 +I_m/I_s (5.2)

Die Formel des Abbe-Limits aus Glg.(5.1) wird um einen Wurzelterm im Z¨ahler erweitert.

I_m gibt die Intensität des STED-Strahls an und I_s ist die Sättigungsintensität. Ab dieser Intensität ist die Besetzungswahrscheinlichkeit von S1, also die Fluoreszenzfähigkeit des Molekül auf unter 50 Prozent gesunken, was auch in Abb. 5.1 rechts dargestellt ist.

Es ist nun m¨oglich, Strukturen mit einem Fernfeld-Lichtmikroskop unterhalb der Beu- gungsgrenze aufzul¨osen.

(34)

5 STED Mikroskopie

Abb. 5.3 Gegen¨uberstellung zweier Aufnahmen, die (a) mit einem Konfokal-Mikroskop und (b) mit einem STED-Mikroskop gemacht wurden.

Bild und Bildunterschriften von[1]

In Abb. 5.3 wird ein Beispiel für die STED-Methode vorgestellt. Beide Bilder zeigen fluoreszierende Latexkügelchen. Das linke Bild stammt von einer Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop. Man erkennt, dass die Latexkügelchen, die einen Durchmesser von zirka 40nm haben, nicht aufgelöst werden können. Beim rechten Bild, das mit einem STED-Mikroskop aufgenommen wurde, sind die einzelnen Kügelchen klar unterscheidbar. Durch dieses hohe Auflösungsvermögen hat die STED-Mikroskopie eine große Bedeutung in der medizinischen Forschung oder der Materialforschung.

5.2 Begrenzung der STED-Methode

In Glg.(5.2) ist abzulesen, dass das Auflösungsvermögen eines STED-Mikroskops mit einer Wurzelfunktion der IntensitätIm des Doughnuts also ∆xmin ∝ √ ¹

1+Im/Is

abnimmt. Dieser Zusammenhang resultiert daraus, dass der Intensitätsverlauf an der Nullstelle, also beim Loch des Dounughts, in erster Näherung parabolisch ist. Im Prinzip könnte bei einem Intensitätsverhältnis Im/Is → ∞ die Auflösung ∆xmin → 0 erreicht werden. Das ist aber deshalb nicht möglich, weil bei zu hoher Intensität des Doungnutstrahls die Intensität im Zentrum nicht mehr null beträgt und dadurch die Methode nicht mehr funktioniert.

Eine kritische Grenze der Intensität am Minimum ist I = 0.02I_m. Die Intensität I_m des Doughnuts kann also nicht beliebig hoch gewählt werden, um die Halbwertsbreite des Lochs im Doughnut zu verkleinern.

Ein weiteres Problem kann Photobleichen des Farbstoffs sein. Die Fluoreszenzmolek¨ule k¨onnen dabei in einen angeregten Dunkelzustand, einen sogenannten metastabilen Triplett-

(35)

5 STED Mikroskopie

Zustand T_n geraten. In diesem Zustand können weitere Photonen aufgenommen werden und das Molekül durch eine Konformationsänderung zu einem anderen Molekül werden.

Dieser unerw¨unschte Effekt kann verhindert werden, indem zwischen den Pulspaaren ein zeitlicher Abstand von etwa einer Mikrosekunde gelassen wird.

5.3 Ausblick auf weitere Entwicklungen um die STED-Mikroskopie

Das Wesentliche der STED-Mikroskopie ist die Intensitätsverteilung eines Laserstrahls mit einer zentralen Nullstelle. Diese Tatsache lässt es auch zu, dass man diese Nullstelle in Rich- tung der optischen Achse mit einer geringen Halbwertsbreite einstellt. Dadurch kann eine axiale Auflösung von zirka 100nmerreicht werden. In Kombination des STED-Mikroskops mit einem 4Pi-Mikroskop kann durch destruktive Interferenz zweier Lichtwellen, die sich in entgegengesetzte Richtung bewegen, eine entsprechende Verkleinerung der Nullstelle erreicht werden, womit eine axiale Auflösung von 30 bis 60 nmmöglich ist [13].

Das Prinzip der eingesetzten Markermoleküle dient in der STED-Mikroskopie dazu, zwei verschiedene ZuständeAundBoder Ein und Aus zu erzeugen. Im Prinzip können an Stelle der fluoreszierenden Markermoleküle auch andere messbare Signale als Marker verwendet werden. Denkbar hierfür wäre zum Beispiel Wärme. Auch damit könnte man die Abbesche Beugungsgrenze umgehen. Es wird erwartet, dass in Zukunft andere Kontrastverfahren für die optische Fernfeldmikrokopie aufkommen werden.

(36)

6 Fazit

Der wesentliche Teil dieser Arbeit beschäftigt sich damit, das beschränkte Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops zu beschreiben. Aufgrund der Beugung von Wellen ist eine bestmögliche Auflösung durch die Wellenlänge des Lichts begrenzt und liegt bei zirka 200nm[2]. Dieser Zusammenhang ist mit den beiden Gleichungen des Abbe-Theorems [1] Glg.(6.1) und des Rayleigh-Kriteriums [11] Glg.(6.2) beschrieben.

∆x_min = λ

2nsinα = λ

2 NA (6.1)

∆x_min = 0.61 λ

nsinα = 0.61 λ

NA (6.2)

Es kann jedoch trotzdem eine bessere Aufl¨osung mit einem Lichtmikroskop erreicht werden.

Die STED-Mikroskopie macht es möglich, eine Auflösung von 20 nm und besser zu errei- chen [1]. Entscheidend dabei ist, dass die Beugungsgrenze bei dieser Methoden keineswegs verletzt ist. Alle Lichtwellen werden auch in einem STED-Mikroskop gebeugt. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmolekülen des STED-Strahls und Rasterung der Probe kann das Beugungsproblem umgangen werden, sodass ein Auflösungsvermögen um 20 mn möglich ist. Das führt zu einer Erweiterung des Abbe-Theorems.

∆x_min = λ

2nsinαp

1 +I_m/I_s (6.3)

Diese nun deutliche Verbesserung des Auflösungsvermögens ist von großer Bedeutung etwa für Biowissenschaften oder die Materialforschung. Viele Proteinreaktionen finden in einem Maßstab von 10 bis 200 nm statt. Durch die STED-Mikroskopie ist es möglich, diese Prozesse zu beobachten.

(37)

Abbildungsverzeichnis

2.1 Darstellung eine Welle . . . 3

2.2 Evaneszente Wellen . . . 7

2.3 Der sichtbare Bereich des elektromagnetischen Spektrums . . . 8

2.4 Licht als elektromagnetische Welle . . . 9

3.1 Huygenssches Prinzip . . . 10

3.2 Beschreibung der Beugung am Spalt durch das Huygenssche Prinzip . . . . 11

3.3 Intensit¨atsverteilung hinter einem Spalt . . . 13

3.4 Skalare Punktquellen . . . 14

3.5 Kirchhoffs Theorem . . . 14

3.6 Interpretation des Neigungsfaktors . . . 16

3.7 Fraunhofer-Beugung . . . 17

3.8 Beugung an der kreisf¨ormigen Lochblende . . . 19

3.9 Beugung an der kreisf¨ormigen ¨Offnung . . . 20

4.1 Beugung am Doppelspalt . . . 21

4.2 Intensit¨atsverteilung bei Beugung am Doppelspalt . . . 22

4.3 Abbe’sche Theorie zur Bildentstehung im Mikroskop . . . 23

4.4 Rayleigh-Kriterium . . . 25

4.5 Beugungsscheibchen . . . 26

5.1 Fluoreszenz eines Markermolek¨uls . . . 28

5.2 Aufbau eines STED Mikroskops . . . 29

5.3 Bild mit einem STED-Mikroskop . . . 31

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Literatur

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[5] Stefan Roth and Achim Stahl. Optik: Experimentalphysik–anschaulich erkl¨art.

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International Journal of Optics, 28(12):1691–1701, 1981.

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