Die Situation ist in Abb. 4.3 dargestellt. Zur Entstehung der beiden Bilder B1 und B2 ist sowohl die +1. als auch die −1. Beugungsordnung notwendig. Daraus folgt, das die ObjektivlinseL1 groß genug sein muss, um das±1.Beugungsmaxima, dass mit dem Winkel θ1 zur Ausbreitungsrichtung des einfallenden Lichts entsteht, einzufangen.
Um dieses Kriterium zu erf¨ullen, muss die Numerische Apertur NA des Mikroskops mit einem Brechungsindex n und dem halben ¨Offnungswinkel des Objektives α folgendes Kri-terium erf¨ullen:
NA =nsinα > nsinθ1 = λ d
Die Aufl¨osung eines optischen Instruments ergibt sich dann aus dem kleinstm¨oglichen Ab-stand ∆xmin =d.
d> λ
nsinα = λ
NA (4.2)
Dieser minimale Abstand wird als Abbe-Limit bezeichnet. Strukturen unter dieser Grenze
4 Beugung als Grenze des Aufl¨osungsverm¨ogen eines Mikroskops
k¨onnen durch konventionelle Lichtmikroskopie nicht mehr aufgel¨ost werden.
Das Aufl¨osungsverm¨ogen ist abh¨angig von der Wellenl¨ange des verwendeten Lichts und der Numerischen Apertur beziehungsweise des Brechungsindex n eines verwendeten Immersi-ons¨ols und dem Winkel αmax, unter dem Licht von der Linse noch eingefangen werden kann.
An dieser Stelle sei ein Beispiel angef¨uhrt. Der Brechungsindex eines Immersions¨ols betr¨agt n= 1.5. Der Einfallswinkelαmaxseiα= 53◦. Damit betr¨agt das Aufl¨osungsverm¨ogen nach Glg.(4.2):
∆xmin = λ
1.5 sin (53◦) ≈ λ 1.19
Die bestm¨ogliche Aufl¨osung liegt in einem Bereich der verwendeten Wellenl¨ange die Lichts.
F¨ur eine Wellenl¨ange vonλ= 500nmw¨are das Aufl¨osungsverm¨ogen bei ∆xmin = 417.4nm.
4.2 Rayleigh-Kriterium der Aufl¨ osung
Nach dem Rayleigh-Kriterium ist die r¨aumliche Aufl¨osungsgrenze durch Beugung wie folgt definiert [11]. Eine beobachtete punktf¨ormige Lichtquelle bildet ein radialsymmetrisches Beugungsmuster wie in Abschnitt 3.2.2 vorgestellt wurde. Das Beugungsmaximum null-ter Ordnung, das Airy-Scheibchen genannt wird, besitzt einen Radius ∆x = rAiry nach Glg.(3.15). Durch Einf¨uhren der Numerischen Apertur NA =nsinα mit D = 2·sinα·f und Multiplizieren mit dem Brechungsindex n kann diese Gleichung auf folgende Form gebracht werden:
∆x= 0.61 λ
nsinα = 0.61 λ
NA (4.3)
Die Numerische Apertur ist das Produkt aus dem Brechungsindexndes optischen Mediums zwischen Objekt und Linse und dem Sinus vom Winkel α, der den halben maximalen Offnungswinkel des Objektives angibt.¨
Nach Rayleigh sind zwei Punktquellen noch r¨aumlich trennbar, wenn das Maximum der Airy-Scheibe der einen Punktquelle, in das Airy-Minimum der anderen Punktquelle f¨allt.
Werden die zwei Punkte n¨aher zueinander gef¨uhrt, ¨uberlappen sich die beiden Airy-Scheibchen und interferieren. Dies soll in Abb. 4.4 dargestellt werden.
4 Beugung als Grenze des Aufl¨osungsverm¨ogen eines Mikroskops
Abb. 4.4 Die Lichtquelle, die die blaue Intensit¨atsverteilung darstellt, bewegt sich immer n¨aher in Richtung der Lichtquelle, die durch die schwarze Intensit¨atsverteilung dargestellt wird. Die rote Intensit¨atsverteilung ergibt sich aus der Interferenz der beiden Lichtquellen und ist als ein-zige beobachtbar.
In der untersten Grafik aus Abb. 4.4 sind noch deutlich zwei Peaks im roten Graph zu erkennen und deshalb beide Punkte getrennt beobachtbar. In der mittleren Grafik sind im roten Graph gerade noch zwei Peaks zu erkennen und die zwei Punkte k¨onnen gerade noch aufgel¨ost werden. In der obersten Grafik haben die beiden Punkte den Mindestabstand
∆xmin nach Glg.(4.3) unterschritten. Es gibt nur noch einen Peak im roten Graph und die beiden Punkte k¨onnen nicht mehr getrennt wahrgenommen, also aufgel¨ost werden.
In Abb. 4.5 ist dieses Zusammenf¨uhren von zwei Punktquellen erneut illustriert. Im Bild C sind beide Punkte noch getrennt wahrnehmbar. In Bild B ist die Unterscheidung der beiden Punkte gerade noch m¨oglich, w¨ahrend in Bild C nur mehr ein Punkt erkennbar ist.
4 Beugung als Grenze des Aufl¨osungsverm¨ogen eines Mikroskops
Abb. 4.5 Beugungsscheibchen zweier Punkte in der Beobachtungsebene. Der Abstand der bei-den Beugungsscheibchen voneinander betr¨agt 0.6λ/D (A), 1.2λ/D (B) und 2.4λ/D (C) Bild und Bildunterschrift von [5, S.353]
5 STED Mikroskopie
5 STED Mikroskopie
Eine Motivation f¨ ur Fernfeld-Lichtmikroskopie
Es wurden im Kapitel 4 beschrieben, dass die bestm¨ogliche Aufl¨osung, die mit einem Mikroskop erreicht werden kann, durch Beugung zirka auf die halbe Wellenl¨ange von Licht begrenzt ist [1]. Das entspricht einer Aufl¨osung von ungef¨ahr 200nm. Dieser Wert berechnet sich aus der Abbe Theorie.
d= λ
2nsinα (5.1)
Diese Formel wurde bereits in Abschnitt 4.1 als Glg.(4.2) vorgestellt, unterscheidet sich allerdings dadurch, dass im Nenner der Faktor 2 dazugekommen ist. Das kann durch einige Manipulationen erreicht werden [12].
Eine bessere Aufl¨osung kann durch Elektronenmikroskopie erreicht werden. Die Bildgebung dabei beschr¨ankt sich jedoch auf Oberfl¨achen und sehr d¨unne Proben. Des Weiteren ist diese Art der Mikroskopie nicht f¨ur die Untersuchung lebender Zellen geeignet. Selbiges Pro-blem ergibt sich bei der Verwendung eines Rastertunnelmikroskops. Licht als Tr¨agerwelle der Information wird bei der Nahfeldmikroskopie eingesetzt. Um jedoch das Nahfeld, al-so die evaneszenten Wellen eines Objekts zu detektieren, muss man sich dem Objekt auf Bruchteile der Wellenl¨ange n¨ahern. Das f¨uhrt jedoch dazu, dass kleinste Unebenheiten eines zu untersuchenden Objekts zum Versagen der Methode f¨uhren. Will man k¨urzere Wellenl¨angen verwenden und dadurch nach der Formel der Abbe-Theorie aus Glg.(5.1) die Aufl¨osung verbessern, landet man im Spektrum der h¨oherenergetischen Strahlung.
R¨ontgenmikrokopie w¨are ein Beispiel daf¨ur. Jedoch ist auch diese Methode nicht geeig-net, um lebende Organismen zu untersuchen, weil R¨ontgenstrahlung zum sofortigen Zelltod f¨uhrt. Zur Untersuchung feinster Strukturen organischer Zellen ist es daher erstrebenswert, eine Methode zu finden, die auf Licht-Fernfeld-Mikroskopie basiert.
5.1 Funktionsweise der STED Mikroskopie
Mit Hilfe der STED-Mikroskopie ist dies gelungen. STED steht f¨ur Stimulated Emission Depletion-Mikroskopie. Diese Methode funktioniert mit Hilfe von Fluoreszenz.
Bestimmte Zellteile lassen sich mit fluoreszierenden Markermolek¨ulen versehen, die ein spe-zifisches Fluoreszenzsignal aussenden. Mit einem Laser werden diese Markermolek¨ule zur Aussendung von Photonen angeregt. Die Markermolek¨ule k¨onnen sogar zelleigene Molek¨ule sein.
5 STED Mikroskopie
Fluoreszenz
Abb. 5.1 Fluoreszenz eines Markermolek¨uls Bild von [1]
Die Anregung des Fluoreszenzmolek¨uls geschieht mit Hilfe eines Lasers, hier in Abb. 5.1 gr¨un dargestellt. Das Molek¨ul wird vom niederenergetischen Zustand S0 in ein Vibra-tionsniveau des h¨oherenergetischeren Zustands S1 gebracht. Strahlungslos geschieht ein Ubergang in das niedrigste Vibrationsniveau von¨ S1. Durch spontane Emission kehrt das Molek¨ul wieder in den Grundzustand zur¨uck. Durch diesen ¨Ubergang, der in der Abbildung gelb eingezeichnet ist, wird ein Fluoreszenzphoton ausgesendet und das Molek¨ul leuchtet.
Dadurch kann noch keine Verbesserung der Aufl¨osung erreicht werden, denn der Laser, der zur Anregung der Fluoreszenzmolek¨ule verwendet wird, unterliegt ebenfalls der Beugungs-grenze und kann dadurch maximal auf einen Bereich von zirka der halben Wellenl¨ange λ/2 des verwendeten Laserlichts fokussiert werden. Es wird nun ein zweiter Laser, der in Abb. 5.2 rot dargestellt ist, verwendet, welcher eine doughnutf¨ormige Intensit¨atsverteilung besitzt. Das bedeutet, dass die Intensit¨atsverteilung genau in der Mitte des Strahls eine Nullstelle besitzt. Dieser Laser wird auf die Mitte des gr¨unen Laserpunktes gerichtet, wie in Abb. 5.2 dargestellt ist.
5 STED Mikroskopie
Abb. 5.2 Aufbau eines STED Mikroskops Bild von [1]
Dieser rote Laser, der als STED-Strahl bezeichnet wird, bewirkt bei den Markermolek¨ulen eine stimulierte Emission. Seine Energie reicht jedoch nicht aus, um ein Molek¨ul vom Zustand S0 in einen angeregten Zustand S1 zu bringen. Es werden also Molek¨ule, die durch den gr¨unen Laser in den Zustand S1 gebracht wurden, durch den roten Laser sofort wieder in den Zustand S0 gebracht. Diese stimulierte Emission findet jedoch nicht in der Mitte des roten Lasers statt, da dort durch seine doughnutf¨ormige Intensit¨atsverteilung keine Energie zur Anregung der Emission vorhanden ist. Es befinden sich nun nur noch in der Mitte des roten Laserstrahls Molek¨ule in einem fluoreszierenden hellen Zustand Aund außerhalb diese Bereichs nicht fluoreszierende dunkle Molek¨ule im Zustand B.
Diese An- und Abregung wird mit synchronisierten Lichtpulsen, die eine L¨ange zwischen 100 und 300pshaben, realisiert. Nach der stimulierten Abregung befinden sich die Molek¨ule in einem h¨oheren Vibrationsniveau von S0 und fallen in einer Femtosekunde weiter in ein niedrigeres Vibrationsniveau von S0. Abgeregte Molek¨ule k¨onnen also nicht sofort wieder angeregt werden.
Um durch diese Methoden mit dem doughnutf¨ormigen Laser eine hohe Aufl¨osung zu erhal-ten, wird nun versucht, das Intensit¨atsminimum r¨aumlich m¨oglichst klein zu halten, damit nur ein kleiner Bereich der Probe fluoresziert. Der Doughnut wird mit Hilfe eines helika-len Phasenspiegels wie in Abb. 5.2 angedeutet erzeugt. Doch auch die Halbwertsbreite des Doughnutlochs unterliegt der Beugung. Es ist nicht einfach m¨oglich, die Halbwertsbreite unter 150 nm zu bringen. Um diesen Bereich dennoch klein zu halten, wird die Intensit¨at des roten Doughnutlasers ver¨andert.
5 STED Mikroskopie
In Abb. 5.1 ist in der rechen Seite des Bilds eine Besetzungswahrscheinlichkeit vom fluo-reszenzf¨ahigen Zustand S1 in Abh¨angigkeit der Intensit¨at des STED-Strahls dargestellt.
Man erkennt eine nahezu exponentielle Abnahme der Besetzungswahrscheinlichkeit mit steigender Intensit¨at des STED-Strahls. Wenn die Intensit¨at des roten Doughnut-Lasers nun erh¨oht wird, steigt die Intensit¨at auch zur Mitte des Rings an, bleibt in der Mitte selbst aber nahezu null. Durch diesen Vorgang kann das Intensit¨atsminimum verkleinert werden und somit der Bereich, in dem die Probe fluoresziert, r¨aumlich verkleinert werden.
Alle Lichtwellen werden weiterhin gebeugt. Durch Rasterung der Probe also Bewegen der beiden Laserstrahlen ¨uber die Probe werden Bereiche einzeln detektiert und sp¨ater als Gesamtbild zusammengesetzt. Vorstellen kann man sich das wie in Abb. 4.4. Zwei Teilchen werden einzeln detektiert und ihre Position zeitlich getrennt voneinander bestimmt. Beide ausgesendeten Lichtwellen unterliegen einzeln der Beugung. Ihre Position kann jedoch sehr genau durch das Maximum ihrer Intensit¨atsverteilung bestimmt werden. Weil die Wellen einzeln betrachtet werden k¨onnen, gibt es keine Interferenz mit einer benachbarten Welle.
Deshalb kann das Intensit¨atsmaximum als Position des Teilchens oder Molek¨uls, von dem die Lichtwelle ausgesendet wurden, angesehen werden.
Die Aufl¨osung ist nicht mehr durch die Interferenz des ausgesendeten Lichts benachbarter Teilchen begrenzt, sondern nur noch durch die Gr¨oße des Rings des Doughnut-Lasers. Der Physiker Stefan Hell, der die STED Methode entwickelt und daf¨ur 2014 den Nobelpreis in Chemie erhalten hat, gibt f¨ur die Aufl¨osung eines STED-Mikroskops folgende Formel an:[2]
∆xmin = λ
2nsinαp
1 +Im/Is (5.2)
Die Formel des Abbe-Limits aus Glg.(5.1) wird um einen Wurzelterm im Z¨ahler erweitert.
Im gibt die Intensit¨at des STED-Strahls an und Is ist die S¨attigungsintensit¨at. Ab dieser Intensit¨at ist die Besetzungswahrscheinlichkeit von S1, also die Fluoreszenzf¨ahigkeit des Molek¨ul auf unter 50 Prozent gesunken, was auch in Abb. 5.1 rechts dargestellt ist.
Es ist nun m¨oglich, Strukturen mit einem Fernfeld-Lichtmikroskop unterhalb der Beu-gungsgrenze aufzul¨osen.
5 STED Mikroskopie
Abb. 5.3 Gegen¨uberstellung zweier Aufnahmen, die (a) mit einem Konfokal-Mikroskop und (b) mit einem STED-Mikroskop gemacht wurden.
Bild und Bildunterschriften von[1]
In Abb. 5.3 wird ein Beispiel f¨ur die STED-Methode vorgestellt. Beide Bilder zeigen fluores-zierende Latexk¨ugelchen. Das linke Bild stammt von einer Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop. Man erkennt, dass die Latexk¨ugelchen, die einen Durchmesser von zirka 40nm haben, nicht aufgel¨ost werden k¨onnen. Beim rechten Bild, das mit einem STED-Mikroskop aufgenommen wurde, sind die einzelnen K¨ugelchen klar unterscheidbar. Durch dieses hohe Aufl¨osungsverm¨ogen hat die STED-Mikroskopie eine große Bedeutung in der medizinischen Forschung oder der Materialforschung.
5.2 Begrenzung der STED-Methode
In Glg.(5.2) ist abzulesen, dass das Aufl¨osungsverm¨ogen eines STED-Mikroskops mit einer Wurzelfunktion der Intensit¨atIm des Doughnuts also ∆xmin ∝ √ 1
1+Im/Is
abnimmt. Dieser Zusammenhang resultiert daraus, dass der Intensit¨atsverlauf an der Nullstelle, also beim Loch des Dounughts, in erster N¨aherung parabolisch ist. Im Prinzip k¨onnte bei einem Intensit¨atsverh¨altnis Im/Is → ∞ die Aufl¨osung ∆xmin → 0 erreicht werden. Das ist aber deshalb nicht m¨oglich, weil bei zu hoher Intensit¨at des Doungnutstrahls die Intensit¨at im Zentrum nicht mehr null betr¨agt und dadurch die Methode nicht mehr funktioniert.
Eine kritische Grenze der Intensit¨at am Minimum ist I = 0.02Im. Die Intensit¨at Im des Doughnuts kann also nicht beliebig hoch gew¨ahlt werden, um die Halbwertsbreite des Lochs im Doughnut zu verkleinern.
Ein weiteres Problem kann Photobleichen des Farbstoffs sein. Die Fluoreszenzmolek¨ule k¨onnen dabei in einen angeregten Dunkelzustand, einen sogenannten metastabilen
Triplett-5 STED Mikroskopie
Zustand Tn geraten. In diesem Zustand k¨onnen weitere Photonen aufgenommen werden und das Molek¨ul durch eine Konformations¨anderung zu einem anderen Molek¨ul werden.
Dieser unerw¨unschte Effekt kann verhindert werden, indem zwischen den Pulspaaren ein zeitlicher Abstand von etwa einer Mikrosekunde gelassen wird.
5.3 Ausblick auf weitere Entwicklungen um die STED-Mikroskopie
Das Wesentliche der STED-Mikroskopie ist die Intensit¨atsverteilung eines Laserstrahls mit einer zentralen Nullstelle. Diese Tatsache l¨asst es auch zu, dass man diese Nullstelle in Rich-tung der optischen Achse mit einer geringen Halbwertsbreite einstellt. Dadurch kann eine axiale Aufl¨osung von zirka 100nmerreicht werden. In Kombination des STED-Mikroskops mit einem 4Pi-Mikroskop kann durch destruktive Interferenz zweier Lichtwellen, die sich in entgegengesetzte Richtung bewegen, eine entsprechende Verkleinerung der Nullstelle erreicht werden, womit eine axiale Aufl¨osung von 30 bis 60 nmm¨oglich ist [13].
Das Prinzip der eingesetzten Markermolek¨ule dient in der STED-Mikroskopie dazu, zwei verschiedene Zust¨andeAundBoder Ein und Aus zu erzeugen. Im Prinzip k¨onnen an Stelle der fluoreszierenden Markermolek¨ule auch andere messbare Signale als Marker verwendet werden. Denkbar hierf¨ur w¨are zum Beispiel W¨arme. Auch damit k¨onnte man die Abbesche Beugungsgrenze umgehen. Es wird erwartet, dass in Zukunft andere Kontrastverfahren f¨ur die optische Fernfeldmikrokopie aufkommen werden.
6 Fazit
6 Fazit
Der wesentliche Teil dieser Arbeit besch¨aftigt sich damit, das beschr¨ankte Aufl¨osungsverm¨ogen eines Lichtmikroskops zu beschreiben. Aufgrund der Beugung von Wellen ist eine bestm¨ogliche Aufl¨osung durch die Wellenl¨ange des Lichts begrenzt und liegt bei zirka 200nm[2]. Dieser Zusammenhang ist mit den beiden Gleichungen des Abbe-Theorems [1] Glg.(6.1) und des Rayleigh-Kriteriums [11] Glg.(6.2) beschrieben.
∆xmin = λ
2nsinα = λ
2 NA (6.1)
∆xmin = 0.61 λ
nsinα = 0.61 λ
NA (6.2)
Es kann jedoch trotzdem eine bessere Aufl¨osung mit einem Lichtmikroskop erreicht werden.
Die STED-Mikroskopie macht es m¨oglich, eine Aufl¨osung von 20 nm und besser zu errei-chen [1]. Entscheidend dabei ist, dass die Beugungsgrenze bei dieser Methoden keineswegs verletzt ist. Alle Lichtwellen werden auch in einem STED-Mikroskop gebeugt. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmolek¨ulen des STED-Strahls und Rasterung der Probe kann das Beugungsproblem umgangen werden, sodass ein Aufl¨osungsverm¨ogen um 20 mn m¨oglich ist. Das f¨uhrt zu einer Erweiterung des Abbe-Theorems.
∆xmin = λ
2nsinαp
1 +Im/Is (6.3)
Diese nun deutliche Verbesserung des Aufl¨osungsverm¨ogens ist von großer Bedeutung etwa f¨ur Biowissenschaften oder die Materialforschung. Viele Proteinreaktionen finden in einem Maßstab von 10 bis 200 nm statt. Durch die STED-Mikroskopie ist es m¨oglich, diese Prozesse zu beobachten.
Abbildungsverzeichnis
2.1 Darstellung eine Welle . . . 3
2.2 Evaneszente Wellen . . . 7
2.3 Der sichtbare Bereich des elektromagnetischen Spektrums . . . 8
2.4 Licht als elektromagnetische Welle . . . 9
3.1 Huygenssches Prinzip . . . 10
3.2 Beschreibung der Beugung am Spalt durch das Huygenssche Prinzip . . . . 11
3.3 Intensit¨atsverteilung hinter einem Spalt . . . 13
3.4 Skalare Punktquellen . . . 14
3.5 Kirchhoffs Theorem . . . 14
3.6 Interpretation des Neigungsfaktors . . . 16
3.7 Fraunhofer-Beugung . . . 17
3.8 Beugung an der kreisf¨ormigen Lochblende . . . 19
3.9 Beugung an der kreisf¨ormigen ¨Offnung . . . 20
4.1 Beugung am Doppelspalt . . . 21
4.2 Intensit¨atsverteilung bei Beugung am Doppelspalt . . . 22
4.3 Abbe’sche Theorie zur Bildentstehung im Mikroskop . . . 23
4.4 Rayleigh-Kriterium . . . 25
4.5 Beugungsscheibchen . . . 26
5.1 Fluoreszenz eines Markermolek¨uls . . . 28
5.2 Aufbau eines STED Mikroskops . . . 29
5.3 Bild mit einem STED-Mikroskop . . . 31
Literatur
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