Struktur und Interaktion der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch

Struktur und Interaktion der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

vorgelegt von Žarko Kulić

an der

Mathematisch Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie

Tag der mündlichen Prüfung: 05.03.2015 1. Referent: Prof. Dr. Heiko M. Möller

2. Referent: Prof. Dr. Wolfram Welte

Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-0-283450

„I’ve missed more than 9000 shots in my career.

I’ve lost almost 300 games. 26 times, I’ve been trusted to take the game winning shot, and missed.

I’ve failed over and over again in my life.

And that’s why I succeed.“

- Michael Jordan

Danksagungen

Die vorliegende Arbeit entstand von Oktober 2009 bis August 2014 an der Universität Konstanz in der Arbeitsgruppe für biomolekulare NMR-Spektroskopie von Prof. Dr. Heiko Möller im Fachbereich Chemie.

Ich möchte mich bei Prof. Dr. Heiko Möller für die stets zuverlässige Betreuung bedanken.

Seine Fachkompetenz und seine Art Wissen zu vermitteln hatte einen großen Einfluss auf das Gelingen dieser Arbeit, und hat sowohl bei meiner wissenschaftlichen als auch persönlichen Entwicklung eine zentrale Rolle gespielt.

Herrn Prof. Dr. Wolfram Welte danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens, für viele hilfreiche Diskussionen sowie die Möglichkeit Laborressourcen seiner Arbeitsgruppe mitzubenutzen.

Herrn PD Dr. Günter Fritz danke ich für die vielen fachlichen Diskussionen und Anregungen rund um die Molekularbiologie und Proteinbiochemie.

Frau Prof. Dr. Claudia Stürmer danke ich für die Möglichkeit Laboreinrichtungen der Arbeitsgruppe Stürmer mitzubenutzen, sowie für viele Diskussionen rund um das Thema Neurolin.

Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann danke ich für die Seminare innerhalb seiner Arbeitsgruppe, welche mich immer wieder vor die Herausforderung gestellt haben, mein Thema „Fachfremden“ anschaulich zu erklären.

Anke Friemel und Ulrich Haunz danke ich für die zahllosen Hilfestellungen bei NMR- Messungen.

Ulrike Binkle und Florian Wedekink danke ich für die Hilfe im Labor, sowie die Produktion der Antikörper.

Allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Möller danke ich für das tolle Arbeitsklima. Besonders bedanken möchte ich mich bei Ruslan Nedielkov, der immer sehr hilfsbereit war, sei es bei Fragen rund um Software, oder der kritischen Durchsicht des Manuskripts. Auch die vielen Freizeit- und Sportaktivitäten innerhalb und außerhalb der Arbeitsgruppe haben mit Ruslan sehr viel Spaß gemacht. David Witte, Dominik Gauss,

Christina Walker und Andreas Prestel haben für eine sehr freundschaftliche Atmosphäre in den Labors gesorgt, und waren immer sehr hilfsbereit.

Meinen Praktikanten, Hiwis, Bachelor- und Master-Studenten Philipp Ansorge, Andrej Jackel, Stefan Weise, Torben Seitz, Philipp Eyring, Florian Wedekink und Tobias Lange danke ich für die helfenden Hände bei den experimentellen Arbeiten. Besonders möchte ich mich bei Tobias Lange für die kritische Durchsicht des Manuskripts bedanken.

Den Mitgliedern der Arbeitsgruppe Wittmann möchte ich für die vielen interessanten Seminare und die Ausflüge danken. Besonders bedanken möchte ich mich bei Torben Seitz, welcher mich bei meinem ersten Konferenzvortrag in Finnland unterstützt hat, das Manuskript korrigiert hat, sowie für sportliche Herausforderungen innerhalb und außerhalb der Uni gesorgt hat.

Der Graduiertenschule Chemische Biologie und dem Young Scholar Fund der Universität Konstanz danke ich für die Finanzierung des Projekts und für die Möglichkeit an Lehrangeboten wie Kursen oder Retreats sowohl teilzunehmen, als auch mitzuwirken.

Den Kärcher Brothers Stefan und Hans-Peter möchte ich für die kurzweiligen Freizeitaktivitäten außerhalb der Uni wie zum Beispiel den Floßbau danken.

Frau Sandra Eibler danke ich für die Möglichkeit des sehr flexiblen Nebenverdienstes in Ihrer Apotheke während meines fast kompletten Studiums.

Mein größter Dank gilt meinen Eltern Jela und Albert Kulić für die emotionale und finanzielle Unterstützung während meiner gesamten Ausbildung und für das Erschaffen vieler Möglichkeiten bei meiner persönlichen Entwicklung! Auch meiner Schwester Albina danke ich für die stete Unterstützung und die vielen Gespräche.

I

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung ... IV

Abkürzungsverzeichnis ... V

Aminosäuren ... VI

1 Einleitung ... 1

1.1 Neuronale Wegfindung und Regeneration ... 1

1.2 Molekulare Mechanismen Neuronaler Wegfindung ... 2

1.3 Das Protein Neurolin ... 3

1.4 Struktur und Interaktion von Immunglobulin Domänen ... 8

1.5 Strukturaufklärung von Proteinen ... 12

1.6 Zielsetzung ... 14

2 Methoden ... 15

2.1 Das pET-Expressionssystem ... 15

2.2 Methoden zur Proteinreinigung ... 16

2.3 NMR-Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen ... 17

2.4 Computermethoden zur Strukturrechnung ... 22

2.5 Methoden zur Bestimmung von Dissoziationskonstanten ... 23

3 Ergebnisse und Diskussion ... 25

3.1 Optimierung des Protokolls von Drees et al. zur Präparation der zweiten Neurolin- Domäne ... 25

3.2 Design molekularer Konstrukte ... 30

3.2.1 Die zweite Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch ... 30

3.2.2 Die zweite Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch... 35

3.2.3 Design weiterer Konstrukte ... 38

3.2.4 Zusammenfassung und Diskussion ... 40

II

3.3 Expression und Reinigung ... 43

3.3.1 Expression und Reinigung der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch . 44 3.3.2 Expression und Reinigung der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch 48 3.3.3 Expression und Reinigung weiterer Proteine ... 50

3.3.4 Zusammenfassung und Diskussion ... 52

3.4 Struktur und Dynamik der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch ... 54

3.4.1 Sekundärstruktur ... 54

3.4.2 Resonanzzuordnung ... 55

3.4.3 Strukturelle Informationen ... 58

3.4.4 Strukturrechnung ... 60

3.4.5 Die Eigenschaften der Struktur der zweiten Ig-Domäne von Neurolin... 65

3.4.6 Die Dynamik der zweiten Ig-Domäne von Neurolin... 68

3.4.7 Zusammenfassung und Diskussion ... 70

3.5 Interaktionsexperimente ... 72

3.5.1 Interaktionsexperimente mit potenziellen Interaktionspartnern ... 72

3.5.2 Interaktionsexperimente mit Homogenaten aus Goldfischgehirnen ... 77

3.5.3 Interaktionsexperimente mit dem Antikörper N518 ... 79

3.5.4 Zusammenfassung und Diskussion ... 87

3.6 Schlussfolgerung ... 90

4 Experimentelle Prozeduren ... 91

4.1 Gentransformation ... 91

4.2 Zellanzucht und Genexpression ... 93

4.3 Proteinreinigung ... 94

4.3.1 Allgemeine Angaben ... 94

4.3.2 Rückfaltungsexperimente mit der verkürzten Neurolin-Domäne nach Drees et al. ... 96

4.3.3 Die zweite Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch ... 97

III

4.3.4 Die zweite Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch... 97

4.3.5 Die erste ROBO-Domäne aus dem Zebrafisch... 98

4.3.6 Die ULP1 ... 98

4.3.6 Der Antikörper N518 ... 98

4.4 NMR-Messungen ... 99

4.4.1 Allgemeine Angaben ... 99

4.4.2 NMR-Messungen für die Resonanzzuordnung und die strukturellen Informationen, Auswertung der Spektren ... 99

4.4.3 NMR-Messungen für die Protein-Dynamik ... 100

4.4.4 NMR-Messungen für die Interaktionsexperimente ... 100

4.5 EPR-Messungen ... 101

4.6 Bioinformatische Analysen und Rechnungen ... 101

4.6.1 Proteinparameter, Visualisierung und Modeling ... 101

4.6.2 Strukturrechnung mit CYANA ... 102

4.6.3 Strukturrechnung mit XPLOR-NIH ... 102

4.6.4 Strukturrechnung mit GROMACS ... 103

4.7 Thermophorese-Messungen... 103

4.8 Cirkulardichroismus ... 105

4.9 Dynamische Lichtstreuung ... 105

4.10 Western Blotting ... 105

5 Referenzen ... 107

6 Anhang ... 116

6.1 Sequenzen und Daten der Konstrukte ... 116

6.2 Spektrenverzeichnis ... 118

6.3 CD-ROM ... 120

IV

Zusammenfassung

Das Protein Neurolin gehört zu der Klasse der Immunglobulin-Rezeptoren und ist in Goldfischen für die gerichtete Wegfindung wachsender und regenerierender Nervenzellen verantwortlich. Der Rezeptor besteht aus fünf extrazellulären Immunglobulin Domänen und ist in die Membran von retinalen Ganglienzellen verankert. Innerhalb der fünf Immunglobulin Domänen, ist die zweite Domäne für die Wegfindung von Neuronen verantwortlich. Bei intraokularer Applikation von spezifischen Antikörpern, welche die zweite Neurolin-Domäne binden ist die Wegfindungsfähigkeit wachsender Neuronen bei Goldfischen gestört. Die homologen Proteine von Neurolin in anderen Klassen von Wirbeltieren erfüllen neben der neuronalen Wegfindung auch weitere wichtige Aufgaben, zum Beispiel innerhalb des Immunsystems. Bislang ist weder eine Struktur, noch ein molekularer Wirkmechanismus für den Rezeptor Neurolin und deren Homologe bekannt.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll ausgearbeitet, die zweite Neurolin-Domäne in hohen Mengen herzustellen und zu reinigen. Dabei wurde die N- und C-terminale Grenze des Proteins abweichend von bislang anerkannten Werten neu bestimmt. Anschließend gelang es, die Struktur der Domäne mittels NMR-Spektroskopie aufzuklären. Auch konnte die Dynamik des Proteins auf einer Pico- bis Nanosekunden-Zeitskala mittels NMR- Spektroskopie bestimmt werden. Die Struktur offenbarte, dass das Protein zum C1-Typ der Immunglobulin-Domänen gehört, und nicht zum V-Typ, wie anhand von Sequenzvergleichen ursprünglich angenommen wurde. Zusätzlich zu der Struktur konnte die Interaktion mit dem domänenspezifischen Antikörper N518 untersucht werden. Dabei konnte sowohl die Dissoziationskonstante, als auch die Bindestelle an der Domäne bestimmt werden. Die vorliegende Arbeit bildet damit die Grundlage für das Verständnis neuronaler Navigation auf molekularer Ebene, und der Wirkungsweise des Antikörpers N518, welcher in der Lage ist die Neuronale Wegfindung in Goldfischen zu stören. Die Neubestimmung der Domänengrenzen und die Struktur ermöglichen weitere Arbeiten, den molekularen Mechanismus des Rezeptors aufzuklären.

V

Abkürzungsverzeichnis

1D/2D/3D Ein-, Zwei-, Dreidimensional

APS Ammoniumperoxodisulfat

CDR Complementarity Determining Regions

cw-EPR Continuous wave Elektronen-Paramagnetische-Resonanz DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

DTT Dithiothreitol

Fn Fibronectin

GSSG Oxidiertes Glutathion

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

Ig Immunglobulin

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

NIg Neurolin-Immunglobulin Domäne

NMR Nukleare magnetische Resonanz

NOE Nuclear Overhauser Effect

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphatgepufferte Salzlösung) PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PNS Peripheres Nevensystem

RIg ROBO- Immunglobulin Domäne

ROBO Roundabout Rezeptor

RMSD Root Mean Squared Deviation (Wurzel der mittleren quadratischen Abweichung)

SDS-PAGE Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SUMO Small Ubiquitin-like MOdifier

ULP1 Ubiquitin-Like protein specific Protease

vgl. Vergleiche

ZNS Zentrales Nervensystem

VI

Aminosäuren

Name der Aminosäure Drei-Buchstaben-Code Ein-Buchstaben-Code

Alanin Ala A

Arginin Arg R

Asparagin Asn N

Asparaginsäure/Aspartat Asp D

Cystein Cys C

Glutamin Gln Q

Glutaminsäure/Glutamat Glu E

Glycin Gly G

Histidin His H

Isoleucin Ile I

Leucin Leu L

Lysin Lys K

Methionin Met M

Phenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonin Thr T

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Valin Val V

1.1 Neuronale Wegfindung und Regeneration

1

1 Einleitung

1.1 Neuronale Wegfindung und Regeneration

Das Wachstum und die Verschaltung des Nervensystems höherer Tiere ist von zentralem Interesse der heutigen Forschung. Das Verständnis hochkomplexer Nervensysteme ist dabei nicht nur für die Neurobiologie eine Herausforderung. In der Computerforschung werden seit langem Prinzipien der Neuronalen Netzwerke dazu genutzt, die Leistungsfähigkeit von Software zu verbessern (Böhm et al., 1992; Hertz et al., 1991). Für ein funktionelles Nervensystem muss eine Vielzahl an Nervenzellen korrekt miteinander verschaltet sein. Da in einem Organismus Nervenverbindungen zwischen räumlich weit voneinander entfernten Geweben nötig sind, ist die gerichtete Wegfindung von Nerven ein hoch spezialisierter Vorgang während des Wachstums von Nervenzellen. Aus diesem Grund existiert eine Vielzahl teils redundanter physiologischer Systeme, um die wachsenden Fortsätze von Nervenzellen zu ihrem vorgesehenen Bestimmungsort zu führen (Raper and Mason, 2010).

Ein in der Neurobiologie weit verbreitetes Modellobjekt zur Untersuchung von neuronalem Wachstum ist die Retina (Erskine and Herrera, 2007). Diese eignet sich aufgrund des pseudo zweidimensionalen Charakters des Gewebes und der Möglichkeit Nervenbündel leicht vom umliegenden Gewebe zu unterscheiden und für die Mikroskopie sichtbar zu machen.

Die spontane Regeneration verletzter Nerven ist physiologisch eng mit den Wachstumsprozessen verwandt. Dabei ist jedoch zu beachten, dass sich die Regenerationen des peripheren und zentralen Nervensystems (PNS bzw. ZNS) in Ausmaß und Geschwindigkeit deutlich voneinander unterscheiden (Kandel et al., 2013; Mumenthaler et al., 2007). Außerdem variiert die Fähigkeit zur Regeneration des zentralen Nervensystems zwischen Vertretern verschiedener Klassen von Tieren. Während Fische in der Lage sind verletzte Nerven des ZNS zu regenerieren, ist es Säugetieren nicht möglich Nervenfunktionalität nach einer Läsion wiederherzustellen (Gaze, 1970). Gründe dafür sind unter anderem Myelin-assoziierte Inhibitor-Moleküle wie NOGO, welche bei Verletzungen von Nerven einen Wiederaufbau der Myelinscheide verhindern, und damit die Regeneration der verletzten Nerven bei Säugetieren hemmen (Filbin, 2003; He and Koprivica, 2004).

Motiviert durch eine Möglichkeit zur Heilung schwerer Nervenschädigungen wie der

2

Querschnittslähmung oder der Multiplen Sklerose ist die Erforschung der Mechanismen neuronaler Regeneration in den Fokus der Wissenschaft gerückt (Hug and Weidner, 2012).

1.2 Molekulare Mechanismen Neuronaler Wegfindung

Nervenzellen bilden während des Wachstums an ihren Fortsätzen (den sogenannten Axonen) einen Wachstumskegel aus. Diese zelluläre Struktur enthält an der Oberfläche viele verschiedene Rezeptoren, welche in der Lage sind, die Wachstumsrichtung der Axone anhand chemischer Reize aus der Umgebung zu bestimmen (Mueller, 1999). Dabei können anziehende Signale die wachsende Zelle in eine bestimmte Richtung leiten, oder abstoßende Signale das Einwachsen in ein bestimmtes Gewebe verhindern. Sowohl lösliche Substanzen als auch Bestandteile der extrazellulären Matrix oder Moleküle auf Zelloberflächen sind bekannt, welche als richtungsweisende Signale während des Axonwachstums dienen. Oft definieren zunächst Pionier-Neuronen eine Nervenbahn bevor weitere Neuronen mittels Zell- Zell-Adhäsionsmolekülen entlang den Pionier-Neuronen wachsen (Goodman, 1996; Tessier- Lavigne and Goodman, 1996). Im Einzelnen wurden folgende Molekülklassen im Zusammenhang mit neuronaler Navigation identifiziert:

 Netrine sind lösliche, sekretierte Proteine, welche als Konzentrationsgradienten in Nervenepithelien auftreten und je nach Rezeptor sowohl anziehende als auch abstoßende Wirkung auf wachsende Axone haben können. Enthält ein Wachstumskegel den Immunglobulin Rezeptor DCC (deleted in colorectal cancer), wirken höher werdende Netrin Konzentrationen anziehend. Enthält ein Wachstumskegel jedoch UNC5 homologe Rezeptoren wird ein wachsendes Axon von Netrinen abgestoßen. (Moore et al., 2007).

 Semaphorine sind ebenfalls lösliche, sekretierte Proteine, die hauptsächlich abstoßende Wirkung auf Wachstumskegel haben. Rezeptoren, welche Semaphorine erkennen, gehören zu den Familien von Plexinen, Neuropilinen und Immunglobulin-artigen Rezeptoren (Fiore and Puschel, 2003).

 Slits sind ebenfalls lösliche, sekretierte Proteine, die abstoßende Wirkung auf wachsende Neuronen haben. Rezeptoren, welche Slits erkennen heißen ROBO (Roundabout) und gehören zu der Familie der Immunglobulin-Rezeptoren. Das Slit/ROBO System ist mit longitudinalen Pionier-Neuronen assoziiert, die lange Distanzen überbrücken (Mastick et al., 2010).

1.3 Das Protein Neurolin

3

 Ephrine und Eph-Rezeptoren sind membranverankerte Moleküle, die bei gegenseitiger Interaktion in der Zell-Zell vermittelten Wegfindung von Neuronen eine Rolle spielen. Dabei sind wiederum sowohl anziehende als auch abstoßende Wirkungen bekannt (Egea and Klein, 2007).

 Cadherine sind Calcium-abhängige, membranverankerte Zell-Adhäsionsmoleküle.

Ein mit Cadherinen ausgestatteter Wachstumskegel erkennt Pionier-Neuronen und wächst entlang der gleichen Bahn (Hansen et al., 2008).

 Zahlreiche Zell-Adhäsionsmoleküle der Immunglobulin Familie sind mit neuronalem Wachstum assoziiert, wie zum Beispiel L1, Axonin und NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule). Die membranverankerten Rezeptoren bestehen aus mehreren Immunglobulin (Ig) Domänen und können zusätzlich Fibronectin (Fn) Domänen enthalten. Der Membrananker besteht aus Glycosyl-Phosphatidyl- Inositol oder einer transmembranen α-Helix mit anschließender intrazellulärer Domäne zur Signalweiterleitung. Analog zu den Cadherinen, leiten die Rezeptoren der Ig Familie wachsende Neuronen adhäsionsvermittelt entlang bereits gewachsener Nervenbahnen. Dabei können die Proteine sowohl mit Proteinen derselben Spezies interagieren (homophile Interaktion), als auch mit artverschiedenen Ig-Rezeptoren (heterophile Interaktion). Auch kann eine Interaktion innerhalb derselben Zelle auftreten (cis-Interaktion) oder mit Proteinen benachbarter Zellen (trans-Interaktion). Zusätzlich ist auch eine Interaktion mit der extrazellulären Matrix bekannt (Brümmendorf and Rathjen, 1996).

Teile dieses Abschnitts wurden sinngemäß aus folgenden Artikeln übernommen:

http://de.wikipedia.org/wiki/Entwicklungsneurobiologie (Stand: 09/2014) http://en.wikipedia.org/wiki/Axon_guidance (Stand: 09/2014)

1.3 Das Protein Neurolin

Neurolin ist ein Membranrezeptor aus dem Goldfisch (Carassius auratus) und Zebrafisch (Danio rerio). Das Protein gehört zu der Familie der Ig-Rezeptoren und besteht aus fünf extrazellulären Immunglobulin Domänen, welche anhand ihrer Sequenz zu den Typen V-V- C2-C2-C2 zugeordnet wurden. An den extrazellulären Teil schließt sich eine Transmembranhelix von 24 Aminosäuren Länge an, gefolgt von einer 30 Aminosäuren langen C-terminalen intrazellulären Domäne (Laessing et al., 1994). Neurolin aus dem Goldfisch umfasst 532 Aminosäuren und hat eine molekulare Masse von ca. 72-90 kDa, wobei 58.1 kDa

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auf die Aminosäure-Sequenz entfallen. Das restliche Molekulargewicht wird von mikroheterogenen Kohlenhydrat-Resten beigetragen. Domäne eins, zwei und vier enthalten dabei jeweils ein Glycosilierungsmotiv, Domäne fünf zwei Glycosilierungsmotive (Denzinger et al., 1999). Das Protein gehört zu dem CD166 Cluster, welcher abhängig vom Organismus verschieden bezeichnet wird. Alle bislang gefundenen Vertreter des CD166 Clusters wurden mit neuronaler Wegfindung in Verbindung gebracht:

 DM-GRASP (Dorsal funiculus and ventral Midline – immunoGlobulin-like Restricted Axonal Surface Protein) wurde als CD166 Rezeptor in der Retina des Haushuhns (Gallus gallus) identifiziert. Während der frühen Phase der neuronalen Entwicklung im Embryo leitet DM-GRASP Ganglienzellen in der Retina in Richtung des Sehnervs. Während der axonalen Wegfindung wurde sowohl eine homophile, als auch eine heterophile Interaktion mit dem Neuroglia Zelladhäsionsmolekül (NgCAM) nachgewiesen (Avci et al., 2004). Insgesamt wurden 11 verschiedene neuronale Membranproteine gefunden, welche in der Lage sind mit DM-GRASP zu interagieren. Es ist jedoch unbekannt, ob alle Vertreter an der neuronalen Wegfindung beteiligt sind (DeBernardo and Chang, 1996).

 BEN/SC1 (Bursal Epithelium and Neurons) ist der Name des CD166 Rezeptors bei Mäusen (Mus musculus). Zusätzlich zu der Leitung und Bündelung von retinalen Ganglienzellen, wurde bei Mäusen auch eine BEN-vermittelte Leitung und Bündelung von Motoneuronen nachgewiesen (Weiner et al., 2004).

 Da die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) keine Retina-Augen hat, wurde der CD166 homologe Rezeptor IrreC-rst über Gen-Knock-out Experimente als wichtigster Faktor für die korrekte Kreuzung der optischen Nerven im Chiasma Opticum identifiziert (Ramos et al., 1993).

 ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) beim Menschen ist der am intensivsten untersuchte Vertreter der CD166 Familie. Ursprünglich wurde ALCAM als Rezeptor für die T-Zell Aktivierung entdeckt (Bowen et al., 1995).

Die Erforschung von ALCAM in Bezug zum neuronalen Wachstum erfolgte aus verständlichen Gründen jedoch nur mit in vitro Methoden. In diesem Sinne wurde an der PC12 Zelllinie ein durch ALCAM verstärktes axonales Wachstum nachgewiesen, das vom Nervenwachstumsfaktor NGF induziert wird (Wade et al., 2012). Daneben ist ALCAM auch in zahlreiche andere physiologische Prozesse involviert. Dazu zählt die Regulation der Hämatopoese (Chitteti et al., 2013) und

1.3 Das Protein Neurolin

5

lymphatischer Netzwerke (Iolyeva et al., 2013), die HIV-Infektion von Nervengewebe (Williams et al., 2013), sowie die Migration von neutrophilen Granulozyten bei Entzündungsreaktionen. Zusätzlich wurde eine Überexpression von ALCAM auf verschiedenen Krebsgeweben festgestellt (Weidle et al., 2010).

Auf molekularer Ebene wurde eine sowohl homophile Interaktion (KD = 29-48 µM) als auch eine höher affine heterophile Interaktion (KD = 0,4-1,0 µM) mit dem CD6 Rezeptor nachgewiesen (Hassan et al., 2004). Letztere erfolgt über die erste N-terminale Ig-Domäne von ALCAM (Bowen et al., 1997).

Neurolin nimmt eine Sonderstellung unter den CD166 Rezeptoren ein. Das Protein ist bei Fischen nicht nur während der embryonalen Entwicklung für die axonale Wegfindung retinaler Ganglienzellen zuständig, sondern wird auch bei Verletzungen von Nerven vermehrt produziert (Paschke et al., 1992). Das hohe Auftreten von Neurolin während Nervenverletzungen, sowie die Abwesenheit in reifen, unverletzten Nervenbahnen beweisen die Beteiligung von Neurolin an der spontanen Regeneration des visuellen Nervensystems von Fischen (Paschke et al., 1992). Zusätzlich zu der Wegfindung wachsender Axone ist Neurolin auch für die Bündelung von Nervenzellen verantwortlich (Ott et al., 1998). Auf molekularer Ebene wurden den verschiedenen Ig-Domänen unterschiedliche Aufgaben zugewiesen. Zu diesem Zweck wurden wiederholt monoklonale Maus-Antikörper gegen die einzelnen Ig-Domänen in die Augen wachsender Goldfische appliziert. Bei Applikation von Antikörpern gegen die Domänen eins und drei, mit den jeweiligen Bezeichnungen N850 und N100, wurde eine verringerte Ausbildung von Nervenbündeln in der Retina festgestellt. Bei Applikation von Antikörpern der Bezeichnung N518 gegen Domäne zwei wurde die Wegfindung wachsender Axone in der Retina gestört, so dass sie nicht in Richtung Sehnerv gewachsen sind, sondern ihre Bahn verlassen haben, und teilweise im Kreis gewachsen sind (Abb. 1.1) (Leppert et al., 1999). Wie bereits für ALCAM gezeigt (van Kempen et al., 2001), wird angenommen dass die Antikörper Teile der Oberfläche von Neurolin bedecken, die für die Interaktion mit Wegfindungsmolekülen zuständig sind. Unklar ist jedoch, welche und wie viele verschiedene Liganden für Neurolin in Frage kommen, da einzelne Domänen für verschiedene Aufgaben zuständig sind. Auch der molekulare Mechanismus der Signalweiterleitung von einem extrazellulären chemischen Reiz in die Zelle hinein ist, wie bei allen Vertretern der CD166 Familie, unklar. Für die Erforschung des neuronalen Wachstums und der neuronalen Regeneration ist die Rolle der zweiten Neurolin-Domäne während der axonalen Wegfindung am interessantesten. In diesem Zusammenhang konnten Drees et al.

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(2008) zeigen, dass eine rekombinant hergestellte zweite Neurolin-Domäne nicht-kovalent dimerisieren kann. Daher wird eine homophile Interaktion zwischen zwei Neurolin Molekülen über die zweite Ig-Domäne angenommen. Es ist jedoch unklar, ob diese Dimerisierung eine Adhäsionsfunktionalität über eine trans-Interaktion mit benachbarten Nervenzellen darstellt, oder eine cis-Interaktion zweier Neurolin-Moleküle auf der gleichen Zelle die intrazelluläre Domäne dimerisieren lässt, und damit eine intrazelluläre Signalkaskade auslöst. Auch bleibt unklar, ob die Dimerisierung die einzige Interaktion der zweiten Neurolin-Domäne darstellt, oder ob noch weitere membrangebundene Liganden, wie bei den Homologen DM-GRASP und ALCAM, in Frage kommen. Auch eine Interaktion mit der extrazellulären Matrix oder löslichen Liganden, wie im Fall des ROBO- oder DCC- Rezeptors, wäre denkbar (Abb. 1.2).

Abbildung 1.1: Präparationen von Goldfisch- Retinae, welche zuvor mit Antikörpern gegen die einzelnen Neurolin Domänen behandelt worden waren. Balken in (B): 300µm, Balken in (C) – (F):

100µm.

(A) Gesamte Retina eines Goldfisches, welcher mit dem Antikörper N100 gegen die dritte Neurolin Domäne behandelt wurde. Die Ausschnitte B und D sind in groß gezeigt.

(B) Ausschnitt aus A. rm steht für retinale Peripherie (retinal margin) und od steht für den Ausgang zum Sehnerv (optic disc).

(C) Retina-Präparation eines Goldfisches, welcher mit dem Antikörper N850 gegen die erste Neurolin Domäne behandelt wurde. Die Nervenzellen wachsen nicht mehr gebündelt, sondern fächern auf.

(D) Ausschnitt aus A. Auch bei Behandlung mit dem Antikörper N100 gegen Domäne 3 wachsen die Nervenzellen nicht mehr gebündelt, sondern fächern auf.

(E) Retina-Präparation eines Goldfisches, welcher mit dem Antikörper N518 gegen die zweite Neurolin Domäne behandelt wurde. Die Nervenzellen wachsen nicht mehr zielgerichtet. Es entstehen Wegfindungsfehler (Pfeil).

(F) Retina-Präparation eines Goldfisches welcher unbehandelt war. In der Kontroll-Präparation wurde gebündeltes und zielgerichtetes Wachstum der Nervenzellen beobachtet.

Mit Erlaubnis übernommen aus (Leppert et al., 1999).

1.3 Das Protein Neurolin

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© 1999 Rockefeller University Press. Originally published in Journal of Cell Biology. 144: 339 – 349. Doi: 10.1083/jcb.144.2.339

Abbildung 1.2: Mögliche Interaktionen der zweiten Neurolin Domäne.

(A) Homophile trans-Interaktion zweier Neurolin Moleküle zwischen zwei verschiedenen Zellen.

Diese Art von Interaktion würde zu einer Adhäsionsvermittelten Wegfindung führen.

(B) Homophile cis-Interaktion auf derselben Zelle, welche auch Ligand induziert denkbar wäre (rotes Sechseck). Eine cis-Interaktion kann intrazellulär eine Signalkaskade induzieren, indem die zwei intrazellulären Domänen bei räumlicher Nähe ein Signalmolekül aktivieren.

(C) Heterophile cis-Interaktion auf derselben Zelle, welche auch Ligand induziert denkbar wäre (rotes Sechseck). In diesem Fall würde die zweite Domäne mit einer Domäne eines anderen Membranrezeptors (z.B. NCAM) interagieren, und intrazellulär eine Signalkaskade auslösen.

(D) Heterophile trans-Interaktion zwischen zwei Zellen. Analog zu (A) würde diese Art von Interaktion zu einer adhäsionsvermittelten Wegfindung führen.

(E) Ein Konzentrationsgradient eines löslichen Liganden könnte die Nervenbahnen leiten. Dieser Mechanismus ist auch für die homophile cis-Interaktion (siehe B) denkbar.

(F) Mögliche Interaktion der zweiten Neurolin-Domäne mit der Extrazellulären Matrix. Analog zu (A) würde auch diese Art von Interaktion zu einer Adhäsionsvermittelten Wegfindung führen.

8

1.4 Struktur und Interaktion von Immunglobulin Domänen

Protein-Domänen sind Untereinheiten von Proteinen, welche eine strukturell und funktionell zusammenhängende Einheit bilden. Domänen der Immunglobulin-Familie wurden nach ihrer ursprünglichen Entdeckung, in Zusammenhang mit der Immunantwort, als Untereinheiten von Antikörpern und B-Zell-Rezeptoren benannt. Jedoch geht ihre Funktion in höheren Eukaryoten weit über das Immunsystem hinaus. Beim Menschen sind die Immunglobulin-Domänen mit 765 Genen die artenreichste Proteinfamilie (Lander et al., 2001). Abseits von diversen Funktionen innerhalb des Immunsystems sind Domänen der Immunglobulin Familie, wie bereits beschrieben, in Prozesse wie Zelladhäsion und Wahrnehmung chemischer Reize auch außerhalb von Nervengewebe involviert. Weitere Beispiele für Proteine, die Immunglobulin-Domänen enthalten sind unter anderem Rezeptor- Tyrosinkinasen, Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, sowie rein mechanisch agierende Proteine wie Titin (Barclay, 2003). Letzteres ist das größte bekannte Protein (3MDa) und sorgt für die passive Elastizität in Muskeln (Labeit and Kolmerer, 1995). Das zusammenhängende Merkmal aller Immunglobulin-Domänen ist die Anordnung von Sekundärstrukturelementen. Sieben bis neun größtenteils antiparallele β-Stränge sind dabei in zwei übereinander gestapelte Faltblätter organisiert. Werden die Domänen in Membranrezeptoren eingebaut, oder zum Beispiel als Antikörper sekretiert, enthalten sie oft ein Glycosilierungsmotiv, und werden vor der Sekretion während der posttranslationalen Prozessierung im Golgi-Apparat glycosyliert. Da die Anzahl und die Sequenz der Aminosäuren sowie die Topologie der β-Stränge zwischen Vertretern der Immunglobulin- Familie variieren, werden die einzelnen Vertreter anhand letzterer Merkmale klassifiziert (Bork et al., 1994). Die Namen der Klassen von Immunglobulin-Domänen sind wiederum historisch bedingt, und beziehen sich auf die Ähnlichkeit zu dem variablen Teil (V-Typ), respektive dem konstanten Teil (C-Typ) von Antikörpern (Abb. 1.3).

1.4 Struktur und Interaktion von Immunglobulin Domänen

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Abbildung 1.3: Schematische Darstellung eines Antikörpers.

Blau: Schwere Kette bestehend aus vier Immunglobulin-Domänen. CH1-3: Konstante Domänen 1 – 3. VH: Variable Domäne mit Antigen- erkennenden Schleifen (CDR).

Grau: Leichte Kette bestehend aus zwei Immunglobulin-Domänen. CL: Konstante Domäne.

VL: Variable Domäne mit Antigen-erkennenden Schleifen (CDR).

Die leichte und die schwere Kette sind über eine Disulfid-Brücke zwischen den Domänen CH1 und CL

verbunden (pink). Des weiteren sind pro Antiköper zwei schwere Ketten über zwei Disulfid-Brücken verbunden, welche zwischen den Domänen CH1 und CH2 lokalisiert sind (pink).

Die Merkmale der Ig-Typen sind:

 V-Typ: Immunglobulin Domänen des V-Typs wurden zuerst an den Antigen- erkennenden Untereinheiten (variablen Domänen) von Antikörpern identifiziert (Abb. 1.3). Domänen dieses Typs bestehen aus neun größtenteils antiparallelen β- Strängen, a bis g, von denen der a-Strang oft in zwei Teile untergliedert ist. Der N- terminale Teil des a-Strangs bildet dabei ein antiparalleles Faltblatt mit Strang b aus, der zweite Teil des a-Strangs bildet das einzige parallele Faltblatt mit Strang g.

Für den Vergleich mit Immunglobulin Domänen der Typen C1, C2 und I, werden drei Stränge mit c, c‘ und c‘‘ bezeichnet. Ein Faltblatt besteht aus den Strängen a, b, d und e, das andere Faltblatt aus den Strängen a, c, c‘, c‘‘, f und g. Wie auch in den C1-, C2- und I-Typen, sind Strang b und f meist durch eine Disulfid-Brücke miteinander verknüpft. In Antikörpern sind Bereiche der variablen Domänen in zwei Teile gegliedert: In drei sequenziell-hypervariable, Antigen-erkennende Schleifen (CDRs, complementarity determining regions), und den sequenziell konservierten restlichen Teil der Domäne (framework region), zu der unter anderem alle β-Stränge zählen. Die drei CDRs befinden sich innerhalb der Schleifen zwischen Strang b und c, zwischen Strang c‘ und c‘‘ und zwischen den Strängen f und g (Abb. 1.4) (Al-Lazikani et al., 1997).

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Abbildung 1.4: Topologien und Beispiele für Strukturen von verschiedenen Immunglobulin- Domänen-Typen. Bei variablen Domänen (V-Typ) befinden sich zwischen den Strängen b – c, c‘ – c‘‘

und f – g die drei sequenziell hypervariablen Peptide, welche für die Antigen-Erkennung in Antikörpern zuständig sind (CDR), (rot). Die beiden Typen der konstanten Domänen (C1- und C2-Typ) unterscheiden sich in der Anzahl der β-Stränge innerhalb der beiden β-Faltblätter. Der Topologie nach ist der I-Typ eine Mischform zwischen den variablen und konstanten Domänen. Beispiele für Strukturen aus:

V-Typ: pdb: 1IGT, (Harris et al., 1997) I-Typ: pdb: 1EPF, (Kasper et al., 2000) C1-Typ: pdb: 1IGT, (Harris et al., 1997) C2-Typ: pdb: 1CDH, (Ryu et al., 1994)

1.4 Struktur und Interaktion von Immunglobulin Domänen

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 C1-Typ: Immunglobulin-Domänen der C-Typen sind nach den konstanten Untereinheiten von Antikörpern benannt. Domänen des C1-Typs bestehen aus sieben antiparallelen β-Strängen, a bis g. Ein Faltblatt besteht aus den Strängen a, b, d und e, das andere Faltblatt aus den Strängen c, f und g (Abb. 1.4).

 C2-Typ: Domänen des C2-Typs bestehen wie Domänen des C1-Typs, aus sieben antiparallelen β-Strängen, a bis g, jedoch sind die beiden Faltblätter anders organisiert: Ein Faltblatt besteht aus den Strängen a, b und e, wobei der Strang d fehlt. Das zweite Faltblatt besteht aus den Strängen c, c‘ f und g (Abb. 1.4).

 I-Typ: Domänen des Typs I wurden erst im Jahr 1994 klassifiziert. Sie kommen hauptsächlich in Adhäsionsmolekülen und Rezeptoren vor, und sind nicht in Antikörpern zu finden. Die Klassifizierung zu dem Typ I (Intermediate) ergibt sich aus der Topologie der Sekundärstruktur-Elemente, welche eine Mischform der V- und C-Typen ist (Harpaz and Chothia, 1994). Wie in Domänen des V-Typs kann der Strang a in zwei Teile gegliedert sein, wobei wiederum der N-terminale Teil ein antiparalleles Faltblatt mit Strang b ausbildet, und der zweite Teil ein paralleles Faltblatt mit Strang g ausbildet. Stränge a, b, d und e bilden ein Faltblatt, Stränge a, c, c‘, f und g das andere. Da es sowohl einen Strang c‘ wie auch d gibt, bleibt aufgrund der Molekülgeometrie der Strang c‘ verhältnismäßig kurz und bildet einen ungewöhnlichen Loop zu Strang d aus (Abb. 1.4).

Die Domänen der Immunglobulin Familie enthalten charakteristische Aminosäure- Sequenzen und können anhand dieser, bereits vor Kenntnis der tertiär-Struktur den einzelnen Klassen zugeordnet werden (Smith and Xue, 1997). Jedoch ist diese Zuordnung nicht immer korrekt. Es kann vorkommen, dass eine Immunglobulin-Domäne anhand ihrer Aminosäure- Sequenz zum Beispiel dem V-Typ zugeordnet wird, die Lösung der Struktur jedoch eine Domäne des I-Typs offenbart. Auch kann es vorkommen, dass bei Multidomänen-Rezeptoren die genauen Grenzen der einzelnen Domänen falsch vorhergesagt werden und Versuche, die isolierten Domänen heterolog herzustellen, fehlschlagen (Klock et al., 2008). Eine weitere Schwierigkeit für strukturelle Arbeiten an Immunglobulin-Domänen besteht in der Natur der Proteine. In ihrer natürlichen eukaryotischen Umgebung werden Immunglobulin-Rezeptoren am rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert, im Golgi-Apparat mithilfe von Faltungshelfern (den sogenannten Chaperonen) gefaltet, von Glycosidasen glycosyliert, und schließlich über Vesikel in die Plasmamembran integriert. Da die Proteine membranverankert sind, besteht außerdem kein Selektionsdruck für Löslichkeit in wässrigen Systemen, da sie in

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ihrer Möglichkeit zur Diffusion in Lösung stark eingegrenzt sind. Alle diese Faktoren erschweren die molekularbiologischen und biochemischen Arbeiten, die für eine Strukturermittlung von Proteinen notwendig sind. Für die Strukturermittlung werden sowohl aus Kostengründen, als auch der einfachen Möglichkeit der Isotopen-Markierung Prokaryoten (insbesondere Escherichia coli) als biotechnische Produktionsmaschinerie für die zu untersuchenden Proteine verwendet. In prokaryotischen Systemen fehlen jedoch die komplexen Zell-Kompartimente wie endoplasmatisches Retikulum und Golgi-Apparat. Die Faltung und Glycosylierung von Proteinen unterliegt anderen Mechanismen als bei Eukaryoten. Außerdem herrscht innerhalb prokaryotischer Zellen eine reduzierende Umgebung, welche die Ausbildung von Disulfid-Brücken verhindert. Disulfid-Brücken sind jedoch insbesondere für die Stabilität und Faltung von Immunglobulin Domänen von enormer Bedeutung. Zur Bestimmung der räumlichen Struktur von Immunglobulin-Domänen ist es aus diesen Gründen unabdingbar, das prokaryotische Expressions-System, das molekulare Konstrukt und die biochemischen Bedingungen zur Proteinpräparation im Vorfeld sorgfältig auszuarbeiten.

1.5 Strukturaufklärung von Proteinen

Um die räumliche Struktur eines Proteins mittels Röntgen-Kristallografie oder NMR- Spektroskopie aufklären zu können, sind Proteinmengen im Milligramm Bereich nötig. Bei der Röntgen-Kristallografie ergibt sich der hohe Bedarf aus der großen Menge an Kristallisationsbedingungen, welche ausprobiert werden müssen, bevor man eine oder mehrere Bedingungen gefunden hat, unter welchen das Protein kristallisiert. Der hohe Proteinbedarf für die Strukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie rührt von der geringen Empfindlichkeit der Messmethode her, welche eine Protein-Konzentration im millimolaren Bereich und einem Probenvolumen von 200 – 600µL voraussetzt. Auch für die Röntgen- Kristallografie sind Protein-Konzentrationen im millimolaren Bereich nötig, da die Keimbildung und das Kristallwachstum eine hohe Substanzkonzentration voraussetzen.

Zusätzlich zu dem hohen Bedarf an Proteinmenge, kommt bei der NMR-Spektroskopie hinzu, dass die Kohlenstoff- und Stickstoffkerne des Proteins nahezu vollständig aus den NMR- aktiven Isotopen ¹³C und ¹⁵N bestehen müssen. Aufgrund ihres Kernspins von ½ können diese Kerne mit hoher spektroskopischer Auflösung detektiert werden. Außerdem sind für die Strukturaufklärung NMR-Experimente nötig, bei welchen eine Magnetisierungsübertragung über mehrere benachbarte Kerne stattfinden muss. Dies ist nur möglich wenn benachbarte

1.5 Strukturaufklärung von Proteinen

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Kerne zu einem großen Prozentsatz NMR-aktive spin-½ Kerne sind. Der große Nachteil dieser methodischen Voraussetzung ist, dass der größte Teil der natürlich vorkommenden Kohlenstoff- und Stickstoff-Isotope aus dem NMR-stummen spin-0 Isotop ¹²C und dem für hochauflösende NMR-Spektroskopie ungeeigneten spin-1 Isotop ¹⁴N bestehen. Die notwendigen ¹³C und ¹⁵N Isotope kommen natürlich in sehr geringen Prozentzahlen vor (¹³C:

1.1% und ¹⁵N: 0.37%). Für die strukturelle Charakterisierung mittels NMR-Spektroskopie ist daher ein Protokoll notwendig, mit dem das zu untersuchende Protein in nahezu vollständig

13C- und ¹⁵N-markierter Form hergestellt werden kann. Wie bereits in Abschnitt 1.4 erläutert, kommen für die meisten strukturellen Arbeiten an Proteinen prokaryotische Expressionssysteme zum Einsatz welche auf Eschericha coli basieren. Neben der Möglichkeit, ¹⁵NH4Cl und ¹³C-Glucose als einzige Stickstoff- und Kohlenstoffquellen während des Bakterienwachstums und der Überexpression zu nutzen, und damit kostengünstig Isotopenmarkierungen in die produzierten Proteine einzuführen, eignen sich E.coli Expressionssysteme vor allem wegen der hohen Ausbeute des gewünschten Produkts.

Die gut charakterisierte Genregulation von E.coli ermöglicht außerdem einen hohen Grad an Reproduzierbarkeit bei der heterologen Überexpression (Baneyx, 1999). Zwar sind auch Methoden bekannt eukaryotische Expressionssysteme für die Produktion Isotopen-markierter Proteine zu verwenden, jedoch sind diese aufgrund hoher Kosten, geringer Ausbeute und der Komplexität der Methoden nur in besonderen Ausnahmefällen praktikabel (Gossert and Jahnke, 2012; Sastry et al., 2012).

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1.6 Zielsetzung

Neurolin nimmt eine sehr wichtige Rolle bei der neuronalen Entwicklung und bei der neuronalen Regeneration bei Goldfischen ein. Die entscheidende Voraussetzung für das Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen ist die genaue Kenntnis der Struktur und der Interaktionen des Proteins. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die biologisch interessanteste zweite Domäne des Proteins Neurolin mit Hilfe der NMR- Spektroskopie strukturell zu charakterisieren und die Interaktionen der Domäne mit Liganden zu untersuchen. Dazu sollte zunächst ein robustes Protokoll ausgearbeitet werden, das Protein in Milligramm-Mengen in ¹³C- und ¹⁵N-markierter Form herzustellen und anschießend zu reinigen. Das Protein sollte nach der Präparation in gefalteter Form vorliegen und in wässrigen Lösungen stabil genug für lange NMR Messzeiten sein. Aufbauend auf den erhaltenen Strukturdaten sollten Interaktionsstudien der zweiten Neurolin Domäne durchgeführt werden. Dazu sollten sowohl potenzielle Interaktionspartner identifiziert werden, als auch die Wechselwirkung zwischen der Proteindomäne mit dem Antikörper N518 charakterisiert werden. Die Interaktionsstudien sollten dazu dienen, Einblicke in den molekularen Mechanismus der axonalen Wegfindung zu erhalten. Besonders die Interaktion der Neurolin Domäne mit dem Antikörper N518, der bei Applikation in Goldfischen ein fehlerhaftes Nervenwachstum hervorruft, ist von großem Interesse. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass die Zuordnung der Bindestelle funktionsblockierender Antikörper den molekularen Mechanismus der Aktivierung eines Zellrezeptors aufklären kann (Kamata et al., 2013). Die Zuordnung der Bindestelle des Antikörpers N518 an die zweite Neurolin Domäne könnte somit aufklären, wo sich die Interaktionsstelle für die Wegfindungsmoleküle befindet.

2.1 Das pET-Expressionssystem

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2 Methoden

2.1 Das pET-Expressionssystem

Für die vorliegenden strukturellen- und Interaktions-Studien war neben der hohen Substanzmenge auch wichtig, die Proteine in ¹³C- und ¹⁵N-markierter Form produzieren zu können. Daher kam das pET-Expressionssystem (NOVAGEN) zum Einsatz. Dieses gewährleistet eine sehr hohe Protein-Ausbeute, da der T7-Promoter eine sehr starke Genexpression induziert. Auch ist die Möglichkeit der Isotopenmarkierung gegeben, da E.

coli Zellen in der Lage sind, ¹⁵NH₄Cl und ¹³C-Glucose als einzige Quellen für Stickstoff beziehungsweise Kohlenstoff zu nutzen und diese Isotope in die produzierten Proteine einzubauen. Für die heterologe Expressionen wird beim pET-Expressionssystem der E. coli BL21 (DE3) Stamm als Expressionsorganismus verwendet. Dieser Stamm ist eine Deletionsmutante, bei welcher die beiden Proteasen Lon und OmpT fehlen. Dadurch werden die für E. coli unbekannten, heterologen Proteine nicht schon während der Expression verdaut. Zusätzlich ist das DE3 Lysogen des λ-Phagen in dem Hauptchromosom über den Lac-Promoter kontrolliert. Das DE3 Lysogen codiert dabei für die T7-Polymerase, welche in Verbindung mit dem T7-Promoter und dem Lac-Operator auf pET-Plasmiden die momentan am stärksten bekannte Genexpression induziert. Die T7-Polymerase ist eine RNA-Polymerase aus dem T7-Bakteriophagen, einem Virus, welches E. coli Zellen infizieren kann. Die Polymerase ist sehr promoterspezifisch und hat eine sehr geringe Fehlerrate, was eine hohe Reproduzierbarkeit bei der rekombinanten Genexpression gewährleistet (Sousa and Mukherjee, 2003). Enthält das Zielprotein eine Disulfidbrücke, kommt der erweiterte BL21 (DE3) Stamm Origami B zum Einsatz. Dieser ist eine Deletionsmutante der beiden Gene Gor und TrxB. Somit sind die Proteine Glutathion-Oxido-Reduktase und ThioredoxinB in den Zellen nicht vorhanden, und damit herrscht innerhalb der Zellen eine oxidative Umgebung, was die Ausbildung von Disulfidbrücken bei z.B. Immunglobulin-Domänen ermöglicht. Der Zusatz „B“ steht für den Tuner-Stamm, der eine Deletionmutante der Gene LacY und LacZ ist. In diesen Zellen fehlt der β-Galactosid-Membrantransporter LacY und die β-Galactosidase LacZ. Dadurch wird Lactose (und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)) nicht aktiv aufgenommen, sondern diffundiert passiv über die Membran, was zu einer homogenen

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Induktion aller im Medium vorhandenen Zellen führt. Durch den verminderten Abbau von Galactosid-Zuckern aufgrund fehlender LacZ dauert die Induktion mittels IPTG zusätzlich sehr lange an.

Innerhalb des pET-Expressionssystems können je nach Zielprotein verschiedene Plasmide zum Einsatz kommen, welche für das jeweilige Gen codieren. Für die heterologe Expression wie in dem vorliegendem Fall, bei dem ein eukaryotisches Protein in dem prokaryotischen Expressionssystem hergestellt werden soll, eignet sich vor allem der pET15b Vektor. Dieser enthält auf der transkribierten mRNA vor dem Gen für das Zielprotein zusätzlich ein E. coli- spezifisches Translationssignal, damit die Translation des für E. coli unbekannten Gens stattfinden kann. Die Regulation des Zielgens erfolgt über den T7-Promoter. Außerdem trägt das Plasmid eine Ampicillin-Resistenz als Selektionsmarker und ein LacI Gen, welches für den Lactose-Repressor codiert. Der Lactose-Repressor bindet an Gene, welche von einem Lactose-Operator kontrolliert sind und verhindert somit eine Basal-Expression. Befindet sich Lactose oder ein Lactose-Analogon wie Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in den Zellen, wird diese Bindung aufgehoben, und eine Expression kann stattfinden. Das experimentelle Vorgehen für die Proteinproduktion mithilfe des pET-Expressionssystems ist daher die Zellen bis zu einer bestimmten Dichte wachsen zu lassen und anschließend die Genexpression des Zielproteins durch Zugabe von IPTG zu induzieren.

2.2 Methoden zur Proteinreinigung

Damit von einem Protein die Struktur aufgeklärt werden kann, muss es nicht nur in hoher Menge hergestellt werden, es muss auch in reiner Form vorliegen. Abhängig von dem eingesetzten Herstellungsverfahren wie zum Beispiel Peptidsynthese und anschließender Native Chemical Ligation oder der rekombinanten Genexpression in Zellkulturen kommen verschiedene Reinigungsverfahren nach der Produktion zum Einsatz. Da bei der vorliegenden Arbeit die rekombinante Genexpression verwendet wurde, galt es die Zielproteine nach der Produktion von den restlichen Zellbestandteilen des E. coli Wirtsorganismus wie Membranen, DNA, anderen Proteinen, usw. zu trennen. Dazu können die Zielproteine mit einem Affinitäts-tag wie beispielsweise dem His₆-tag fusioniert werden. Dieser dient dazu, das Protein über die Koordination der Histidin-Reste an immobilisierte Nickel-Ionen einer Sepharose-Matrix affinitäts-chromatographisch von allen anderen Zellbestandteilen zu trennen. Die experimentellen Bedingungen während der Reinigung sollten gewährleisten, dass die Ausbeute hoch bleibt, und das Zielprotein am Ende der Reinigung in stabil gefalteter

2.3 NMR-Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen

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und funktioneller Form vorliegt. Ausschlaggebendes Kriterium für diese Anforderungen ist die Optimierung von Pufferbedingungen, welche während der Reinigung zum Einsatz kommen. Hierbei spielen vor allem der pH-Wert und die Ionenstärke der Lösung eine Rolle.

Der pH-Wert bestimmt den Ladungszustand der auf der Oberfläche des Proteins befindlichen basischen beziehungsweise sauren Aminosäuren anhand ihres pI-Wertes. Liegen viele dieser Aminosäuren geladen vor, kann das Protein eine Hydrathülle ausbilden. Wenn sich die Ladungen jedoch kompensieren, weil der pI des gesamten Proteins dem pH-Wert der Lösung entspricht, kann es vorkommen, dass das Protein aufgrund geringer Ladung nicht mit den Wassermolekülen, sondern eher mit hydrophoben Flächen des Nachbarproteins interagiert, wodurch es zu unlöslichen Proteinaggregaten kommt. Daher sollte der pH-Wert des Präparationspuffers möglichst von dem pI des Proteins abweichen, gleichzeitig jedoch keine extremen Werte wie unter 5 und über 9 annehmen, da das Protein ansonsten zerstört werden könnte. Die Ionen in der eingesetzten Pufferlösung dienen dazu die Oberflächenladungen der Proteine zu sättigen. Zusätzlich wirken manche Ionen, wie Chlorid-Ionen leicht chaotrop und stabilisieren leicht hydrophobe Moleküloberflächen in wässrigen Lösungen durch Reduktion hydrophober Wechselwirkungen. Der gleiche Effekt kann mit weiteren Lösungsmittel- Zusätzen wie zum Beispiel Glycerin erreicht werden. Bei Proteinen, welche eine Koordinationsstelle für zweiwertige Metalle wie z.B. Calcium, Eisen oder Zink besitzen, ist für die Stabilität während der Präparation außerdem der Zusatz entsprechender Ionen wichtig.

Da die Isotopenmarkierung mit ¹⁵N, ¹³C und eventuell ²H während der Proteinproduktion sehr kostenintensiv sein kann, ist die Optimierung der Reinigungsbedingungen in Richtung hoher Proteinausbeuten ein wichtiger und oft auch langwieriger Prozess.

2.3 NMR-Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen

Um Informationen zur räumlichen Struktur eines Proteins mittels NMR zu erhalten, müssen zunächst die Resonanzen möglichst aller Protonen des Proteins bekannt sein. Auch die Resonanzwerte der Cα und Cβ Kerne können wertvolle Informationen zur Sekundärstruktur des Proteins liefern. Aus diesen Gründen ist es üblich, möglichst alle ¹H,

13C, und ¹⁵N Resonanzen eines Proteins zuzuordnen, bevor man Informationen zur räumlichen Struktur sammelt. Hat das zu untersuchende Protein molekulare Massen über 5 – 10kDa, kommen dreidimensionale NMR-Spektren zum Einsatz, da in zweidimensionalen Spektren der Überlapp der Signale zu hoch wäre. Je größer das Molekül wird, desto höher wird der spektrale Überlapp, und desto stärker sind Mechanismen der transversalen

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Relaxation ausgeprägt. Letzteres führt bei Standard-NMR-Experimenten zu Signalverbreiterung bis hin zum völligen verschwinden von Signalen. Bei Proteinen oder Proteinkomplexen über 20 – 30kDa kommen daher Transversal-Relaxation-optimierte (TROSY) NMR-Methoden (Pervushin et al., 1997) zum Einsatz, bei welchen jene Multiplettkomponenten selektiert werden, die eine lange Relaxationszeit aufweisen, und die Multiplettkomponenten, welche eine kurze Relaxationszeit aufweisen im Rauschen des Spektrums untergehen. Die verschiedenen Relaxationszeiten der Multiplettkomponenten ergeben sich aus zwei verschiedenen Relaxationsmechanismen, die Dipol-Dipol-Relaxation und Anisotropie der chemischen Verschiebung genannt werden. Diese beiden Mechanismen der transversalen Relaxation korrelieren konstruktiv auf die Relaxationszeit einer Multiplettkomponente, und negativ auf die andere. Da vom TROSY-Experiment nur die konstruktiv korrelierenden Komponenten selektiert werden, weisen auch Spektren von Molekülen über 20kDa auswertbare Signale auf (Pervushin et al., 1997).

Die meisten für die Resonanzzuordnung benötigten 3D-NMR-Spektren basieren auf einer 2D-¹H-¹⁵N-Korrelation mit einer zusätzlichen dritten Dimension, die weitere Informationen mit der Amid-NH-Gruppe verknüpft. Das 2D-¹H-¹⁵N-HSQC bzw. das 2D-¹H-¹⁵N-TROSY eignet sich als Basis-Spektrum besonders gut, da es, abgesehen von Prolin, pro Aminosäure ein Signal des Amid-Proton-Stickstoff-Paares aus dem Peptid-Rückgrat aufweist. Zusätzlich weisen die Aminosäuren Tryptophan, Asparagin, Glutamin auch Signale der Proton- Stickstoff-Paare entsprechender Seitenketten auf. Signale von Seitenketten der Arginine und Histidine sind je nach Austauschrate der Proton-Stickstoff-Paare auch in den Spektren sichtbar. Dies hängt jedoch stark von der direkten Umgebung der Reste ab, z.B. ob die Protonen über Wasserstoffbrücken stabilisiert werden. Basierend auf Amid-Signalen erhält man in den 3D Spektren eine Spur je Aminosäure, in welcher abhängig vom Spektrum zusätzliche Informationen, zum Beispiel zur Seitenkette, enthalten sind.

Um die Resonanzen des Protein-Rückgrats zuzuordnen, werden Signale der beiden Experimente HNCACB (Wittekind and Mueller, 1993) und CBCACONH (Grzesiek and Bax, 1992) in einer Resonanzliste erfasst. Das Spektrum CBCACONH enthält pro NH-Korrelation auch Signale von Cα- und Cβ-Resonanzen der N-terminal benachbarten Aminosäure. Das Spektrum HNCACB enthält die gleichen Signale wie CBCACONH, jedoch auch zusätzlich die Resonanzen der Cα und Cβ Kerne, welche zur eigenen Aminosäure gehören. Zusätzlich haben die Signale des HNCACB-Spektrums für Cα und Cβ jeweils verschiedene Vorzeichen, so dass die Cα und Cβ Resonanzen leicht voneinander zu unterscheiden sind. Auf diese Art ist

2.3 NMR-Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen

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es möglich, die Cα und Cβ Resonanzen der eigenen und der N-terminal benachbarten Aminosäure zu definieren. Die erfassten Resonanzen können anschließend von der Software AutolinkII (Masse and Keller, 2005) abgeglichen werden, so dass Ketten von Nachbarn definiert werden können. Sie Software ist außerdem in der Lage, charakteristische Resonanzen der Cα und Cβ Kerne bestimmter Aminosäuren zu erfassen, und somit Sequenz- Fragmente des Proteins zuzuordnen. Für die Veranschaulichung der Verkettung von Nachbar- Resonanzen eignet sich die Abb. 3.18 aus Abschnitt 3.4.2 (Seite 57). Um die Zuordnung zu bestätigen, können zusätzlich die Spektren HNCO und HNCACO (Kay et al., 1990) mit einbezogen werden. Das HNCO-Spektrum enthält in der dritten Dimension die Resonanz des Peptid-Carbonyls der N-terminal benachbarten Aminosäure, das HNCACO Spektrum zusätzlich noch die Resonanz des Peptid-Carbonyls der eigenen Aminosäure. So können analog zu HNCACB und CBCACONH benachbarte Aminosäuren identifiziert werden. Da die Zuordnungen der Software fehlerhaft sein können, werden diese manuell überprüft, und gegebenenfalls verbessert, oder neue Zuordnungen hinzugefügt. Für die Zuordnung der Seitenketten-Resonanzen kommen wiederum 3D-Spektren zum Einsatz, bei welchen ausgehend von einer NH- oder CH_x-Korrelation Nachbarschafts-Beziehungen über eine oder mehrere kovalente Bindungen identifiziert werden können. Beispielsweise sind in 3D-¹H-¹⁵N-TOCSY-HSQC (Fesik and Zuiderweg, 1988), HcCH- und hCCH-TOCSY- Spektren (Bax et al., 1990) annähernd alle Protonen bzw. Kohlenstoff-Resonanzen eines Aminosäurerestes ausgehend von einer NH- bzw. CH-Korrelation sichtbar. Die positionsspezifische Zuordnung dieser Resonanzen innerhalb des Restes können anschließend mit dem HCCH-COSY-Experiment (Gehring and Ekiel, 1998) erfolgen, bei welchen Nachbarschaften von Protonen über zwei oder drei Bindungen identifiziert werden können.

Für die Zuordnung von Resonanzen aromatischer Reste existieren 2D-Experimente wie hbCBcgcdHD oder hbCBcgcdHar, welche die Cβ-Resonanzen mit den aromatischen Protonenresonanzen korrelieren (Löhr et al., 2007; Yamazaki et al., 1993). Somit ist es möglich, ausgehend von bekannten Cβ-Resonanzen die Protonenresonanzen des aromatischen Restes zu identifizieren.

Damit eine Protein-Struktur mit NMR-Methoden aufgeklärt werden kann, bedarf es neben der Resonanzzuordnung auch struktureller Informationen. Um strukturelle Informationen bei Proteinen zu erhalten, werden drei NMR-Methoden am häufigsten verwendet. Die wichtigste davon basiert auf dem nuklearen Overhauser Effekt (NOE), welcher die räumliche Nähe zweier Kerne bis zu einer Distanz von ca. 5-6Å aufzeigen kann. Aufgrund ihrer Häufigkeit in

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Proteinen, werden meistens die Distanzen von Protonen untereinander ausgewertet. Um Distanzinformationen zwischen Protonen innerhalb eines Proteins zu erhalten, werden NOE- Signale in 3D-NOESY-Spektren (Fesik and Zuiderweg, 1988) in einer NOE-Peakliste erfasst.

Zusätzlich zu Spektren, welche auf 2D-¹H-¹⁵N-HSQC basieren, kommen auch Spektren zum Einsatz, welche auf 2D-¹H-¹³C-HSQC basieren. In den spektralen Spuren der jeweiligen NH-, bzw. CH-Signale sind in der NOESY-Dimension Resonanzen der jeweiligen räumlich benachbarten Protonen sichtbar. Für die Veranschaulichung eines 3D-NOESY-Spektrums eignet sich die Abb. 3.19 aus Abschnitt 3.4.3 (Seite 58). Sobald alle NOE-Signale in der NOE-Peakliste erfasst sind, werden sie anschlißend integriert, da die Intensität umgekehrt- proportional zur sechsten Potenz der Distanz der Kerne ist, und somit einen Distanzwert angibt. Da viele Protonen-Resonanzen innerhalb eines Proteins überlappen, können die NOE- Signale bis auf wenige Ausnahmen nicht eindeutig zugeordnet werden. Diese Aufgabe wird während der Strukturrechnung bei einem iterativen Prozess von der Software CANDID (Herrmann et al., 2002) übernommen, und anschließend manuell überprüft und gegebenenfalls verbessert.

Die zweite Art struktureller Informationen, welche mit NMR-Methoden erfasst werden kann, sind die Dieder-Winkel bei kovalenten Bindungen. In Proteinen werden dabei meistens nur die beiden Winkel φ und ψ im Rückgrat ausgewertet, weil diese den größten Informationsgehalt bezüglich der Sekundärstrukturelemente, und damit der Gesamtfaltung enthalten. Der Winkel φ beschreibt den Winkel zwischen der Fläche, die von CO, N und Cα aufgespannt wird, und der Fläche, welche von N, Cα und CO aufgespannt wird, also CO-N- Cα-CO. Dieser Winkel wird indirekt anhand des Winkels H^N-N-Cα-Hα bestimmt, indem die Kopplungskonstante zwischen H^N und Hα ermittelt wird. Die Kopplungskonstante nimmt je nach Diederwinkel verschiedene Werte an (Karplus, 1963; Minch, 1994). Die Auswertung erfolgt über ein 3D-HNHA-Spektrum. Dieses Spektrum basiert wiederum auf einer 2D-¹H-¹⁵N-Korrelation. Die dritte Dimension enthält zusätzlich Hα-Signale, die über drei Bindungen mit den jeweiligen Amidprotonen skalar koppeln. Das Prinzip des 3D-HNHA- Experiments ist es, die Intensität der Signale anhand der Kopplungskonstante zu modulieren.

Das Experiment wird dabei auf eine mittlere Kopplungskonstante von beispielsweise 9.6 Hz eingestellt. Weicht eine Kopplungskonstante von diesem Wert ab, verändern sich die Intensitätsverhältnisse zwischen dem H^N- und Hα-Signalen. Die Kopplungskonstante kann nach Integration der Signale nach folgender Formel berechnet werden (Vuister and Bax, 1993):

2.3 NMR-Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen

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Mit:

I(Hα) Intensität des Hα-Signals I(H^N) Intensität des H^N-Signals

K Konstante, errechnet sich aus der festgelegten mittleren Kopplungskonstante von ³J(HH) = 9.6 Hz nach , und beträgt 26 ms.

J(H^NHα) Das Ergebnis der Kopplungskonstante des jeweiligen H^N-Hα-Paares

Ein weiterer Winkel ψ ist für die Rückgratkonformationen von Proteinen ebenfalls ausschlaggebend. ψ beschreibt den Winkel zwischen der Fläche, die von N, Cα und CO aufgespannt wird, und der Fläche, welche von Cα, CO und N aufgespannt wird, also N-Cα-CO-N. Dieser Winkel wird anhand der Resonanzen der Kerne CO, Cα, Cβ, N und H^N bestimmt. Die Werte der Resonanzen sind dabei charakteristisch für bestimmte ψ Winkel (Shen et al., 2009). Die Auswertung ist mithilfe der Software TALOS+ möglich, welche die experimentell ermittelten Resonanzwerte mit Werten für typische ψ-Dieder-Winkel abgleicht (Shen et al., 2009).

Die dritte Art struktureller Informationen, welche mit NMR-Methoden erfasst werden kann, sind Orientierungen von Bindungsvektoren, welche über dipolare Restkopplungen zweier benachbarter Kerne, ermittelt werden können. Letztere können nur bestimmt werden, wenn die Moleküle relativ zum äußeren Magnetfeld partiell ausgerichtet sind. Diese partielle Ausrichtung der Proteine im Magnetfeld wird durch Medienzusätze in der Lösung erreicht, welche die Eigenschaft haben, sich entlang des Magnetfeldes auszurichten, und damit auch einen geringen Anteil (ca. 0.1%) an Proteinen auszurichten. Als Ausrichtungsmedien kommen dabei z.B. Phagen, Bizellen oder gestreckte Polycarylamid-Gele zum Einsatz. Ohne eine entsprechende Ausrichtung der Protein-Moleküle im Magnetfeld könnten die dipolaren Restkopplungen nicht gemessen werden, weil sich der zugrundeliegende Messwert bei isotroper Molekülbewegung ausmittelt (Prestegard et al., 2004).

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2.4 Computermethoden zur Strukturrechnung

Nach der Auswertung von Protein-NMR-Spektren liegen zwar die Zuordnungen für fast alle Resonanzen vor, jedoch nicht die Zuordnungen der NOEs, also welche Kerne zueinander eine räumliche Nachbarschaft ausbilden. Es sind zwar zu jeder Proton-Resonanz die jeweiligen NOEs in einer Peakliste erfasst, jedoch können sie aufgrund von Mehrdeutigkeiten in den meisten Fällen nicht zu Nachbar-Kernen innerhalb des Proteins zugeordnet werden.

Damit die NOEs trotzdem als strukturelle Informationen verwendet werden können, läuft die Strukturrechnung als iterativer Prozess ab. Als Basis-Informationen stehen der verwendeten Software CYANA (v.3.0) (Güntert et al., 1997) zunächst die Aminosäure-Sequenz, die zugeordneten Resonanzen, die Informationen zu den Dieder-Winkeln und die jeweiligen nicht zugeordneten NOEs zu den Protonen-Resonanzen. (Falls vorhanden, werden auch die Winkel zu den Bindungsvektoren und eine Model-Struktur mit einbezogen.) Die Software errechnet im ersten Schritt eine grobe Struktur, welche auf den gegebenen Informationen basiert. Diese grobe Struktur dient im nächsten Rechnungsschritt als Vorlage. Die Software analysiert in diesem Schritt die direkte Umgebung eines Protons, und vergleicht die Resonanzen der räumlichen Nachbar-Protonen mit den NOEs, welche für das Proton in der NOE-Peakliste erfasst wurden. Passt eine Resonanz eines Nachbarprotons zu einem NOE aus der Peakliste, wird diese Zuordnung für den nächsten Rechnungsschritt übernommen. Dies erfolgt mit allen zugeordneten Protonen und den jeweiligen NOEs. Zusätzlich werden die Werte der NOE- Signalintensität absoluten Distanzen in Ångsröm zugeordnet. Auf diese Art werden nicht nur die NOEs zugeordnet, sondern die Protein-Struktur wird auch genauer, da immer mehr strukturelle Informationen die Struktur definieren. Üblicherweise gibt es bei der Software CYANA sieben Iterations-Schritte, bei welchen jeweils 20 Strukturen berechnet werden. Die Qualität der Zuordnungen wird dabei durch eine sogenannte Target-Funktion angegeben. Je geringer der Wert der Target-Funktion, desto besser sind die Zuordnungen, und desto mehr gleichen sich auch die gerechneten 20 Strukturen. Die Target-Funktion und die während der Rechnung verletzten Strukturinformationen, wie Distanz- oder Winkelangaben, werden nach der Rechnung als Zusammenfassung in Textdateien angegeben. Die verletzten Angaben werden daraufhin sowohl in den Spektren, als auch in der berechneten Struktur überprüft.

Fällt eine fehlerhafte Zuordnung auf, wird diese für eine Folgestrukturrechnung entfernt. Ist die Zuordnung jedoch richtig, besteht die Möglichkeit, dass z.B. zwei überlagerte NOEs das Integral für nur eine erfasste Distanz definieren, bzw. ein Überlapp zweier HNHA-Signale den Integralwert beider Einzelkomponenten ausmacht. Der Integralwert fällt somit zu hoch