Die zweite Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch

Der Einsatz von SUMO und die Optimierung von Domänen-Termini anhand homologer Strukturen wurde für die vorliegende Arbeit mehrfach angewandt. Für Experimente der Ligandsuche war vorgesehen, die zweite Neurolin Domäne des Zebrafisches zu verwenden, welche einen C-terminalen strep-tag enthält. Der strep-tag besteht aus acht Aminosäuren (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) und kann sehr spezifisch auf einer strep-Tactin-funktionalisierten Matrix reversibel immobilisiert werden. Ein so spezifisch immobilisiertes Protein sollte in der Lage sein aus einem Homogenat aus Zebrafisch-Nervengewebe Liganden zu binden, welche anschließend isoliert werden können. Die Wahl auf den Organismus Zebrafisch anstatt Goldfisch ergab sich aus der Verfügbarkeit genetischer Daten.

Im Gegensatz zum Goldfisch, ist das Genom des Zebrafisches komplett sequenziert und die entsprechenden Daten öffentlich verfügbar. Daher kann ein hypothetischer Protein-Ligand aus Zebrafisch-Gewebe mittels Massenspektrometrie analysiert, und anhand des Abgleichs mit der Genom-Datenbank identifiziert werden. Für dieses Vorhaben wurde die zweite Neurolin-Domäne des Zebrafisches analog jener des Goldfisches entworfen, jedoch mit einem zusätzlichen C-terminalen strep-tag (Abb. 3.8).

Abbildung 3.8: Schematische Darstellung des Zebrafisch-Fusionskonstruktes. Die Sequenz der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch (rot) umfasst die Aminosäuren 130 – 240 des gesamten Rezeptors, analog dem Konstrukt der Goldfisch-Domäne aus Abschnitt 3.2.1, Seite 33. Ein Histidin6-tag und SUMO (blau) sind N-terminal an die Neurolin-Domäne fusioniert. Für Experimente der Identifizierung von Liganden ist zusätzlich ein strep-tag (violett) über einen kurzen Platzhalter von drei Aminosäuren SSG (Ser-Ser-Gly) C-terminal an die Neurolin Domäne fusioniert.

Dieses Zebrafisch-Neurolin-Konstrukt ist während der Präparation nach der Abspaltung von SUMO ausgefallen. Aufgrund der nicht vorhandenen Löslichkeit war dieses Protein für Ligand-Studien ungeeignet. Wenn SUMO nicht abgespalten wurde, blieb das Protein in Lösung. NMR-Spektren des kompletten Fusions-Proteins deuteten jedoch darauf hin, dass nur SUMO in gefalteter Form vorlag, und die zweite Neurolin-Domäne des Zebrafisches keine globuläre Faltung aufwies (Abb. 3.9).

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Abbildung 3.9: Überlagerung von ¹H-¹⁵N-HSQC-Spektren von dem kompletten Fusionsprotein SUMO-NIg2_strep (schwarz) und SUMO (blau). Der Teil der Signale aus dem Fusionsprotein, welcher breit über das Spektrum verteilt und charakteristisch für ein gefaltetes Protein ist, gehört zu SUMO. Die übrigen Signale, welche zu der Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch inklusive strep-tag gehören, haben eine sehr geringe Verteilung in Spektrum zwischen 7.5 und 8.2 ppm. Dies ist ein Indiz dafür, dass die zweite Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch nicht korrekt gefaltet ist, und vermutlich als ungefaltete Peptidkette an das gefaltete SUMO fusioniert in der Lösung vorliegt. Dies wird insbesondere durch einen Vergleich mit dem Spektrum des Fusionsproteins mit der Goldfisch Neurolin-Domäne in Abb. 3.7 (Seite 34) deutlich.

Dieses Ergebnis war insofern ungewöhnlich, da das entsprechende Goldfisch-Konstrukt unter den gleichen Bedingungen eine Langzeit-stabile Faltung aufwies. Das unterschiedliche Verhalten wurde auf Unterschiede in der Aminosäure-Sequenz innerhalb der Domänen zurückgeführt. Der zusätzliche C-terminale strep-tag bei der Zebrafisch-Domäne ist als Fehlerquelle sehr unwahrscheinlich, da dieser generell wasserlöslich ist. Ein Vergleich der Goldfisch-Sequenz mit der Zebrafisch-Sequenz innerhalb der zweiten Neurolin-Domäne ergab eine erwartet hohe Homologie mit 82% Identität und 86% Ähnlichkeit, wobei bei der Zebrafisch-Sequenz das Glycosylierungsmotiv NQT fehlte (Abb. 3.10).

3.2 Design molekularer Konstrukte

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Abbildung 3.10: Sequenzvergleich der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch und dem Zebrafisch. Die Homologie in den Sequenzen ist rot markiert (Cysteine gelb). Es gibt nur sehr wenige Unterschiede zwischen den beiden Domänen. Für Experimente der Ligandsuche war bei der Zebrafisch Domäne C-terminal ein strep-tag (unterstrichen) über einen kurzen Abstandshalter (Serin-Serin-Glycin) fusioniert.

Aus Strukturmodellen der Goldfisch- und Zebrafisch-Domänen wurde deutlich, dass die geringen Unterschiede in der Aminosäure-Sequenz eine große Auswirkung auf die Löslichkeit haben könnten. Im Falle der Goldfisch-Domäne, waren an den Positionen 212, 230 und 232 jeweils Glutamat-Reste, welche auf der Oberfläche des Proteins exponiert waren.

Diese sind unter den Präparations- und Messbedingungen (pH=7-8) negativ geladen (pKa

Glutamat-Rest: 4.07), und verleihen dem Protein eine hohe Löslichkeit an dieser Seite des Moleküls (Abb. 3.11). Im Gegensatz dazu, waren an den entsprechenden Stellen in der Zebrafisch-Domäne Alanin-212-, Threonin-230- und Aspartat-232-Reste. Alanin- und Threonin-Reste weisen keine negative Ladung auf. Der Aspartat-232-Rest ist unter den Präparations- und Messbedingungen analog dem Glutamat-Rest auch negativ geladen (pKa

Aspartat-Rest: 3.90), jedoch ist die geladene Carboxyl-Gruppe aufgrund einer kürzeren Seitenkettenlänge nicht so stark auf der Oberfläche des Proteins exponiert, wie im Falle des Glutamat-Restes bei der Goldfisch-Domäne (Abb. 3.11). Somit trugen bei der Zebrafisch-Domäne die geringen Unterschiede bei der Aminosäure-Sequenz zu einer geringen Löslichkeit der Protein-Oberfläche bei, und damit wurde höchst wahrscheinlich eine korrekte globuläre Faltung des Moleküls verhindert.

38 Abbildung 3.11:

(A) Struktur der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch (siehe Abschnitt 3.4, Seite 54).

(B) Strukturmodell der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch. Als Vorlage für die Homologiemodellierung diente die Goldfisch-Domäne aus (A).

(C) Elektrostatisches Potenzial der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch. Die Glutamat-Reste 212, 230 und 232 tragen wesentlich zu einer negativen Ladung auf dieser Seite des Proteins bei.

(D) Elektrostatisches Potenzial der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch anhand des Models aus (B). An den entsprechenden Stellen 212, 230 und 232 befinden sich bei der Zebrafisch Domäne ein Alanin, ein Aspartat und ein Threonin (Abb. 3.10). Diese Reste können nicht ein vergleichbar starkes negatives elektrostatisches Potenzial erzeugen wie die entsprechenden Glutamat Reste aus der Goldfisch-Domäne (C).