4.3.1 Allgemeine Angaben
Bis auf den Antikörper N518 erfolgten die Reinigungen aller Proteine nach dem gleichen Schema, und sofern nicht anders angegeben, bei 4°C. Der Zellaufschluss erfolgte über drei Durchgänge mit einer French Press bei 130MPa. Dazu wurden die Zellen in 20mL Reinigungspuffer suspendiert und vor und nach dem Aufschluss auf Eis gekühlt. Der Reinigungspuffer war je nach Protein verschieden, wurde aber immer mit einer Spatelspitze MgCl2 und DNAseI (ROCHE) versetzt. Außer bei der Reinigung der ULP1 wurde immer eine Tablette an cOmplete Mini EDTA-freien Proteaseinhibitoren (ROCHE) dazugegeben. Nach dem Aufschluss wurde die Suspension auf 65mL mit dem Reinigungspuffer verdünnt und für eine Stunde bei 100000g und 4°C zentrifugiert, um Bruchstücke der Zellmembranen vom löslichen Teil der Zellen zu trennen. Das lösliche Zell-Lysat wurde anschließend chromatographisch getrennt. Alle chromatographischen Schritte wurden mit einer Äkta Prime (GE HEALTHCARE) bei einer Flussrate von 1mL/Minute durchgeführt. In allen Fällen wurde das Zell-Lysat zunächst auf eine selbst gepackte 10mL-Nickel-Sepharose-Säule (GE HEALTHCARE) aufgetragen. Unspezifisch gebundene Proteine wurden mit dem Reinigungspuffer solange von der Säule gewaschen, bis sich eine stabile UV-Basislinie eingestellt hatte. Die Elution von der Nickel-Matrix erfolgte bei jedem Experiment mit Imidazol, welches je nach Protein in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt wurde. Je nach Protein folgten weitere Reinigungsschritte, welche den proteinspezifischen Abschnitten entnommen werden können. Gegebenenfalls wurde der Puffer nach den Reinigungen der Proteine getauscht. Dies erfolgte mit illustra NAP-5 Sephadex G-25 Säulen (GE HEALTHCARE), indem die Säule mit 10mL des gewünschten Puffers äquilibriert wurde,
4.3 Proteinreinigung
95
anschließend 0.5mL der Proteinlösung aufgetragen wurde, und das Protein mit 1mL gewünschten Puffer eluiert wurde. Alternativ wurde der Puffer ausgetauscht, indem die Proteinlösung über Ultrafiltration eingeengt und mit dem gewünschten Puffer verdünnt wurde. Für einen erfolgreichen Pufferaustausch wurde diese Prozedur fünf Mal wiederholt.
Für die Ultrafiltration kamen entweder Amicon Ultra-15/Ultra-4 Ultracel-10kDa Membranen (MILLIPORE) bei 7500g, oder Amicon Centriprep Ultracel YM-10kDa Membranen (MILLIPORE) bei 3000g zum Einsatz. Beide Membranen hatten einen Cut-off von 10kDa. Die Membranen wurden auch benutzt, um die Lösungen auf eine bestimmte Proteinkonzentration einzuengen. Die Proteinkonzentrationen wurden photometrisch bestimmt, indem die Absorption bei 280nm gemessen wurde. Die Konzentration des Proteins wurde mit dem Lambert-Beerschen Gesetz errechnet:
Mit:
A : gemessene Absorption
ε : molarer Extinktionskoeffizient
c : Konzentration des Proteins
d : Dicke der Küvette, typischerweise 1cm
Der Molare Extinktionskoeffizient ε der Proteine wurde mit der Web-basierten Software ProtParam (Wilkins et al., 1999) ermittelt. Die Werte für die Proteine befinden sich im Anhang.
Die Reinigungsschritte und die Reinheit der Proteinlösungen wurden mittels SDS-PAGE nach Laemmli (1970) verfolgt. Um die Proteinproben für die Elektrophorese vorzubereiten, wurden 10 – 30µL Proteinlösung mit 10µL 2-fach SDS-Ladepuffer (0.1M Tris pH=6.8, 4%(Gew.) SDS, 20%(Vol.) Glycerin, 25mM EDTA, 0.04%(Gew.) Bromphenolblau und 2%(Gew.) Dithiothreitol) gemischt, und die Mischung für 10 Minuten auf 95°C erwärmt. Für die Abschätzung der Molekulargewichte kamen Low molecular weight standards (BIORAD) oder Roti-Mark STANDARD (CARL ROTH) zum Einsatz. Die Elektrophorese bestand aus einem Sammelvorgang von 10 Minuten bei 160V und einem Trennvorgang von 35 Minuten bei 250V. Der Elektrophorese-Puffer bestand aus 14.4g/L Glycin, 3.0g/L Trizma Base und 1.0g/L SDS. Für den Antikörper N518 kam ein 10% SDS-Gel zum Einsatz, bei allen anderen Proteinen ein 15% SDS-Gel. Nach der Elektrophorese wurden die Proteinbanden im Gel mit
96
einer Färbelösung (10%(Vol.) Ethanol, 5%(Vol.) Essigsäure, 0.2%(Gew.) Coomassie Brilliant Blue G-250) für ca. 2 Stunden gefärbt. Um die Hintergrundfärbung des Gels zu entfernen wurde das Gel zunächst zwei Mal für 15 Minuten in einer 30%igen Ethanol-Lösung und anschließend in reinem Wasser gewaschen.
Tabelle 8: Zusammensetzung der SDS-Gele
Sammelgel Trenngel
10% 15%
30% (Bis-)Acrylamid 0.325mL 1.70mL 2.50mL
Sammel-/Trenngel-Puffer 2.175mL 1.25mL 1.25mL
Deionisiertes Wasser - 2.00mL 1.20mL
10% (Gew.) APS 0.02mL 0.05mL 0.05mL
Sammelgel-Puffer: 0.1M Tris pH=6.8, 0.11%(Vol.) TEMED, 0.11%(Gew.) SDS Trenngel-Puffer: 1.5M Tris pH=9, 0.4%(Vol.) TEMED, 0.4%(Gew.) SDS 30% (Bis-)Acrylamid: Rotiphorese Gel 30 (CARL ROTH)
4.3.2 Rückfaltungsexperimente mit der verkürzten Neurolin-Domäne nach Drees et al.
Der Reinigungspuffer für die verkürzte Domäne (Reste 132 – 228) richtete sich nach dem publizierten Protokoll von Drees et al. (2008), und bestand aus 20mM HEPES pH=7.4, 300mM NaCl und 10mM Imidazol. Nach dem Aufschluss der Zellen und der Ultrazentrifugation wurde jedoch nicht der lösliche Anteil weiterverarbeitet, sondern das Pellet, welches die Inclusion bodies enthielt. Das Pellet wurde in einem denaturierendem Puffer solubilisiert, welcher 2M Guanidinium-Hydrochlorid (GnCl) und 50mM NaPi pH=7.5 enthielt. Nach der Solubilisierung wurde für eine Stunde bei 100000g und 4°C zentrifugiert.
Das Pellet wurde verworfen, und der Überstand auf die Nickel-Sepharose geladen. Das Protein wurde über einen Gradienten von 0 – 0.5M Imidazol in dem denaturierendem Puffer (2M GnCl) eluiert. Das Eluat wurde anschließend auf eine Proteinendkonzentration von ca.
0.5mM mit denaturierendem Puffer verdünnt und eine Endkonzentration von 2 mM L-Cystein oder eine Mischung von 2mM Dithiothreitol und 0.5mM oxidiertem Glutathion wurde eingestellt. Diese Mischung wurde über drei Tage bei 4°C gegen den nativen Reinigungspuffer dialysiert, welcher ebenfalls 2mM L-Cystein, beziehungsweise eine Mischung von 2mM Dithiothreitol und 0.5mM oxidiertem Glutathion enthielt. Optional enthielt der native Puffer zusätzlich 0.2M Arginin oder 0.02% Dodecylmaltosid. Nach der
4.3 Proteinreinigung
97
Dialyse wurde zu der Lösung 2mM CaCl2 und Thrombin (GEHEALTHCARE) (eine Einheit pro mg Protein) gegeben und für 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um den His6-tag abzuspalten. Anschließend wurde 0.1%(Vol.) gesättigter PMSF Lösung (in Ethanol) zugesetzt, um den Thrombin-Verdau anzuhalten. Die Lösung wurde auf ca. 20mL konzentriert und erneut auf die Nickel-Sepharose Matrix aufgetragen. Der Durchlauf enthielt die Protein-Domäne ohne den His6-tag und wurde für 5 Minuten bei 14000g zentrifugiert, um vorhandenes Präzipitat zu entfernen, über eine 0.2µm Celluloseacetat-Membran filtriert und auf 1mL eingeengt. Die konzentrierte Proteinlösung wurde anschließend über eine Superdex75 16/60 (GEHEALTHCARE) Säule weiter gereinigt.
4.3.3 Die zweite Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch
Der Reinigungspuffer für das His6-SUMO-NIg2 Konstrukt (Reste 130 – 240) bestand aus 50mM Tris pH=8, 500mM NaCl und 5%(Vol.) Glycerin. Nach dem Zellaufschluss und der Ultrazentrifugation wurde der lösliche Zellextrakt auf die Nickel-Sepharose geladen und mit 50mM Tris pH=8, 500mM NaCl, 5%(Vol.) Glycerin und 500mM Imidazol isokratisch eluiert.
Das Eluat wurde bei Raumtemperatur über Nacht gegen den Reinigungspuffer dialysiert, um das Imidazol zu entfernen. Zusätzlich wurde zur Proteinlösung die ULP1 im Verhältnis 1mg:10mg (ULP1: His6-SUMO-NIg2) zugegeben, um das Fusionsprotein zu spalten. Nach erfolgter Dialyse wurde die Proteinlösung erneut auf die Nickel-Sepharose geladen. Der Durchlauf, welcher NIg2 enthielt, wurde auf 1mL eingeengt, über eine 0.2µm Celluloseacetat-Membran filtriert, und über eine Superdex75 16/60 (GEHEALTHCARE) Säule weiter gereinigt. Der vereinigte Pool, welcher NIg2 enthielt wurde eingeengt, der Puffer wurde gegebenenfalls getauscht und die Proteinlösung stand für weitere Experimente zur Verfügung.
4.3.4 Die zweite Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch
Die Reinigung der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Zebrafisch (Reste 130 – 240) entsprach im Wesentlichen der Reinigung der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch (Abschnitt 4.3.3). Jedoch wurden hier verschiedene Reinigungspuffer ausprobiert und die Spaltung des Fusionsproteins mittels ULP1 ist nicht immer erfolgt (siehe hierzu den Abschnitt 3.3.2, Seite 48).
98
4.3.5 Die erste ROBO-Domäne aus dem Zebrafisch
Die Reinigung der ersten ROBO-Domäne aus dem Zebrafisch (Reste 24 – 128) war von den Puffern und experimentellen Bedingungen identisch zu der Reinigung der zweiten Neurolin-Domäne aus dem Goldfisch (Abschnitt 4.3.3).
4.3.6 Die ULP1
Für den Aufschluss der Zellen, welche die ULP1 enthielten, war sehr wichtig, dass keine Protease-Inhibitor Tablette zugesetzt werden durfte. Der Reinigungspuffer enthielt 40mM HEPES pH=7.5, 150mM KCl, 20mM β-Mercaptoethanol und 10mM Imidazol. Nach Zellaufschluss und Ultrazentrifugation wurde das lösliche Zell-Lysat auf die Nickel-Sepharose geladen, und isokratisch mit 40mM HEPES pH=7.5, 150mM KCl, 20mM β-Mercaptoethanol und 250mM Imidazol eluiert. Nach der Elution von der Nickel-Matrix wurde das Protein über Nacht gegen einen Puffer mit der Zusammensetzung von 40mM HEPES pH=7.5, 100mM KCl und 10mM β-Mercaptoethanol dialysiert, um das Imidazol aus der Proteinlösung zu entfernen. Die Lösung wurde auf eine Protein-Endkonzentration von 8mg/mL eingeengt, und es wurde Glycerin zu einer Endkonzentration von 50% Vol.
hinzugefügt. Es wurden 0.2mL Aliquote hergestellt, mit flüssigem Stickstoff schockgefroren, und bei -80°C aufbewahrt.
4.3.6 Der Antikörper N518
Die Anzucht der Hybridom-Zellen, welche den Antikörper N518 sekretieren wurde bei der Arbeitsgruppe Stürmer von Ulrike Binkle und Florian Wedekink nach Standardmethoden durchgeführt. Für die Reinigung wurden 2.5L Überstand des Wachstumsmediums, welcher den Antikörper N518 enthielt, auf zwei hintereinandergeschaltete 1mL ProteinG-HP-Matrix-Säulen (GEHEALTHCARE) geladen. Die Elution des Antikörpers von der Matrix erfolgte mit 0.1M Glycin pH=2.7. Damit der Antikörper nicht lange in dem sauren Puffer ausgesetzt war, wurde pro 1mL Elutionsfraktion 0.2mL 1M Tris pH=9 vorgelegt, um die Lösung annähernd zu neutralisieren. Für weitere Experimente wurde der Puffer des Antikörpers nach beschriebenen Methoden ausgetauscht. Die Konzentration des Antikörpers wurde mit zwei photometrischen Methoden bestimmt. Die erste entspricht der oben genannten Absorptionsmessung bei 280nm mit einem Extinktionskoeffizienten von 203000M-1cm-1. Die zweite wurde mit einem Bradford ULTRA Kit (GENTAUR) durchgeführt. Bei dieser wurde eine Kalibrationsmessreihe mit Rinderserumalbumin mit Konzentrationen von 0.1mg/mL – 1.5mg/mL erstellt, um die Konzentrationen zu vergleichen.