Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an prokaryotischen Reggie-assoziierten Proteinen
und am Protein Neurolin aus dem Goldfisch
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
vorgelegt von Walker, Christina
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Tag der mündlichen Prüfung: 2. Mai 2012 1. Referent: Dr. Heiko Möller 2. Referent: Prof. Dr. Winfried Boos
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-192931
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
1.1 Das Protein Neurolin aus dem Goldfisch ... 1
1.2 SPFH-Proteine in Eukaryoten und Prokaryoten ... 7
1.3 Reggie-assoziierte NfeD-Proteine aus Bakterien ... 11
1.4 Eine GCN5-verwandte N-Acetyltransferase im Operon yuaFGI in B. subtilis ... 15
2 Aufgabenstellung ... 19
2.1 Ig2-Domäne von Neurolin aus dem Goldfisch ... 19
2.2 SPFH-assoziierte NfeD-Proteine aus Bakterien ... 19
2.3 Acetyltransferase YuaI aus Bacillus subtilis ... 19
3 Ergebnisse und Diskussion ... 21
3.1 Ig2-Domäne von Neurolin aus dem Goldfisch ... 21
3.1.1 Expression und Reinigung ... 21
3.1.2 Die Ig2-Domäne von Neurolin bildet nichtkovalente Homodimere ... 25
3.1.3 Biochemische und biophysikalische Charakterisierung ... 26
3.1.4 Sekundärstrukturgehalt ... 27
3.1.5 NMR-Spektren ... 29
3.1.6 Homologiemodell ... 32
3.1.7 Erkennung durch spezifischen Antikörper ... 34
3.1.8 Retinapräparationen ... 35
3.1.9 Ausblick ... 36
3.2 Lösliche Domäne des NfeD-Proteins YuaF aus Bacillus subtilis ... 39
3.2.1 Auswahl des Konstrukts zur Strukturaufklärung ... 39
3.2.2 Vorbereitungen für die Proteinstrukturaufklärung ... 40
3.2.3 Methode der Strukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie ... 42
3.2.3.1 Zuordnung des Proteinrückgrats und der Proteinseitenketten ... 42
3.2.3.2 Berechnung der Proteinstruktur mit CYANA ... 45
3.2.3.3 Strukturverfeinerung mit AMBER 8 ... 47
3.2.3.4 Vergleich mit dem aktuellen Stand der Methodenentwicklung ... 48
3.2.4 Resonanzzuordnung von sYuaF ... 49
3.2.5 Strukturberechnung von sYuaF ... 50
3.2.6 Diskussion der Struktur ... 54
3.2.7 ATNOS/CANDID ergibt ähnliche Struktur ... 56
3.2.8 Flexibilität des Proteinrückrats ... 58
3.2.9 Titration von sYuaF mit einem Peptid des koregulierten SPFH-Protein YuaG 60 3.3 Lösliche Domäne des NfeD-Proteins YqiJ aus Escherichia coli ... 62
II
3.3.1 Auswahl des Konstrukts zur Strukturaufklärung ... 62
3.3.2 Vorbereitungen für die Proteinstrukturaufklärung ... 63
3.3.3 Resonanzzuordnung von sYqiJ ... 64
3.3.4 Strukturberechnung von sYqiJ ... 65
3.3.5 Diskussion der Struktur ... 69
3.3.6 Flexibilität des Proteinrückrats ... 70
3.4 Strukturvergleich der NfeD-Proteine ... 72
3.5 Acetyltransferase YuaI aus Bacillus subtilis ... 78
3.5.1 Auswahl des Konstrukts ... 78
3.5.2 Expression und Reinigung ... 78
3.5.3 Vorbereitungen für die Resonanzzuordnung ... 78
3.5.4 Resonanzzuordnung von YuaI ... 79
3.5.5 Sekundärstruktur ... 81
3.5.6 Flexibilität des Proteinrückrats ... 83
3.5.7 Untersuchungen zur Substratspezifität der Acetyltransferase YuaI ... 85
4 Zusammenfassung ... 91
4.1 Ig2-Domäne von Neurolin aus dem Goldfisch ... 91
4.2 SPFH-assoziierte NfeD-Proteine aus Bakterien ... 91
4.3 Acetyltransferase YuaI aus Bacillus subtilis ... 93
5 Summary ... 95
5.1 Ig Domain 2 of Neurolin from Goldfish ... 95
5.2 SPFH-associated NfeD Proteins from Bacteria ... 95
5.3 Acetyltransferase YuaI from Bacillus subtilis ... 97
6 Experimenteller Teil ... 99
6.1 Geräte und Zubehör ... 99
6.2 Chemikalien ... 100
6.3 Antibiotika ... 102
6.4 Antikörper ... 103
6.5 Tiere ... 103
6.6 Puffer und Medien ... 103
6.7 Verwendete Bakterienstämme ... 104
6.8 15 % SDS-PAGE ... 104
6.9 Die zweite Ig-Domäne des Proteins Neurolin ... 105
6.9.1 Sequenz-alignment ... 105
6.9.2 Molekularbiologische Methoden ... 105
6.9.2.1 Klonierung ... 105
6.9.2.2 Kompetente Zellen ... 106
III
6.9.2.3 Expression ... 106
6.9.2.4 Reinigung ... 106
6.9.3 Analytische Methoden ... 107
6.9.3.1 Analytische Gelfiltration ... 107
6.9.3.2 Proteinbestimmung ... 108
6.9.3.3 Thiole ... 108
6.9.3.4 Massenbestimmung ... 108
6.9.3.5 FTIR-Spektroskopie ... 108
6.9.3.6 Circulardichroismus ... 109
6.9.3.7 NMR-Experimente ... 109
6.9.3.8 Dot Blot-Analyse ... 109
6.9.4 Retinapräparationen ... 110
6.9.4.1 Entfernung der Endotoxine ... 110
6.9.4.2 Proteinbestimmung über BSA-Kalibriergerade ... 110
6.9.4.3 Injektionen in Goldfischaugen in vivo ... 111
6.9.4.4 Immunfärbungen von Goldfischretinae ... 111
6.9.5 Homology Modelling ... 112
6.10 Die lösliche Domäne des NfeD-Proteins YuaF ... 113
6.10.1 Sequenz-alignment ... 113
6.10.2 Expression und Reinigung ... 113
6.10.3 Massenbestimmung ... 113
6.10.4 Proteinstrukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie ... 114
6.10.4.1 NMR-Proben ... 114
6.10.4.2 Optimierung der Messbedingungen ... 114
6.10.4.3 Aufnahme der NMR-Spektren ... 114
6.10.4.4 Zuordnung der NMR-Spektren ... 115
6.10.4.5 Strukturberechnung und Verfeinerung... 116
6.10.4.6 Strukturvalidierung ... 117
6.10.5 Strukturberechnung mit ATNOS/CANDID ... 117
6.10.6 Messung von {1H}-15N-heteronuklearen NOEs ... 118
6.10.7 Titration von sYuaF mit einem Peptid aus YuaG ... 118
6.11 Die lösliche Domäne des NfeD-Proteins YqiJ ... 118
6.11.1 Expression und Reinigung ... 118
6.11.2 Massenbestimmung ... 119
6.11.3 Strukturberechnung mittels NMR-Spektroskopie ... 119
6.11.3.1 Optimierung der Messbedingungen ... 119
6.11.3.2 NMR-Proben ... 119
IV
6.11.3.3 NMR-Messungen ... 119
6.11.3.4 Resonanzzuordnung ... 120
6.11.3.5 Strukturberechnung und –verfeinerung ... 120
6.11.4 Strukturvalidierung ... 120
6.11.5 Messung von {1H}-15N-heteronuklearen NOEs ... 121
6.12 Strukturvergleich der NfeD-Proteine ... 121
6.12.1 Sequenz- und 3D-alignment ... 121
6.13 Die Acetyltransferase YuaI ... 121
6.13.1 Expression und Reinigung ... 121
6.13.2 Massenbestimmung ... 122
6.13.3 NMR-Proben ... 122
6.13.4 Optimierung der Messbedingungen ... 122
6.13.5 Aufnahme der NMR-Spektren ... 122
6.13.6 Zuordnung der NMR-Spektren ... 123
6.13.7 Sekundärstrukturvorhersage mit PREDITOR ... 123
6.13.8 Sekundäre chemische Verschiebungen ... 123
6.13.9 Messung von {1H}-15N-heteronuklearen NOEs ... 124
6.13.10 Homologiemodell ... 124
6.13.11 Enzymatische Acetylierung von Polyaminen und Dünnschichtchromatographie ... 124
7 Anhang ... 127
7.1 Restraints der Strukturberechnungen ... 127
7.1.1 sYuaF ... 127
7.1.2 sYqiJ ... 132
7.2 CYANA-Protokolle ... 137
7.2.1 sYuaF ... 137
7.2.1.1 CALC.cya ... 137
7.2.1.2 init.cya ... 137
7.2.2 sYqiJ ... 137
7.2.2.1 CALC.cya ... 137
7.2.2.2 init.cya ... 138
7.3 AMBER-Protokolle ... 138
7.3.1 Protokoll für simulated annealing ... 138
7.3.2 Minimierungsprotokoll ... 138
7.4 Nicht-Standard Pulsprogramme ... 139
7.4.1 stdtocnhsqcwf.3d.hm ... 139
7.4.2 hnhbgp3d.t0.be ... 141
7.5 Verzeichnisse der verwendeten NMR-Daten ... 143
V
7.5.1 sYuaF ... 143
7.5.2 sYqiJ ... 144
7.5.3 YuaI ... 145
7.5.4 Ig2-Domäne von Neurolin ... 146
8 Literaturverzeichnis ... 147
VI
VII
Abkürzungsverzeichnis
APS Ammoniumpersulfat
AS Aminosäure
BSA Rinderserumalbumin (auch bovines Serumalbumin)
BCA Bicinchoninsäure
CAPS 3-(Cyclohexylamino)-propansulfonsäure
CD Circulardichroismus
DTNB 5,5‘-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)
DTT threo-1,4-Dimercapto-2,3-butandiol (Dithiothreitol)
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ESI Elektronenspray-Ionisation
FTIR Fourier-Transform-Infrarot
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure
Ig Immunglobulin
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
NOE Kern-Overhauser-Effekt (engl. Nuclear Overhauser Effect)
NMR kernmagnetische Resonanz
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PFA Paraformaldehyd
PSMF Phenylmethylsulfonylfluorid
RDC residuale dipolare Kopplungen
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese sYqiJ lösliches YqiJ (engl. soluble YqiJ)
sYuaF lösliches YuaF (engl. soluble YuaF)
TCA Trichloressigsäure
TCEP Tris(2-carboxyethyl)-phosphin
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
VIII Tabelle 1
Die 20 proteinogenen Aminosäuren im Ein- und Drei-Buchstabencode
Aminosäure Drei-Buchstabencode Ein-Buchstabencode
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Asparaginsäure Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gln Q
Glutaminsäure Glu E
Glycin Gly G
Histidin His H
Isoleucin Ile I
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Phenylalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosin Tyr Y
Valin Val V
1
1 Einleitung
1.1 Das Protein Neurolin aus dem Goldfisch
Eine Besonderheit des Goldfisches ist das lebenslange Wachstum seines Sehsystems. Hierbei bilden sich Ganglienzellen am äußeren Rand der Retina. Die aus diesen Zellen entstehenden Axone wachsen direkt von außen nach innen zur Papille, wobei sie sich mit anderen Axonen der gleichen und der vorhergehenden Generation zu Faszikeln zusammenschließen. Hierbei korreliert die Vermehrungsrate der Neuronen in der Retina mit dem Wachstum des gesamten Fisches (Fernald, 1990). Schnell wachsende Goldfische bilden im gleichen Zeitraum eine wesentlich größere Anzahl von Ganglienzellen und Axonen auf der Retina als langsamer wachsende Individuen.
Weiterhin sind die Ganglienzellen auf der Retina zur spontanen Regeneration ihrer Axone nach einer Verletzung fähig. Diese Fähigkeit zur Regeneration hat das zentrale Nervensystem bei Säugetieren, z. B. nach Querschnittslähmung oder Schlaganfall, verloren.
Das Protein Neurolin aus dem Goldfisch ist ein glykosyliertes Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 86 kDa (Paschke et al., 1992). Es gehört zur Immunglobulin- Superfamilie (IgSF) (Brummendorf et al., 1995). Es besteht aus einem großen extrazellulären Teil mit fünf Ig-Domänen, einer Transmembranhelix und einer stark konservierten cytoplasmatischen Domäne (Laessing et al., 1994) (Abbildung 1). Die beiden ersten N- terminalen Domänen des extrazellulären Teils sind vom V-Typ, die drei C-terminalen vom C2-Typ (Leppert et al., 1999).
Abbildung 1
Schematische Darstellung des Proteins Neurolin aus dem Goldfisch (Denzinger et al., 1999). Alle extrazellulären Ig-Domänen außer der vierten sind durch Disulfidbrücken stabilisiert. Die N- Glykosylierungsstellen sind mit Rauten markiert.
2
Alle Ig-Domänen bis auf die vierte sind durch die für Ig-Domänen typischen Disulfidbrücken stabilisiert. Wie bei DM-GRASP (Burns et al., 1991), einem Homologen von Neurolin, ist bei der vierten Ig-Domäne statt eines Cysteins ein Leucin vorhanden (Laessing et al., 1994). Es ist bereits von anderen Proteinen der IgSF bekannt, dass in Ig-Domänen Cystein-Reste fehlen und statt dessen hydrophobe Aminosäuren vorhanden sind (Williams et al., 1988).
Wie in Abbildung 1 zu sehen, gibt es fünf N-Glykosylierungsstellen. Alle haben die Erkennungssequenz Asn-Xxx-Ser/Thr und sind heterogen glykosyliert. Diese N-Glykane zeigen meist eine einfach verzweigte Struktur mit terminalen Galaktose- und Neuraminsäureresten (Denzinger et al., 1999). Die Anordnung der glykosylierten Ig- Domänen steht im Einklang mit der früher vorgeschlagenen Struktur der extrazellulären Domänen von Zelladhäsionsproteinen (Kuster et al., 1998).
Das Protein Neurolin wurde im Goldfisch als Antigen gegen den monoklonalen Antikörper E21 entdeckt (Paschke et al., 1992). Neurolin wird von Axonen der Retinaganglienzellen räumlich und zeitlich begrenzt exprimiert. Die Expression ist in Goldfischembryos und bei der Axonregeneration hochreguliert. Weiterhin wird Neurolin selektiv von neu differenzierten Retinaganglienzellen und wachsenden Axonen dieser Zellen exprimiert (Paschke et al., 1992).
In früheren Experimenten von Stürmer und Mitarbeitern wurde die Funktion von Neurolin durch in vivo-Studien mit Antikörpern untersucht. Einerseits wurde Neurolin durch Fab- Fragmente eines polyklonalen Antiserums, das gegen immunologisch aufgereinigtes Neurolin gerichtet ist, blockiert. Fab-Fragmente sind die Antigen-bindenden Teile von Antikörpern.
Andererseits wurde eine Blockierung von Neurolin mit Antikörpern, die spezifisch gegen die Ig-Domänen 1, 2 und 3 gerichtet sind, durchgeführt. In beiden Fällen erhielt man schwere Wegfindungsstörungen der Axone (Ott et al., 1998; Leppert et al., 1999) (Abbildung 2).
Anstatt in Richtung der Papille zu wachsen, verließen die Axone ihr ursprüngliches Faszikel und wuchsen in die entgegengesetzte Richtung oder verloren völlig die Orientierung (Ott et al., 1998; Leppert et al., 1999). Mittels der monoklonalen Antikörper konnte gezeigt werden, dass die zweite Ig-Domäne von Neurolin für diese Wegfindungsfunktion der Axone essentiell ist (Leppert et al., 1999).
Weiterhin bildeten die Axone bei Behandlung sowohl mit den Fab-Fragmenten als auch mit den monoklonalen Antikörpern statt der sonst so schmalen, engverbundenen, nur noch locker verknüpfte Faszikel (Ott et al., 1998; Leppert et al., 1999). Für die Bildung von festen Faszikeln sind die Ig-Domänen 1 und 3 essentiell (Leppert et al., 1999).
3 Abbildung 2
Blockade der Neurolinfunktion durch monoklonale Antikörper, anti-Neurolin-Ig2, führt zu gravierenden Störungen des Axonenwachstums hinsichtlich der Wegfindung in Richtung auf die Papille (Leppert et al., 1999). (A) Vergrößerung des dorsalen Teils, wie oben durch den Kasten angegeben. Anstatt in Richtung der Papille (optic disc, od) zu wachsen, ändern sie die Richtung (Pfeile in A), entfernen sich von ihrem ursprünglichen Bündel (B), wachsen in Schleifen (C) und enden zwischen einzelnen Bündeln (D). Der Rand der Retina ist oben, die Papille (optic disc, od) ist unten. Der Balken in A entspricht 200 µm, derjenige in B – D 100 µm.
Um die Funktion von Neurolin weiter zu untersuchen, wurden von Heike Diekmann Fusionsproteine aus dem extrazellulären Teil von Neurolin und dem Fc-Teil des humanen IgG1-Antikörpers hergestellt. Hierzu wurden einmal der gesamte extrazelluläre Bereich von Neurolin, einmal die beiden ersten Domänen und einmal die einzelnen Domänen 1 und 2 verwendet. Es wurde untersucht, ob und mit welcher Domäne Neurolin an Gewebsstrukturen der Goldfisch-Retina bindet. Die Experimente ergaben, dass die komplette extrazelluläre Domäne von Neurolin an die Axone der Retina bindet. Dagegen besaßen die Fc- Fusionsproteine der separaten Domänen Ig1 und Ig2, sowie ein Konstrukt aus den beiden Domänen Ig1 und Ig2 keine Affinität (Diekmann, 2002; Heinz, 2004).
Schließlich wurde nach Interaktionspartnern von Neurolin gesucht: In einem phage display screen wurde ein Protein ähnlich dem Muc1/Merozoit-Oberflächenantigen 2 gefunden, das mit den extrazellulären Domänen von Neurolin interagiert (Diekmann, 2002). Für die cytoplasmatische Domäne wurde mit einem yeast two hybrid screen ein neuartiges Zinkfinger-Protein gefunden (Diekmann, 2002). Beide Interaktionen sind noch nicht biochemisch bestätigt.
4
Neurolin kommt nicht nur im Goldfisch, sondern auch im Zebrafisch vor (84 % Sequenzidentität). Dort hat Neurolin eine ähnliche Funktion wie beim Goldfisch. Bei Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen Neurolin erhält man auch hier massive Defekte der neuronalen Entwicklung (Ott et al., 2001).
Wie Neurolin seine Funktion ausübt, ist nicht bekannt. Es wird vermutet, dass die Papille dirigierende Verbindungen abgibt, die von Neurolin erkannt werden und axonales Wachstum entlang des Konzentrationsgradienten auslösen. Andersherum könnte es auch einen repulsiven Impuls vom Retinarand aus geben. Vorstellbar wären auch Wechselwirkungen von Neurolin mit Strukturen auf bereits vorhandenen Axonen, die ebenfalls zu einem gerichteten Wachstum in Richtung der Papille führen würden.
Bei Homologen von Neurolin wie dem menschlichem activated leukocyte-cell adhesion molecule, kurz ALCAM, (Bowen et al., 1995) und dem menschlichem receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) (Neeper et al., 1992; Schmidt et al., 1992) ist der Funktionsmechanismus bereits gut untersucht.
ALCAM ist an aktivierte Leykozyten gebunden und besteht wie Neurolin aus zwei N- terminalen V-Domänen gefolgt von drei C-Domänen, einer hydrophoben Transmembranregion und einem kurzen cytoplasmatischen Teil. Die extrazelluläre Struktur von ALCAM besteht aus zwei funktionellen Modulen, der N-terminalen V-Domäne D1 und den beiden membranständigen C-Domänen D4 und D5 (van Kempen et al., 2001) (Abbildung 3).
Die D1-Domäne geht trans-Interaktionen mit dem ALCAM-Molekül der benachbarten aktivierten Leukozytenzelle ein (Abbildung 3). Sie ist ebenfalls essentiell für die Bindung von Liganden, wie in Abbildung 4 mit dem Protein CD6, das an T-Zellen gebunden ist (Aruffo et al., 1997) gezeigt. Die beiden Domänen D4 und D5 sind an der cis-Oligomerisierung an der Zelloberfläche beteiligt. Diese Oligomerisierung mit unbekannter Stöchiometrie erhöht die ALCAM-Bindungsfähigkeit. Beide Module, die N-terminale D1-Domäne und die Funktionseinheit aus D4- und D5-Domäne, müssen gleichzeitig vorhanden sein, um eine feste Bindung zwischen den Zellen auszubilden.
5 Abbildung 3
Homophile ALCAM-ALCAM-Interaktionen zwischen aktivierten Leukozyten (van Kempen et al., 2001). Der extrazelluläre Teil von ALCAM hat zwei funktionelle Untereinheiten. Die Ig-Domäne D1 ist essentiell für die Bindung des Liganden. Die Ig-Domänen D4 und D5 sind an der cis- Oligomerisierung auf der Zelloberfläche beteiligt.
Abbildung 4
Schematische Darstellung der Domänen, die für die heterophile Interaktion zwischen CD6 und ALCAM und die homophile Interaktion zwischen verschiedenen ALCAM-Molekülen notwendig sind (Bowen et al., 2000). Offene Rechtecke stehen für C-Domänen und gefüllte Rechtecke für V- Domänen. Die membranständige Ligandbindungsdomäne von CD6 ist in schwarz gezeigt. Diese Domäne bindet an die N-terminale Domäne von ALCAM (trans). Die drei membranständigen Domänen von ALCAM binden an weitere ALCAM-Moleküle an der Zelloberfläche (cis).
6
In Analogie dazu stehen die Ergebnisse bei Neurolin von Leppert et al. (1999). Hier wurde mit einem anti-Ig1-Antikörper die Bildung von festen Faszikeln gestört. Weiterhin wird angenommen, dass mit einem Antikörper gegen die Ig-Domäne 3 die Bildung von Neurolinclustern auf der Zelloberfläche behindert wird. Die Avidität der Bindung nimmt dadaurch ab, was die beobachtete Defaszikulation als Resultat hat. Bisher ist es allerdings nicht gelungen, homophile cis- oder trans-Interaktionen bei Neurolin nachzuweisen.
Nach Bowen et al. (1996) ist die Bildung von ALCAM-Clustern auch bei heterophilen Bindungen essentiell, da sie die Avidität erhöhen (Abbildung 4). In dieser Untersuchung hatten ALCAM-Fusionsproteine, die C-Domänen enthielten, eine höhere Bindungsfähigkeit zu CD6 als solche ohne C-Domänen.
Analog dazu mag das bei Neurolin der Grund sein, warum bei Diekmann (2002) Bindungsaktivitäten nur bei rekombinanten Fc-Konstrukten, die alle extrazellulären Domänen beinhalteten, beobachtet wurden. Bei den anderen Fc-Konstrukten war nur die erste, die zweite oder die beiden ersten Domänen vorhanden. Somit würde die Möglichkeit zur Oligomerisierung fehlen.
Bei dem Homologen RAGE ist die Struktur (PDB-Codes (Berman et al., 2000): 3O3U, 3CJJ, 2ENS, 2E5E) und die Funktion noch detaillierter untersucht. Das Protein besteht aus einer V- Domäne und zwei C-Domänen, gefolgt von einer Transmembranhelix und einer 43 Aminosäuren langen cytosolischen Domäne (Schmidt et al., 1994). Die V-Domäne und die erste C-Domäne (C1) sind keine unabhängigen Domänen, sondern bilden eine zusammenhängende Struktureinheit. Die zweite C-Domäne (C2) dagegen ist vollständig unabhängig (Dattilo et al., 2007). Die aktuelle Hypothese der Aktivierung von RAGE sieht folgendermaßen aus (Koch, 2007) (Abbildung 5): Durch Bindung eines Liganden, hier S100B, wird ein Dimer von RAGE stabilisiert. Hierbei nähern sich die beiden cytoplasmatischen Domänen so weit an, dass sich eine Signalplatform in der Zelle bildet.
Dieser Komplex aktiviert dann intrazelluläre Signalkaskaden. Ostendorp et al. (2007) konnten zeigen, dass S100B an die V- und die C1-Domäne von RAGE bindet. Multimere Formen von S100B binden mit hoher Affinität an dimeres RAGE.
7 Abbildung 5
Modell für die Aktivierung von RAGE (Koch, 2007). Die Bindung eines Liganden (rot) stabilisiert die Assoziation zweier Rezeptormoleküle (beige und orange). Dieser Komplex initiiert die Signaltransduktion durch die Bildung einer Signalplatform, an die Liganden (hellblau) binden können.
Angesichts der hohen Sequenzhomologie zwischen der Ig2-Domäne von Neurolin und der C1-Domäne von RAGE (20 % Identität, 70 % Ähnlichkeit) (Kulić, 2009) könnten S100- Proteine auch potentielle Interaktionspartner von Neurolin sein.
1.2 SPFH-Proteine in Eukaryoten und Prokaryoten
Reggie- beziehungsweise Flotillin-Proteine wurden von den Arbeitsgruppen von Claudia Stürmer, Madeleine Duvic und Michael Lisanti unabhängig voneinander entdeckt (Schroeder et al., 1994; Bickel et al., 1997; Schulte et al., 1997). In Fischen werden die Proteine Reggie-1 und Reggie-2 nach Verletzung des Sehnervs und während der Axonregeneration exprimiert (Schulte et al., 1997). Der Name Reggie wird von deren Regenerationsfunktion abgeleitet, da diese Proteine für die Axonregeneration und das Wachstum der Axone notwendig sind. Eine verminderte Expression führt nach einer Beschädigung des Sehnervs von Zebrafischen zu einer deutlichen Reduktion der Anzahl der regenerierten Axone auf der Retina (Munderloh et al., 2009). Von der Gruppe von Michael Lisanti wurde dieselben Proteine als Flotillin-1 und -2 bezeichnet, da diese Proteine spezifische Marker für die schwimmende (englisch „floating“) lipid raft-Fraktion des Lungengewebes von Mäusen sind (Bickel et al., 1997). Flotillin-1 entspricht hierbei Reggie-2 und umgekehrt. Die Reggie/Flotillin-Proteine gehören zur SPFH-(Stomatin/Prohibitin/Flotillin/HflC/K)-Protein- Superfamilie (Tavernarakis et al., 1999). In Eukaryoten sind diese Proteine Schlüsselkomponenten bei der Bildung von lipid rafts und spielen eine wichtige Rolle bei der
8
Bildung von Membranmikrodomänen ähnlich den Caveolae (Langhorst et al., 2005). Zu dem großen Spektrum an Funktionen gehören unter anderem Wachstum und Regeneration von Axonen (Munderloh et al., 2009), Endozytose (Glebov et al., 2006) und Insulin-stimulierte Aufnahme von Glukose (Baumann et al., 2000). Claudia Stürmer (Stuermer, 2010) gibt eine Erklärung für die vielfältigen Funktionen dieser Proteine: Die Reggie/Flotillin-Mikrodomänen begünstigen die Agglomeration von Zelltyp-spezifischen Zelloberflächenproteinen und Signalkomplexen an der Plasmamembran (Abbildung 6). Dadurch wird ein Signalzentrum geschaffen, dass den Tansport von Membranmaterial und spezifischen Membranproteinen von internen Vesikeln hin zu strategisch wichtigen Plasmamembran-Domänen wie Zell- Zellkontakten und regenerierenden Axonen auslöst.
Abbildung 6
Modell einer Reggie/Flotillin-Mikrodomäne, die die Agglomeration von Zelltyp-spezifischen Zell- oberflächenproteinen und Signalkomplexen an der Plasmamembran begünstigt. Dadurch wird ein Signalzentrum geschaffen, dass den Tansport von Membranmaterial und spezifischen Membran- proteinen von internen Vesikeln hin zu strategisch wichtigen Plasmamembran-Domänen auslöst.
Aus Rivera-Milla et al. (2006).
López und Kolter (2010) konnten zeigen, dass lipid rafts auch in Bakterien vorkommen. Sie sind den eukaryotischen lipid rafts funktionell ähnlich, indem sie Proteine, die an Signaltransduktion, Translokation von kleinen Molekülen und Proteinsekretion beteiligt sind, aufnehmen und organisieren. Auch Reggie-Proteine finden man in vielen Prokaryoten (Hinderhofer et al., 2009). Die Proteine YuaG aus B. subtilis und YqiK aus E. coli zeigen 60 % beziehungsweise 42 % Sequenzähnlichkeit zum menschlichen Reggie-1. Sie werden als
9 Reggie-ähnliche Proteine bezeichnet und gehören ebenfalls zur SPFH-Protein-Superfamilie.
Die genaue Funktion ist nicht bekannt, es wird jedoch über die Beteiligung an Membranorganisationsprozessen wie in Eukaryoten diskutiert. Das Reggie-ähnliche Protein YuaG aus Bacillus subtilis zum Beispiel zeigt eine Lokalisation in diskreten foci in der Zellmembran (siehe Seite 15) und spielt eine wichtige Rolle bei der Sporulation (Donovan et al., 2009). Eine Deletion dieses Proteins führt zu einem verspäteten Beginn der Sporulation zusammen mit einer reduzierten Sporulationseffizienz.
Zur Zeit sind drei Strukturen von SPFH-Domänen bekannt: Die Struktur der SPFH-Domäne von Flotillin-2 aus der Maus (Reste 43-167, PDB: 1WIN, Miyamoto et al., noch zu veröffentlichen) und zwei SPFH-Strukturen der paralogen Proteine PH1511 (Reste 56-234, PDB: 3BK6) (Yokoyama et al., 2008) und PH0470 (Reste 66-174, PDB: 2RPB) (Kuwahara et al., 2009) aus Pyrococcus horikoshii, einem thermophilen Archaebakterium. Hier sind die monomeren Formen der drei SPFH-Domänen gezeigt (Abbildung 7).
Abbildung 7
Strukturvergleich der bisher aufgeklärten SPFH-Domänen. Abbildung von Kuwahara et al. (2009).
Alle SPFH-Proteine haben einen Bereich mit Wiederholungen der Sequenz Glutamat-Alanin, sogenannte EA-Wiederholungen, in ihren C-Termini. Dieser Bereich bildet coiled coil- Strukturen. Im Fall von Flotillin-1 und -2 ist dieser Bereich stark verlängert und wird als Flotillin-Domäne bezeichnet (Langhorst et al., 2005) (Abbildung 8).
10
Abbildung 8
Vergleich des Aufbaus der Reggie-Proteine (= Flotillin-Proteine) mit anderen SPFH-Proteinen. SPFH- und Flotillin-Domänen sind angegeben. Acylierungsstellen, hydrophobe Domänen und EA- Wiederholungen als strukturelle Charakteristika sind in der Abbildung bezeichnet. Die Abbildung wurde Langhorst et al. (2005) entnommen.
Die Bildung oligomerer Formen erfolgt bei dem Protein PH0470 aus P. horikoshii über die SPFH-Domäne (Kuwahara et al., 2009). Es wird ein sogenannter domain swapping- Mechanismus vorgeschlagen (Abbildung 9): Die SPFH-Domäne könnte in einen α-Helix- und einen β-sheet-Teil auseinanderklappen und sich anti-parallel mit einem weiteren Molekül zusammenlagern, wodurch ein Dimer entstehen würde. Trimere, Tetramere und höhere Multimere könnten sich durch die Anlagerung des β-sheet- und des α-Helix-Teils an zwei Moleküle bilden.
Abbildung 9
Domain swapping-Modell zur Erklärung der Oligomerisierung der SPFH-Domäne von PH0470 aus P.
horikoshii (Kuwahara et al., 2009).
PH1511 aus P. horikoshii liegt als Trimer aus SPFH-Domänen vor (Abbildung 10). Die Röntgenstruktur enthält zusätzlich zur unten gezeigten Struktur C-terminal eine α-Helix, die
11 für die Bildung von Oligomeren benötigt wird. Sie bildet mit der α-Helix eines weiteren Proteinmoleküls eine anti-parallele coiled coil-Struktur (Yokoyama et al., 2008). Die Oligomerisierungsregion besteht wahrscheinlich aus insgesamt drei α-Helices die sich anti- parallel zusammenlagern könnten. Die letzten beiden fehlen jedoch in dem Konstrukt für die Strukturbestimmung, werden aber von Algorithmen zur Sekundärstrukturvorhersage auf Basis der Aminosäuresequenz angegeben.
Abbildung 10
Homotrimers des Proteins PH1511 (Reste 56-234) aus P. horikoshii. Die Abbildung stammt aus Yokoyama et al. (2008).
Bei Flotillin-2 werden Oligomere ausschließlich über die Flotillindomäne gebildet. Solis et al.
(2007) konnten zeigen, dass Flotillin-Komplexe aus Homo- und Heterotetrameren von Flotillin-1 und -2 bestehen. Flotillin-1 und -2 bilden diese Tetramere über coiled coil- Regionen innerhalb der Flotillindomäne. Die SPFH-Domäne wird, da Flotillin-2 im Vergleich zu PH1511 keine Transmembrandomäne besitzt, zu Verankerung an der Membran benötigt (Abbildung 6). Diese Membranverankerung wird durch Palmitoylierung bewerkstelligt.
Die hier beschriebenen Oligomere bilden wohl die funktionell aktiven Formen ihrer Proteine in den lipid rafts und in den Caveolae-ähnlichen Membranmikrodomänen.
1.3 Reggie-assoziierte NfeD-Proteine aus Bakterien
Viele Gene Reggie-ähnlicher Proteine aus Prokaryoten sind zusammen mit einem Gen eines weiteren Membranproteins, in einem Operon lokalisiert (Abbildung 11) (Green et al., 2004;
Hinderhofer et al., 2009). Das Gen für das Reggie-assoziierte Protein kodiert für ein Membranprotein, das entsprechend der Sequenz zur NfeD-Proteinklasse gehört.
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nfed
ClpP , SPFH , domain
B. subtilis E. coli E. coli T. denitrificans B. subtilis E. coli
yuaF yuaG yuaI
yqiJ yqiK
ybbJ ybbK
yqeZ ybbK
yqeZ yqfA yqfB
hflK hflC
Abbildung 11
Operonstrukturen prokaryotischer SPFH- und NfeD-Proteine.
Proteine, deren Gene ein Operon bilden, werden gemeinsam exprimiert und reguliert. In B. subtilis ist die Expression der beiden Operons mit Genen für Reggie-ähnliche und NfeD- Proteine, yuaFGI und yqeZ-yqfAB, von dem Faktor σW reguliert (Huang et al., 1999; Wiegert et al., 2001). Die Transkription σW-kontrolierter Gene wird unter zellulären Stressbedingungen, wie alkalischem Schock, hohen Salzkonzentrationen, oder der Anwesenheit von toxischen Peptiden, hochreguliert (Petersohn et al., 2001; Wiegert et al., 2001; Helmann, 2006). Die Funktion des σW-Faktors liegt in der Kontrolle der Resistenz von B. subtilis gegenüber einer Vielzahl Antimikrobiotika (Helmann, 2006). In der komplexen mikrobiellen Gemeinschaft im Boden ist die Fähigkeit, den zahlreichen antimikrobiellen Verbindungen, die von anderen Bakterien produziert werden, standzuhalten, entscheidend für den Erhalt der eigenen ökologischen Nische.
Das ursprüngliche Protein mit dem Namen NfeD (nodulation formation efficiency D) gehört zu einer Klasse von membrangebundenen Metalloproteasen mit unbekannter physiologischer Funktion. Es wurde von Soto et al. (1994) als genetischer Faktor identifiziert, der mit dem pSymB-Megaplasmid des symbiotisch lebenden Bakteriums Sinorhizobium meliloti assoziiert ist, das die Effizienz der Knöllchenbildung auf einer Wirtspflanze erhöht. Eine falsche Bezeichnung der Proteindomäne PF01957 und eine anschließende automatischen Genklassifizierung führten dazu, dass eine Vielzahl von Sequenzen irrtümlicherweise als nfeD-Gene benannt wurden. Green et al. (2004) versuchten dieses zu berichtigen und den Begriff „Stomatinoperon-Partnerprotein“ (STOPP) einzuführen. Aber die NfeD-Terminologie war bereits so etabliert, dass sie weiterhin verwendet wird.
Strukturell gibt es zwei Formen von NfeD-Proteinen, eine kurze und eine lange Form (Green et al., 2009; Hinderhofer et al., 2009). Die kurze Form besteht am N-Terminus aus einer Transmembrandomäne und C-terminal aus einer löslichen NfeD-Domäne, beispielsweise YuaF aus B. subtilis in Abbildung 11. Die lange Form der NfeD-Proteine enthält zusätzlich
13 eine Serin-Protease, die strukturelle Ähnlichkeit zur ClpP-Protease aus E. coli zeigt und N- terminal vor der Transmembrandomäne liegt (Yokoyama et al., 2005). Ein Beispiel hierfür ist YqeZ, ebenfalls aus B. subtilis (Abbildung 11). Sekundärstrukturvorhersagen deuten darauf hin, dass diese NfeD-Domäne aus einer -Fassstruktur aufgebaut ist.
Die gemeinsame Expression und Regulation von NfeD- und SPFH-Proteinen durch ihre Operonstruktur spricht für eine funktionelle Beziehung oder eine physikalische Interaktion.
Ein Beispiel für eine funktionelle Beziehung ist das NfeD/SPFH-Genpaar in E. coli, ybbJ/ybbK, das an der Antwort auf Hitzestress beteiligt ist. Die Überexpression von YbbK (auch als QmcA bezeichnet) kompensiert teilweise die Wachstumsverzögerung in E. coli bei 42 °C, die durch Deletion der nicht-essentiellen Membranproteasen ftsH und htpX induziert wird. Die Kompensation der Wachstumsverzögerung wird noch effektiver, wenn sowohl YbbK als auch YbbJ überexprimiert werden (Chiba et al., 2006).
In P. horikoshii gibt es zwei NfeD/SPFH-Genpaare, die in Operons reguliert sind, PH1510 / PH1511 und PH0471 / PH0470. PH1511 und PH0470 sind die beiden SPFH-Proteine, PH1510 ist ein NfeD-Protein der langen Form, PH0741 ein NfeD-Protein der kurzen Form.
Hier wurden direkte Interaktion der beiden Proteinklassen beobachtet: Die N-terminale Domäne von PH1510 ist eine ClpP-ähnliche Serinprotease und spaltet selektiv die C- terminale, hydrophobe coiled coil-Region von PH1511 und verhindert so deren Oligomerisierung (Yokoyama et al., 2005; Yokoyama et al., 2008).
Mittels Oberflächenplasmonresonanz konnten Yokoyama et al. (2006) zeigen, dass die ClpP- ähnliche Serinprotease von PH1510 mit der NfeD-Domäne des gleichen Proteins interagiert.
Weiterhin wurde eine Interaktion der NfeD-Domäne des Proteins PH1510 mit der C- terminalen coiled coil-Region des SPFH-Proteins PH0470 beobachtet. Schließlich wurde die coiled coil-Region von PH0470 als Inhibitor der Spaltungsaktivität der ClpP-Protease von PH1510 an der coiled coil-Region von PH1511 identifiziert. Yokoyama et al. (2006) stellten mit diesen Ergebnissen die Hypothese auf, dass das NfeD-Protein PH1510 einen großen Komplex mit den Oligomeren der SPFH-Proteine PH1511 und PH0470 bildet (Abbildung 12). Wenn die ClpP-Protease von PH1510 die coiled coil-Domäne von PH1511 spaltet, ist das Protein nicht mehr zur Oligomerisierung fähig, wodurch sich die Struktur des Komplexes ändert. Dieser Prozess könnte Teil einer Signalübertragungskaskade sein, wie er bei SPFH- Proteinen in Eukaryoten diskutiert wird (Rivera-Milla et al., 2006; Stuermer, 2010).
14
Abbildung 12
Modell der Membrantopologie und der Beziehungen zwischen dem NfeD-Protein PH1510 und den SPFH-Proteinen PH1511 und PH0470. Das Modell basiert auf der Annahme, dass alle löslichen Region dieser Proteine auf der gleichen Seite der Membran liegen. Offene Pfeile zeigen Interaktionen, die mittels SPR detektiert wurden, mit den entsprechenden Dissoziationskonstanten (KD). Der ausgefüllte Pfeil gibt an, dass die ClpP-ähnliche Protease von 1510 die coiled coil-Domäne von PH1511 spaltet. Die Abbildung wurde Yokoyama et al. (2006) entnommen.
Von Kuwahara et al. (2008) wurde untersucht, ob die Proteine des zweite Genpaars in P. horikoshii, PH0470 und PH0471, interagieren. Dazu wurde die 15N-markierte NfeD- Domäne von Ph0471 vorgelegt und die SPFH-Domäne von PH0470 hinzutitriert. Im NMR- Spektrometer wurde jedoch keine Interaktion beobachtet. Es wird vermutet, dass die NfeD- Domäne mit der coiled coil-Region des SPFH-Proteins oder der membranständigen Region oder einer Kombination der beiden interagiert.
In B. subtilis wurde mittels Fluoreszenzspektroskopie und YFP-Fusionsproteinen nachgewiesen, dass das SPFH-Protein YuaG und das NfeD-Protein YuaF aus dem gemeinsamen Operon yuaFGI jeweils in diskreten foci in der Zellmembran lokalisiert sind (Abbildung 13). Wird eines der beiden Proteine deletiert und das andere als YFP- Fusionsprotein beobachtet, ist folgendes zu beobachten: Ist YuaG ausgeschaltet, ist keine foci- Bildung mehr zu sehen. Hingegen bleiben die foci bei der Deletion von YuaF erhalten. Somit rekutiert YuaG YuaF für diese Lokalisation an der Zellmembran. Dieses sind unveröffentlichte Ergebnisse von Prof. Peter Graumann und seinem Mitarbeiter Felix Dempwolff von der Universität Freiburg.
15 Abbildung 13
Fluoreszenzmikrospie von B. subtilis-Zellen mit YuaF oder YuaG als YFP-Fusionsprotein. In der unteren Reihe wurde jeweils das Gen des einen Proteins deletiert und das andere Protein mit YFP- Markierung beobachtet (Kooperation mit Prof. P. Graumann, Universität Freiburg).
1.4 Eine GCN5-verwandte N-Acetyltransferase im Operon yuaFGI in B. subtilis
Das Operon yuaFGI ist eine Spezialfall. Es besteht nicht nur aus dem Gen für das SPFH- und das NfeD-Protein. Zusätzlich enthält es noch das Gen für die Acetyltransferase YuaI. In keinem weiteren von Hinderhofer et al. (2009) analysierten Genom ist ein Homologes von YuaI in einem Operon von NfeD- und SPFH-Protein vorhanden. YuaI ist ein lösliches Protein und gehört gemäß der Sequenz zur Familie der GCN5-verwandten N-Acetyltransferasen (Neuwald et al., 1997). In chemical shift perturbation mapping-Experimenten konnte gezeigt werden, dass YuaI mit AcetylCoA interagiert (Doll, 2007). In der Überlagerung eines 15N- HSQC-Spektrums von YuaI mit einem Spektrum von YuaI in Anwesenheit von AcetylCoA (kurz für Acetyl-CoenzymA) kann man eine deutliche Verschiebung der Lage der einzelnen Signale beobachten. Dies spricht dafür, dass die beiden Subtanzen aneinander binden (Abbildung 14). Die Affinität von YuaI zu AcetylCoA wurde durch Dialysemessungen und Ammoniumsulfat-Fällungsexperimente mit einem KD-Wert von 24 μM bestimmt (Doll, 2007).
YuaF-YFP YuaG-YFP
YuaF-YFP, DyuaG YuaG-YFP, DyuaF
16
Abbildung 14
[1H, 15N]-HSQC-Spektrum von His6-YuaI (schwarz) und mit AcetylCoA im äquimolaren Verhältnis (rot). Die Protonenverschiebungen sind horizontal, die Stickstoffverschiebungen vertikal aufgetragen. Die Abbildung stammt von Doll (2007).
Die Klasse der GCN5-verwandten N-Acetyltransferasen (GNAT) bildet eine der größten Proteinfamilien. Der Großteil der Mitglieder der GNAT-Superfamilie katalysiert den Transfer einer Acetylgruppe von AcetylCoA zu einem aliphatischen Amin (Vetting et al., 2005). Diese Proteinfamilie hat eine strukturell konservierte Faltung, die vom N-Terminus aus gesehen aus einem N-terminalen β-Strang (β1), gefolgt von zwei α-Helices, drei antiparallelen β-Strängen (β2-4), einer zentralen Helix (α3), einem fünften β-Strang, einer vierten Helix und C-terminal einem β-Strang besteht (Dyda et al., 2000) (Abbildung 15A). Der N-terminale β-Strang (β0) ist nicht vollständig konserviert. Die Überlagerung von 15 GNAT-Strukturen zeigt, dass diese Sekundärstrukturelemente, trotz einer Sequenzidentität von nur 3 - 23 %, praktisch allgemein konserviert sind (Abbildung 15B) (Vetting et al., 2005).
Die konservierte GNAT-Faltung hat zwei allgemeine Funktionen, die Bindung des Pantetheinarms von AcetylCoA und die Wasserstoffbrückenbindung und Polarisierung der Carbonylgruppe des Thioesters (Vetting et al., 2005). Strang β4 und Helix α3 bilden zusammen mit der dazwischenliegenden Schleife den wichtigsten Teil der AcetylCoA- Bindungsfläche, die auch die Konsensussequenz des AcCoA-Bindemotivs R/Q–X–X–G–X–
G/A, wobei X jede Aminosäure sein kann, enthält (Dyda et al., 2000). Unterschiede zwischen den einzelnen GNAT-Strukturen sind grundsätzlich auf den unmittelbaren N-Terminus und mit größeren Variationen auf den C-Terminus beschränkt, der deutlich erweitert sein kann.
17 Abbildung 15
(A) Topologie der Kernstruktur der GNAT-Faltung. Der N-terminale β-Strang β0 ist nicht vollständig konserviert und der dunkelblaue C-terminale β-Strang kann vom gleichen Monomer oder von einem anderen Monomer stammen. (B) Überlagerung von 15 GNAT-Strukturen. Reste zwischen denen der RMSD kleiner als 2,7 Å ist, sind rot markiert. Aus Vetting et al. (2005).
Die Bindung von AcetylCoA induziert teilweise dramatische Änderungen der Konformation, hauptsächlich bei α1, α2 und der dazwischenliegenden Schleife. Dies kann weitere Strukturelemente erzeugen, die für die Erkennung und Bindung von Substraten notwendig sind (Vetting et al., 2005). Der Mechanismus der Acetylübertragung erfolgt bei fast allen GNATs über die Bindung von AcetylCoA und des zu acetylierenden Substrats unter Bildung eines ternären Komplexes, gefolgt vom nukleophilen Angriff des Amines und der Eliminerung von CoA (Vetting et al., 2005). Es gibt Beispiele einer Katalyse bei der eine allgemeine Base, eine allgemeine Säure, beide oder keine der beiden notwendig ist (Vetting et al., 2005).
Die Acetyltransferase mit bekannter Struktur mit der engsten Verwandtschaft zu YuaI ist das Protein TTHA1209, auch als auch ttk003001606 bezeichnet, aus Thermus thermophilus. Hier sind bereits zwei Strukturen bekannt: eine Struktur mit AcetylCoA (PDB: 2CY2, noch zu veröffentlichen) und eine Struktur ohne gebundenes AcetylCoA (PDB: 1WK4, noch zu veröffentlichen). Das zu acetylierende Substrat dieses Proteins ist nicht bekannt.
Die GCN5-verwandte N-Acetyltransferase mit der höchsten Identität (23 %) zu YuaI im Proteom von B. subtilis ist PaiA, das verschiedene Polyamine, hauptsächlich Spermin und Spermidin, acetyliert. Dessen Struktur im Komplex mit AcetylCoA ist bekannt (PDB: 1TIQ) (Forouhar et al., 2005). Überexpression von PaiA in Bakterien hat eine erhöhte Acetylierung
18
des endogenen Spermidinpools zur Folge (Forouhar et al., 2005). Zusätzlich zum Einfluß auf Polyaminkonzentrationen, beeinflußt PaiA zweifellos die Bindungseigenschaften von Polyaminen, da die Acetylierung die Molekülladung um eins reduziert. Da die Existenz eines auf Polyamine reagierenden Transkriptionsfaktors in eukaryotischen Systemen beobachtet wurde (Wang et al., 1998), ist es möglich, dass PaiA die Expression anderer Gene durch die Kontrolle von Konzentration und Bindung von Polyaminen reguliert. Das Gen paiA tritt mit paiB in einem gemeinsamen Operon auf. Die Funktion von PaiB ist unbekannt. Forouhar et al. (2005) schlagen für den pai-Operon eine Beteiligung an der Polyamin-Homöostase in B.
subtilis vor.
In B. subtilis gibt es mit dem Protein BltD noch eine weitere Spermin/Spermidin- N-Acetyltransferase (Woolridge et al., 1997; Woolridge et al., 1999). Eine Überexpression des bltD-Gens in B. subtilis hat die Acetylierung von Spermin und Spermidin zur Folge. bltD ist mit einem weiteren Gen, blt, in einem Operon lokalisiert. blt kodiert für ein multidrug- Exportprotein, dessen Funktion der Spermidintransport aus der Zelle ist (Woolridge et al., 1997). Im blt-bltD-Operon sind somit zwei verschiedene Mechanismen, chemische Modifikation und Transport aus der Zelle, kombiniert, um die intrazelluläre Spermidinkonzentration zu senken.
Polyamine sind für das normale Zellwachtum und die Differenzierung von Zellen essentiell (Tabor et al., 1984; Pegg, 1986). Sie spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen wie der DNA-Bindung und -Stabilität, der Chromatinkondensation, der RNA- Bindung und -Konformation und der mRNA-Translation (Tabor et al., 1985). Ein intrazellulärer Überschuß von Polyaminen ist jedoch giftig für Zellen (Fukuchi et al., 1995).
Daher sind die intrazellulären Konzentrationen durch Biosynthese, Aufnahme in die Zelle, intrazellulären Abbau und Export aus der Zelle genau reguliert (Shappell et al., 1993).
N-Acetyltransferasen katalysieren den ersten Schritt sowohl des Abbaus als auch des Exports von Polyaminen. Beim intrazellulären Abbau dient acetyliertes Spermin und Spermidin als Substrat für die Polyaminoxidase, die diese Verbindungen durch Entfernen einer Acetamidopropanal-Gruppe in Spermidin und Putrescin umwandelt. Beim Export werden acetylierte Polyamine durch Transporter, die an der Zellmembran lokalisiert sind, aus der Zelle ausgeschleust. Eine Ausnahme stellt das oben beschriebene Protein Blt dar, das Spermidin und nicht die acetylierte Verbindung aus der Zelle transportiert.
19
2 Aufgabenstellung
2.1 Ig2-Domäne von Neurolin aus dem Goldfisch
In der Gruppe von Prof. Claudia Stürmer an der Universität Konstanz war gezeigt worden, dass die zweite Ig-Domäne des Proteins Neurolin aus dem Goldfisch für das korrekte Wachstum der Axone im Auge des Goldfischs essentiell ist (Leppert et al., 1999). Wird diese Domäne blockiert, ist die Wegfindung vom Rand der Retina zur Papille gestört. Die Axone verlassen ihr ursprüngliches Faszikel, wachsen in die entgegengesetzte Richtung oder verlieren völlig die Orientierung (Ott et al., 1998; Leppert et al., 1999). Bisher ist weder die dreidimensionale Struktur von Neurolin oder einer seiner Domänen bekannt, noch wurden Interaktionspartner, die an dieser Funktion beteiligt sind, identifiziert.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Ig2-Domäne von Neurolin in E. coli exprimiert und gereingt werden, um sie anschließend biochemisch zu charakterisieren. Weiterhin sollten Bedingungen für die Aufnahme von NMR-Spektren zur Strukturaufklärung gefunden werden.
Durch Injektion von rekombinantem Neurolin-Ig2 in Goldfischaugen in vivo und Inkubation von Goldfischretinae mit Neurolin-Ig2 in vitro sollte die Fragestellung bearbeitet werden, ob diese Domäne an Axonstrukturen bindet oder lösliche Komponenten erkennt.
2.2 SPFH-assoziierte NfeD-Proteine aus Bakterien
In Prokaryoten werden SPFH-Proteine der Reggie/Flotillin- und Stomatin-Familien fast immer in Operonstrukturen zusammen mit einem NfeD-Protein gefunden. Ihre Funktion wie auch diejenige ihrer assoziierten SPFH-Proteine ist großteils unklar. Sekundärstruktur- vorhersagen deuten darauf hin, dass diese SPFH-assoziierten NfeD-Proteine aus
-Fassstrukturen in ihren löslichen cytoplasmatischen C-Termini aufgebaut sind.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen die Strukturen der löslichen C-terminalen Domänen der NfeD-Proteine YuaF und YqiJ aus NMR-Daten berechnet werden, die Dynamik der Strukturen untersucht, und ein Vergleich der beiden Strukturen angestellt werden. Weiterthin soll das Programm ATNOS/CANDID zur Strukturberechnung mit automatischer Identifikation und Zuordnung von NOE-Signalen anhand der NMR-Spektren von YuaF in der Arbeitsgruppe etabliert werden.
2.3 Acetyltransferase YuaI aus Bacillus subtilis
Das Operon yuaFGI in B. subtilis ist ein Spezialfall unter den Operons mit Genen für SPFH- und NfeD-Proteine. Zusätzlich enthält es noch das Gen für die Acetyltransferase YuaI, einem
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löslichen Protein, das zur Familie der GCN5-verwandten Acetyltransferasen gehört. Der Großteil der Mitglieder der GNAT-Superfamilie acetyliert kleine Moleküle mit primären Aminogruppen.
Im Rahmen dieser Arbeit soll die Resonanzzuordnung von YuaI durchgeführt werden.
Anhand von sekundären chemischen Verschiebungen und unter Zuhilfenahme des Programms PREDITOR soll geklärt werden, ob YuaI die typische Faltung der GNAT-Superfamilie annimmt. Die Flexibilität des Proteins soll mittels {1H}-15N-heteronuklearen NOEs untersucht werden. Schließlich sollen Untersuchungen zur Substratspezifität dieser Acetyltransferase, von der bereits bekannt ist, dass sie mit AcetylCoA interagiert, durchgeführt werden. Das nächste Homologe von YuaI in B. subtilis, PaiA, wurde bereits charakterisiert. In dieser Studie wurden Polyamine als potentielle Substrate untersucht. Daher bieten sich diese Verbindungen auch für die Substratsuche bei YuaI an.
21
3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Ig2-Domäne von Neurolin aus dem Goldfisch
3.1.1 Expression und Reinigung
Zelloberflächenrezeptoren der Ig-Superfamilie wie Neurolin sind häufig eine Herausforderung, wenn vollständige Proteine oder ihre Fragmente heterolog exprimiert werden sollen. Hauptsächlich verantwortlich dafür sind die korrekte Bildung von Disulfidbrücken, die für die Proteinfaltung essentiell sind, und die Glykosylierung, wichtig für Löslichkeit und Faltung des Proteins. Beides findet im endoplasmatischen Retikulum von Eukaryoten statt. In Prokaryoten fehlt ein solches Kompartiment. Dort gibt es andere Mechanismen, um korrekte Disulfidbrücken in sekretierten Proteinen zu bilden. Ein weiteres Problem betrifft alle Proteine an Membranen. In der natürlichen Umgebung des Proteins sind die Möglichkeiten intermolekularer Kontakte und der Diffusion der extrazellulären Bereiche durch die Verankerung in der Membran stark eingeschränkt. Bringt man solche Proteindomänen isoliert in Lösung, sind die Verhältnisse ganz andere. Dies führt häufig zur Aggregation und Unlöslichkeit der isolierten extrazellulären Domänen. Trotzdem wird die Expression von Membranproteindomänen in Bakterien favorisiert. Die für Strukturstudien nötigen hohen Ausbeuten gehen hier mit niedrigen Kosten und der Möglichkeit der Isotopenmarkierung über Minimalmedien einher.
Um eine Expression der Ig2-Domäne von Neurolin in Bakterien, hier Escherichia coli, erfolgreich durchzuführen, muß die korrekte Bildung der Disulfidbrücke zwischen Cystein 127 und 154 gewährleistet sein. In E. coli werden Disulfide gebildet, wenn die Proteine ins Periplasma sekretiert werden (Le et al., 1991). Häufig ist hierbei die wesentlich geringere Ausbeute im Vergleich zur Expression im Cytoplasma der Nachteil. Im Zellinneren andererseits ist das niedrige Redoxpotential ungünstig für die Oxidationsreaktion von Thiolgruppen zur Disulfidbrücke. Meistens enden deshalb solche Immunglobulindomänen aggregiert und mißgefaltet in inclusion bodies.
Um beide Nachteile zu umgehen, wurde der Origamistamm von E. coli speziell für die intrazelluläre Bildung von Disulfidbrücken zugeschnitten (Bessette et al., 1999). Dies wird durch Ausschalten der Gene der Glutathion-Oxidoreduktase und der Thioredoxin-Reduktase erreicht. Man erhält eine Erhöhung des Redoxpotentials, sodass die Bildung von Disulfiden auch intrazellulär möglich wird. Außerdem sind die Ausbeuten der Proteine in diesen Mutanten generell höher als im Vergleich zur Sekretion ins Periplasma (Bessette et al., 1999).
22
Die Ig2-Domäne von Neurolin wurde in E. coli BL21 (DE3) Origami B exprimiert. Zusätzlich wurde eine Expression in E. coli BL21 (DE3) Rosettagami B durchgeführt. Dieser Stamm besitzt ein weiteres Plasmid, das für tRNAs sieben seltener Codons in E. coli kodiert.
Die cDNA, die für die Ig2-Domäne von Neurolin (Aminosäuren 132-227) kodiert, wurde von der Arbeitsgruppe von Prof. Claudia Stürmer zu Verfügung gestellt (Leppert et al., 1999). Die Auswahl dieses Sequenzbereich wird anhand eines alignments mit den homologen Proteinen ALCAM (Mensch, Bowen et al (1995)), DM-GRASP (Huhn, Burns et al. (1991)), RAGE (Mensch, Neeper et al. (1992) und Schmidt et al. (1992)) und Neurolin aus dem Zebrafisch (Kanki et al., 1994; Laessing et al., 1994) deutlich (Abbildung 16). In dieser Abbildung ist die Domänenstruktur der einzelnen Proteine entsprechend der sequenzbasierten Angaben in der UniProt-Datenbank farblich markiert. Der unterstrichene Bereich entspricht der Sequenz des Plasmids. Es ist klar zu erkennen, dass die Position und die Länge der einzelnen Domänen, speziell auch der Ig-Domäne 2, gut konserviert ist. Nur das Ende der dritte Domäne von RAGE ragt in den Bereich der vierten Domäne der anderen Proteine, da die Ig-Domänen 4 und 5 in RAGE fehlen. Die für das Plasmid ausgewählten Sequenz, ist der Bereich, indem alle 5 Ig2-Domänen ohne größere Lücken im alignment übereinanderliegen. Die DNA dieses Bereichs (Aminosäuren 132-227) wurde in den Vektor pET15b ligiert, der die Sequenz für einen N-terminalen His6-tag und eine Thrombin-Schnittstelle beinhaltet. Die Expression des Vektors pET15b-Neurolin-Ig2 ist über einen T7-Promotor mittels IPTG induzierbar.
Die Expression bei 37 °C ergab niedrige Ausbeuten löslichen Proteins, da der Hauptanteil des Proteins in inclusion bodies vorlag. Die Expressionsausbeuten konnten unter Verwendung von DYT-Puffer mit Natriumphosphat als zusätzlicher Phosphatquelle und Reduktion der Expressionstemperatur auf 25 °C erhöht werden. Eine deutliche Steigerung der Ausbeuten konnte durch eine verlängerte Induktionszeit von 12-14 h und durch Zugabe von 0,2-1 % Glukose ins Medium erreicht werden, was die latente Induktion der T7-Polymerase unterdrückt.
Zellen mit latent induzierter T7-Polymerase bewirken eine negative Selektion gut exprimierender Zellen, da die gut exprimierende Zellen schlechter wachsen und somit nach einigen Verdopplungen nicht mehr vorhanden sind. Im Hefeextrakt oder auch im Trypton des Mediums ist Laktose als Kontamination vorhanden. Dies führt in E. coli BL21 (DE3) zur Ablösung des LacI-Repressors vom LacI-Promoter, also zur Transkription der T7- Polymerase. Wird Glukose ins Medium zugegeben, werden alle anderen Zuckertransporter von E.coli ausgeschaltet und nur noch Glukose aufgenommen. Somit wird die Laktose ausgeschlossen und eine latente Induktion der T7-Polymerase vermieden.
23
Signalsequenz
Neurolin_Goldfisch -MQS---VVCLIGAFIAAAVFRPGSCVGTVIGLYGETIVVPCNDGTKKPDGLI 49 Neurolin_Zebrafisch -MHS---VICLFGAFIAAALFAPGSCLPTVIGLYGETIEVPCNNGNNKPDGLI 49 ALCAM_Mensch -MESKGASS---CR--LLFCLLISATVFRPGLGWYTVNSAYGDTIIIPCR--LDVPQNLM 52 DM-GRASP_Huhn MMEPPAAAARASCRRRPLLCLLLAALCMPPALGLYTVNAVYGDTITMPCR--LEVPDGLM 58 RAGE_Mensch -MAAG---TAVGAWVLVLSLWGAVVGAQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPP--- 46 * . : .: . .: . *:.: : *. . *
Ig-Domäne 1
Neurolin_Goldfisch FTKWKYVKDDGSPGDLLVKQAQKDEATVSATDGYKSRVSIAANSSLLIARGSLADQRVFT 109 Neurolin_Zebrafisch FTKWKYAKDDGSPGDLLIKQAQKDDPTVSAMDGYKTRVSIAANSSLLIAQGSLTDQRVFT 109 ALCAM_Mensch FGKWKYEKPDGSPVFIAFRSSTKKSVQYDDVPEYKDRLNLSENYTLSISNARISDEKRFV 112 DM-GRASP_Huhn FGKWKYEMPNGSPVFIAFRSSTKKNVQYDDVPDYKDRLSLSENYTLSIKNARISDEKRFV 118 RAGE_Mensch -QRLEWKLNTG---RTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFR 98 : :: * : . . :. : * :* : : *: * Neurolin_Goldfisch CMVVSFTNLEEYS-VEVKVHKKPSAPVIKNNAKELENGKLTQLGECVVENANPPADLIWK 168 Neurolin_Zebrafisch CMVVSSTNLEEFS-VEVKVHKKPSAPVIKNKVKELENGKLTQLGECVVESANPAADLIWM 168 ALCAM_Mensch CMLVTEDNVFEAP-TIVKVFKQPSKPEIVSKALFLETEQLKKLGDCISEDSYPDGNITWY 171 DM-GRASP_Huhn CMLVTEDDVSEEP-TVVKVFKQPSQPEILHQADFLETEKLKMLGECVVRDSYPEGNVTWY 177 RAGE_Mensch CQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWH 158 * :. . . *:*.: *. * * .. * . :* *: ..: * . : *
Ig-Domäne 2
Neurolin_Goldfisch KNNQTLVDDGKTIIITSTITKDKITGLSSTSSRLQYTARKE-DVESQFTCTAKHVMGPDQ 227 Neurolin_Zebrafisch KNNQALVDDGKTIIITSDVTKDPVTGLSSTSSRLQYTARKE-DVASQFTCVAKHVTGPNQ 227 ALCAM_Mensch RNGKVLHPLEGAVVIIFKKEMDPVTQLYTMTSTLEYKTTKA-DIQMPFTCSVTYYGPSGQ 230 DM-GRASP_Huhn KNGRVLQPVEEVVVINLRKVENRSTGLFTMTSSLQYMPTKE-DANAKFTCIVTYHGPSGQ 236 RAGE_Mensch LDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHR 218 :.: * : : . * * : * * . : * *:* . :
Ig-Domäne 3
Neurolin_Goldfisch ---VSEPESFPIHYPT--EKVSLQVVSQ-SPIREGEDVTLKCQADGNPPPTSFNFNIKGK 281 Neurolin_Zebrafisch ---VSTPDTFQIRYPT--EKVSLQVVSQ-SPIREGDDVTLKCQADGNPPPTSFNFNIKGK 281 ALCAM_Mensch KTIHSEQAVFDIYYPT--EQVTIQVLPPKNAIKEGDNITLKCLGNGNPPPEEFLFYLPGQ 288 DM-GRASP_Huhn KTIQSEPVVFDVHYPT--EKVTIRVLSQSSTIKEGDNVTLKCSGNGNPPPQEFLFYIPGE 294 RAGE_Mensch -ALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQ-IHWMKDGV 276 : : *. *:* : * . ..: * :**.* .:*.* : : * Neurolin_Goldfisch KVTVTDKDVYTLTGVTRADSGIYKCSLLDNDVMESTQFVTVSFLDVSLTPTGKVLKNVGE 341 Neurolin_Zebrafisch KVTVTDKDVYTLTGVTRADSGVYKCSLLDNDVMESTQIVTVSFLDASLTPTGKVLKKLGE 341 ALCAM_Mensch PEGIRSSNTYTLTDVRRNATGDYKCSLIDKKSMIASTAITVHYLDLSLNPSGEVTRQIGD 348 DM-GRASP_Huhn TEGIRSSDTYVMTDVRRNATGEYKCSLIDK-SMMDATTITVHYLDLQLTPSGEVTKQIGE 353 RAGE_Mensch PLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHS---SHGPQE 312 : . . :. : * *.* .. : :
Ig-Domäne 4
Neurolin_Goldfisch NLIVSLDKNASSEAKVTWTKDNRKLDKLPDFSKLTYSDAGLYVCDVS---IEGIKRSLSF 398 Neurolin_Zebrafisch NLVVSLEKNASSEVKVTWTKDNRKLDKLPDFSQLRYSDAGLYVCDVS---IEGIKHSFSF 398 ALCAM_Mensch ALPVSCTISASRNATVVWMKDNIRLRSSPSFSSLHYQDAGNYVCETALQEVEGLKKRESL 408 DM-GRASP_Huhn ALPVSCTISSSRNATVFWIKDNTRMKTSPSFSSLQYQDAGNYICETTLQEVEGLKKRKTL 413 RAGE_Mensch SRAVSISIIEPG--- 324 ** .
Ig-Domäne 5
Neurolin_Goldfisch ELTVEGIPKITSLTKHRSSDGKHKVLTCEAEGSPKPDVQWSVNGTN---DEVSYNNG 452 Neurolin_Zebrafisch ELTVEGGPRITGLTKHRSNDGKHKVLTCEAEGSPKPEVQWSVNGTD---DETSYVNG 452 ALCAM_Mensch TLIVEGKPQIK-MTKKTDPSGLSKTIICHVEGFPKPAIQWTITGSGSVINQTEESPYING 467 DM-GRASP_Huhn KLIVEGKPQIK-MTKKTNTNKMSKTIVCHVEGFPKPAVQWTVTGSGSLINKTEETKYVNG 472 RAGE_Mensch ---
Neurolin_Goldfisch KATYKLTVVPSKNLTVSCLVTNKLG---EDTKEISVFSQ---KNEDGTEQAK 498 Neurolin_Zebrafisch KATYKLTVVPSKNLTVSCLVTNKLG---FDTKDISVFSLFEEDKPKPGKNEDGADQAK 507 ALCAM_Mensch RYYSKIIISPEENVTLTCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK 527 DM-GRASP_Huhn KFSSKIIIAPEENVTLTCIAENELERTVTSLNVSAISIPEYDEPEDRNDDNSEKVNDQAK 532 RAGE_Mensch ---EEGPTAGSVGGSGLG---TLA 342 * . . .
Transmembranhelix cytoplasmatische Domäne
Neurolin_Goldfisch VIVGIVVGLLVAAALVGLIYWIYIKKT----RQGSWKTGEKEAGTSEESKKLEENNHKPDV- 555 Neurolin_Zebrafisch VIVGVVVGLFLAAALVGLIYWLYIKKT----RQGSWKTGEKETGTSEESKKLEENNHKADV- 564 ALCAM_Mensch LIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKKS----KTAS-KHVNKDLGNMEENKKLEENNHKTEA- 583 DM-GRASP_Huhn LIVGIVVGLLLVALVAGVVYWLYVKKS----KTAS-KHVDKDLGNIEENKKLEENNHKSET- 588 RAGE_Mensch LALGILGGLGTAALLIGVILWQRRQRRGEERKAPENQEEEEERAELNQSEEPEAGESSTGGP 404 : :*:: ** .* : *:: * :: : . : ::: . ::.:: * .: ..
Abbildung 16
Sequenzalignment von Neurolin (Goldfisch) mit den Homologen Neurolin (Zebrafisch), ALCAM (Mensch), DM-GRASP (Huhn) und RAGE (Mensch). Die unterstrichene Sequenz entspricht der Sequenz des Plasmids (Aminosäuren 132-227). Die einzelnen Domänen sind angegeben. Das Alignment wird folgendermaßen bewertet: Stern = Sequenzidentität, Doppelpunkt = große Ähnlichkeit, Punkt = geringe Ähnlichkeit.
24
Mit dieser Anleitung von Dr. Günter Fritz erhielt ich mit den Origami- und Rosettagami- Stämmen aus einem Liter Kultur 9-14 g Zellen im Naßgewicht (Drees et al., 2008). Beide Stämme zeigten eine hohe Expression der Ig2-Domäne von Neurolin. Ungefähr 50 % des Proteins lagen in inclusion bodies vor (Abbildung 17A). Trotzdem lag die Ausbeute von löslichem His6-Neurolin-Ig2 bei 21 mg und von tag-less-Neurolin-Ig2 bei 16 mg pro Liter Kultur (Tabelle 2). Das Protein wurde mittels eines N-terminalen His6-tags durch Ni2+-Affinitäts- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Nach der Reinigung wurde der His6-tag ohne Verlust an Löslichkeit abgespalten. Eine Expression in den entsprechenden isogenen Stämmen ohne geändertes Redoxpotential, E. coli BL21 bzw. E. coli BL21 Rosetta, ergab bei 37 und 25 °C kein detektierbares lösliches Protein (Abbildung 17B). Der Stamm E. coli BL21 Rosetta hat im Vergleich zum Standard-E. coli zusätzlich ein Plasmid für seltene tRNAs, aber nicht das besondere Redoxmilieu für gute Disulfidbrückenbildung wie der Stamm E. coli BL21 Rosettagami.
Abbildung 17
(A) Reinigung von His6-Neurolin-Ig2 aus E. coli BL21(DE3) Origami B.
Es wurden folgende Proben auf die SDS–PAGE geladen: Spalte 1: Pellet nach Ultrazentrifugation: Es enthielt große Mengen von His6-Neurolin-Ig2 als inclusion bodies; Spalte 2:
Molekulargewichtsmarker; Spalte 3: Überstand nach Ultrazentrifugation; Spalte 4: Proteine, die nicht an die Ni2+-Sepharose-Säule gebunden hatten; Spalte 5: Eluat der Ni2+-Sepharose-Säule mit löslichem His6-Neurolin-Ig2; Spalte 6: Gereinigtes His6-Neurolin-Ig2 nach Gelfiltrations- chromatographie. (B) Expression von His6-Neurolin-Ig2 in E. coli BL21(DE3) B oder E. coli BL21(DE3) Rosetta B ergab nur unlösliches Protein. Spalte 1: Molekulargewichtsmarker; Spalte 2: Pellet von E.
coli BL21(DE3) B; Spalte 3: Löslicher Teil von E. coli BL21(DE3) B; Spalte 4: Pellet von E. coli BL21(DE3) Rosetta B; Spalte 5: Löslicher Teil von E. coli BL21(DE3) Rosetta B.
25 Tabelle 2
Reinigung von rekombinantem Neurolin-Ig2 aus 1 L Kultur E. coli BL21(DE3) Origami B
Reinigungsschritt Gesamtprotein / mg Neurolin-Ig2 / mg
Rohextrakt 1600 nicht bestimmt
Ultrazentrifuge, lösliche Fraktion 700 ca. 70
Ni2+-Sepharose 40 36
Superdex 75 21 21 (mit His6-tag)
Um tag-less Neurolin-Ig2 zu erhalten, wurde der His6-tag nach der Ni2+-Sepharose entfernt
Thrombinverdau 35 32
His-Trap HP 24 24
Superdex 75 16 16
3.1.2 Die Ig2-Domäne von Neurolin bildet nichtkovalente Homodimere Die analytische Gelfiltration zeigte, dass sowohl His6-Neurolin-Ig2 als auch tag-less Neurolin-Ig2 bei einer deutlich höheren molekularen Masse eluierten als das Markerprotein Cytochrom C mit einer molekularen Masse von 12,4 kDa (Abbildung 18A) (Drees et al., 2008). Die Kalibrierung der Säule ergab Massen von 25 ± 2 kDa und 23 ± 2 kDa für Neurolin mit beziehungsweise ohne His6-tag. Die Werte stimmen gut mit der Bildung eines Neurolin- Ig2-Dimers überein.
Abbildung 18
(A) Analytische Gelfiltrationschromatographie von Neurolin-Ig2. Das Protein eluierte in einem einzelnen Signal. Die Elutionsvolumina der Markerproteine mit bekanntem Molekulargewicht sind mit Pfeilen angezeigt. (B) Kalibriergerade der analytischen Gelfiltration. Hierzu wurden Albumin (66 kDa), Carboanhydrase (29 kDa), Cytochrom C (12,4 kDa) und Aprotinin (6,5 kDa) verwendet.
Neurolin-Ig2 ohne His6-tag eluiert bei 11,1 ml, was einem Molekulargewicht von 23 kDa entspricht.
