Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms Enniatinsynthetase

Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms Enniatinsynthetase

vorgelegt von Diplom- Chemiker

Anke Doller

Von der Fakultät III- Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat.-

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. sc. techn. L.-G. Fleischer Berichter: Prof. Dr. U. Szewzyk

Berichter: Priv.- Doz. Dr. R. Zocher

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 12.01.2001

Berlin 2001 D83

Abstract

Doller, Anke:

Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms Enniatinsynthetase

Enniatine haben vielfältige pharmakologische Eigenschaften und sind daher von hohem biotechnologischen Interesse. Diese Verbindungen gehören zur Klasse der Cyclodepsipeptide und werden nichtribosomal von einem Multienzym, der Enniatinsynthetase (ESYN) gebildet. Enniatine bestehen aus jeweils drei Molekülen der D-2-Hydroxyisovaleriansäure und einer N-methylierten L-Aminosäure. Diese Grundbausteine sind alternierend durch Peptid- und Esterbindungen verknüpft. Im Gegensatz zu anderen Peptidsynthetasen besitzt das Enzym nur zwei Reaktionsmodule (EA und EB), die Zweierbausteine synthetisieren, die in einem iterativen Prozess verknüpft werden.

Ziel der Arbeit war es, durch den Einsatz biochemischer und molekularbiologischer Methoden weitere Erkenntnisse über die Struktur und Funktion dieses Enzyms zu erhalten. Ein Hauptpunkt der Untersuchungen bildete die funktionale Expression der Enniatinsynthetase. Als Expressionsorganismus wurde Streptomyces gewählt, da in diesem Organismus bereits eine ganze Reihe von Enzymen des Sekundärmetabolismus exprimiert wurden. Dazu wurde ein Konstrukt aufgebaut, welches das gesamte Gen der ESYN enthält. Da der Codongebrauch der Streptomyceten unterschiedlich zu dem von Fusarien ist, musste dieser N-terminal angeglichen werden. Der Aufbau des Konstrukts erfolgte in 7 Stufen in einem E. coli/ Streptomyces Shuttlevektor. Expressionsversuche in S. lividans blieben trotz intensiven Screenings erfolglos, ebenso in dem Depsipeptidproduzenten S. tsusimaensis. Der Grund könnte darin liegen, dass die positiven Transformanden sensitiv auf das entstehende Enniatin sind und dadurch nicht überleben. Deswegen wurden nur Transformanden gefunden, bei denen das Insert aus dem Vektor eliminiert wurde.

Weiter wurde die molekulare Basis der Substraterkennung an zwei Enniatinsynthetasen unterschiedlicher Substratspezifität untersucht. Interessanterweise lässt sich die Spezifität durch die von Stachelhaus (1999, Chem. & Biol. 6: 493-505) und Challis (2000, Chem. & Biol. 7: 211-224) vorgeschlagenen Modelle nicht vorhersagen. Dies zeigt, dass die von bakteriellen Systemen abgeleiteten Modelle nicht ohne weiteres auf pilzliche Systeme übertragbar sind.

Eine weitere Analyse des Enniatinsynthetasegens ergab im Gegensatz zu den bisher bekannten Peptidsynthetasen drei Kondensationsdomänen, die in einem iterativen Synthesemechanismus auch gefordert werden. Eine Kondensation wird für die Ausbildung der Peptidbindung benötigt, zwei weitere für die Elongation und finale Zyklisierungsreaktion. Dies ist eine weitere Bestätigung für den postulierten Mechanismus.

Es konnte durch Cross-Linking–Experimente gezeigt werden, dass in der Enniatinsynthetase N- und C-Terminus dicht beieinander liegen, was darauf hinweist, dass die beiden Reaktionsmodule in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander liegen müssen. Dies konnte bereits durch die Ergebnisse des Epitop-Mapping mit monoklonalen Antikörpern postuliert werden.

I. Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

1.1 Peptidantibiotika 1

1.2 Enniatin 2

1.3 Peptidbiosynthese 3 1.4 Enniatinsynthetase-Gen 7

1.4.1 Adenylierungs-Domäne 8 1.4.2 N-Methyltransferase 10 1.4.3 Thiolierungs-Domäne 12 1.4.4 Kondensations-Domäne 13

1.5 Substratspezifität 15 1.6 Die Biologie der Fusarien und Streptomyceten 17

1.7

Zielsetzung der Arbeit 19 2 Materialien

2.1 Mikroorganismen 20

2.2 Vektoren, Primer und Peptide 20

2.3 Chemikalien 22

2.4 Lösungen 25

2.5 Enzyme und Kits 25 2.6 Trägermaterialien, Filter und Filme 26

2.7 Geräte 26

3 Medien

3.1 Anzucht und Stammhaltung 28

3.1.1 Escherichia coli 28

3.1.2 Streptomyces 29

4 Methoden

4.1 Standardmethoden 31

4.2 DNA-Präparation 31

4.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 31 4.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Streptomyces 32 4.2.3 Präparation genomischer DNA aus Streptomyces

(Pospiech und Neumann, 1995) 34

4.3 Agarose-Gelelektrophorese von DNA 35 4.4 PCR-Technik und Klonierung 35

4.4.1 PCR-Reaktion 35

4.4.2 Analyse und Isolierung der PCR-Produkte 37

4.4.3 Vektoren 37

4.4.4 Transformation von E. coli 38

4.4.4.1 Herstellung von kompetenten Zellen

(XL1-Blue, DH5α, ET12567) 38 4.4.4.2 Herstellung kompetenter Zellen (M15[pREP4]) 38 4.4.4.3 Transformation von Plasmid- DNA in

E. coli (XL1-Blue, DH5α, ET12567) 39 4.4.4.4 Transformation in M15[pREP4] 40 4.4.5 Transformation von Streptomyces 40 4.4.5.1 Präparation von Protoplasten 40 4.4.5.2 Transformation von Plasmid-DNA in Streptomyces 41 4.4.5.3 Anzucht thiostreptonhaltiger

Kolonien zur Plasmidkontrolle 43

4.5 Analyse von Nukleinsäuren 43

4.5.1 Southern Blot-Analyse 43 4.5.1.1 Radioaktive Markierung von DNA-Proben 45 4.5.2 DNA-Sequenzierung 46

4.5.2.1 Auswertung der DNA-Sequenzen 47

4.6 Expression rekombinanter Proteine 47

4.6.1 Expression in E. coli 47 4.6.2 Expression in pQE- Vektoren 47 4.6.3 Expression in Streptomyces 48

4.7 Proteinchemische Arbeiten 49

4.7.1 Reinigung des exprimierten Enzyms aus E. coli 49 4.7.1.1 Reinigung mit Guanidiniumhydrchlorid 49

4.7.1.1.1 Aufschluß 49

4.7.1.2 Benzonaseprozedur 51 4.7.1.3 Aufschluß nach Williamson et al. (1996 ) 52

4.7.1.3.1 Reinigung 54

4.7.1.3.2 Proteaseverdau des exprimierten Proteins 55

4.7.2 Test von Streptomyces- Transformanden

auf exprimiertes Protein 56 4.7.3 Nachweismethoden für Proteine 57 4.7.3.1 Proteinbestimmung 57 4.7.3.2 SDS- PAGE 58

4.7.3.3 ELISA 59

4.7.3.3.1 Verdrängungs- ELISA 59

4.7.4 Westernblot und Kolonie- Blotting 60 4.7.5 Cross-Linking- Experimente 60

4.7.5.1 Crosslinken 60

4.7.5.2 Proteaseverdau 60

4.7.5.3 Detektion und Analyse der Proteinfragmente 61

5 Ergebnisse

5.1 Heterologe Expression des esyn1 Gens

aus Fusarium scirpi in Streptomyces species 62

5.1.1 Klonierung des esyn1 Genes in einen E.coli/

Streptomyces shuttle- Vektor 64 5.1.2 Expressionsversuche in Streptomyces 73

5.2 Untersuchungen zur Substratspezifität

von Peptidsynthetasen 74

5.2.1 Hohe Homologie der Adenylierungs-Domänen

zwischen verschiedenen ESYNs 74 5.2.2 Bindungsstudien mit dem auf ESYN aus F. scirpi

spezifischen monoklonalen Antikörper 76 5.2.3 Sequenzvergleich mit anderen Adenylierungs-Domänen 78

5.2.3.1 Sequenzvergleich mit Valin- aktivierenden

Adenylierungs-Domänen 78 5.2.3.2 Vergleich mit in der Literatur vorgestellten

Modellen 80

5.2.4 Untersuchungen zum Bindungsort vom mAB21.1 84

5.3 Erkennungsstelle des monoklonalen Antikörpers

25.91 88

5.3.1 Amplifizierung des Fragments vor dem Modul EA

der ESYN aus F. scirpi 88 5.3.2 Expression von Teilen des Moduls EA und dem

upstream- Bereich von Modul EA der ESYN aus F. scirpi 90 5.3.3 ELISA- Test zur Lokalisierung der Antikörper-

Bindungsstelle 93

5.4 Neubewertung des ESYN – Modells 94

5.4.1 Die X- Domänen 94

5.4.2 Die Kondensationsdomänen 95

5.5 Cross-Linking-Experimente 98

5.5.1 Zeitabhängigkeit der Cross- Link-Reaktion 98 5.5.2 Einfluss der Kopplung auf die Beladung mit L-Valin 99 5.5.3 Proteaseverdau des gekoppelten Enzyms 100 5.5.4 Präparativer Verdau und Analyse der entstandenen

Peptide 101

6 Diskussion 103 7 Anhang

7.1 A1 Erläuterungen zu den konservativen

Austauschen bei der Benutzung von Genedoc 115 7.2 A2 Zeitabhängigkeit für mAB21.1 115 7.3 A3 Alignment Valin- aktivierende

Adenylierungs-Domänen 116 7.4 A4 Alignment Aminosäure- aktivierende

Domänen mit Hilfe des Programms

MAXHOM aus PredictProtein 119 7.5 A5 Modell der Enniatinsynthetase 125 7.6 A6 Alignment der putativen Kondensations-

Domänen C

und C

der ESYN aus F. scirpi 127 7.7 A7 Alignment der putativen Kondensations-

Domäne C3 der ESYN aus F. scirpi mit putativen N- terminalen Kondensations-Domänen der CYSYN aus T. niveum und ACMSII aus

S. chrysomallus 130

7.8 A8 Bevorzugter Gebrauch synonymer Kodons

in Streptomyceten 132 7.9 A9 Karten der für die Klonierung des esyn1 Gens

in Streptomyces spp. benutzten Vektoren 133 7.10 A10 Listing des Programms „Peptidanalyse“

Dr. F. Mallwitz 135

8 Literaturverzeichnis 141

II Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Strukturformel von Enniatin (allgemein) 2 Abbildung 2 Schematische Darstellung der Enniatin B Synthese 5 Abbildung 3 Domänenstruktur der Enniatinsynthetase 7

Abbildung 4 Schematischer Strukturvergleich der

Peptidsynthetase-Domäne mit der Domäne des adenylatbildenden Enzyms

9

Abbildung 5 Morphologische Differenzierungsvorgänge bei Streptomyceten

18

Abbildung 6 Klonierungsstrategie für die Expression des esyn1 Gens in Streptomyces spp

65

Abbildung 7 Plasmidkarte und Agarosegelauftrennung (1%) der Klonierung des Plasmids KS6/7S

66

Abbildung 8 Plasmidkarte und Agarosegelauftrennung (1%) der Klonierung des Plasmids To0,5SE

67

Abbildung 9 Plasmidkarte und Agarosegelauftrennung (1%) der Klonierung des Plasmids KS7.5SE

68

Abbildung 10 Gegenüberstellung der Original- esyn1- Sequenz und der an den Codon von Streptomyces angepassten Sequenz

68

Abbildung 11 Plasmidkarte und Agarosegelauftrennung (1%) der Klonierung des Plasmids p2.1DrX

69

Abbildung 12 Plasmidkarte der Klonierung des Plasmids p3.1DrX 70 Abbildung 13 Plasmidkarte und Agarosegelauftrennung (1%) der

Klonierung des Plasmids pspIJ026SphI

71

Abbildung 14 Plasmidkarte und Agarosegelauftrennung (1%) der Klonierung des Plasmids pTZIJ9,4SpX

72

Abbildung 15 Sequenzvergleich der aminosäureaktivierenden Domänen aus F. scirpi und F. sambucinum

75

Abbildung 16 Verdrängungs- ELISA 77

Abbildung 17 Reaktion des mAB21.1 mit Enniatinsynthetase aus F. scirpi in Anwesenheit des Peptids LVVT

78

Abbildung 18 Sequenzvergleich der Domänen PheA, CYSYN dm2 (Leu), CYSYN dm 9 (Val), ESYNsamb (Leu), ESYNscir2 (Val) und ESYNscir1 (Hiv) in einem Bereich von Position 185- 523 (bezogen auf PheA)

81

Abbildung 19 Angenommene Bindungstaschen für die ESYN aus den beiden Fusarien

83

Abbildung 20 Expression des Proteins repräsentiert durch Plasmid pc1.6SX

85

Abbildung 21 Typisches DEAE Säulenprofil nach einem Aufschluß mit 6M Guanidiniumhydrochlorid

86

Abbildung 22 Typisches AcA54 Säulenprofil und ausgewählte Säulenfraktionen auf SDS-PAGE nach einem Aufschluß mit Triton X-100

87

Abbildung 23 10% SDS- Gel der Pentylagarose- Fraktionen des 65 kDa- Proteins

88

Abbildung 24 Ausschnitt aus dem Alignment zwischen der bestehenden ESYN- Sequenz (Haese etal., 1993) und der in dieser Arbeit ermittelten Sequenz

90

Abbildung 25 Übersicht über die Lage der benutzten Klone zur Detektion derAntikörperbindungsstelle von mAB25.91

91

Abbildung 26 Expression von Proteinen der Klone pSK1.4H/S, pSK EA-1 und des Vektors pSK⁺ zur Detektion der Antikörperbindungsstelle von mAB25.91

92

Abbildung 27 ELISA-Test von 3 verschiedene Fragmente der Enniatinsynthetase auf die Lokalisierung der Antikörperbindungsstelle (mAB25.91)

93

Abbildung 28 Lokalisierung der putativen X-Domäne 94 Abbildung 29 Lokalisierung der putativen Kondensations-Domänen 95 Abbildung 30 Darstellung der Modulstruktur der Enniatinsynthetase unter

Beachtung der Ergebnisse für die putativen X- Domänen und die putativen Kondensations-Domänen C

97

Abbildung 31 Zeitabhängigkeit der Cross-Link-Reaktion bei zwei verschiedenen Glutardialdehyd-Konzentrationen

99

Abbildung 32 Räumliches Modell der Enniatinsynthetase 102

III. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Konsensussequenzen der Core Motive aus Adenylierungs-Domänen

8

Tabelle 2 Motive der Kondensations-Domäne 13

Tabelle 3 Kinetische Konstanten von verschiedenen Fusarien 16 Tabelle 4 Gegenüberstellung der Sequenzunterschiede in mehr als einer

Position zwischen den Adenylierungs-Domänen aus F. scirpi und F. sambucinum

76

Tabelle 5 Übersicht der in Position 128 (bezogen auf F. sambucinum) gefundenen Aminosäuren in Relation zur aktivierten Aminosäure

80

Tabelle 6 Aminosäurepositionen des substratspezifischen Codes für L-Leucin und L-Valin (Stachelhaus et al., 1999)

82

Tabelle 7 Ergebnisse der Beladung mit ¹⁴C-Valin vor und nach dem Cross-Linking der ESYN

100

Tabelle 8 Peptidsequenz der ausgewählten Banden 101

Abkürzungsverzeichnis

A. Aspergillus Abb. Abbildung ACM Actinomycin

ACMSII Actinomycinsynthetase II ACV α-Aminoadipyl- cysteinyl- valin A- Domäne Adenylierungsdomäne

Adomet S- Adenosyl-L- methionin

ADP Adenosindiphosphat amp Ampicillin

AMP Adenosinmonophosphat AngR Anguibactinsynthetase Protein Arg Arginin

Asn Asparagin Asp Asparaginsäure ATP Adenosintriphosphat ATPase Adenosintriphosphatase B. Bacillus

BacA Bacitracinsynthetase- Untereinheit A BacC Bacitracinsynthetase- Untereinheit C BBA Biologische Bundesanstalt BCIP 5-Bromo- 4- chloro- 3- indoylphosphat bidest entionisiertes Wasser bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin C. Cephalosporium C. carbonum Cochliobolus carbonum

C Cytosin C- Carboxy-

CAT Chloramphenicol- acetyltransferase C- Domäne Kondensationsdomäne

Ci Curie cpm counts per minute

CoA Coenzym A

CssA Cyclosporinsynthetase CYSYN Cyclosporinsynthetase D- Ala D- Alanin

dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat

ddNTP Didesoxyribonukleotidtriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat D- Hiv D- Hydoxyisovaleriansäure

dm2 Domäne 2

dm9 Domäne 9

DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat DTE Dithioerythreitol

DTT Dithiothreitol

dTTP Desoxythymidintriphosphat E. Escherichia

EA Modul der Enniatinsynthetase, aktiviert D- Hiv EB Modul der Enniatinsynthetase, aktiviert L- Val EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme- linked immunosorbent assay EntE Enterobactinsynthetase Untereinheit E ESYN Enniatinsynthetase

ESYNsamb Enniatinsynthetase aus F. sambucinum

ESYNscir1 Enniatinsynthetase aus F. scirpi Domäne A aus EA ESYNscir2 Enniatinsynthetase aus F. scirpi Domäne A aus EB esyn1 Gen der Enniatinsynthetase

ETH Eidgenössische Technische Hochschule F. Fusarium

FenB Fengycinsynthetase- Untereinheit B FenE Fengycinsynthetase- Untereinheit E fxbB Exochelinsynthetase- Untereinheit B fxbC Exochelinsynthetase- Untereinheit C G Guanidin

Glu Glutaminsäure

GrsA Gramicidinsynthetase- Untereinheit A GrsB Gramicidinsynthetase- Untereinheit B GSH Glutathion

GSSH Glutathiondisulfid h Stunde

HC- Toxin Helminthosporium carbonum Toxin HIS/ His Histidin

HMWM SDS-6H

HMWP1/ HTS1 High molecular weight protein 1 (Untereinheit Yersiniabactinsynthetase)

HMWP2 High molecular weight protein 2 (Untereinheit Yersiniabactinsynthetase

IPTG Isopropylthiogalaktosid kb(p) Kilobasenpaare

kcat katalytische Konstante kDa Kilodalton

K_M Michaelis- Konstante

kHz Kilo- Hertz

LB Luria- Broth

LchAA Lichenysin-A-synthetase- Untereinheit A LchAB Lichenysin-A-synthetase- Untereinheit B Leu Leucin

licA Lichenysin-D-synthetase- Untereinheit A licB Lichenysin-D-synthetase- Untereinheit B licC Lichenysin-D-synthetase- Untereinheit C

L-Ile L- Isoleucin

L-Leu L- Leucin

LMWM SDS7 Dalton Mark VII-L

L-Val L- Valin

Lys Lysin

M N- Methyltransferase- Domäne

mAB monoklonaler Antikörper

MCS Multiple cloning site

mel Melaninpromotor Met Methionin

min Minute

MOPS 3- Morpholino-1- propansulfonsäure mRNA messenger Ribonukleinsäure N. Neurospora

N. lactamdurans Nocardia lactamdurans N- Amino- NBT Nitro Blue Tetrazolium

Ni- NTA Nickel- Nitrilo- Tri- Acetic acid

OD Optische Dichte

ORF Open reading frame (offener Lesereahmen) P. Pseudomonas

P. pastoris Pichia pastoris

PAGE Polyacrylamid- Gelelektrophorese PBS Phosphat buffered saline

PCR Polymerase- Kettenreaktion PEG Polyethylenglycol

Phe Phenylalanin

PheA Phenylalanin aktivierende Domäne aus GrsA PhsA Bialaphossynthetase

Pksorfx5 putative Polyketidsynthetase ORF5

PMSF Phenylmethylsulphonylfluorid PP Phosphopantethein

P- Puffer Protoplastenpuffer

PPS3 Peptidsynthetase-Untereinheit 3 aus B. subtilis PPS5 Peptidsynthetase-Untereinheit 5 aus B. subtilis Pro Prolin

PvdE Pyoverdinsynthetase Untereinheit E PVDF Polyvinylidendifluorid RNA Ribonukleinsäure RNaseA Ribonuklease A rpm Rotationen pro Minute

RT Raumtemperatur S. Streptomyces s/ sec Sekunde

SDS Natriumdodecylsulfat Ser Serin

SET NaCl/ EDTA/ Tris S- Domäne Thiolierungs- Domäne

simA Gen der Cyclosporinsynthetase spp. Spezies

SrfAA Surfactin-A-synthetase- Untereinheit A SrfAB Surfactin-A-synthetase- Untereinheit B

srfb Surfactinsynthetase- Untereinheit B SSPE NaCl/ Natriumphosphat/ EDTA

SyrB Syringomycinsynthetase- Untereinheit B SyrE Syringomycinsynthetase- Untereinheit E T. Tolypocladium

TAE Tris/ Essigsäure/ EDTA TBE Tris/ Borsäure/ EDTA TBS Tris Buffered Saline

TCA Trichloressigsäure T- Domäne Thiolierungs- Domäne

TE Tris/ EDTA

TEDG Tris/ EDTA/ DTT/ Glyzerin

TEMED N,N,N’,N’,- Tetramethylethylendiamin

TES Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminomethansulfonsäure TES Tris/ EDTA/ SDS

Thr Threonin

Tris Tris (hydroxymethyl)aminomethan tRNA Transfer Ribonukleinsäure

tsr Thiostrepton

TycA Tyrocidinsynthetase- Untereinheit A TycB Tyrocidinsynthetase- Untereinheit B TycC Tyrocidinsynthetase- Untereinheit C Tyr Tyrosin

U Units (Enzymeinheit)

V Volt Val Valin

X- Gal 5- Chloro- 4- bromo- 3-indoyl- β- D-galactppyranosid

1. Einleitung

1.1 Peptidantibiotika

Eine große Anzahl von Oligopeptiden mit therapeutischen Eigenschaften wird in der Natur von verschiedenen Eu- und Prokaryonten synthetisiert. Viele dieser Peptide enthalten ungewöhnliche Aminosäuren, die nicht in Proteinen vorkommen. Typische Merkmale dieser nichtproteinogenen Aminosäuren sind z. B. das Auftreten von Doppelbindungen, D-Konfigurationen am α-Kohlenstoff oder langkettige aliphatische Reste. Aber auch N-methylierte Aminosäuren und Hydroxysäuren können Bestandteile bioaktiver Peptide sein.

Peptidantibiotika werden nichtribosomal von hochmolekularen multifunktionellen Enzymen oder Enzymkomplexen synthetisiert (Zocher & Keller, 1997; Glinski et al., 2000; Kleinkauf

& von Döhren, 1983/1990).

Sie haben sehr vielfältige pharmazeutische Eigenschaften. Prominente Vertreter der Klasse der Peptidantibiotika sind unter anderem das β-Lactam-Antibiotikum Penicillin und das Undekapeptid Cyclosporin A. Penicillin hemmt die Zellwandbiosynthese bei Bakterien.

Cyclosporin A besitzt neben immunosuppressiven auch entzündungshemmende, antifungale und antiparasitäre Eigenschaften (Borel, 1986). Cyclosporin A wird in der Transplantationsmedizin eingesetzt, um Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen zu verhindern (Kahan, 1984; Schindler, 1985). Mittlerweile sind für Peptidantibiotika anti-HIV Wirkungen nachgewiesen worden (Traber et al., 1994).

Peptidantibiotika besitzen keine unmittelbare Notwendigkeit für den Lebenscyclus des produzierenden Organismus. Obwohl die Biosynthese einer Vielzahl von Sekundärmetaboliten erst am Ende der Trophophase induziert wird, kann hinsichtlich des Startzeitpunktes der Biosynthese keine eindeutige Aussage getroffen werden. Die Bildung von Phytotoxinen aus Pilzen wie z. B. die der Enniatine unterliegt keiner regulatorischen Kontrolle. Enniatine werden konstitutiv synthetisiert (Billich et al., 1988), d. h. es existiert keine Trennung von Tropho- und Idiophase.

Die Nutzung der Biosynthese der Peptidantibiotika für den produzierenden Organismus ist bisher nicht geklärt. Es gibt lediglich Hinweise darauf, dass sie dem Produzenten Selektionsvorteile durch Erhöhung der Resistenz gegenüber schädlichen Umwelteinflüssen verschaffen.

Das Repertoire des Sekundärmetabolismus ist enorm, jedoch sind viele der an der Biosynthese beteiligten Enzyme bislang unbekannt bzw. nicht charakterisiert. Durch die gezielte Veränderung von diesen Enzymen ergibt sich ein weites Forschungsfeld, um Sekundärmetaboliten mit gewünschten Eigenschaften bewusst zu erzeugen.

1.2 Enniatin

Enniatine sind cyclische Hexadepsipeptide, in denen je drei hydrophobe verzweigtkettige L-Aminosäuren und D-Hydroxyisovaleriansäure- einheiten über Peptid- und Esterbindungen miteinander verknüpft sind. Die Peptidbindungen sind N-methyliert. Enniatine werden während der gesamten Wachstumsphase (Billich et al., 1988) von filamentösen Pilzen der Gattung Fusarium produziert.

Die Enniatine werden nach ihren Aminosäureresten in Enniatin A/A1, B/B1 und C (siehe Abbildung 1) eingeteilt (Pieper et al., 1995). Die bekannten Enniatine unterscheiden sich nur in den Aminosäureeinheiten. Enniatin A enthält die Aminosäure L-Isoleucin, während in Enniatin B L-Valin als Aminosäurebaustein enthalten ist. In Enniatin A1 sind zwei Positionen durch L-Isoleucin und eine durch L-Valin besetzt. In Enniatin B1

findet man die entsprechend umgekehrten Verhältnisse, d. h. zwei Positionen sind mit L-Valin und eine Position mit L-Isoleucin besetzt.

Die antibiotische Wirkung von Enniatinen gegenüber Bakterien und Pilzen (Plattner et al., 1948; Wipf et al., 1968; Laribaud, 1971) wird mit der Dekompensation der oxidativen Phosphorylierung in Bakterien und in Mitochondrien von höheren Organismen in Verbindung gebracht (Shemyakin et al., 1969). Es gibt Hinweise auf

Enniatin A R2=R4=R6= -CH(CH3)CH2CH3

Enniatin A1 R2=R4=

-CH(CH3)CH2CH3

R6=-CH(CH3)2

Enniatin B R2=R4=R6= -CH(CH3)2

Enniatin B1 R2=R4=-CH(CH3)2

R6=-

CH(CH3)CH2CH3

Abbildung 1: Strukturformel von Enniatin (allgemein) R1=R3=R5= iso- Propyl

anthelminthische, antiinflammatorische und immunomodulierende Wirkung von Enniatinen (Simon-Lavoine et al., 1980). Enniatine sind potente Inhibitoren der Säugetier-Cholesterol- Acyltransferase (Tomoda et al., 1992) und bekannt für ihr ionophores Verhalten mit hoher Spezifität gegenüber Natrium- und Kaliumionen (Wipf et al., 1968). Toxin produzierende Fusarien sind wirtsunspezifische Pflanzenpathogene (Drysdale, 1982). Enniatine haben phytotoxische Eigenschaften, induzieren nekrotische Schäden an Blattgeweben verschiedener Pflanzen und an Kartoffelknollengewebe und sind neben anderen Stoffen für die Welke von Pflanzen verantwortlich (Gäumann et al., 1960; Walton, 1990; Hershenhorn et al., 1992;

Hermann et al., 1996 a).

Interessanterweise besitzt Enniatin, wie die Struktur verwandten Cyclodepsipeptide Beauvericin und Bassianolid, insektizide Eigenschaften (Grove et al., 1980).

Die Biosynthese von Enniatin erfolgt nichtribosomal. Die Peptidkette wird durch Multienzymkomplexe synthetisiert (Zocher et al., 1982/1983).

1.3 Peptidbiosynthese

Proteine nehmen mit ihrer Struktur- und Funktionsvielfalt die Schlüsselposition bei fast allen biologischen Prozessen ein. Die am höchsten spezialisierte Form der Proteine stellen die Enzyme dar. Enzyme sind Proteine mit spezieller katalytischer Aktivität. Francis Crick stellte 1958 den zentralen Lehrsatz der Biochemie (der Fluss der genetischen Information führt ausgehend von der DNA über die RNA zum Protein) als Grundlage der Proteinbiosynthese auf. Alle RNA-Arten werden aufgebaut, indem eine RNA-Polymerase entsprechend der Desoxynucleotidfolge der Gene in eine Folge von Ribonucleotiden umgeschrieben (Transkription– mRNA) und dem Proteinsynthese-Apparat zur Verfügung gestellt wird. Die Reihenfolge der Nucleotide bestimmt die Reihenfolge der Aminosäuren im Protein. Die mRNA dient als Matrize für die Verknüpfung einzelner Aminosäuren zur Peptidkette am Ribosom (Translation). Das Ribosom ist ein Ribonucleotid-Proteinkomplex. Mehr als 200 Proteine sind an der ribosomalen Peptidsynthese während der Initiation, Elongation, Regulation und Termination beteiligt. Bei dem Prozess der Übersetzung des RNA-Codons in die Proteinsequenz nehmen die transfer-RNAs (tRNAs) eine zentrale Rolle ein, sie dirigieren die richtige Aminosäure an die von der RNA-Sequenz vorgegebene Position. Dazu haben die tRNAs zwei besondere Struktuelemente: erstens eine exponierte Dreiergruppe von

Nucleotiden (Anticodon), die mit der komplementären Folge von Nucleotidtripletts auf der mRNA Wasserstoff-Brückenbindungen eingeht; und zweitens eine Stelle, an die eine spezifische Aminosäure gebunden wird. Für jede der 20 proteinogen Aminosäuren gibt es spezifische tRNAs. Die Anheftung der Aminosäure an das 3’-Ende der tRNA ist ein zentral wichtiger Prozess bei der Proteinsynthese. Denn damit wird die Voraussetzung für die Übersetzung des RNA-Codes in eine Aminosäurefolge geschaffen, weil die Aminosäure quasi in ein RNA-Derivat überführt wird, so dass dann eine Reihung der Aminosäure aufgrund von Wasserstoff-Brückenbindungen zwischen zwei RNA-Arten möglich wird, nämlich Brücken zwischen dem Anticodon der Aminosäure-tragenden tRNA und dem Codon der mRNA. Die Beladung der tRNAs mit Aminosäuren erfolgt durch eine Klasse von Enzymen, die als Aminoacyl-t-RNA-Synthetase bezeichnet werden. Dabei wird die Aminosäure als Aminoacyladenylat aktiviert und anschließend mit der tRNA kovalent durch Esterbindung gebunden. Die sehr hohe Genauigkeit der ribosomalen Proteinbiosynthese beruht auf der Fähigkeit der Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen ein mit der falschen Aminosäure gebildetes Adenylat zu hydrolysieren, bevor es zur Beladung der tRNA kommt (Proofreading).

Die überwiegende Zahl an Peptiden wird auf ribosomalem Weg synthetisiert. Eine weitere Möglichkeit der Peptidbiosynthese ist die nichtribosomale Peptidbiosynthese. Eikhom et al.

(1963/1964) konnten am Beispiel der Gramicidin S Biosynthese zeigen, dass trotz Inhibierung des ribosomalen Peptidsynthesesapparates durch Chloramphenicol Gramicidin S, ein cyclisches Dekapeptid aus Bacillus brevis, gebildet wird. Untersuchungen im zellfreien System der Gramicidin S Biosynthese konnten diese Ergebnisse bestätigen. Die Synthese des Peptides konnte trotz Zugabe von RNAse in Anwesenheit von ATP beobachtet werden (Berg et al., 1965).

Die nichtribosomale Peptidbiosynthese läuft an großen multifunktionellen Enzymkomplexen ab. Nichtribosomal synthetisierte Peptide werden häufig nach einem uniformen Mechanismus, dem Thiotemplate-Mechanismus, der Analogien zur Fettsäurebiosynthese aufweist, gebildet (Gilhuus-Moe et al., 1970; Kleinkauf et al., 1971; Lipmann et al., 1971; Lipmann 1973;

Lipmann 1980; Wakil et al., 1983; Schlumbohm et al., 1991; Stein et al., 1994/ 1995; Stein et al., 1996; Zocher et al., 1997). Das Reaktionsschema (Zocher et al, 1982/1983; Billich und Zocher, 1987/1990) soll am Beispiel des Enniatin B, welches als Aminosäurekomponente L-Valin enthält, erläutert werden (siehe Abbildung 2).

Die Adenylierungs-Domäne (A- Domäne) der Enniatin-Synthetase (347 kDa) aktiviert die Substrate (L-Valin und D-2-Hydroxy- isovaleriansäure) unter ATP- Verbrauch als Amino- acyladenylat. Danach erfolgt eine Reaktion mit spezifischen Sulfhydrylgruppen. Die Sulfhydrylgruppen werden vom

kovalent gebundenen 4’-Phosphopantethein-Cofaktor

bereitgestellt (Schlumbohm et al., 1991). L-Valin wird anschließend unter Verbrauch von S-Adenosyl- Methionin N-methyliert. Der Modifizierung des Substrats folgt

die Ausbildung der Peptidbindung und die Kondensation von Dipeptidolen (Elongation). Das Dipeptidol wird auf einen dritten Pan-Arm (Warteposition) übertragen. In dieser Position erfolgt die Bindung zum Tetrapeptidol und zum Hexapeptidol. Die komplette Peptidkette bleibt kovalent als Thioester an das Enzym gebunden, bis es durch abschließende Cyclisierung vom Enzym entfernt wird.

Für jede eingebaute Komponente (Aminosäure/Hydroxysäure) besitzt die Peptidsynthetase aktive Domänen, die als semiautonome Regionen innerhalb des Enzyms für alle benötigten Informationen der Erkennung, Aktivierung, Thioesterbildung, Kondensation und in manchen Fällen Modifizierung (Epimerisierung, N-Methylierung) diese Substrats benötigt werden. Die Interaktion dieser Domänen führt durch schrittweise, gerichtete (amino- zu carboxyterminal) Inkorporation der als Thioester gebundenen Substrate zur Bildung des Peptidprodukts. Die

1. Substrataktivierung:

Esyn(AMP~D-Hiv) i (AMP~L-Val)

2ATP + 2PP

D-Hiv L-Val Esyn +

2. Thioesterbildung:

- 2AMP Esyn(AMP~D-Hiv)

(AMP~L-Val) Esyn P¹

P2 D-Hiv

L-Val P H3

D-Hiv

4. Dipeptidolbildung:

Esyn

D-Hiv 1

2 P

P L-MeVal H

P H3 Esyn

P H3 P1 P2

D-Hiv L-MeVal

5.Dipeptidolübertragung:

Esyn P H¹ P3

D-Hiv L-MeVal

P H2 Esyn

P H3 D-Hiv

1 2 P

P L-MeVal H 3. N-Methylierung:

AdoMet AdoHcy

Esyn P H3

P1 P2

D-Hiv L-Val

Esyn P H3

P1

L-MeVal P2

D-Hiv +

6. Tetrapeptidolbildung, Hexapeptidolbildung und Zyklisierung :

Esyn P H¹ P3

D-Hiv L-MeVal

P H2

P H3 Esyn P H¹

P H2 ⁺ Enniatin B

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Enniatin B Synthese. P1, P2 und P3 sind die 4’-Phosphopantethein- Cofaktoren

Sequenz und die Struktur des gebildeten Produkts ist damit von der sequentiellen Anordnung und Funktion der Biosynthesemodule abhängig. Einige Systeme entsprechen nicht diesen Vorstellungen, so beobachteten Gehring et al., dass das Cluster für die Yersiniabactin- Biosynthese (Yersinia pestis) eine ungewöhnliche Organisation aufweist. Drei Hauptenzyme sind an der Biosynthese beteiligt, eine Aryl-AMP-Ligase (YbtE), eine Peptidsynthetase (HMWP2) und eine gemischte Polyketid-Peptidsynthetase (HMWP1). HMWP2 enthält eine Adenylierungs-Domäne, die für die Aminoacyladenylatbildung von drei unterschiedlichen Thiolierungs-Domänen verantwortlich ist. Zwei der T-Domänen sind in der Untereinheit HMWP2 lokalisiert und damit nicht mit der Adenylierungs-Domäne verbunden. Sie sind cis- ständig zur A-Domäne, während die dritte T-Domäne in HMWP1 trans-ständig ist (Gehring et al., 1998). Eine weitere Ausnahme stellt das Exochelin-Biosynthesecluster aus Mycobacterium smegmatis dar (Yu et al., 1998). Sequenzanalysen der Gene fxbB und fxbC zeigen insgesamt 6 Module, obwohl das sekretierte Exochelin ein Pentapeptid ist. Es ist unklar, ob ein Hexapeptid als Zwischenprodukt gebildet wird, welches später zu dem sekretierten Pentapeptid verkürzt wird oder ob das letzte Modul in fxbC inaktiv ist. Ein weiterer interessanter Aspekt ist die Verteilung der Kondensations-Domänen und die Art der ausgebildeten Bindungen. Am Übergang von FxbB und FxbC findet sich nur eine carboxterminale Kondensations-Domäne, was dafür spricht, dass die Kondensations-Domäne unabhängig von ihrer Position ihre spezifische Reaktion katalysieren kann. Drei der vier durch die Kondensations-Domäne gebildeten Bindungen sind Amid- und nicht Peptidbindungen, so dass sich das Spektrum der katalysierten Reaktionen erweitert (Konz et al., 1999). Durch die Charakterisierung der Syringomycin-Peptidsynthetase-Gene von Pseudomonas syringae konnten Guenzi et al. zeigen, dass die Untereinheiten der Synthetase von unterschiedlichen mRNAs transkribiert werden. Die SyrB Untereinheit, welche die letzte Aminosäure des Syringomycin aktiviert, muss spezielle Interaktionen mit dem C-terminalen Ende von SyrE eingehen, um ein funktionales Enzym zu gewährleisten. Am C-Terminus von SyrE befinden sich zwischen dem letzten Modul und der Thioesterasedomäne eine Kondensations- und eine Thiolierungs-Domäne, denen eine Adenylierungs-Domäne fehlt, diese ist durch SyrB repräsentiert (Guenzi et al., 1998).

1.4 Enniatinsynthetase-Gen

In bakteriellen Systemen liegen die Gene für die Synthese eines spezifischen Peptides typischerweise als Operon vor. Dieses kann eine Region von 6-45 Kilobasen umfassen.

Bakterielle Systeme bestehen aus interagierenden Einzelenzymen, die zusammen den aktiven Komplex bilden. Die einzelne Peptidsynthetase (Gramicidinsynthetasen aus B. brevis [Turgay et al., 1992; Krätzschmar et al.,1989], Bacitracinsynthetasen aus B. licheniformis [Konz et al., 1997], Actinomycinsynthetasen aus S. chrysomallus [Pfennig et al., 1999; Schauwecker et al., 1998; Schauwecker et al., 2000]) in diesem System kann aus 1-9 Modulen aufgebaut sein. Im Gegensatz dazu sind Peptidsynthetasen in fungalen Systemen auf einem großen Gen kodiert.

Eines der beeindruckensten Beispiele ist das Gen für die Cyclosporinsynthetase aus T.

inflatum, mit einem offenem Leserahmen von 46 Kilobasen, das in 11 Modulen für ein 1600 kDa großes Protein kodiert.

Ein weiteres Beispiel ist die Enniatinsynthetase, deren Gen (esyn1) aus Fusarium scirpi ETH 1536 isoliert und sequenziert wurde (Haese et al., 1993; Zugangsnummer Z18755 in der EMBL-Datenbank für Nukleotidsequenzen). Es hat einen offenen Leserahmen (ORF) von 9393 Basenpaaren, der ein 346,9 kDa großes Protein, bestehend aus 3131 Aminosäuren, codiert. Nach der Unterbrechung des esyn1 homologen Gens in F. avenaceum konnte keine Enniatinbiosynthese mehr detektiert werden, was den Schluss zulässt, dass das esyn1 Gen für die Enniatinproduktion verantwortlich ist (Hermann et al., 1996). Weitere Hinweise konnten durch die Expression von Teilfragmenten des Genes, die katalytische Aktivität besitzen gewonnen werden (Pieper et al., 1995; Haese et al., 1994). Die aus dem ORF abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt die für Peptidsynthetasen typische Domänenstruktur (siehe Abb. 3).

pSK1.6BP

wild-type

EA EB

A X S B M XS

1

C S

3131

456 1103 1524 2014 2447 2707

pSK1.6BP

wild-type

EA EB

A X S A M XS

1

C S

3131

456 1103 1524 2014 2447 2707 AS

Abbildung 3: Domänenstruktur der Enniatinsynthetase. Anordnung konservierter Regionen auf dem ESYN-Protein. EA repräsentiert das D-Hiv- Aktivierungsmodul; EB repräsentiert das L-Valin- Aktivierungsmodul. Angegeben sind die Bereiche A (Adenylierungs-Domäne)/X/C (Kondensations- Domäne) und S (Thiolierungs-Domäne) mit ausgeprägten Homologien zu anderen Peptidsynthetasen, sowie die N-Methyltransferase-Region M. Die Nummerierung gibt die Aminosäurepositionen in der Enniatinsynthetase-Sequenz an.

EA und EB sind hochkonservierte funktionelle Module, die eine Länge von ca. 600 Aminosäuren haben. Zwei Module einer Peptidsynthetase sind durch eine ca. 500 Aminosäuren lange Kondensations-Domäne voneinander getrennt.

Ein Minimalmodul besteht aus einer Adenylierungs-Domäne, einer Thiolierungs-Domäne und einer Kondensations-Domäne, sofern es sich nicht um das Initiationsmodul handelt. Ein Initiationsmodul besteht nur aus Adenylierungs-Domäne und Thiolierungs-Domäne (Linne et al., 2000).

1.4.1 Adenylierungs-Domäne

Eine Übersicht über die hoch konservierten Sequenzmotive einer Aktivierungsdomäne, die als

„Core-Motive“ (Marahiel, 1992) bezeichnet werden, einschließlich der Funktion ist in Tabelle 1 gezeigt.

Core Motiv Aminosäure-Sequenz Funktion

A1 L(TS)YxEL

A2(Core1) LKAGAxAYL(VL)P(LI)D unbekannt A3(Core2) LAYxxYTSG(ST)TGxPKG ATP-Bindung

A4 FDxS A5 NxYGPTE

A6(Core3) GELxIxGxG(VL)ARGYL ATP-Bindung A7(Core4) Y(RK)TGDL ATPase-Motiv A8(Core5) GRxDxQVKIRGxRIELGEIE ATP-Bindung

A9 LpxYM(IV)P A10 NGK(VL)DR

T(Core6) DxFFxxLGG(HD)S(LI) 4’-Phosphopantethein-Bindung

Tabelle 1 Konsensussequenzen der Core Motive aus Adenylierungs-Domänen nach Konz et al., 1999 und deren zugeordnete Funktionen (Gocht et al., 1994; Zuber et al., 1997; Schlumbohm et al., 1991; Stein et al., 1994; Pavela-Vrancic et al., 1994a/b).

Die Adenylierungs-Domänen A (etwa 420 Aminosäuren) in EA und EB weisen zueinander eine Ähnlichkeit von 39,5% und eine Identität von 25% auf. EA und EB zeigen außerdem Homologien zu allen A-Domänen anderer Peptidsynthetasen wie den ACV-Synthetasen (AcvA) aus Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans und Cephalosporium

acremonium, den Gramicidinsynthetasen A und B (GrsA/ GrsB), der Tyrocidinsynthetase A (TycA) aus Bacillus brevis und der HC-Toxinsynthetase aus Cochliobolus carbonum (Übersicht in Stachelhaus & Marahiel, 1995 c; Konz et al., 1999). Bei einem Vergleich der Domänen von 8 Peptidsynthetasen mit den Proteinsequenzen von 9 adenylierenden Enzymen (Turgay et al., 1992) konnte gezeigt werden, dass diese einer verkürzten Peptidsynthetase- Domäne entsprechen, der das zur Thioesterbindung des Substrates notwendige Core 6 fehlt.

Abbildung 4 zeigt den schematischen Vergleich zwischen Peptidsynthetase-Domäne und adenylierendem Enzym.

Abbildung 4: Schematischer Strukturvergleich der Peptidsynthetase-Domäne mit der Domäne des adenylatbildenden Enzyms. Die konservierten Motive von Peptidsynthetasen sind in der Abbildung vermerkt. Im Fall von geringer Konserviertheit sind diese Aminosäuren in Klammern gesetzt bzw. deren Position in der Abbildung weiß unterlegt (modifiziert nach Turgay et al., 1992).

Es wurden bereits eine Reihe adenylierender Enzyme sequenziert, wie die 2,3-Dihydroxybenzoesäure-AMP-Ligase aus der Enterobactin Biosynthese von E. coli (Staab et al., 1989; Rusnak et al., 1991), die dazu analoge 2,3–Dihydroxybenzoesäure-AMP-Ligase aus B. subtilis (Albertini et al., 1995), 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase aus der Pristinamycin I Biosynthese aus S. pristinaespiralis (de Crecy-Lagard et al., 1997a), die Luciferase aus dem Leuchtkäfer (Photinus pyralis) (de Went et al., 1987), die 4-Coumarat- Coenzym-A-Ligase höherer Pflanzen z. B. aus Petroselinum crispum (Loyoza et al., 1988), die Coenzym-A (CoA)-Synthasen der längerkettigen Fettsäuresynthese z. B. aus Rattus norvegicus (Suzuki et al., 1991) und Acetyl-CoA-Ligasen aus A. nidulans und N. crassa (Connerton et al., 1990).

100

0 200 300 400 500 600

Aminosäuren

Core Motiv 1 2 3 4 5 6

Core Sequenz: KAGGA SGTTGxPKGGELCIGG

TGD KIRGx RIELGEIE

LGGxS NGK

Core Sequenz: (KAGGA) SGTTGxPKG

(GELCIGG)

TGD

NGK

(KIRGx RIELGEIE) Domäne einer Peptidsynthetase

Domäne eines adenylatbildenden Enzyms

Durch die Auswertung der Kristallstruktur von 2 adenylatbildenden Enzymen, Luciferase aus Photinus pyralis (Conti et al., 1996) und Gramicidinsynthetase A (GrsA) aus Bacillus brevis (Conti et al., 1997), konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme eine Faltung aufweisen, die unterschiedlich zu der von Klasse I und II Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen ist. Die beiden adenylatbildenden Enzyme haben mit 16% nur eine geringe Homologie der Sequenz , die Topologie der dreidimensionalen Struktur dagegen, zeigt eine große Übereinstimmung.

Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmung von 30-60% der Peptidsynthetase-Domänen untereinander, kann man davon ausgehen, dass die Struktur von GrsA eine Prototyp für die Adenylierungs-Domänen darstellt (Conti et al,. 1997).

Monoklonale Antikörper die gegen das Multienzym ESYN gerichtet sind, wurden zur Charakterisierung der katalytischen Einheiten des Enzyms genutzt (Billich et al., 1987). Die Antikörper lassen sich auf Grund ihres Einflusses auf die katalytische Funktion in drei Gruppen unterteilen. Mitglieder der Gruppe eins inhibieren die L-Valin-Thioester-Bildung, während Gruppe zwei die Bildung des D-Hiv–Thioesters verhindert. Die Antikörper der dritten Gruppe blockieren die Bildung von beiden Thioestern und des weiteren die N-Methylierung des gebundenen Valins. Keiner der Antikörper beeinflusst die Aktivierung von L-Valin und D-Hiv als Adenylat. Die Ergebnissen zeigen, dass es zwei voneinander abgegrenzte, aber benachbarte katalytische Zentren für die Thioesterbildung gibt, während die Adenylierungszentren anscheinend räumlich voneinander entfernt sind (Billich et al., 1987).

Die Überexpression von verschiedenen Bereichen des esyn1 Gens in Escherichia coli und die funktionelle Charakterisierung der gereinigten rekombinanten Proteine zeigte, dass das Modul EA die D-Hydroxyisovaleriansäure adenylieren kann. Das Modul EB ist dagegen für die Adenylierung von L-Valin verantwortlich (Haese et al., 1993/1994). Diese Ergebnisse wurden durch Untersuchungen von Substrat-markierten proteolytischen Fragmenten der ESYN bestätigt (Pieper et al., 1995).

1.4.2 N-Methyltransferase

Die Struktur von Modul EB unterscheidet sich von EA durch einen Einschub von 434 Aminosäuren (M siehe Abb. 3). Ein Glycin-reiches Motiv (Motiv I: VLEIGxGxGxx), das in vielen Methyltransferasen konserviert ist (Kagan et al., 1994; Malone et al., 1995), wird auch in N-Methyltransferase-Domänen aus Peptidsynthetasen gefunden (Haese et al., 1993;

Burmester et al., 1995; Hacker et al., 2000). Struktur-Sequenz–Alignments von

N-Methyltransferase-Domänen aus Peptidsynthetasen mit Methyltransferasen zeigen weitere Homologien (Kagan et al., 1994; Schluckebier et al., 1995; Posfai et al., 1989). Das Motiv II aus DNA-Methyltransferasen wird ebenfalls in N-Methyltransferase-Domänen aus Peptidsynthetasen (hier als Motiv II/Y bezeichnet) gefunden. Diese Motiv ist wahrscheinlich in die AdoMet-Bindung involviert (Pieper et al., 1995; Hacker et al., 2000). Die Motive I / II und IV finden sich in jedem Typ Methyltransferase in einer gleichen räumlichen Anordnung zueinander. Die hochkonservierte Sequenz NSVV/AQYFPxxxYL (korrespondierende Position in Enniatinsynthetase aus F. scirpi 2159-2171) befindet sich in allen N-Methyltransferasen aus Peptidsynthetasen C-terminal von Motiv II. Diese Sequenz entspricht Motiv IV der DNA-Methyltransferase-Nomenklatur, welches homolog zu Motiv II von Kagan und Clark ist (Kagan et al., 1994; Malone et al., 1995; Posfai et al., 1989).

Downstream von Motiv IV befindet sich die Sequenz ²¹⁹⁴ ATNGHFLAAR, welche Homologien zu Motiv V aus γ-DNA-Methyltransferasen, z. B. M.TaqI (Malone et al., 1995) zeigt. In diesem Motiv findet sich ein Phenylalanin, welches in N-Methyltransferasen aus Peptidsynthetasen streng konserviert ist. Für eine weitere Charakterisierung der Methyltransferase aus Enniatinsynthetase wurden 7 Deletionsvarianten konstruiert. Die korrespondierenden Proteine wurden exprimiert, partiell gereinigt und nach Renaturierung auf ihre AdoMet-Bindungsfähigkeit getestet. Die Bindungsstudien zeigten, dass 21 Aminosäuren vom N-Terminus deletiert werden können, ohne dass die Bindungsfähigkeit verloren geht.

Wird dagegen ein Teil von 38 Aminosäuren am C-Terminus deletiert oder werden interne Sequenzen deletiert, geht die AdoMet-Bindungsfähigkeit deutlich zurück (Hacker et al., 2000). Das hochkonservierte Asn in Motiv IV findet sich auch in anderen Methyltransferasen, wie der M.TaqI und Glycin-N-Methyltransferase aus Ratte (Labahn et al., 1994; Schluckebier et al., 1997; Ogawa et al., 1987). Cheng et al., 1993 postulierte, dass die Seitenkette des Asn als Donor für die Wasserstoffbrücke zum Target Adenin agiert und damit einen direkten Transfer der aktivierten Methylgruppe ermöglicht. Die Deletionsvariante pM7, welche eine interne Deletion am C-Terminus ist, führt ebenfalls zum Verlust der Bindungsfähigkeit.

Hacker et al. (2000) schließen daraus, dass für die AdoMet-Bindung Strukturelemente downstream von Motiv V benötigt werden. Die Methyltransferase-Funktion der ESYN wurde durch Untersuchungen rekombinanter Proteine und S-[Methyl¹⁴C]-Adenosyl-L-Methionin markierter proteolytischer ESYN-Fragmente in diesem Einschub lokalisiert. Von Pieper et al.

(1995) wurde ein S-[Methyl¹⁴C]-Adenosyl-L-Methionin markiertes Nonapeptid (Position 2098-2106 von ESYN) isoliert, das einen Tyrosin-Rest enthält. Dieses Tyrosin-haltige Motiv ist auch in den Methyltransferase-Domänen anderer Peptidsynthetasen konserviert. Takata et

al. konnten diesen Rest auch in Guanidinumacetat-Methyltransferase aus Ratte nachweisen.

Das ¹³⁶Tyr befindet sich 66 Aminosäuren C-terminal von einer konservierten Sequenz (LD/EV/L/IGxGxG), die hohe Homologien zu Motiv I aufweist (Takata et al., 1992). Mit Punktmutationen wurde das Tyrosin in Alanin, Valin, Serin und Phenylalanin überführt. Die Mutationen mit aliphatischen Seitenketten zeigen eine deutlich eingeschränkte Bindungskapazität (19-28% des Wildtyps), während die Phenylalaninmutante noch 70% der Wildtypaktivität aufweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Tyrosin eine wichtige Rolle in der AdoMet-Bindung bzw. in der korrekten Proteinfaltung einnimmt (Hacker et al., 2000).

Sequenzinformationen verschiedener N-Methyltransferasendomänen aus Peptidsynthetasen eukaryontischen und prokaryontischen Ursprungs sind heute zugänglich. Burmester et al.

konnten ein 1535 bp großes PCR-Fragment aus F. sambucinum BBA 63933 unter Nutzung degenerierter Primer, abgeleitet von konservierten Sequenzen aus dem esyn1 Gen aus Fusarium scirpi (¹⁹⁵⁵QFKIRGNR und ²⁴⁵⁷VPSYMVP), amplifizieren. Die angegebenen Sequenzen sind Teil der angrenzenden konservierten Domäne, welche die Methyltransferase flankieren. Die Nucleotidsequenz des klonierten PCR-Fragments hat eine Identität von 88,5%

zum korrespondierenden Teil von esyn1 aus F. scirpi. Die Identität der abgeleiteten Aminosäuresequenz beträgt 91% (Burmester et al., 1995).

Während der Synthese des Cyclosporins, ein Undekapeptid, werden sieben Aminosäuren methyliert. In der, aus dem SimA Gen, welches die Cyclosporinsynthetase (CYSYN) kodiert, abgeleitete Aminosäuresequenz aus Tolypocladium inflatum (Weber et al, 1994) findet man in sieben Domänen einen Bereich von 430 Aminosäuren, der eine Identität von 47-52% zu der N-Methyltransferase-Domäne von ESYN aufweist. Phylogenetisch bilden diese N-Methyltransferasen eine Gruppe. Eine zweite Gruppe (prokaryontischer Ursprung) beinhaltet die N-Methyltransferasen verschiedener Streptomyces und Microcystis spp.

(Schauwecker et al., 2000; de Crecy-Lagard et al., 1997a/b; Nishizawa et al., 1999). Die N-Methyltransferasen der verschiedenden Streptomyceten besitzen 38-68% Identität zueinander. N-Methyltransferasen aus Mycrocystis spp. und den verschiedenen Streptomyceten zeigen 27-30% Sequenzhomologie (Hacker et al., 2000).

1.4.3 Thiolierungs-Domäne

In den meisten Peptidsynthetasen schließt sich an die Adenylierungs-Domäne eine Thiolierungs-Domäne an, die ein 4’-Phosphopantethein-Cofaktor in seiner holo-Form besitzt.

Während der Peptidsynthese reagiert das Acyladenylat, welches mit der Adenylierungs- Domäne assoziiert ist, mit der SH-Gruppe des kovalent an die korrespondierende Thiolierungs-Domäne gebundenen Phosphopantetheins (Stein et al., 1996; Stein et al., 1994;

Stachelhaus et al., 1996a; Schlumbohm et al., 1985). Das Motiv (siehe Tabelle 1) der Thiolierungs-Domäne enthält ein konservierten Serinrest, der die 4’-Phosphopantetheinbindungsstelle repräsentiert (Schlumbohm et al., 1991; Stein et al., 1994; Stachelhaus et al., 1996; Lambelot et al., 1996). Die spezifische 4’-Phosphopantethein- Modifikation jeder Thiolierungs-Domäne wird durch die Familie der 4’-Phosphopantethein- Transferasen katalysiert. Diese Enzyme vermitteln den nucleophilen Angriff der Hydroxylgruppe des Serin an die Pyrophosphatbrücke des CoA. Daraus resultiert der Transfer des 4’ PP-Cofaktors an die Thiolierungs-Domäne und die Freisetzung von 3’,5’-ADP (Lambelot et al., 1996; Walsh et al., 1997).

1.4.4 Kondensations-Domäne

Die gerichtete Kondensation der Thioesterintermediate wird durch die Kondensations- Domäne katalysiert. Die für eine solche Domäne postulierten Motive sind in Tabelle 2 aufgelistet.

Motiv Aminosäuresequenz C1 SxAQxR/LM)(WY)xL C2 RHExLRRTxF C3(His) MHHxISDG(WV)S

C4 YxD(FY)AVW C5 (IV)GxFVNT(QL)(~)xR C6 (HN)QD(YV)PFE C7 RDxSRNPL

Tabelle 2 Motive der Kondensations-Domäne nach Konz et al., 1999

Das HHxxxDG-Motiv (His-Motiv) ist ein Spacer-Motiv, das in Modulen, die vermutlich für die Peptidtransferkatalyse oder Epimerisierung verantwortlich sind, auftritt. Dieses hochkonservierte Motiv wird ebenfalls in der gut untersuchten Klasse der Acyltransferasen, zu der die E2-Dihydrolipoyltransacetylase und die Typ Tn9 Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT) gehören (Guest, 1987), gefunden. Das zweite Histidin des

HHxxxDG-Motivs korrespondiert mit dem katalytischen Rest der CAT (HxxxDG), was darauf hindeutet, dass alle diese Enzyme von einer Stammacetyltransferase abstammen (de Crecy-Lagard et al., 1995). Die Chloramphenicol-Acetytransferase katalysiert den Transfer einer Acetylgruppe vom Acetyl-CoA auf die primäre (C3) Hydroxylgruppe des Chloramphenicols (Shaw, 1983). In der CAT- und E2–Acetyltransferase-Familie konnte gezeigt werden, dass das His ein Rest der Aktivierungsstelle ist (Lewendon et al., 1993;

Russell et al., 1992). Strukturstudien am CAT-Enzym (Leslie, 1990) haben gezeigt, dass dem konservierten Histidin (His 195 in CAT Typ III Enzym (Alton et al., 1979)) eine grundlegende Aufgabe bei der Katalyse der Reaktion zukommt. Die ungewöhnliche Konformation des His ermöglicht die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen dem Carbonylsauerstoff und dem Stickstoff in N1 Position. Diese tautomere Stabilisierung ermöglicht dem N3 – Elektronenpaar des Imidazolrings ein Proton der C3-Hydroxylgruppe des Chloramphenicols zu abstrahieren, um einen nucleophilen Angriff an den Carbonylkohlenstoff des Acetyl-CoA zu ermöglichen (Leslie, 1990; Shaw, 1994). De Crecy-Lagard et al. postulieren davon ausgehend für die Kondensations-Domäne der Peptidsynthetasen folgenden Mechanismus: das zweite Histidin deprotoniert die NH3+ - Gruppe der als Thioester aktivierten Aminosäure, ermöglicht damit einen nucleophilen Angriff auf die aktivierten Carbonylgruppe des vorangegangenen Peptid- Phosphopantetheinyl-Thioesters und führt zur Amidbindung (de Crecy-Lagard et al., 1995).

In einem System aus der Phe-aktivierenden Domäne (GrsA) und der Pro-aktivierenden Domäne aus TycB konnten Stachelhaus et al., zeigen, dass kein Produkt gebildet wird, wenn die Kondensationdomäne der Pro-aktivierenden Domäne deletiert wird. Durch Mutation des Histidin (His147) zu Valin in der Kondensations-Domäne konnte gezeigt werden, dass Prolin aktiviert und ein Thioester ausgebildet wird, aber keine Verknüpfung zwischen Phe und Pro stattfindet (Stachelhaus et al., 1998). Durch Mutationen in den His-Motiven der 4 Module der Surfactinsynthetase konnte gezeigt werden, dass in vivo und in vitro mit gereinigtem Enzym keine Surfactinproduktion stattfindet (Vater et al., 1997). Die Zahl der His-Motive in einem Modul sollte exakt der Zahl der Aminoacylkondensationen- und Epimerisierungsreaktionen entsprechen, die gebraucht werden, um ein Peptid zu synthetisieren (esyn1 Position 1226 ) (de Crecy-Lagard et al., 1995). Konz et al. postulieren für die Enniatinsynthetase eine zweite Kondensations-Domäne hinter EB (Konz et al., 1999). Diese „Extra-Kondesationsdomäne“

findet sich auch am N-Terminus der Cyclosporinsynthetase und am Carboxterminus der HC-Toxin-, Rapamycinsynthetase und im FK 506 System. Es wird angenommen, dass diese

Kondensations-Domäne an der Peptidkettentermination und der abschließenden Cyclisierung beteiligt ist (Konz et al., 1999).

In Proteinen, die nur die Aminosäure oder Hydroxysäure aktivieren (EntE; AngR; HMWP2, Pksorfx5, PvdE und PhsA) findet sich das His – Motiv nicht. Bei Peptidsynthetasen, die auf einer Polypetidkette angeordnet sind (Enniatinsynthetase, ACV-Synthetase), befindet sich das His-Motiv jeweils zwischen 2 aminosäureaktivierenden Domänen. Dieser Umstand lässt die Hypothese zu, dass die Kondensations-Domäne eine Donor- und eine Akzeptorseite für die Bindung des Phosphopantetheincarriers besitzt (Stachelhaus et al., 1998). Besteht die Peptidsynthetase aus Enzymkomplexen (Gramicidin-, Enterobactin- oder Surfactinsynthetase), besitzt die Untereinheit, die die erste Aminosäure aktiviert, kein His-Motiv am N-Terminus und damit keine Kondensations-Domäne. Die relative Position der Phosphopantetheinyl-Erkennungsstelle zu einem His-Motiv beträgt zwischen 170-190 Aminosäuren (de Crecy-Lagard et al., 1995).

1.5 Substratspezifität

Es ist weitestgehend unklar, wie die Substratspezifitäten der aminosäureaktivierenden Domänen der Peptidsynthetasen zustande kommen.

Während F. scirpi ETH 1536 und F. lateritium BBA 65090 Enniatin B und B1 produzieren, synthetisiert F. sambucinum BBA 63933 die Enniatine A und A1 (Pieper et al., 1992). Madry et al. (1984) konnten im Enniatinproduzenten F. oxysporum in vivo durch präkursordirigierte Synthese (Zugabe von Aminosäuren) das Verhältnis der produzierten Enniatine verschieben, die zugegebene Aminosäure wurde verstärkt eingebaut.

Untersuchungen der Substratspezifitäten der gereinigten Enniatinsynthetasen aus F. scirpi ETH 1536, F. lateritium BBA 65090 und F. sambucinum BBA 63933 zeigen, dass es Enniatinsynthetasen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten zu den verzweigtkettigen L-Aminosäuren gibt (Pieper et al., 1992). Die Synthetasen aus F. scirpi und aus F. lateritium weisen eine hohe Substratspezifität gegenüber L-Val auf. Im Gegensatz dazu aktiviert die ESYN aus F. sambucinum bevorzugt L-Ile und L-Leu. Die kinetischen Daten zeigt Tabelle 3.

F. scirpi F. sambucinum F. lateritium

KM[µM] kcat [s^-1] kcat/KM [s^-1µM^-1] KM[µM] kcat [s^-1] kcat/KM [s^-1µM^-1] KM[µM] kcat [s^-1] kcat/KM [s^-1µM^-1] L-Val 80 1014 12.68 310 520 1.68 53 619 11.68

L-Ile 130 318 2.45 25 1040 41.6 77 377 4.9 L-Leu 270 133 359 28 1280 45.71 770 7540 9.79

Tabelle 3 Kinetische Konstanten von verschiedenen Fusarien nach Pieper et al., 1992

Das aminosäureaktivierende Zentrum sollte sich deutlich in seiner Raumstruktur unterscheiden. Daher ist zu erwarten, dass die Aminosäurezusammensetzung der Reaktionszentren differiert (Pieper et al., 1992). Es konnte ein 2991 bp langes PCR-Produkt aus F. sambucinum mit Hilfe degenerierter Primer von den flankierenden Bereichen der aminosäureaktivierenden Domäne des esyn1 Gens aus F. scirpi amplifizieren (Doller, 1996).

Die abgeleitet Aminosäuresequenz wurde mit Adenylierungs-Domänen bekannter Peptidsynthetasen verglichen. Sie zeigt 87% Identität zur A-Domäne von ESYN aus F. scirpi, 53% und 51% zu den A-Domänen dm2 (aktiviert L-Leucin) und dm9 (aktiviert L-Valin) aus Cyclosporinsynthetase (CYSYN) aus T. inflatum und 34% zu PheA aus B. brevis (Doller, 1996). Frühere Sequenzanalysen der A-Domäne von F. scirpi mit der A-Domäne aus F.

avenaceum, die ebenfalls L-Valin aktiviert, ergibt eine 99,9% Identität auf Nucleotidebene (Hermann et al., 1996b).

Anhand von Sequenzanalysen der 11 Domänen aus CYSYN und deren Vergleich mit der Röntgenstrukturanalyse der Luciferase (Conti et al., 1996) konnte eine Substrat-spezifische Tasche vorhergesagt werden (Husi et al., 1997). Drei Aminosäurereste, die zwischen Core A3 und A5 (Tabelle 1) liegen, repräsentieren den „ Triplett-Code“, denen Husi et al. eine große Bedeutung in der Substraterkennung zuweisen (Husi et al., 1997). Die Positionen werden im Ergebnisteil eingehend besprochen.

Die Kristallstruktur von PheA konnte im Komplex mit L-Phenylalanin und AMP vermessen werden (Conti et al., 1997). Zwischen den Coremotiven A4 und A5 flankiert von ²³⁵Asp und

517Lys (korrespondierend zu PheA) konnte ein stretch von 100 Aminosäuren ermittelt werden, in dem die, für die Aminosäureaktivierung notwendigen Reste liegen sollen. Daraus wurde ein Substraterkennungscode von 10 Aminosäuren postuliert, der mit der Adenylierungs- Domäne von 160 Peptidsynthetase-Domänen verglichen wurde (Stachelhaus et al., 1999).

Interessant ist, dass die phylogenetische Analyse der Sequenzdaten für die Substraterkennung eine Zuordnung der ESYN aus F. scirpi zu einer Gruppe von Threonin und Serin aktivierenden Domänen unterschiedlichsten phylogenetischen Ursprungs zeigen (Stachelhaus

et al., 1999). Ausgehend von der Kristallstruktur von PheA entwickelten Challis et al. ein Modell für die Vorhersage der Anordnung und Identität der aktivierten Aminosäure in Peptidsynthetasen basierend auf Sequenzinformationen (Challis et al., 2000).

1.6 Die Biologie der Fusarien und Streptomyceten

Fusarien gehören zur Gattung der Hyphomyceten, früher wurden sie der Gattung der Deuteromyceten zugeordnet. Heute gibt es Überlegungen die anamorphe Form den Hypocreales (Ascomyceten) zuzuordnen. Die telemorphe Form der meisten Spezies wird der Gruppe Gibberella zugeordnet. Die Fungi imperfecti bilden eine Gruppe von Pilzen, zu der etwa 20000 Arten gehören, von denen bisher nur die Nebenfruchtformen bzw. nur die sterilen Myzelien bekannt sind. Wahrscheinlich ist bei einigen die Fähigkeit zur Bildung der Hauptfruchtform verlorengegangen. Fusarien sind durch die Produktion von schlanken, septierten, kanuförmigen Konidien (Makrokonidien) gekennzeichnet. Nach der Form der Sporen unterscheidet man bei den Fungi imperfecti vier Formordnungen: a) Spaeropsidales, die Konidien werden in Behältern oder Höhlungen gebildet, b) Melaconiales, die Konidien werden auf stromartigen Lagern gebildet, c) Moniliales, die Konidien werden an typischen Konidienträgern gebildet, d) Mycelia sterilia, Mycel, ohne jegliche Konidien oder andere Fortpflanzungserscheinungen. Einige Spezies bilden außerdem noch davon deutlich unterschiedliche Konidien (Mikrokonodien) im Luftmycel aus. Abhängig von Spezies und der ökologischen Situation dominieren Makro- oder Mikrokonidien in den natürlichen Substraten (Stöcker et al., 1986; Booth, 1971; Nirenberg, 1990)

Die Streptomyceten gehören zu den Eubakterien und werden in die zweite große Gruppe der grampositiven Bakterien, den coryneformen Bakterien und Actinomyceten eingeordnet. Die Actinomyceten zeigen große morphologische Diversität und sind durch einen hohen G/C-Gehalt ihrer DNA gekennzeichnet (Woese, 1987). Dieser liegt bei durchschnittlich 74%

für die gesamte DNA und steigt in kodierenden Bereichen an der dritten Codon-Position sogar auf 76-99% an (Wright et al, 1992).

Der natürliche Lebensraum von Streptomyceten sind aerobe Bodenbereiche, dort wachsen sie in Mikrokolonien auf festen Bodenpartikeln. Die gute Anpassung an die stark schwankenden Bedingungen im Habitat wird in ihrer Morphologie deutlich (Ensign, 1992). Streptomyceten scheiden Exoenzyme und antibiotisch wirksame Substanzen, meist Stoffwechselprodukte des

Sekundärmetabolismus, aus, deren Synthese und Sekretion genetisch gekoppelt mit der Sporulation verläuft (Hopwood, 1988).

Abbildung 5: Morphologische Differenzierungsvorgänge bei Streptomyceten. Die Entwicklung der Streptomyceten beginnt nach dem Auskeimen der Spore mit der Bildung des Substratmycels. Bei eintretender Nährstofflimitierung beginnen die Hyphen zu lysieren, wodurch zusätzliche Nährstoffe für das Wachstum des Luftmycels und die sich anschließende Sporulation zur Verfügung stehen. In dieser Phase der Differenzierung ist der Organismus anfällig gegenüber der Konkurrenz anderer Mikroorganismen im Habitat. Dieser Umstand spricht für eine Kopplung von Antibiotikaproduktion und Sporulation (Hopwood, 1988).

1.7 Zielsetzung der Arbeit

Ausgangspunkt der Arbeit sind Untersuchungen zur Substratspezifität der Adenylierungs- Domänen aus F. scirpi und F. sambucinum. Um weitere Struktur- und Funktionsuntersuchungen durchführen zu können, war es notwendig ein geeignetes Expressionssystem zu etablieren. Versuche, Teile des Peptidsynthetasegens in E. coli (Haese et al., 1994; Hacker et al., 2000) und P. pastoris (Haese, A. persönl. Mitteilungen) zu exprimieren, erwiesen sich, auf Grund der schlechten Löslichkeit der resultierenden Proteine und damit verbundenen Problemen bei der Funktionalität, als ungeeignet, um das Gesamtgen zu exprimieren. Die Expression des Gesamtsgen eröffnet Möglichkeiten für die gezielte Mutationsanalyse, mit deren Hilfe funktionale Zusammenhänge aufgeklärt werden können.

Während der letzten Jahre haben Streptomyceten als potentieller Host für die heterologe Expression verbreitet Anwendung gefunden. Für verschiedene Streptomyceten Sekretions-/

Expressionssysteme wurde die Proteinproduktion prokaryontischen und eukaryontischen Ursprungs beschrieben (zur Übersicht, Baltz 1990; Engels et al., 1992). Ausgehend von den zu erwartenden Ergebnissen sollte das bestehende Modell des esyn1 Gens verfeinert werden.

2 Materialien

2.1 Mikroorganismen

E. coli XL 1-Blue (Bullock et al., 1987) E. coli DH5α (Hanahan, 1983)

E. coli ET12567 (Flett et al., 1997)

E. coli M15[pRep4] (Zamenhof et al., 1972)

Fusarium scirpi J5 ETH 1536, Habitat: Weideland-Boden (ETH Zürich) Fusarium sambucinum BBA 63933, Habitat: Weizen (BBA Berlin)

Streptomyces lividans TK 64 (AG Keller, TU Berlin) Streptomyces tsusimaensis (AG Keller, TU Berlin)

2.2 Vektoren, Primer und Peptide

pBluesscript SK/ KS (Stratagene, Amsterdam) pIJ702 (Katz et al., 1983)

pTZ18R (Mead et al., 1988)

PCR 2.1^® TOPO (Invitrogen, Niederland)

Sequenzierungsprimer:

Reverse Primer (16mer) 5^’-AAC AGC TAT GAC CAT (Stratagene, Amsterdam)

M13-1Primer (17mer) 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT (Stratagene, Amsterdam) AD SEA5 (18mer) 5’-CTG AAC AGT CAG TGT CAG (MWG-Biotech, Ebersberg)

AD SEA3 (18mer) 5’-CTG ACA CTG ACT GTT CAG (MWG-Biotech, Ebersberg)