5.2 Untersuchungen zur Substratspezifität von Peptidsynthetasen
5.2.3 Sequenzvergleich mit anderen Adenylierungs-Domänen
Betrachtet man das Alignment aus Abbildung 15 eingehender, fällt auf, dass in 31 Einzelpositionen Unterschiede in der Aminosäuresequenz der Adenylierungs-Domänen der beiden Fusarien auftreten. Ein Sequenzvergleich mit Valin bzw. Leucin/Isoleucin aktivierenden Domänen soll Auskunft über mögliche konservierte Positionen geben.
5.2.3.1 Sequenzvergleich mit Valin-aktivierenden Adenylierungs-Domänen
Um die 31 Einzelpositionen, in denen sich die Adenylierungs-Domänen von F. scirpi und F.
sambucinum unterscheiden, auf eventuelle Homologien zu untersuchen, wurde ein Alignment aus 9 aktivierenden Adenylierungs-Domänen (siehe Anhang A3) erstellt. Die Valin-aktivierende Domänen aus F. scirpi wurde mit den entsprechenden Domänen aus Cyclosporinsynthetase aus T. inflatum (Domänen 4 [64% Identität zur Valin-aktivierenden Domäne aus F. scirpi] und 9 [62%]) (Weber et al., 1994), ACV-Synthetase aus P.
1E-5 1E-4 1E-3 0.01 0.1 1
Prozent Aktivität bezogen auf Esyn
Konzentration Peptid LVVT in mg/ml
Esyn PeptidLVVT
Abbildung 17: Reaktion des mAB21.1 mit Enniatinsynthetase aus F. scirpi in Anwesenheit des Peptids LVVT. Die kleine Abbildung zeigt die Sättigungskurve des monoklonalen Antikörpers bei einer Entwicklungszeit von 15 min. Die Auswahl der Entwicklungszeit erfolgt durch Aufnahme einer Zeitkurve bei verschiedenen Verdünnungen (Daten siehe Anhang).
1x10-5 1x10-4 10-3
chrysogenum (Domäne 3 [32%]) (Smith et al., 1990), Fengycinsynthetase aus Bacillus subtilis (fenE Domäne 2 [44%]) (Lin et al., 1998), Gramicidinsynthetase aus Bacillus brevis (grsB Domäne 2 [42%]) (Turgay et al., 1992, Krätzschmar et al., 1989), Lichenysin D-Synthetase aus Bacillus licheniformis (licB Domäne 1 [43%]) (Konz et al., 1998), Surfactinsynthetase aus Bacillus subtilis (srfb Domäne 1 [45%]) (Cosima et al., 1993) und Tyrocidinsynthetase aus Bacillus brevis (tycC Domäne 4 [43%]) (Mittenhuber et al., 1989) verglichen. Das Alignment verdeutlicht, dass die Positionen 23, 50, 115, 124, 185, 219, 354, 356, 368, 369, 373, 387 und 391 sehr variable Bereiche sind und damit nicht für die Substraterkennungsstelle in Betracht kommen. Position 198 stimmt mit einer von Stachelhaus (Stachelhaus et al., 1999) postulierten Position überein, die weiter unten besprochen werden sollen. Position 10 befindet sich in Motiv A2 (Konz et al., 1999), wobei sowohl die Valindomäne der Enniatinsynthetase aus F. scirpi, die Leucindomäne der ESYN aus F. sambucinum und die Valindomäne (Domäne 4) der Cyclosporinsynthetase aus T. inflatum nicht das typische Glycin an dieser Stelle aufweisen. In Position 249 ist in fast allen miteinander verglichenen Domänen ein Prolin konserviert, Ausnahmen finden sich in fenE Domäne 2, ACVS Domäne 2 aus C.
acremonium (Hoskins et al.,1990; Gutierrez et al., 1991), aus A. nidulans (Maccabe et al., 1991), aus P. chrysogenum (Smith et al., 1990; Diez et al., 1990) und aus S. clavuligerus (Tobin et al., 1991; Yu et al., 1994), die alle einen Serinrest an dieser Position aufweisen.
Weitere Ausnahmen (Anhang A4) finden sich in der ACVS Domäne 3 aus N. lactamdurans (Coque et al., 1991) (Threonin), in HTS1 Domäne 3 aus C. carbonum (Scott-Craig et al., 1992) (Asparagin) und in der Leucindomäne der ESYN aus F. sambucinum (Glutamin). In Position 289 ist ein Asparagin, Histidin bzw. ein Lysin konserviert. Position 311 liegt in Core A7 (Konz et al., 1999), an dieser Stelle sind Arginin bzw. Lysin konserviert, in der A-Domäne von F. sambucinum befindet sich an dieser Stelle ein Glycin. Für Position 128 könnte in dem Alignment (Anhang A3) der Eindruck entstehen, dass an dieser Stelle mit Ausnahme der Valindomäne aus F. scirpi eine der Aminosäuren Leucin, Isoleucin bzw. Valin konserviert ist, betrachtet man das umfangreichere Alignment (Anhang A4), welches mit dem Programm PredictProtein (Rost, 1996) erstellt wurde, ergibt sich folgende Variabilität in dieser Position (Tabelle 5).
aktivierte Aminosäure Gefundene Aminosäuren in Position 128
Valin (P/T); (L/I/V); (Y) Leucin/Isoleucin (F/Y); (A); (L)
Serin (V); (C) Phenylalanin (M/I/L); (F) Glutaminsäure (F/Y)
Lysin (F)
Prolin (C/N); (I) Cystein (Y); (L)
Alanin (L); (P); (F) Glycin (L/V); (Y) Ornithin (F); (M) Asparaginsäure (Y); (I)
Threonin (Y)
Tabelle 5 Übersicht der in Position 128 (bezogen auf F. sambucinum) gefundenen Aminosäuren in Relation zur aktivierten Aminosäure. Die Bewertung der Austausche erfolgt unter Beachtung der Festlegung für konservative Austausche nach Tokita et al. 1993. Es wurden nur Aminosäuren berücksichtigt, von denen mehr als zwei Domänen verglichen werden konnten.
Aus der Tabelle wird deutlich, dass keine Aussage über die aktivierte Aminosäure getroffen werden kann. Lediglich für Threonin und Lysin wurde in dieser Position nur eine Aminosäure gefunden, für alle anderen Fälle ergeben sich immer mehrere Möglichkeiten.
Interessanterweise sind für die meisten aktivierten Aminosäuren an dieser Position Aminosäuren mit hydrophober Seitenkette bzw. aromatische Aminosäuren anzutreffen. Für die Positionen 134, 138, 154, 172, 175, 210, 214, 237, 252, 269, 307, 341, 374 und 398 lassen sich keine Gesetzmäßigkeiten für die Substratspezifität ableiten.
5.2.3.2 Vergleich mit in der Literatur vorgestellten Modellen
Husi et al. (1997) analysierten durch Sequenzanalysen der 11 Module der Cyclosporinsynthetase aus T. inflatum und ihren Vergleich mit den Röntgenstrukturdaten aus Leuchtkäfer-Luciferase aus Photinus pyralis eine mögliche substratspezifische Tasche in der A-Domäne (Conti et al., 1996). Drei Aminosäurepositionen, die sich zwischen Core A3 und
A5 (Konz et al., 1999) befinden, repräsentieren den „Triplett-Code“, der eine bedeutende Rolle in der Substraterkennung haben soll (Husi et al., 1997).
Die Kristallstruktur von PheA (Phenylalanin aktivierende Domäne der Gramicidinsynthetase aus B. brevis) wurde in Anwesenheit von L-Phenylalanin und AMP ermittelt. Aus der darausfolgenden Strukturaufklärung ergab sich, dass jeder Domäne des Enzyms eine Struktur der Luciferase aus Photinus pyralis zuordnen ist (Conti et al., 1997). Dieser Umstand gewinnt besonders an Bedeutung, wenn man die geringe Sequenzidentität von 16% auf Aminosäureebene dazu in Relation setzt. Davon ausgehend haben Stachelhaus et al., die postulierte Bindungstasche mit 160 anderen A-Domänen verglichen. Gefunden wurden dabei 10 Aminosäurepositionen, die für die Bildung der Tasche von Bedeutung sind. 9 der 10 Aminosäuren befinden sich innerhalb einer Sequenz von 100 Aminosäuren, die zwischen den hochkonservierten Cores A4 und A5 liegt (die fehlende Position ist das hochkonservierte
517Lys aus Core A10) (Stachelhaus et al., 1999) (Anhang 5).
Abbildung 18 zeigt den Aminosäuresequenzvergleich eines Teils von PheA (A-Domäne Position 183 von Motiv A3 bis Position 517) mit ESYNs aus F. sambucinum und F. scirpi und den A-Domänen 2 (aktiviert L-Leucin) und 9 (aktiviert L-Valin) aus CYSYN.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Motive AI und AII der A-Domänen aus Enniatinsynthetase nicht mit den vorgeschlagenen Selektivitätselementen von Stachelhaus et al. und Husi et al.
übereinstimmen.
Abbildung 18: Sequenzvergleich der Domänen PheA, CYSYN dm2 (Leu), CYSYN dm 9 (Val), ESYNsamb (Leu), ESYNscir2 (Val) und ESYNscir1 (Hiv) in einem Bereich von Position 185- 523 (bezogen auf PheA).
Die mit Großbuchstaben bezeichneten Positionen entsprechen dem „Triplett-Code“ nach Husi et al., 1996.
Die mit Motiv AI- AIII bezeichneten Motive entsprechen den in dieser Arbeit gefundenen Positionen. Mit Pfeilen gekennzeichneten Aminosäuren entsprechen den 10 Positionen nach Stachelhaus et al., 1999.
Tabelle 6 zeigt die Aminosäurepositionen des substratspezifischen Codes für L-Leucin und L-Valin (Stachelhaus et al., 1999) im Vergleich zu den korrespondierenden Positionen der ESYNs aus F. sambucinum and F. scirpi.
Position
aktivierte Aminosäure
235 236 239 278 299 301 322 330 331 517 Ursprung
Phe D A W T I A A V C K PheA
Ile-1 D G F F L G V V Y K BacA, BacC, LicC, LchAC
Ile-2 D A F F Y G I T F K FenB, PPS5
Leu-1 D A W F L G N V V K BacA, LicA, LchAA, LicB, LchAB, SrfAA, SrfAB
Leu-2 D A W L Y G A V M K CssA
Leu-3 D G A Y T G E V V K GrsB, TycC
Leu-4 D A F M L G M V F K LicA, LchAA, SrfAA
Val-1 D A F W I G G T F K GrsB, FenE, LicB, LchAB, PPS3, SrfAB, TycC
Val-2 D F E S T A A V Y K AcvA
Val-3 D A W M F A A V L K CssA
Val D Â W F I G I I I K ESYNscir
Leu, Ile D A W F A G V M I K ESYNsamb
Hiv - A L F - G G S I K ESYNscir (Hiv)
Tabelle 6 Aminosäurepositionen des substratspezifischen Codes für L-Leucin und L-Valin (Stachelhaus et al., 1999) im Vergleich zu den korrespondierenden Positionen der ESYN aus F. sambucinum and F. scirpi.
Die ESYNs aus F. scirpi und F. sambucinum unterscheiden sich bezüglich des Codes in den Positionen 299, 322 und 330 (PheA Nummerierung). In der vorgeschlagenen Aminosäurebindungstasche der ESYN aus F. scirpi sind in den Positionen 299Ile und 322Ile größere Aminosäurereste lokalisiert, als in den analogen Positionen der ESYN aus F.
sambucinum (299Ala und 322Val) (Abbildung 19).
F. scirpi
Abbildung 19: Angenommene Bindungstaschen für die ESYN aus den beiden Fusarien unter Berücksichtigung der Aminosäurereste, die sich an den putativen Bindungsstellen befinden (nach Challis et al., 2000).
Diese Tatsache stimmt mit den kinetischen Konstanten der beiden ESYN-Enzyme überein, die in Tabelle 3 (siehe Einleitung) zusammengefasst sind. Interessanterweise ergeben phylogenetische Untersuchungen (Konz et al., 1999) ein davon verschiedenes Bild. Die ESYN aus F. scirpi ist in einer Gruppe von Threonin- und Serinaktivierenden Domänen verschiedenen Ursprungs geclustert (Stachelhauset al., 1999). Ausgehend von der Röntgenstruktur von PheA entwickelten Challis et al. ein auf Sequenzaussagen basierendes Modell zur Vorhersage der aktivierten Aminosäure in Peptidsynthetasen (Challis et al., 2000).
Eine Online-Analyse (http://raynam.chm.jhu.edu/~nrps/) dieser Methode wurde auf die beiden Enzyme angewandt. Für die A-Domäne aus EB der ESYNs aus F. sambucinum und F.
scirpi wird als aktivierte Aminosäure L-Valin vorhergesagt, im Gegensatz zu der von der ESYN aus F. sambucinum aktivierten Aminosäure L-Leucin bzw. L-Isoleucin (Tabelle 3, siehe Einleitung). Für die A-Domäne aus EA der ESYN aus F.scirpi wird als aktivierte
Aminosäure Cystein vorhergesagt, obwohl das Enzym D-Hydoxyisovaleriansäure aktiviert.
Allerdings stützt sich diese Aussage nur auf zwei Homologie aufweisende Enzyme, die noch nicht ausreichend untersucht sind. Die Identität der 8 ausgewählten Aminosäuren für die putative Bindungstasche beträgt jeweils 50% zur Dihydroaeruginsäure-Synthetase aus Pseudomonas aeruginosa (Reimmann et al., 1998) und einer putativen Peptidsynthetase aus Streptomyces coelicolor (Redenbach et al., 1996).