Adenylierungs-Domäne

Eine Übersicht über die hoch konservierten Sequenzmotive einer Aktivierungsdomäne, die als

„Core-Motive“ (Marahiel, 1992) bezeichnet werden, einschließlich der Funktion ist in Tabelle 1 gezeigt.

Core Motiv Aminosäure-Sequenz Funktion

A1 L(TS)YxEL

A2(Core1) LKAGAxAYL(VL)P(LI)D unbekannt A3(Core2) LAYxxYTSG(ST)TGxPKG ATP-Bindung

A4 FDxS A5 NxYGPTE

A6(Core3) GELxIxGxG(VL)ARGYL ATP-Bindung A7(Core4) Y(RK)TGDL ATPase-Motiv A8(Core5) GRxDxQVKIRGxRIELGEIE ATP-Bindung

A9 LpxYM(IV)P A10 NGK(VL)DR

T(Core6) DxFFxxLGG(HD)S(LI) 4’-Phosphopantethein-Bindung

Tabelle 1 Konsensussequenzen der Core Motive aus Adenylierungs-Domänen nach Konz et al., 1999 und deren zugeordnete Funktionen (Gocht et al., 1994; Zuber et al., 1997; Schlumbohm et al., 1991; Stein et al., 1994; Pavela-Vrancic et al., 1994a/b).

Die Adenylierungs-Domänen A (etwa 420 Aminosäuren) in EA und EB weisen zueinander eine Ähnlichkeit von 39,5% und eine Identität von 25% auf. EA und EB zeigen außerdem Homologien zu allen A-Domänen anderer Peptidsynthetasen wie den ACV-Synthetasen (AcvA) aus Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans und Cephalosporium

acremonium, den Gramicidinsynthetasen A und B (GrsA/ GrsB), der Tyrocidinsynthetase A (TycA) aus Bacillus brevis und der HC-Toxinsynthetase aus Cochliobolus carbonum (Übersicht in Stachelhaus & Marahiel, 1995 c; Konz et al., 1999). Bei einem Vergleich der Domänen von 8 Peptidsynthetasen mit den Proteinsequenzen von 9 adenylierenden Enzymen (Turgay et al., 1992) konnte gezeigt werden, dass diese einer verkürzten Peptidsynthetase-Domäne entsprechen, der das zur Thioesterbindung des Substrates notwendige Core 6 fehlt.

Abbildung 4 zeigt den schematischen Vergleich zwischen Peptidsynthetase-Domäne und adenylierendem Enzym.

Abbildung 4: Schematischer Strukturvergleich der Peptidsynthetase-Domäne mit der Domäne des adenylatbildenden Enzyms. Die konservierten Motive von Peptidsynthetasen sind in der Abbildung vermerkt. Im Fall von geringer Konserviertheit sind diese Aminosäuren in Klammern gesetzt bzw. deren Position in der Abbildung weiß unterlegt (modifiziert nach Turgay et al., 1992).

Es wurden bereits eine Reihe adenylierender Enzyme sequenziert, wie die 2,3-Dihydroxybenzoesäure-AMP-Ligase aus der Enterobactin Biosynthese von E. coli (Staab et al., 1989; Rusnak et al., 1991), die dazu analoge 2,3–Dihydroxybenzoesäure-AMP-Ligase aus B. subtilis (Albertini et al., 1995), 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase aus der Pristinamycin I Biosynthese aus S. pristinaespiralis (de Crecy-Lagard et al., 1997a), die Luciferase aus dem Leuchtkäfer (Photinus pyralis) (de Went et al., 1987), die 4-Coumarat-Coenzym-A-Ligase höherer Pflanzen z. B. aus Petroselinum crispum (Loyoza et al., 1988), die Coenzym-A (CoA)-Synthasen der längerkettigen Fettsäuresynthese z. B. aus Rattus norvegicus (Suzuki et al., 1991) und Acetyl-CoA-Ligasen aus A. nidulans und N. crassa (Connerton et al., 1990).

100

0 200 300 400 500 600

Aminosäuren

Core Motiv 1 2 3 4 5 6

Core Sequenz: KAGGA SGTTGxPKGGELCIGG

TGD KIRGx

Durch die Auswertung der Kristallstruktur von 2 adenylatbildenden Enzymen, Luciferase aus Photinus pyralis (Conti et al., 1996) und Gramicidinsynthetase A (GrsA) aus Bacillus brevis (Conti et al., 1997), konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme eine Faltung aufweisen, die unterschiedlich zu der von Klasse I und II Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen ist. Die beiden adenylatbildenden Enzyme haben mit 16% nur eine geringe Homologie der Sequenz , die Topologie der dreidimensionalen Struktur dagegen, zeigt eine große Übereinstimmung.

Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmung von 30-60% der Peptidsynthetase-Domänen untereinander, kann man davon ausgehen, dass die Struktur von GrsA eine Prototyp für die Adenylierungs-Domänen darstellt (Conti et al,. 1997).

Monoklonale Antikörper die gegen das Multienzym ESYN gerichtet sind, wurden zur Charakterisierung der katalytischen Einheiten des Enzyms genutzt (Billich et al., 1987). Die Antikörper lassen sich auf Grund ihres Einflusses auf die katalytische Funktion in drei Gruppen unterteilen. Mitglieder der Gruppe eins inhibieren die L-Valin-Thioester-Bildung, während Gruppe zwei die Bildung des D-Hiv–Thioesters verhindert. Die Antikörper der dritten Gruppe blockieren die Bildung von beiden Thioestern und des weiteren die N-Methylierung des gebundenen Valins. Keiner der Antikörper beeinflusst die Aktivierung von L-Valin und D-Hiv als Adenylat. Die Ergebnissen zeigen, dass es zwei voneinander abgegrenzte, aber benachbarte katalytische Zentren für die Thioesterbildung gibt, während die Adenylierungszentren anscheinend räumlich voneinander entfernt sind (Billich et al., 1987).

Die Überexpression von verschiedenen Bereichen des esyn1 Gens in Escherichia coli und die funktionelle Charakterisierung der gereinigten rekombinanten Proteine zeigte, dass das Modul EA die D-Hydroxyisovaleriansäure adenylieren kann. Das Modul EB ist dagegen für die Adenylierung von L-Valin verantwortlich (Haese et al., 1993/1994). Diese Ergebnisse wurden durch Untersuchungen von Substrat-markierten proteolytischen Fragmenten der ESYN bestätigt (Pieper et al., 1995).

1.4.2 N-Methyltransferase

Die Struktur von Modul EB unterscheidet sich von EA durch einen Einschub von 434 Aminosäuren (M siehe Abb. 3). Ein Glycin-reiches Motiv (Motiv I: VLEIGxGxGxx), das in vielen Methyltransferasen konserviert ist (Kagan et al., 1994; Malone et al., 1995), wird auch in N-Methyltransferase-Domänen aus Peptidsynthetasen gefunden (Haese et al., 1993;

Burmester et al., 1995; Hacker et al., 2000). Struktur-Sequenz–Alignments von

N-Methyltransferase-Domänen aus Peptidsynthetasen mit Methyltransferasen zeigen weitere Homologien (Kagan et al., 1994; Schluckebier et al., 1995; Posfai et al., 1989). Das Motiv II aus DNA-Methyltransferasen wird ebenfalls in N-Methyltransferase-Domänen aus Peptidsynthetasen (hier als Motiv II/Y bezeichnet) gefunden. Diese Motiv ist wahrscheinlich in die AdoMet-Bindung involviert (Pieper et al., 1995; Hacker et al., 2000). Die Motive I / II und IV finden sich in jedem Typ Methyltransferase in einer gleichen räumlichen Anordnung zueinander. Die hochkonservierte Sequenz NSVV/AQYFPxxxYL (korrespondierende Position in Enniatinsynthetase aus F. scirpi 2159-2171) befindet sich in allen N-Methyltransferasen aus Peptidsynthetasen C-terminal von Motiv II. Diese Sequenz entspricht Motiv IV der DNA-Methyltransferase-Nomenklatur, welches homolog zu Motiv II von Kagan und Clark ist (Kagan et al., 1994; Malone et al., 1995; Posfai et al., 1989).

Downstream von Motiv IV befindet sich die Sequenz ²¹⁹⁴ ATNGHFLAAR, welche Homologien zu Motiv V aus γ-DNA-Methyltransferasen, z. B. M.TaqI (Malone et al., 1995) zeigt. In diesem Motiv findet sich ein Phenylalanin, welches in N-Methyltransferasen aus Peptidsynthetasen streng konserviert ist. Für eine weitere Charakterisierung der Methyltransferase aus Enniatinsynthetase wurden 7 Deletionsvarianten konstruiert. Die korrespondierenden Proteine wurden exprimiert, partiell gereinigt und nach Renaturierung auf ihre AdoMet-Bindungsfähigkeit getestet. Die Bindungsstudien zeigten, dass 21 Aminosäuren vom N-Terminus deletiert werden können, ohne dass die Bindungsfähigkeit verloren geht.

Wird dagegen ein Teil von 38 Aminosäuren am C-Terminus deletiert oder werden interne Sequenzen deletiert, geht die AdoMet-Bindungsfähigkeit deutlich zurück (Hacker et al., 2000). Das hochkonservierte Asn in Motiv IV findet sich auch in anderen Methyltransferasen, wie der M.TaqI und Glycin-N-Methyltransferase aus Ratte (Labahn et al., 1994; Schluckebier et al., 1997; Ogawa et al., 1987). Cheng et al., 1993 postulierte, dass die Seitenkette des Asn als Donor für die Wasserstoffbrücke zum Target Adenin agiert und damit einen direkten Transfer der aktivierten Methylgruppe ermöglicht. Die Deletionsvariante pM7, welche eine interne Deletion am C-Terminus ist, führt ebenfalls zum Verlust der Bindungsfähigkeit.

Hacker et al. (2000) schließen daraus, dass für die AdoMet-Bindung Strukturelemente downstream von Motiv V benötigt werden. Die Methyltransferase-Funktion der ESYN wurde durch Untersuchungen rekombinanter Proteine und S-[Methyl¹⁴C]-Adenosyl-L-Methionin markierter proteolytischer ESYN-Fragmente in diesem Einschub lokalisiert. Von Pieper et al.

(1995) wurde ein S-[Methyl¹⁴C]-Adenosyl-L-Methionin markiertes Nonapeptid (Position 2098-2106 von ESYN) isoliert, das einen Tyrosin-Rest enthält. Dieses Tyrosin-haltige Motiv ist auch in den Methyltransferase-Domänen anderer Peptidsynthetasen konserviert. Takata et

al. konnten diesen Rest auch in Guanidinumacetat-Methyltransferase aus Ratte nachweisen.

Das ¹³⁶Tyr befindet sich 66 Aminosäuren C-terminal von einer konservierten Sequenz (LD/EV/L/IGxGxG), die hohe Homologien zu Motiv I aufweist (Takata et al., 1992). Mit Punktmutationen wurde das Tyrosin in Alanin, Valin, Serin und Phenylalanin überführt. Die Mutationen mit aliphatischen Seitenketten zeigen eine deutlich eingeschränkte Bindungskapazität (19-28% des Wildtyps), während die Phenylalaninmutante noch 70% der Wildtypaktivität aufweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Tyrosin eine wichtige Rolle in der AdoMet-Bindung bzw. in der korrekten Proteinfaltung einnimmt (Hacker et al., 2000).

Sequenzinformationen verschiedener N-Methyltransferasendomänen aus Peptidsynthetasen eukaryontischen und prokaryontischen Ursprungs sind heute zugänglich. Burmester et al.

konnten ein 1535 bp großes PCR-Fragment aus F. sambucinum BBA 63933 unter Nutzung degenerierter Primer, abgeleitet von konservierten Sequenzen aus dem esyn1 Gen aus Fusarium scirpi (¹⁹⁵⁵QFKIRGNR und ²⁴⁵⁷VPSYMVP), amplifizieren. Die angegebenen Sequenzen sind Teil der angrenzenden konservierten Domäne, welche die Methyltransferase flankieren. Die Nucleotidsequenz des klonierten PCR-Fragments hat eine Identität von 88,5%

zum korrespondierenden Teil von esyn1 aus F. scirpi. Die Identität der abgeleiteten Aminosäuresequenz beträgt 91% (Burmester et al., 1995).

Während der Synthese des Cyclosporins, ein Undekapeptid, werden sieben Aminosäuren methyliert. In der, aus dem SimA Gen, welches die Cyclosporinsynthetase (CYSYN) kodiert, abgeleitete Aminosäuresequenz aus Tolypocladium inflatum (Weber et al, 1994) findet man in sieben Domänen einen Bereich von 430 Aminosäuren, der eine Identität von 47-52% zu der N-Methyltransferase-Domäne von ESYN aufweist. Phylogenetisch bilden diese N-Methyltransferasen eine Gruppe. Eine zweite Gruppe (prokaryontischer Ursprung) beinhaltet die N-Methyltransferasen verschiedener Streptomyces und Microcystis spp.

(Schauwecker et al., 2000; de Crecy-Lagard et al., 1997a/b; Nishizawa et al., 1999). Die N-Methyltransferasen der verschiedenden Streptomyceten besitzen 38-68% Identität zueinander. N-Methyltransferasen aus Mycrocystis spp. und den verschiedenen Streptomyceten zeigen 27-30% Sequenzhomologie (Hacker et al., 2000).