Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien in aktivierte Oozyten beim Schwein

der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Braunschweig

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien

in aktivierte Oozyten beim Schwein

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Sabine Probst aus Bad Gandersheim

Hannover 2001

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. D. Rath

1. Gutachter: Prof. Dr. D. Rath

2. Gutachter: Prof. Dr. D. Waberski

Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2001

Meinen Eltern

in liebevoller Dankbarkeit

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 9

2 SCHRIFTTUM 11

2.1 Oozytenreifung 11

2.1.1 In-vivo-Reifung 11

2.1.2 In-vitro-Reifung 12

2.2 Befruchtung und Aktivierung 14

2.2.1 Physiologie der Befruchtung 14

2.2.2 Aktivierung und parthenogenetische Entwicklung der Oozyte 15

2.2.2.1 Grundlagen der Oozytenaktivierung 15

2.2.2.2 Parthenogenese 18

2.2.2.3 Methoden der artifiziellen Aktivierung gereifter Säugeroozyten 19

2.2.3 In-vitro-Fertilisation (IVF) 26

2.2.4 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) 27

2.2.4.1 Grundlagen 27

2.2.4.2 ICSI-Technik 28

2.2.4.3 Einsatz der ICSI bei verschiedenen Haustierspezies 31

2.2.4.4 Artifizielle Aktivierung von Oozyten zur ICSI bei verschiedenen Haustierspezies 32

2.3 Embryonalentwicklung 36

2.3.1 Entwicklung nach IVF 36

2.3.2 Entwicklung nach ICSI 36

2.3.3 Entwicklung porziner Oozyten nach parthenogenetischer Aktivierung 41

2.4 Erzeugung von Nachkommen mit vorherbestimmtem Geschlecht 43

2.4.1 Geschlechtsspezifische Trennung von Spermien mittels Flowzytometrie 43

2.4.2 Einsatz von gesexten Spermien bei IVF und ICSI 46

3 MATERIAL UND METHODEN 48

3.1 In-vitro-Maturation (IVM) porziner Oozyten 49

3.1.1 Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe 49

3.1.2 In vitro Maturation porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU 37 50

3.1.3 Denudierung und Vorbereitung der in vitro gereiften Oozyten für ICSI 50

3.1.4 Bestimmung der Maturationsrate 51 3.2 In-vivo-Maturation porziner Oozyten 51

3.2.1 Versuchstiere 51

3.2.2 Gewinnung in vivo gereifter porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe 52 3.2.3 Denudierung und Vorbereitung der in vivo gereiften Oozyten für ICSI 52 3.3 Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe 53 3.4 Gewinnung und Aufbereitung der verwendeten Spermien 53

3.4.1 Nebenhodenschwanzspermien 53

3.4.2 Flüssigkonservierte Spermien 54

3.4.3 Flowzytometrisch sortierte, flüssigkonservierte Spermien 54 3.5 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) 55

3.5.1 Mikroinjektionsausstattung 55

3.5.2 Durchführung der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion 59 3.6 Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI 62

3.6.1 Aktivierung durch CaCl2-Injektion 62

3.6.2 Aktivierung durch Ca²⁺-Ionophor 63

3.6.3 Aktivierung durch elektrischen Puls 64

3.7 In-vitro-Kultur 65

3.8 Beurteilung der Entwicklungsraten in vitro kultivierter Embryonen

nach ICSI 65

3.8.1 Beurteilung anhand der Vorkernstadien nach 20 und 48 Stunden 65 3.8.2 Beurteilung der Teilungsrate nach 48 Stunden 67 3.8.3 Beurteilung anhand der Zellkernzahlen nach 168 Stunden 67 3.8 Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit der ICSI-Embryonen

durch Embryotransfer 68

3.9.1 Empfängertiere 68

3.9.2 Transfer von Embryonen im Zwei- bis Vier-Zell-Stadium 68 3.9.3 Transfer von Embryonen im Zygotenstadium 69

3.10 Statistische Auswertung 70

4 ERGEBNISSE 71

4.1 Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI 71

4.1.1 Aktivierung durch CaCl₂-Injektion 71

4.1.2 Aktivierung durch Ca²⁺-Ionophor 74

4.1.3 Aktivierung durch elektrischen Puls 77 4.1.4 Vergleich der Aktivierungs- und Befruchtungs- bzw. Parthenogenese-

raten nach Aktivierung durch CaCl₂, Ca²⁺-Ionophor oder elektrischen Puls 80 4.2 Einsatz von flüssigkonservierten, ungesexten und gesexten Spermien

zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit und ohne CaCl₂-

Aktivierung 83

4.2.1 Entwicklungsraten 48 Stunden nach ICSI 83

4.2.1.1 Teilungsrate 83

4.2.1.2 Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate 84 4.2.2 Entwicklungsraten 168 Stunden nach ICSI 87 4.3 Überprüfung der Entwicklungsfähigkeit spermieninjizierter

Oozyten durch Embryotransfer 91 4.3.1 Transfer von Embryonen aus in vitro gereiften, mit ungesexten Spermien

injizierten und mit CaCl₂ aktivierten Oozyten 91 4.3.2 Transfer von Embryonen aus in vivo gereiften, mit sortierten, y-chromoso-

malen Spermien injizierten und mit CaCl₂ aktivierten Oozyten 93

5 DISKUSSION 96

5.1. Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur intrazytoplasmatischen

Spermieninjektion 97

5.2. Einsatz von sortierten und unsortierten Spermien beim Einsatz

zur ICSI mit und ohne CaCl₂-Aktivierung 102 5.3 Überprüfung der Vitalität mit ICSI erstellter Embryonen durch

Embryotransfer 105

5.4 Schlussfolgerungen 107

6 ZUSAMMENFASSUNG 108

7 SUMMARY 111

8 LITERATURVERZEICHNIS 114

9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 144

10 ANHANG 147 10.1 Zusammensetzung der verwendeten Medien 147

10.1.1 Kulturmedien 147

10.1.2 Paraformaldehyd-Triton X-100-Lösung 148

10.1.3 Mounting Medium 148

10.1.4 Lacmoid-Färbelösung 148

10.1.5 Medium zur elektrischen Aktivierung 149

10.1.6 Hoechst 33342-Farbstofflösung 149

10.1.7 2 %-TEST-Eidotter-Lösung 149

10.2 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 150

10.2.1 Tabellen 150

10.2.2 Abbildungen 152

1 EINLEITUNG

In der Reproduktionsmedizin wurden in den letzten Jahrzehnten durch die Weiter- und Neuentwicklung verschiedener biotechnischer Verfahren große Fortschritte erzielt. In der Humanmedizin wurde dabei zur Therapie männlicher Sub- und Infertilität eine spezielle Technik der In-vitro-Befruchtung entwickelt, die die Verwendung unreifer, immotiler oder morphologisch abnormaler Spermien zulässt: die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI). Mit Hilfe dieser Technik werden viele Schritte der normalen Befruchtung umgangen, indem ein einzelnes Spermium direkt in das Zytoplasma einer gereiften Oozyte injiziert und diese somit befruchtet wird. Ein einzelnes, normalerweise nicht befruchtungsfähiges Spermium reicht somit zur Befruchtung einer Oozyte aus.

Diese Methode wurde auch in der Tierzucht erfolgreich erprobt (Kaninchen: HOSOI et al.

1988; Rind: GOTO et al. 1990; Schaf: GOMEZ et al. 1998a; Katze: POPE et al. 1998; Pferd:

McKINNON et al. 1998; Schwein: MARTIN 2000). Ein Einsatzgebiet der ICSI-Technik ist dabei beispielsweise die Erhaltung bedrohter Tierarten, bei denen nur unzureichende Samenmengen mit zum Teil schlechter Qualität zur Verfügung stehen bzw. kein Konservierungsverfahren verfügbar ist (CATT 1996; IRITANI et al. 1998; POPE et al. 1998).

Des weiteren stehen die Anwendungen der ICSI im Zusammenhang mit neueren Biotechniken zur Debatte. Es besteht z. B. die Möglichkeit, ICSI zur Produktion transgener Schweine einzusetzen (LAVITRANO et al. 1999; PERRY et al. 1999a; KIM und SHIM 2000).

Interessant ist auch die Anwendung der ICSI im Zusammenhang mit dem Einsatz flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierten Spermas, das z. B. für das Schwein noch nicht in ausreichenden Mengen für normale Besamungen produziert werden kann (JOHNSON 2000). Der Einsatz sortierter Spermien in der In-vitro-Befruchtung ist beim Schwein aufgrund hoher Polyspermieraten bisher ebenfalls noch eingeschränkt (RATH et al.

1997, 1999), so dass die ICSI eine gute Alternative bieten würde.

Jedoch befindet sich die ICSI-Technik bei landwirtschaftlichen Nutztieren erst am Anfang der Entwicklung und das Entwicklungspotential spermieninjizierter Oozyten ist noch sehr begrenzt. Eine zusätzliche Aktivierung der Oozyten zur ICSI mit exogenen Stimulantien wäre eine Möglichkeit, die Entwicklungsraten zu verbessern. Dies hat sich beim Rind bereits bewährt (GOTO et al. 1990; GOTO 1993; HAMANO et al. 1999).

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zum einen, eine Methode zur künstlichen Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI zu entwickeln, um die frühembryonalen Entwicklungsraten zu verbessern. Zum anderen sollten porzine Embryonen mit vorherbestimmtem Geschlecht durch ICSI mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien produziert werden. Als Kriterium

des Entwicklungspotentials mittels ICSI erstellter Embryonen sollte der Embryotransfer mit der Geburt von Ferkeln dienen.

2 SCHRIFTTUM 2.1 Oozytenreifung

Als Oozytenreifung werden Entwicklungen der Oozyte bezeichnet, die zwischen dem Diplotänstadium der Prophase der ersten Meiose und der Metaphase der zweiten Meiose stattfinden und sowohl den Zellkern als auch Zytoplasma, Zellorganellen und die der Zona pellucida anheftenden, somatischen Zellen (Cumulus oophorus) betreffen. Sie bilden die Voraussetzung für die erfolgreiche Befruchtung und Aktivierung der Oozyte durch das Spermium und für eine ungestörte frühembryonale Entwicklung (THIBAULT et al. 1987;

SCHNORR 1989; MOOR et al. 1983,1990).

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion beim Schwein ist sowohl für in vivo gereifte als auch für in vitro gereifte Oozyten beschrieben worden (z. B. CATT u. RHODES 1995; KIM et al. 1998b; KLOCKE 1999, KOLBE u. HOLTZ 1999, MARTIN 2000).

Für die Gewinnung in vivo gereifter, porziner Oozyten werden Sauen zur Östrusinduktion hormonell stimuliert, kurz vor der Ovulation geschlachtet und die Oozyten aus den dem Schlachttier entnommenen Ovarfollikeln aspiriert. Als Spendertiere können präpuberale Jungsauen, zyklische Jungsauen oder Altsauen verwendet werden, wobei sich die Verwendung von präpuberalen Jungsauen aufgrund der einfachen Zyklusinduktion bewährt hat (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Bei den Tieren ist in jedem Fall auf Allgemein- und Geschlechtsgesundheit zu achten, um die Qualität der Oozyten durch diese Faktoren nicht zu gefährden.

Zur Östrusinduktion sind verschiedene hormonelle Stimulationsprotokolle entwickelt worden, wobei die Anwendung der verschiedenen Protokolle abhängig von Alter und Zyklusstand der verwendeten Sauen ist (NIEMANN u. MEINECKE 1993; SCHNURRBUSCH u. HÜHN 1994).

Um die Ausbeute an gereiften Oozyten zu maximieren, werden die Tiere superovuliert. Der Einsatz von PMSG (Pregnant mare´s serum Gonadotropin) in Kombination mit hCG (human Choriogonadotropin) hat sich bei präpuberalen Jungsauen bewährt (RATH u. NIEMANN 1996). Üblich ist dabei z. B. eine einmalige, intramuskuläre Injektion von ca. 1500 I.E.

PMSG, gefolgt von einer intramuskulären Injektion von 500 I.E. hCG 72 Stunden später (NIEMANN u. MEINECKE 1993; RATH 1992). Die Oozytengewinnung durch Schlachtung des Tieres, oder auch durch Laparotomie, erfolgt 38 Stunden später, kurz vor der Ovulation, die ca. 40 Stunden nach hCG-Gabe auftritt (YOSHIDA 1987, 1989; NAGASHIMA et al.

1993).

Verschiedene Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass die Anwendung in vivo gereifter Oozyten bei der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion beim Schwein bisher deutlich bessere Ergebnisse lieferte als in vitro gereifte Oozyten (KOLBE 1998; KLOCKE 1999; MARTIN 2000).

2.1.2 In-vitro-Reifung

Das Problem der In-vitro-Reifung ist, neben der Kernreifung auch eine vollständige zytoplasmatische Reifung zu erreichen (CRAN u. CHENG 1985; MOOR et al. 1990), die sich in der regelrechten Ausbildung des männlichen Vorkerns und der frühembryonalen Entwicklung ausdrückt (DAY 2000).

Unreife Oozyten (primäre Oozyten im Germinal-Vesikel-Stadium (GV-Stadium) (MOOR et GANDOLFI 1987; SCHNORR 1989)) können aus Ovarien präpuberaler Sauen nach der Schlachtung durch Aspiration von 2-5 mm großen Follikeln gewonnen werden. Oozyten aus kleineren Follikeln sind ungeeignet, da diese eine verminderte Kompetenz zur Fortsetzung der Meiose zeigen (CROZET 1989; MOTLIK et al. 1984; ROSENKRANZ u. LIPP 1989). Die Oozyten sollten ein homogenes, fein granuliertes Zytoplasma und mindestens drei kompakte Kumulus-Zellschichten um die Oozyte herum aufweisen (LEIBFRIED und FIRST 1979). Die Notwendigkeit der Anwesenheit einer ausreichenden Anzahl von Kumuluszellen für die Oozytenreifung ist mehrfach beschrieben worden (MOTLIK et al. 1986; MOTLIK u. FULKA 1986; MATTIOLI et al. 1988; MOOR et al. 1990; THOMAS u. SEIDEL 1993).

Als Basismedien für die in vitro Reifung werden beispielsweise Tissue Culture Medium (TCM) 199 (MOTLIK et al. 1986; MATTIOLI et al. 1989; FUNAHASHI u. DAY 1993b;

NAGASHIMA et al. 1993; GRUPEN et al. 1995), Waymouth Medium (KIKUCHI et al. 1995;

COY et al. 1999), North Carolina State University Medium (NCSU) 23 (ABEYDEERA et al.

1998b, 1999a; BOQUEST et al. 1999) oder NCSU 37 (FUNAHASHI et al. 1997; LONG et al.

1999; RATH et al. 1999; PETTERS u. WELLS 1993) und Krebs-Ringer-Bicarbonat-Lösung (KRB) (NAITO et al. 1988; HIRAO et al. 1994) verwendet. Je nach unterschiedlichen Zusätzen und Kulturbedingungen konnten Kernreifungsraten bis zu 100 % (NAGAI u. MOOR 1990) erreicht werden. Der Zusatz der Gonadotropine FSH und LH bzw. deren Analoga PMSG und hCG zum Medium führt zu einer Verbesserung der Oozytenreifung, der Kumulusexpansion und der Spermienpenetration (EPPIG 1979; MEINECKE u. MEINECKE- TILLMANN 1979; MOOR et al. 1980). Die Vorkernbildungsraten werden optimiert, wenn die Hormone sich nur für die ersten 20 Stunden der Reifung im Medium befinden (FUNAHASHI

und DAY 1993a; FUNAHASHI et al. 1994a). Das Gleiche gilt für den Zusatz von db-cAMP (Dibutyryl-cyclic-Adenosin-3`, 5`-Monophosphate) zum Reifungsmedium (FUNAHASHI et al.

1997).

FUNAHASHI und DAY (1993b) fanden bei einem umfassenden Vergleich heraus, dass porzine Follikelflüssigkeit (pFF) als proteinhaltiger Zusatz im Zusammenspiel mit gonadotropen Hormonen sehr gute Reifungsergebnisse erzielt. Dies wurde verschiedentlich bestätigt (CHENG et al. 1997; NAITO et al. 1988; RATH et al. 1995; YOSHIDA et al. 1992).

Einen günstigen Einfluss auf die Kumulusexpansion und damit auf die Oozyten-Maturation haben Wachstumsfaktoren wie beispielsweise der „Epidermal Growth Factor“ (EGF), durch dessen Zusatz auch die embryonale Entwicklung nach IVF verbessert wird (SINGH et al.

1993, 1997; ABEYDEERA et al. 1998a, 1999b).

Glutathion, das während der Reifung synthetisiert wird und als Indikator für die zytoplasmatische Reifung angesehen werden kann (YOSHIDA et al. 1993a), stimuliert den Aminosäuretransport sowie die Proteinsynthese und schützt die Oozyte gegenüber oxidativen Schädigungen (MEISTER 1983; MEISTER u. ANDERSON 1993; TAKAHASHI et al. 1997, YOSHIDA 1993). Durch Reduzierung der Disulfidbrücken in den Protaminen der Spermienköpfe bewirkt es die Dekondensation derselben (MAHI u. YANAGIMACHI 1975) und trägt somit entscheidend zur Ausbildung des männlichen Vorkerns bei. Weil Oozyten Glutathion selbständig aus geeigneten Substraten, z. B. Cystein, synthetisieren können, bewirkt ein Cystein-Zusatz zum Reifungsmedium eine Verbesserung der Entwicklungsrate nach IVF (ABEYDEERA et al. 1999a; YOSHIDA et al. 1993a). Allerdings wird Cystein unter In-vitro-Bedingungen schnell zu Cystin oxidiert (MOHINDRU et al. 1985). Dieses Defizit kann durch Zugabe von β-Merkaptoethanol oder Cysteamin ausgeglichen werden (TAKAHASHI et al.1993; GRUPEN et al. 1995; ABEYDEERA et al. 1998b; BOQUEST et al. 1999).

Der osmotische Druck des Reifungsmediums sollte zwischen 265 und 355 mOsm (optimaler Wert: 285 mOsm) liegen (McGAUGHEY U. VAN BLERKOM 1977; STAIGMILLER 1988).

Der pH-Wert sollte auf 7,2 - 7,4 eingestellt sein (SATO und KOIDE 1987). Als optimales Kulturmilieu für Oozyten gilt eine Temperatur von 38,5-39 °C (ENG et al. 1986; NAITO et al.

1989; YOSHIDA 1987) und eine Gasatmosphäre mit 5 % CO₂ (TSAFIRI u. CHANNING 1975).

Als insgesamt benötigte Reifungsdauer wird ein Zeitraum von mindestens 44 Stunden angesehen, wobei die Kernreifung schon nach 36 Stunden abgeschlossen ist. Dies gilt jedoch nicht für die zytoplasmatische Reifung, soweit dies aus Ergebnissen von IVF- Versuchen geschlossen werden kann (GRUPEN et al. 1996, 1997; PRATHER u. DAY 1998).

2.2 Befruchtung und Aktivierung

Die Befruchtung ist ein komplexer Vorgang, der mit der Imprägnation (aktives Eindringen des Spermiums in die Eizelle) beginnt und mit der Sygamie oder Konjugation (Verschmelzung des männlichen und des weiblichen haploiden Vorkerns zu einem Kern) endet.

Beim Schwein findet die Befruchtung am Übergang der Eileiterampulle zum Isthmus tubae uterinae statt. Die Oozyten gelangen nach der Ovulation über den Fimbrientrichter in den Eileiter und erreichen nach 30-45 Minuten die Eileiterampulle (HUNTER 1991). Ihre optimale Befruchtungsfähigkeit bleibt jedoch nur maximal sechs Stunden bestehen (HUNTER 1991;

SCHNURRBUSCH u. HÜHN 1994). Die ersten Spermien können schon 15 Minuten nach der Konzeption den Eileiter erreichen, was durch das relativ große Spermavolumen des Ebers, die intrauterine Deposition und kranial gerichtete Myometriumskontraktionen gefördert wird (HUNTER 1991). Im Bereich des kaudalen Isthmus tubae uterinae wird jedoch zuerst ein Spermienreservoir gebildet, wobei die Spermien an epithelialen Zellen binden (HUNTER 1991). Die Freisetzung der Spermien erfolgt periovulatorisch aufgrund vom Follikel ausgehender hormoneller Signale (HUNTER 1995).

Die Spermien sollten die Oozyte in einem befruchtungskompetentem Stadium erreichen.

Hierfür muss zunächst die Kapazitation eingeleitet werden (HUNTER u. DZIUK 1968). Die Kapazitation ist durch komplexe biochemische und biophysikalische Umgestaltungsprozesse gekennzeichnet (GADELLA 1996; NIEMANN u. MEINECKE 1993) und ist Voraussetzung für die Akrosomenreaktion (AUSTIN 1951; CHANG 1951), die die Spermien zur Penetration durch die Zona pellucida und zur Gametenfusion befähigt. Bei der Akrosomenreaktion kommt es zur Verschmelzung der Plasmamembran des Spermienkopfes mit der äußeren Akrosomenmembran und der anschließenden Exozytose akrosomaler Enzyme (BARROS et al. 1967; YANAGIMACHI 1988). Nach Durchdringen der Zona erfolgt die Fusion der nebeneinanderliegenden Plasmamembranen von Samenzelle und Oozyte. Aus dem Halsstück der Samenzelle entwickelt sich das Zentriol für die später stattfindende erste Teilung (SCHNORR 1989; YLLERA-FERNANDEZ et al. 1992). Die Gametenfusion führt zu einer Zustandsänderung der Oozyte, die als Aktivierung bezeichnet wird (siehe Kapitel 2.2.2.1). Diese führt zur Fortsetzung der Meiose und somit zur Ausschleusung des zweiten Polkörperchens und der Ausbildung des weiblichen Vorkerns. Demgegenüber steht die Dekondensation des Spermienkopfes mit Ausbildung des männlichen Vorkerns (SCHNORR 1989), wobei ein zytoplasmatischer Faktor der Oozyte der „Male pronucleus growth factor“

(MPGF) eine entscheidende Rolle spielt (KIKUCHI et al. 1995). Die ersten Vorkerne sind

frühestens sechs Stunden nach Besamung bzw. Konzeption zu sehen (HANCOCK 1961;

LAURINCIK et al. 1994). Zur Syngamie wandern beide Vorkerne aufeinander zu und verschmelzen miteinander zur diploiden Zygote. Die erste Furchungsteilung vollzieht sich in Form einer normalen Mitose, und tritt mindestens 21 Stunden nach Konzeption auf (HANCOCK 1961).

2.2.2 Aktivierung und parthenogenetische Entwicklung der Oozyte

2.2.2.1 Grundlagen der Oozytenaktivierung

Die Aktivierung der Oozyte ist die Voraussetzung für die weitere Entwicklung zur Zygote und zum Embryo. Bekannt ist, dass es durch die Fusion von Spermium und Oozyte zu einem initialen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Ionen-Konzentration kommt, in dessen Folge der intrazelluläre Ca²⁺-Gehalt bis zur Bildung der Vorkerne oszilliert (DAY et al. 2000; JONES et al. 1995). Die Ca²⁺-Oszillationen sind wiederum das auslösende Signal für weitere Vorgänge im Rahmen der Oozyten-Aktivierung (OZIL 1990; VITULLO u. OZIL 1992):

⇒ Sie bewirken die Exozytose der kortikalen Granula, die zu einer Modifikation von Oolemm und Zona pellucida führt. Der Inhalt der kortikalen Granula entleert sich dabei in den perivitellinen Raum und es kommt zu physikochemischen und biochemischen Zustandsänderungen der Plasmamembran und zur Aushärtung der Zona pellucida (CRAN u. CHENG 1986), so dass ein Polyspermieblock aufgebaut wird, der das Eindringen weiterer Spermien in die Oozyte verhindert (HUNTER 1991).

⇒ Die Ca²⁺-Oszillationen führen auch zur Fortsetzung der Meiose, so dass der zweite Polkörper ausgeschleust wird und die Vorkerne gebildet werden. Ein hoher Gehalt an aktivem „Maturation Promoting Factor“ (MPF), der für die Oozytenreifung beim Säuger essentiell ist (WU et al. 1997; MOTLIK et al. 1998), erhält die Arretierung in der Metaphase II aufrecht. Durch ein Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau einer der Untereinheiten des MPF, des Cyclin B, bleibt die hohe MPF-Aktivität unter Kontrolle zytostatischer Faktoren bestehen (KUBIAK et al. 1993). Als Folge der Ca²⁺-Oszillationen im Rahmen der Befruchtung kommt es zu einer Störung dieses Gleichgewichtes und die MPF-Aktivität nimmt deutlich ab (FULKA et al. 1992). Somit kann die Blockierung der Meiose überwunden werden und der Zellzyklus läuft mit Ausbildung des weiblichen und männlichen Vorkerns und der Ausschleusung des zweiten Polkörperchens weiter (TAIEB et al. 1997). Eine wichtige, aber bisher noch nicht vollständig geklärte Rolle spielt dabei die „Mitogen-activated Protein Kinase“ (MAPK) (LIU u. YANG 1999).

⇒ Außerdem kommt es im Rahmen der Ca²⁺-Oszillationen zu einer Änderung im Proteinmuster, die als Kennzeichen einer vollständigen Aktivierung angesehen werden kann. DING et al. (1992a) stellten fest, dass es beim Schwein aufgrund der Befruchtung zu einem plötzlichen Absinken der Konzentration von 46 kDa-Proteinen kommt. Ebenso tritt eine progressive Reduzierung eines 25 kDa-Proteins gekoppelt mit einem Anstieg eines 22 kDa-Proteins auf. DING et al. (1992a) beschrieben weiterhin, dass diese Veränderungen nicht auf eine Änderung der Proteinsynthese zurückzuführen sind, sondern auf posttranslationale Modifikationen, die im Verlauf der Befruchtung stattfinden.

Die Proteinsynthese ist für die Befruchtung im Gegensatz zur Oozytenreifung nicht essentiell (DING et al. 1992b). Eine Änderung des Proteinmusters aufgrund der Befruchtung konnte auch bei anderen Säugetieren beschrieben werden (z. B. Maus:

ENDO et al. 1986; Schaf: MOOR u. GANDOLFI 1987).

⇒ Vom Seeigel und einigen anderen Invertebraten ist es bekannt, dass es während der Befruchtung zu einem für die vollständige Aktivierung notwendigen, intrazellulären Anstieg des pH-Wertes kommt (SHEN u. STEINHARDT 1979). Allerdings wiesen KLINE und ZAGRAY (1995) sowie PHILIPS und BALTZ (1996) bei der Maus keinen intrazellulären pH-Anstieg während der Befruchtung nach. Gleiches stellten BEN-YOSEF et al. (1996) für die Ratte fest. Für das Schwein liegen Untersuchungsergebnisse bezüglich der pH-Veränderungen bei in vitro gereiften Oozyten nach künstlicher Aktivierung vor. So konnten RUDDOCK et al. (2000) einen Anstieg des pH durch die artifizielle Aktivierung der Oozyten mit 7 % Ethanol, mit Ca²⁺-Ionophor und mit Thimerosal nachweisen. Untersuchungen bezüglich pH-Veränderungen im Rahmen der physiologischen Befruchtung beim Schwein fehlen.

Bezüglich des Mechanismus, wie durch das Spermium die Ca²⁺-Oszillationen ausgelöst werden, bestehen zwei Theorien:

1. Bei der Fusion des Spermiums mit der Oozyte wird ein lösliches Protein aus dem Zytoplasma (cytosolic sperm factor: CSF) der Samenzelle in die Oozyte freigesetzt, das über einen noch ungeklärten Weg die Ca²⁺-Oszillationen auslöst und nicht spezies- spezifisch ist.

Das Vorhandensein eines aktivierenden CSF ist verschiedentlich beschrieben worden (Seeigel: DALE et al. 1985; Kaninchen, Maus: STICE u. ROBL 1990; Hamster: SWANN 1990; Mensch: HOMA u. SWANN 1994; PALERMO et al. 1997; Rind: WU et al. 1998).

So konnten PARRINGTON et al. (1996) ein lösliches Spermien-Protein nachweisen, Oscillin, das die für eine normale Befruchtung charakteristischen Ca²⁺-Oszillationen in

Mäuse-Oozyten auslösen konnte. Im Spermienkopf sitzt dieses Protein auf Höhe des Äquatorialsegmentes, der Bereich, an dem die Spermien-Oozyten-Fusion ihren Anfang nimmt. MACHATY et al. (2000) zeigten außerdem, dass durch Injektion eines porzinen CSF in Oozyten vom Schwein alle Folgen der Aktivierung vollständig ausgelöst wurden.

Der Mechanismus wie der CSF die Ca²⁺-Freisetzung bewirkt, bleibt jedoch noch unklar.

Untersuchungen von WU et al. (2001) weisen allerdings darauf hin, dass CSF die Phospholipase C stimuliert und somit über Produktion von Inositol-1,4,5 Triphosphat (IP₃) die Ca²⁺-Freisetzung bewirkt. PERRY et al. (1999b, 2000) führten als Ergebnisse ihrer Untersuchungen beim Rind an, dass nur das Zusammenspiel mehrerer hitzestabiler und hitzeempfindlicher Spermien-Proteine eine Aktivierung auszulösen vermag.

2. Die zweite Theorie nimmt an, dass das Spermium an einen Rezeptor in der Plasmamembran der Oozyte bindet, der mit einem G-Protein oder einer Protein-Tyrosin- Kinase (KIM et al. 1999a) gekoppelt ist, die über die Aktivierung der Phospholipase C die Produktion von Inositol-1,4,5 Triphosphat (IP₃) bewirken, was zur Freisetzung von Ca²⁺- Ionen aus intrazellulären Speichern führt. So konnten MACHATY et al. (1995) nachweisen, dass gereifte porzine Oozyten einen G-Protein vermittelten Signaltransduktionsweg besitzen. Durch Stimulation desselben mit Guanosin-5´-0-(3´- Thiotriphosphat) (GTP-γ-S, ein GTP-Analog) konnten sie Ca²⁺-Oszillationen und die folgenden Ereignisse der Oozyten-Aktivierung auslösen. Die Anwesenheit des G-Protein vermittelten Signalwegs in porzinen Oozyten wurde in nachfolgenden Versuchen bestätigt (KIM et al. 1998a; MACHATY et al. 1997a). Jedoch ist dadurch nicht bewiesen, dass das Spermium bei der Befruchtung auf diesem Weg die Oozyte aktiviert.

Im Anschluß an eine erfolgreiche Aktivierung einer vollständig gereiften Oozyte durch das Spermium kommt es schließlich zur synchronen Ausbildung des männlichen und des weiblichen Vorkerns, zur Verschmelzung der beiden und zur nachfolgenden Zellteilung.

Die beschriebene, bei einer Befruchtung auftretende Aktivierung einer Oozyte kann auch spontan erfolgen, ohne dass eine Samenzelle daran beteiligt ist. In diesem Fall kann es zu einer parthenogenetischen Entwicklung der Oozyte mit Zellteilung und Blastozystenbildung kommen.

2.2.2.2 Parthenogenese

Unter Parthenogenese versteht man eine reduzierte Form der Fortpflanzung, bei der sich der Embryo aus einer unbefruchteten Oozyte entwickelt, wodurch der Austausch genetischen Materials unterbleibt (WEHNER u. GEHRING 1990).

Von der typischen Parthenogenese sind zwei verwandte Phänomene abzugrenzen (KAUFMAN 1983):

⇒ die Gynogenese, bei der die Oozyte, stimuliert durch ein Spermium, die zweite Meiose beendet und sich weiterentwickelt, ohne dass das Spermium genetisches Material beisteuert;

⇒ die Androgenese, bei der sich die Oozyte, ebenfalls stimuliert durch ein eingedrungenes Spermium, weiterentwickelt, aber nur das männliche Genom an der folgenden embryonalen Entwicklung teilnimmt.

Es handelt sich bei der Parthenogenese um eine im Tierreich relativ weitverbreitete Art der Reproduktion mit Ausnahme der Säugetiere. Physiologischerweise kommt sie bei verschiedenen Insekten, Reptilien und Fischen vor (WEHNER u. GEHRING 1990). Es wird auch über Parthenogenese bei Hühnern (OLSEN 1966) und Truthühnern (DARCEY et al.

1971) berichtet.

Ursächliche Mechanismen für den Beginn einer parthenogenetischen Entwicklung liegen dabei vermutlich in der Meiose begründet. Durch Ausbleiben der meiotischen Teilung bleibt die Oozyte diploid und kann sich zu einem normalen Nachkommen entwickeln. Allerdings können auch Fehler im Ablauf der Meiose, z. B. durch Nichtausbilden des ersten oder zweiten Polkörperchens, zur Ausbildung einer diploiden Oozyte und somit zum Beginn einer parthenogenetischen Entwicklung führen (NIEMANN u. MEINECKE 1993).

Im frühen Embryonalstadium können auch beim Säuger parthenogenetische Entwicklungsstadien auftreten, wobei diese Stadien durch eine nicht spermien-induzierte Aktivierung der Säugeroozyte entstehen. Diese Aktivierung kann entweder spontan oder aufgrund künstlicher, externer Stimuli (siehe Kapitel 2.2.2.3) auftreten. Es gibt jedoch keine Berichte über eine vollständige, parthenogenetische Entwicklung mit der Geburt normaler Nachkommen bei Säugetieren (NIEMANN u. MEINECKE 1993).

In Abbildung 1 sind die von KAUFMAN und SACHS (1976) beschriebenen Möglichkeiten der Entstehung parthenogenetischer Embryonen mit ihren genetische Konstitutionen aus Oozyten in der Metaphase II dargestellt.

Abbildung 1: Möglichkeiten der Entstehung parthenogenetischer Embryonen (nach KAUFMAN u. SACHS 1976)

2.2.2.3 Methoden der artifiziellen Aktivierung gereifter Säugeroozyten

Zur Zeit gewinnt das Phänomen der parthenogenetischen Entwicklung von Säugeroozyten im Rahmen der Untersuchungen zum Kerntransfer zunehmend an Bedeutung (z. B. LIU u.

MOOR 1997; TAO et al. 1999; KOO et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000). Deswegen wurden im Laufe der letzten Jahre viele Methoden getestet, um Oozyten durch externe Stimuli künstlich zu aktivieren und eine parthenogenetische Entwicklung auszulösen.

Auch im Zusammenhang mit der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) sind verschiedene Aktivierungsmethoden bei unterschiedlichen Spezies geprüft worden, um die Aktivierungsraten und somit die Befruchtungs- und frühembryonalen Entwicklungsraten

Gereifte Oozyte (Metaphase II)

2. Polkörper nicht ausgeschleust

sofortige Teilung Aktivierung

Ausschleusung des 2.

Polkörpers

1 diploider Vorkern

2 haploide Vorkerne

1 haploider Vorkern pro Blastomere

1 haploider Vorkern

2. meiotische Teilung

heterozygot

diploid heterozygot diploid

mosaik haploid

mosaik

haploid uniform

haploid

Vorkern- Stadien

1. Teilung

genetische Konstitution

spermieninjizierter Oozyten durch einen zusätzlichen, aktivierenden Stimulus zu verbessern (z. B.: Mensch: TESARIK u. TESTART 1994; YANAGIDA et al. 1999; ZHANG et al. 1999;

Rind: KEEFER et al. 1990; LI et al. 1999; CHUNG et al. 2000; Pferd: KATO et al. 1997;

GUIGNOT et al. 1998; LI et al. 2000; Schaf: GOMEZ et al. 1998c; Schwein: KIM et al. 1999c;

KOLBE u. HOLTZ 1999). Die Ausschleusung des zweiten Polkörpers ist hierbei im Gegensatz zum Kerntransfer essentiell, um eine normal befruchtete Zygote zu erhalten.

Verschiedene Autoren berichteten über ein abgewandeltes Muster des oben beschriebenen Anstiegs der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]ⁱ) nach parthenogenetischer Aktivierung. Während die spermien-induzierte Aktivierung zu andauernden Ca²⁺- Oszillationen führt (Abbildung 2A), tritt bei einer parthenogenetischen Aktivierung meist ein konstanter Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration auf, die ein Plateau erreicht, bevor sie nach einiger Zeit langsam wieder abfällt (Abbildung 2B) (RICKORDS u. WHITE 1992;

SUN et al. 1992; TESARIK et al. 1994; TESARIK u. TESTART 1994).

Abbildung 2: Muster der Veränderungen der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]ⁱ):

A: spermienabhängige Aktivierung; B: parthenogenetische Aktivierung (modifiziert nach TESARIK et al. 1994)

Die Entwicklung der Oozyten nach parthenogenetischer Aktivierung verläuft umso besser, je mehr mit Hilfe künstlicher Aktivatoren die spermienabhängigen Ca²⁺-Oszillationen nachgeahmt werden können (OZIL 1990).

Zeit Zeit

[Ca2+ ]i [Ca2+ ]i

A B

Die vielfältigen Aktivierungsmethoden lassen sich grob in physikalische, chemische und biochemische Reize einteilen, wie in Tabelle 1 dargestellt wird.

Tabelle 1: Methoden zur artifiziellen Aktivierung von Säugerozyten

Aktivierungsmethode Beispiele aus der Literatur

Elektrische Stimulation

COLLAS et al. (1989);

ONODERA u. TSUNODA (1989);

ESCRIBA u. GARCIA-XIMENEZ (2000);

COLLAS et al. (1993);

PROCHAZKA et al. (1992, 1993);

JOLIFF u. PRATHER (1997);

KURE-BAYASHI et al. (2000)

Mechanische Stimulation (z. B. Injektion)

RHODES et al. (1994);

CATT u. RHODES (1995);

GOMEZ et al. (1998a) physikalisch

Thermische Stimulation

KOMAR (1973);

LONGO (1975);

BALAKIER u. TARKOWSKI (1976)

Ca²⁺-Ionophor

STEINHARDT et al. (1974);

KLINE u. KLINE (1992);

CHIAN u. SIRARD (1995);

WANG et al. (1998a,b, 1999)

Ethanol

CUTHBERTSON (1983);

O´NEILL u. KAUFMAN (1989);

DIDION et al. (1990);

NAGAI (1992);

MINAMIHASHI et al. (1993) CaCl₂ FULTON u. WHITTINGHAM (1978);

MACHATY et al. (1996) chemisch

Thimerosal

CHEEK et al. (1993);

FISSORE u. ROBL (1995);

HERBERT et al. (1995);

MACHATY et al. (1997b)

Tabelle 1: (Fortsetzung)

Aktivierungsmethode Beispiele aus der Literatur

Stimulation eines G-Proteins

MIYAZAKI (1988);

MOORE et al. (1993);

MACHATY et al. (1995, 1997a);

KIM et al. (1998a)

Injektion von Inositol-1,4,5 Triphosphat

WHITAKER u. IRVINE (1984);

MIYAZAKI (1988);

MIYAZAKI et al. (1992);

BERRIDGE (1993)

Protein-Synthese-Inhibitoren

SIRACUSA et al. (1978);

BALAKIER u. CASPER (1993);

FIRST et al. (1992);

YANG et al. (1992);

NUSSBAUM und PRATHER (1995)

Protein-Kinase-Inhibitoren

SZÖLLÖSI et al. (1993);

RICKORDS et al. (1992);

MAYES et al. (1995) biochemisch

Injektion eines CSF

PARRINGTON et al. (1996);

MACHATY et al. (2000);

HOMA u. SWANN (1994);

PALERMO et al. (1997);

WU et al. (1998)

Als einer der wichtigsten Aktivatoren kann dabei die elektrische Stimulation angesehen werden, die zur Fusion beim Kerntransfer regelmäßig eingesetzt wird und eine Steigerung der Aktivierungs- und Entwicklungsraten bewirkt. Durch einen elektrischen Puls kommt es zu einer kurzfristigen Porenbildung in der Zellmembran, so dass ein Influx von Ca²⁺-Ionen aus dem extrazellulären Medium stattfinden kann (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982). Durch Frequenz, Dauer und Stärke des elektrischen Pulses kann der Level des Ca²⁺-Anstiegs in der Zelle reguliert werden (COLLAS et al. 1993).

Im Zusammenhang mit ICSI ist auch besonders die mechanische Stimulation einer Oozyte durch den Injektionsprozess von Bedeutung. Verschiedentlich wurde nachgewiesen, dass diese Manipulation an der Oozyte zur Aktivierung und Vorkernbildung führt (GOMEZ et al.

1997, 1998c) und somit die Befruchtungsraten durch parthenogenetische Entwicklung negativ beeinflusst. Auch Zentrifugation oder Vortexing können Oozyten mechanisch aktivieren.

Ein weiterer, sehr häufig angewandter Aktivator ist ein Ca²⁺-Ionophor (A23187). Ionophore sind carbozyklische Polyether-Antibiotika, die mit Kationen einen lipophilen Komplex bilden können und somit frei in der Lipidregion von Zellmembranen beweglich sind. Auf diese Weise werden Kationen, wie z. B. Ca²⁺-Ionen, passiv durch die Membran transportiert. Die Oozyte wird aktiviert und die entsprechenden Ereignisse einer Oozyten-Aktivierung laufen ähnlich den physiologischen Vorgängen einer Befruchtung ab. Allerdings darf die Zelle nur kurz der Einwirkung des Ca²⁺-Ionophors ausgesetzt werden, da eine längere Einwirkung zu einer starken Druckerhöhung in der Zelle und somit zum Zelltod führt (STEUBER u.

KROKER 1994).

Die direkte Injektion von Ca²⁺-Ionen, z. B. in Form von CaCl₂, in das Zytoplasma der Oozyte bewirkt zum einen den direkten Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, zum anderen wirkt es stimulierend auf die intrazellulären Mechanismen der Ca²⁺-Freisetzung und setzt auf diese Weise Calcium aus intrazellulären Speichern frei (FINCH et al.1991; BERRIDGE 1993). Die Oozyte wird somit aktiviert.

Thimerosal, eine organische Quecksilber-Verbindung mit hoher aktivierender Wirkung, bewirkt die Mobilisierung intrazellulärer Ca²⁺-Speicher durch Oxidierung kritischer Sulfhydrylgruppen an intrazellulären Ca²⁺-Releasing-Proteinen und führt auf diese Weise zu sich wiederholenden Ca²⁺-Wellen. Die Wirkung der Thimerosal-Inkubation muss durch den Antagonisten Dithiothreitol (DTT) (MACHATY et al. 1997b) nach ca. 10 Minuten wieder aufgehoben werden, weil es sonst zur Oxidierung der Tubulin-Sulfhydryl-Gruppen mit Zerstörung der meiotischen Spindel kommen kann.

Eine Aktivierung von Oozyten durch Inhibition der Proteinsynthese begründet sich darauf, dass durch entsprechende Mittel, z. B. Cycloheximid oder Puromycin, die Synthese zytostatischer Faktoren und von Cyclin B verhindert wird, wodurch die MPF-Aktivität nicht mehr aufrechterhalten werden kann und die Oozyte die Meiose wieder aufnimmt. Beim Rind hat sich diese Methode im Zusammenspiel mit elektrischer Stimulation als effektiv erwiesen (FIRST et al. 1992; YANG et al. 1992), und NUSSBAUM und PRATHER (1995) zeigten den gleichen Effekt bei porzinen Oozyten.

Protein-Kinase-Inhibitoren, z. B. 6-Dimethylaminopurin (6-DMAP) (SZÖLLÖSI et al. 1993), Staurosporin (RICKORDS et al. 1992) oder H7 ([1-(5-Isoquinolinesulfonyl)-2- Methylpiperazin, HCL]) (MAYES et al. 1995), bewirken ebenfalls eine Störung des Gleichgewichtes zur Aufrechterhaltung der MPF-Aktivität, so dass die Oozyte aus der

Metaphase-II-Arretierung freigesetzt werden kann. In Folge der Protein-Kinase-Inhibition ist beim Schwein keine Exozytose der kortikalen Granula und keine Entwicklung bis zur Blastozyste zu beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass damit nur ein Teil der Aktivierungskomponenten ausgelöst werden kann (MAYES et al. 1995; GREEN et al. 1999).

Beim Rind wurden Kombinationen von Ca^2+-Ionophor zusammen mit 6-DMAP als sehr erfolgreich beschrieben (RHO et al. 1998a,b; CHUNG et al. 2000).

In Tabelle 2 sind Erfolgsraten verschiedener Aktivierungsmethoden porziner Oozyten anhand der Aktivierungsraten zusammengestellt.

Eine Oozyte gilt im Allgemeinen als aktiviert, wenn sie mindestens einen Vorkern aufweist.

Ergebnisse bezüglich Morulae- oder Blastozystenraten sind in Kapitel 2.3.2.3 beschrieben.

WANG et al. (1998a) verglichen die Ca²⁺-Ionophor-Aktivierung mit der elektrischen Aktivierung in Bezug auf das vollständigen Auftreten der Aktivierungsereignisse in porzinen Oozyten. Dabei stellte sich heraus, dass die elektrische Aktivierung im Gegensatz zur Ionophor-Aktivierung kaum zur Ausbildung eines Polyspermieblocks führte, obwohl eine Exozytose der kortikalen Granula stattgefunden hat. Außerdem bewirkte die elektrische Aktivierung zwar eine höhere Vorkernbildung, jedoch fehlte deutlich öfter die Ausschleusung des zweiten Polkörpers, so dass es vermehrt zur Ausbildung von zwei Vorkernen kam. Die Aktivierung mittels Ca²⁺-Ionophor entsprach somit eher einer spermieninduzierten Aktivierung (WANG et al. 1998b).

In verschiedenen Versuchen stellte sich heraus, dass die Anwendung einer Konzentration von mindestens 50 µM für eine Dauer von zwei Minuten die besten Ergebnisse bei der Aktivierung porziner Oozyten mit Ca²⁺-Ionophor ergibt (WANG et al. 1998a,b, 1999).

Tabelle 2: Beispiele der Wirksamkeit unterschiedlicher Aktivierungsmethoden für porzine Oozyten anhand der Aktivierungsrate (6-24 Stunden nach Stimulation)

Aktivierung Autor In-vitro-Kultur (h)

Aktivierungsrate (%)

HAGEN et al. 1991a 24 88

PROCHAZKA et al. 1992 6 40,6-100

KIM et al. 1996b 18 75

LIU u. MOOR 1997 7-8 72,2-86,7

Elektrische Aktivierung

WANG et al. 1998a 12 88

WANG et al. 1998a,b; 1999 12 19,8-65

Ca²⁺-Ionophor

JILEK et al. 2000 24 26-70

Thimerosal (+DTT) MACHATY et al. 1997b 6 73,8

CaCl2-Injektion MACHATY et al. 1996 6 79,4

MAYES et al. 1995 9 68,1

Protein-Kinase Inhibitoren

GREEN et al. 1999 24 74

Ethanol DIDION et al. 1990 18 22

Cytosolic Sperm Factor

(CSF) MACHATY et al. 2000 6 89,2

G-Protein-Stimulation

(GTP-γ-S) MACHATY et al. 1995 6 71,4

Protein-Synthese- Inhibitoren + elektrische Aktivierung

NUSSBAUM u. PRATHER

1995 24 92

Ethanol + 6-DMAP LEAL u. LIU 1998 8 96

Ca²⁺-Ionophor +

Cycloheximid JILEK et al. 2000 24 26-85

2.2.3 In-vitro-Fertilisation

Die Grundlage der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion ist die In-vitro-Befruchtung (IVF), bei der entweder in vivo oder in vitro gereifte Oozyten mit befruchtungsfähigen Spermien zusammen für kurze Zeit inkubiert und befruchtet werden. Obwohl schon seit Anfang der siebziger Jahre an der In-vitro-Produktion (IVP) von porzinen Embryonen geforscht wird (HARMS u. SMIDT 1970; MOTLIK u. FULKA 1974), ist bis heute noch immer kein voll befriedigendes Verfahren entwickelt worden (NAGAI 1996, DAY 2000).

Das größte Problem bei der IVF in vitro gereifter Oozyten beim Schwein stellt dabei in vielen Laboratorien die polysperme Befruchtung dar (NAGAI 1996). Aufgrund bisher suboptimaler Kulturbedingungen kommt es zu einer unzureichenden Oozytenreifung, in deren Folge die Ausbildung und Exozytose der kortikalen Granula nicht korrekt abläuft, der Block der Zona pellucida nicht ausreichend ausgebildet wird und somit das Eindringen mehrerer Spermien pro Oozyte nicht verhindert werden kann (CRAN u. CHENG 1986). Die Reduzierung der pro Oozyte eingesetzten Spermienkonzentrationen bei der IVF, die Kokultivierung der Spermien mit Eileiterzellen, das Hinzufügen von Eileiterflüssigkeit aus Eileitern rauschender Sauen zum Befruchtungsmedium oder die Supplementierung des Mediums mit RGD enthaltenden Oligopeptiden führte bei verschiedenen Arbeitsgruppen aber zu guten Ansätzen zur Senkung der Polyspermieraten (NAGAI und MOOR 1990; RATH 1992; KIM et al. 1996a; YOSHIDA et al. 1993b). Ein weiteres Problem der IVF mit in vitro gereiften Oozyten ist die oft mangelhafte und asynchrone Ausbildung des männlichen Vorkerns, jedoch ist dieser Sachverhalt durch die Klärung des erforderlichen Glutathiongehaltes der gereiften Oozyte (siehe auch Kapitel 2.1.2) verbessert worden (NAGAI 1996).

Zur Erlangung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien ist es notwendig, dass diese kapazitieren und die Akrosomenreaktion ausgelöst wird. Eine essentielle Rolle spielen dabei in vitro extrazelluläre Ca²⁺-Ionen (FRASER 1987). Der kapazitationsinduzierende Effekt von Kalzium, das im Medium nur begrenzt löslich ist, kann unter in vitro Bedingungen durch Anwendung von Ca²⁺-Ionophor gesteigert werden (BIRD u. HOUGHTEN 1989). Ein regelmäßig zur Auslösung der Kapazitation angewandtes Mittel ist Koffein, das die Kopplung der Ca²⁺-Ionen an die Spermien fördert (NIWA 1993; NAGAI et al. 1994; FUNAHASHI u.

NAGAI 2001). Somit wurden spezielle Fertilisationsmedien entwickelt, die den Bedürfnissen der Spermien und Oozyten zum Zeitpunkt der IVF gerecht werden. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass Methoden zur Verbesserung der Kapazitation zwar zu einer verbesserten Penetrationsrate, jedoch oft auch zu erhöhten Polyspermieraten führen (ABEYDEERA u. DAY 1997).

2.2.4 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)

2.2.4.1 Grundlagen

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion ist eine spezielle Art der In-vitro-Befruchtung, bei der ein einzelnes Spermium zur Befruchtung direkt in das Zytoplasma einer gereiften Oozyte injiziert wird. Dabei werden wichtige Schritte einer physiologischen Befruchtung umgangen, wie z. B. Kapazitation, Akrosomenreaktion und Penetration. Die verwendeten Spermien müssen daher nicht voll funktionstüchtig sein. ICSI gewährleistet im Gegensatz zu anderen In-vitro-Fertilisationstechniken eine ausschließlich monosperme Befruchtung.

Andere mikromanipulatorische Fertilisationstechniken, wie Zona Drilling, Partial Zona Dissection (PZD) und subzonale Insemination (SUZI), gingen der ICSI-Technik in der Humanmedizin voraus, waren jedoch nicht sehr erfolgreich (CATT 1996).

Als Anwendungsbereich steht in der Humanmedizin der therapeutische Ansatz bei androgener Sub- und Infertilität im Vordergrund (CATT 1996). Bei Säugetieren kann ICSI zur Erstellung transgener Tiere genutzt werden, indem die zu injizierenden Spermien mit einem Genkonstrukt beladen werden und als Vektor dienen (LAVITRANO et al. 1999; PERRY et al.

1999a, SQUIRES 1999; KIM u. SHIM 2000). Außerdem ist die ICSI-Technik eine effiziente Methode zur optimalen Ausnutzung genetischen Materials, z. B. für den Erhalt seltener Rassen, aber auch für die Erstellung bestimmter Zuchtlinien (CATT 1996; POPE et al. 1998).

Interessant ist ICSI im Zusammenhang mit dem Einsatz von flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierten Spermien. Besonders beim Schwein ist die Erstellung einer für eine normale Besamung ausreichenden Menge an sortierten Spermien noch unzureichend. Der Einsatz von gesexten Spermien zur IVF wird andererseits durch erhöhte Polyspermieraten begrenzt (RATH et al. 1999; SEIDEL u. JOHNSON 1999).

Die Ursprünge der ICSI-Technik gehen bis in die sechziger Jahre zurück, als erste Versuche mit Seeigel- und Frosch-Gameten durchgeführt wurden, bei denen die Bildung von Vorkernen erreicht werden konnte (HIRAMOTO 1962; GRAHAM 1966). Vorkernbildung konnte mit der Injektion sowohl homologer als auch hertrologer Spermien erreicht werden (IRITANI et al. 1998). HOSOI et al. (1988) berichteten über die ersten Nachkommen bei Säugetieren, als sie ICSI beim Kaninchen anwandten. In den neunziger Jahren stiegen die experimentellen Versuche zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion sprunghaft an, und es wurden ebenfalls Nachkommen bei Rind (GOTO et al. 1991), Mensch (PALERMO et al.

1992; VAN STEIRTEGHEM et al. 1993), Maus (AHMADI et al. 1995; KIMURA et al. 1995), Schaf (CATT 1996; GOMEZ et al. 1998a) und Pferd (McKINNON et al. 1998) produziert. Die

einzigen Berichte über „ICSI-Ferkel“ wurden erst kürzlich veröffentlicht (KOLBE u. HOLTZ 2000; MARTIN 2000).

In der Humanmedizin wurden intensive Studien zum Einsatz von unreifen und defekten Spermien bei der ICSI durchgeführt. Nach ersten Versuchen an Labortieren, bei denen unreife Spermien in Mäuseoozyten injiziert worden waren (KIMURA u. YANAGIMACHI 1995;

OGURA u. YANAGIMACHI 1995), wurden die positiven Ergebnisse auf die Humanmedizin übertragen. SOFIKITIS et al. (1995) erreichten mit der Injektion von Spermatiden die erste Schwangerschaft, und TESARIK et al. (1995) sowie TESARIK und MENDOZA (1996) berichteten über die ersten Kinder, die aus mit Spermatiden befruchteten humanen Oozyten geboren wurden. Beim Rind berichteten GOTO et al. (1996a,b) ebenfalls über den erfolgreichen Einsatz unreifer Spermienformen. Der Reifungsgrad der männlichen Gameten spielt bei der ICSI also keine entscheidende Rolle. Allerdings stellten YAZAWA et al. (2001) fest, dass unreife Spermienformen das Muster im Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Ionen auslösten, das einer parthenogenetischen Aktivierung gleicht (Abbildung 2).

HEUWIESER et al. (1992a) erreichten vergleichbar hohe Befruchtungsraten bei ICSI mit defekten sowie mit morphologisch unauffälligen Bullenspermien. Ebenso stellten McKINNON et al. (1998) keinen Unterschied bei der Verwendung von Spermien infertiler Hengste im Vergleich zu denen fertiler Hengste fest. Auch bei der Verwendung von kapazitierten im Vergleich zu nicht kapazitierten Spermien bei Schaf und Rind wurde kein Unterschied in der Befruchtungsrate festgestellt (GOMEZ et al. 1997; GALLI et al. 1999). Aufgrund dieser Ergebnisse scheint die Beschaffenheit des Spermiums keinen Einfluss auf die Entwicklungsraten nach ICSI zu haben, allerdings zeigten GOMEZ et al. (1997) in ihren Versuchen, dass frische Spermien im Gegensatz zu tiefgefrorenen beim Schaf bessere Befruchtungsraten erzielten. LACHAM-KAPLAN und TROUNSON (1995) erreichten bei der Maus mit kapazitierten Spermien höhere Befruchtungsraten als mit nicht kapazitierten.

HOSOI et al. (1999) verglichen den Einsatz von Spermienköpfen und intakten Spermien und zeigten verringerte Teilungsraten für die Spermienköpfe. KIM et al. (1999c) konnten beim Schwein nur mit Hilfe einer zusätzlichen Aktivierung der Oozyten Erfolge bei der Injektion von Spermatiden erzielen.

2.2.4.2 ICSI-Technik

Für die erfolgreiche Durchführung der ICSI ist es notwendig, dass alle auf die Oozyte wirkenden Stressfaktoren so gering wie möglich gehalten werden und das Spermium ordnungsgemäß im Zytoplasma abgesetzt wird.

Der Durchmesser der Injektionspipette sollte möglichst genau der Größe der Spermienköpfe angepasst werden, um das mechanische Trauma durch den Injektionsprozesses in der Zona pellucida und vor allem im Oolemm möglichst gering zu halten. GOTO et al. (1996a) setzten z. B. beim Rind Pipetten mit einem inneren Durchmesser von 8 µm ein, während KIM et al.

(1998b) beim Schwein einen inneren Durchmesser von 6-7 µm angaben, entsprechend der jeweiligen Spermienkopfgröße. TOCHARUS et al. (1996) bewiesen durch Einsatz von Injektionspipetten verschiedenen Durchmessers, dass mit den dünneren Pipetten bessere Entwicklungsergebnisse erreicht wurden. Das mit dem Spermium zusammen injizierte Volumen des Spermienmediums kann bei Anwendung dünnerer Injektionspipetten sehr gering gehalten werden.

Wichtig ist, dass das Spermium vor der Aufnahme in die Injektionspipette immobilisiert wird.

Bei der physiologischen Befruchtung verliert das Spermium bei der Fusion mit der Oozyte seine Motilität, bei ICSI würde es ohne künstliche Immobilisation jedoch weiterhin im Zytoplasma der Oozyte Geißelbewegungen machen. Dadurch könnten zytoplasmatische Strukturen irreversibel geschädigt werden, was früher oder später zur Degeneration der Oozyte führen würde (FISHEL et al. 1995; GERRIS et al. 1995).

Üblicherweise wird die Injektionspipettenspitze über dem Mittelstück des Spermienschwanzes abgesenkt und auf den Boden der Petrischale gedrückt, um die Spermien durch Zerstörung der Schwanzstruktur unbeweglich zu machen (PAYNE 1995).

Ein Vorteil ist dabei das Anreißen der Spermienmembran, das durch seitliches Wegziehen der Pipette noch verstärkt werden kann. Der beschriebene CSF (cytosolic sperm factor) kann somit leicht aus dem „Restzytoplasma“ des Spermiums austreten und die Aktivierung der Oozyte fördern. Ebenso wird das Chromatin der Samenzelle auf diese Weise für dekondensierende Faktoren aus dem Zytoplasma der Oozyte leichter zugänglich (DOZORTSEV et al. 1994, 1995a).

Um die Immobilisierung und das Einfangen der Spermien zu erleichtern, wird die Viskosität der verwendeten Spermiensuspension erhöht, was sich durch eine 10%ige Polyvinylpyrrolidonlösung (PVP) mit einem Molekulargewicht von 360.000 erzielen lässt. Die Verwendung von PVP wird allerdings kontrovers diskutiert. MOTOISHI et al. (1996) und SAHA et al. (1996) stellten bei der Anwendung von PVP bei der Injektion boviner Oozyten zwar keine negativen Einflüsse auf Entwicklungsfähigkeit und Embryonenqualität fest, jedoch zeigten STREHLER et al. (1998) in einer elektronenmikroskopischen Studie, dass bei der Verwendung von PVP der Spermiennukleus durch vermutlich nekrotische Prozesse geschädigt wird. CLARKE und JOHNSON (1988) berichteten über mangelhafte

Vorkernbildung nach Anwendung von PVP. Demnach sollte die Menge der injizierten, PVP enthaltenden Spermiensuspension so gering wie möglich gehalten werden.

Bei dem Injektionsvorgang selber ist darauf zu achten, dass die Chromosomen der Oozyte durch die eingeführte Injektionspipette nicht beschädigt werden, um die Weiterentwicklung der Oozyte nicht zu beeinträchtigen. Die Metaphasenplatte befindet sich in der Regel in der Nähe des ausgeschleusten Polkörpers, so dass der Einstich möglichst weit vom Polkörper entfernt stattfindet. Dazu wird die Oozyte an der Haltepipette so positioniert, dass der Polkörper auf 6- oder 12-Uhr-Position zu liegen kommt. Der Einstich erfolgt dann von der 3- Uhr-Position aus (siehe Abbildung 3) (PAYNE 1995).

Abbildung 3: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) – schematische Darstellung

Fehlerhaftes Absetzen des Spermiums führt zum Misserfolg der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Aufgrund der Elastizität des Oolemms kann es leicht zu einem Einstülpen desselben und einem Absetzen der Samenzelle im perivitellinen Raum kommen, obwohl man sich vermeintlich im Zytoplasma der Oozyte befindet. Durch Erzeugen eines Unterdruckes in der Injektionspipette wird das Durchstoßen der Plasmamembran erleichtert.

Außerdem kann durch Ansaugen von Zytoplasma, bevor das Spermium in die Oozyte entlassen wird, kontrolliert werden, ob die Pipettenspitze sich wirklich im Zytoplasma befindet (PAYNE 1995). Allerdings berichteten MANSOUR et al. (1996), dass ohne Ansaugen des Zytoplasmas die entstandenen Embryonen eine deutlich bessere Qualität hatten. Die Befruchtungsrate wurde dabei nicht negativ durch fehlerhaftes Absetzen des Spermiums beeinflusst.

1. Polkörper

Injektionspipette Haltepipette

Oozyte in der Metaphase II Zona pellucida

Spermium

2.2.4.3 Einsatz der ICSI bei verschiedenen Haustierspezies

Der Erfolg der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion zur Befruchtung von Oozyten der Säugetiere war bisher von Spezies zu Spezies sehr unterschiedlich. Während die Oozyten von Mensch, Kaninchen, Hamster, Schwein und auch Schaf durch den Injektionsprozess ausreichend stimuliert wurden, um sich weiterzuentwickeln (CATT 1996), war bei bovinen Oozyten eine zusätzliche Aktivierung notwendig (KEEFER et al. 1990). In Tabelle 3 sind Beispiele der Aktivierungs- (AR) und Befruchtungsraten (FR) verschiedener Haustierspezies ohne zusätzliche Aktivierung der Oozyten dargestellt.

Tabelle 3: Beispiele für Aktivierungs- (AR) und Befruchtungsraten (FR) nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion und Parthenogeneseraten (PR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies ohne zusätzliche Aktivierung

Tierart Autor Reifung AR (%) FR (%) PR (%)

RHODES et al. (1994) In vitro - 60 50

CATT u. RHODES (1995) In vitro - 63 55

Schaf

GOMEZ et al. (1998a) In vitro - 30,6 26,6

In vitro - 9 1

Rind HEUWIESER et al. (1992b)

In vivo - 74 66

DELL`AQUILLA et al. (1997) In vitro 65,2 52,2 - Pferd

GRØNDAHL et al. (1997) In vitro 66,7 50 0

Kaninchen DENG u. YANG (2001) In vivo 78 - -

CATT u. RHODES (1995) In vitro 62 60 20

KIM et al. (1998b) In vitro 80 54 18

LEE et al. (1998) In vitro 85 33 25

In vivo 46,4 33,6 7,3

Schwein

KLOCKE (1999)

In vitro 46,9 40,2 6,4

Um den Erfolg der Spermieninjektionen richtig einschätzen zu können, ist es empfehlenswert, die entsprechenden parthenogenetischen Entwicklungsraten nach Kontrollinjektion zu berücksichtigen. Sofern die Parthenogeneserate (PR) angegeben war, ist sie in Tabelle 3 mit aufgeführt. Die Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate umfasst die Zellstadien, die genau zwei Vorkerne bildeten. Die Aktivierungsrate gibt den Anteil an Oozyten an, die mindestens einen Vorkern enthielten. Effektiv sind Ergebnisse mit hohen Aktivierungs- und Befruchtungsraten bei geringen Parthenogeneseraten kontrollinjizierter Oozyten.

Demnach sind die dargestellten Ergebnisse beim Schaf ohne eine zusätzliche Aktivierung der Oozyten zur ICSI bislang unbefriedigend (RHODES et al. 1994; CATT u. RHODES 1995;

GOMEZ et al. 1998a), ebenso beim Rind (HEUWIESER et al. 1992b).

Die bisherigen Ergebnisse für das Schwein weisen auf eine gute Aktivierbarkeit und Befruchtung der Oozyten ohne hohe parthenogenetische Entwicklungsraten nach ICSI hin (CATT u. RHODES 1995; KIM et al. 1998b; KLOCKE 1999).

Ebenso zeigen die Ergebnisse von GRØNDAHL et al. (1997), dass ICSI beim Pferd ohne zusätzliche Aktivierung gute Erfolgsaussichten hat. Ergebnisse der frühen Embryonalentwicklung nach ICSI ohne zusätzliche Aktivierung sind in Kapitel 2.3.2 dargestellt.

2.2.4.4 Artifizielle Aktivierung von Oozyten zur ICSI bei verschiedenen Haustierspezies

Es wurde verschiedentlich die zusätzliche Aktivierung von Oozyten zur ICSI diskutiert. Das trifft besonders auf bovine Oozyten zu, die sich mittels ICSI nur schwer aktivieren lassen und bei denen große Probleme bei der Bildung des männlichen Vorkernes auftreten.

In Tabelle 4 sind Beispiele einer Aktivierung der Oozyten zur ICSI bei verschiedenen Haustieren dargestellt. Es wird deutlich, dass der am häufigsten zur ICSI eingesetzte Aktivator Ca²⁺-Ionophor ist. Beim Rind können Aktivierungsraten von 70-80 % mit zusätzlicher Aktivierung erreicht werden, aber die Befruchtungsraten blieben bislang unter 40 % und zeigten keinen ausgeprägten Unterschied zu den Parthenogeneseraten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Oozyten nach ICSI und künstlicher Aktivierung gut aktiviert wurden, die Ausbildung des männlichen Vorkernes jedoch nicht in ausreichendem Umfang erfolgte. RHO et al. (1998a) versuchten dieses Problem durch Behandlung der Spermien mit Dithiothreitol (DTT) zu lösen und konnten eine signifikant höhere Bildungsrate des männlichen Vorkerns erzielen (40 % vs. 11 %). DTT reduziert Disulfidbrücken in den

Protaminen des Spermienkerns und fördert somit die Dekondensation der Spermienköpfe im Zytoplasma der Oozyte.

LI et al. (2000) führten einen umfassenden Versuch bezüglich eines Vergleichs verschiedener Aktivierungsmethoden zur ICSI beim Pferd durch. Weil jedoch entsprechende parthenogenetische Vergleichsraten fehlen, kann die Effektivität der einzelnen Aktivatoren nicht beurteilt werden. Gleiches gilt für die Untersuchungen von GOMEZ et al. (1998a) beim Schaf.

Tabelle 4: Beispiele für Aktivierungs- (AR) und Befruchtungsraten (FR) nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion und Parthenogeneseraten (PR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies mit zusätzlicher Aktivierung

Tierart Autor Aktivierung Reifung AR (%) FR (%) PR (%) HEUWIESER et al.

(1992a) A 23187 In vitro - 39 -

HEUWIESER et al.

(1992b) A 23187 In vitro - 44 23

MEDVEDEV et al.

(1997) A 23187 In vitro 41 11 4

LI et al. (1999) 7 % Ethanol In vitro 78,8 26,9 - Rind

CHUNG et al. (2000)

A 23187 +

DMAP In vitro 70 38,3 23,7 GUIGNOT et al.

(1998) A 23187 In vitro - 62,1 -

A 23187 59 - -

7 % Ethanol 56 - -

Thimerosal 79 - -

Pferd

LI et al. (2000)

IP3

In vitro

56 - - In vitro 91,6 50 -

Schaf GOMEZ et al. (1998a) A 23187

In vivo 92 44 -

In der Tabelle 5 sind separat die Ergebnisse der Versuche zur ICSI mit zusätzlicher Aktivierung beim Schwein dargestellt. Zu den Aktivierungsverfahren gehören die Inkubation in Ca²⁺-Ionophor (A 23187), die elektrische Stimulation vor bzw. nach den Spermieninjektionen und die Injektion einer Ca²⁺-Ionen-haltigen Lösung.

O´BRIAN et al. (1996) sowie CATT et al. (1997) erreichten eine deutliche Verbesserung der Befruchtungsrate durch Ca²⁺-Injektion, ohne dass es zu einem Anstieg der Parthenogeneserate kam. Während CATT et al. (1997) zwar eine Verbesserung der Befruchtungsrate bei Anwendung der A 23187-Aktivierung erhielten, konnten KOLBE u.

HOLTZ (1999) keinen positiven Effekt mit A 23187 erzielen.

Auch die Ergebnisse elektrischer Aktivierungsversuche von LEE et al. (1998) und KIM et al.

(1999b) zeigten keine akzeptablen Verbesserungen der Entwicklungsraten. Allerdings konnten KIM et al. (1999c) durch elektrische Aktivierung vor Spermatideninjektion eine deutliche Verbesserung der Befruchtungsrate erreichen. In diesem Zusammenhang wurde die Parthenogeneserate in einem direkten Vergleich aber nicht mituntersucht.

Ergebnisse der frühen Embryonalentwicklung nach ICSI mit zusätzlicher Aktivierung der Oozyten sind für die verschiedenen Haustiere in Kapitel 2.3.1 zusammengefasst.

TR (%) - - - - 26

TR(%) + - - - 22

PR (%) - 18 25 0 25 23,1 - - 8

PR (%) + 5 18 6 22 92,9 - - 12

FR (%) - 28 31 32 33 - 2 2 -

FR (%) + 68 67 63 25 - 46 19 -

AR (%) - 64 69 55 85 84 21 21 -

AR (%) + 92 93 67 97 96,4 95 89 -

Reifung In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro

Aktivierung CaCl2-Injektion Ca2+ -Injektion A 23187 Elektrischer Puls (nach ICSI) Elektrischer Puls (vor ICSI) Elektrischer Puls (vor ICSI) Elektrischer Puls (nach ICSI) A 23187

Autor O´BRIAN et al. (1996) CATT et al. (1997) LEE et al. (1998) KIM et al. (1999b) KIM et al. (1999c) KIM et al. (1999c) KOLBE u. HOLTZ (1999)

Tabelle 5 : Aktivierungs- (AR), Befruchtungs- (FR) und Teilungsraten (TR) nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion bzw. Parthenogeneseraten (PR) nach Kontrollinjektion beimSchweinmit (+) und ohne (-) zusätzliche Aktivierung

2.3 Embryonalentwicklung

Innerhalb weniger Tage nach der Befruchtung entwickelt sich aus der Zygote durch Zellteilung eine Blastozyste mit Differenzierung der Zellen in Innere Zellmasse (inner cell mass = ICM) und Trophektoderm (TE) (McLAREN 1982; SCHNORR 1989; DORST 1991).

Während dieser frühembryonalen Entwicklungsphase findet eine progressive Umstellung von maternaler zu embryonaler RNA-Synthese statt (McLAREN 1982; BAVISTER 1988;

ARCHIBONG et al. 1989; TELFORD et al. 1990; JARRELL et al. 1991). Beginn dieser Umstellung ist beim Schwein das Vier-Zellstadium, der Zeitpunkt, zu dem in vivo auch der Übertritt der Embryonen vom Eileiter in den Uterus stattfindet (BAVISTER 1988; BRÜSSOW 1985). Die Embryonen sind in diesem Stadium daher erheblichen internen und externen Veränderungen ausgesetzt, die in einer In-vitro-Kultur oftmals nicht ausreichend unterstützt werden können.

Bei der In-vitro-Produktion (IVP) porziner Embryonen wurde im Vier-Zellstadium daher oft eine Entwicklungsblockade beschrieben (BAVISTER 1988, 1995). Die Kulturbedingungen wurden jedoch durch Supplementierung der Kulturmedien mit Serumbestandteilen, Aminosäuren und Energiesubstraten (BAVISTER 1981; BECKMANN u. DAY 1991, 1993;

HAGEN et al. 1991b; REED et al. 1992; PETTERS u. WELLS 1993) soweit optimiert, dass eine relativ zuverlässige IVP porziner Embryonen bis zum Blastozystenstadium mittlerweile möglich geworden ist (DAY 2000). Die Geburt von Ferkeln nach IVF ist sowohl bei Verwendung von in vivo (z. B. YOSHIDA 1987; NAGAI et al. 1988; RATH 1991; RATH et al.

1997) als auch mit in vitro gereiften Oozyten (z. B. MATTIOLI et al. 1989; YOSHIDA et al.

1993b; KIKUCHI et al. 1999; RATH et al. 1999; ABEYDEERA et al. 1998c, 2000) schon mehrfach beschrieben worden.

2.3.2 Entwicklung nach ICSI

Die frühembryonale Entwicklung nach ICSI wurde bei den meisten Haustieren, abgesehen vom Rind, erst vereinzelt untersucht. In Tabelle 6 sind dazu die Teilungs- (TR) und Blastozystenraten (BR) nach Spermieninjektion ohne zusätzliche Aktivierung dargestellt.

Vielversprechend sind dabei die Entwicklungsraten in Versuchen von DENG und YANG (2001), die in vivo gereifte Oozyten des Kaninchens untersuchten. Sie erhielten gute Blastozystenraten ohne hohe Parthenogeneseraten und konnten Nachkommen nach ICSI

erzeugen (Tabelle 8). Gleiches gilt für die Ergebnisse von GOMEZ et al. (1998a) beim Schaf, wobei sogar in vitro gereifte Oozyten verwendet worden sind, die sich im Allgemeinen schlechter entwickeln als in vivo gereifte Oozyten. Beim Schwein sind entweder die Entwicklungsraten sehr gering, wobei erneut die Entwicklungsblockade im Vier-Zellstadium ein Problem darstellte, oder die parthenogenetischen Entwicklungsraten lagen sehr hoch (KLOCKE 1999; KOLBE u. HOLTZ 1999). Eine positive Ausnahme bezüglich der Blastozystenentwicklung stellen die Ergebnisse von KIM et al. (1998b) dar.

Tabelle 6: Beispiele für Teilungs- (TR) und Blastozystenraten (BR) nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion bzw. parthenogenetische Teilungsraten (pTR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies ohne zusätzliche Aktivierung

Tierart Autor Reifung TR (%) pTR (%) BR (%)

Rind KEEFER et al. (1990) In vitro 4 - -

Schaf GOMEZ et al. (1998a) In vitro 42,5 31,6 8,5 Ziege KESKINTEPE et al. (1997) In vitro 57,7 - 15,5

SQUIRES et al. (1996) In vitro 25 - -

MEINTJES et al. (1996) In vitro 39 - -

Pferd

GRØNDAHL et al. (1997) In vitro 16 - -

IRITANI et al. (1998) In vivo 87 - 7

Kaninchen

DENG u. YANG (2001) In vivo 68 29 39

Katze POPE et al. (1998) In vivo 58,1 - 16

KIM et al. (1998b) In vitro 73 67 38

In vivo 43,1 5,4 0

KLOCKE (1999)

In vitro 38,9 10,9 0

In vitro 16 14 -

KOLBE u. HOLTZ (1999)

In vivo 14 2 -

Schwein

MARTIN (2000) In vivo 69 - 38

In Tabelle 7 sind die entsprechenden frühembryonalen Entwicklungsraten nach ICSI bei verschiedenen Haustieren mit zusätzlicher Aktivierung der Oozyten aufgeführt. Daraus wird ersichtlich, dass bei bovinen Oozyten mittels zusätzlicher Aktivierung stabile Blastozystenraten von ca. 5-15 % erreicht werden. RHO et al. (1998a) erreichten dagegen nach Vorbehandlung der bovinen Spermien mit DTT eine relativ hohe Blastozystenrate von 24 %. Bei keiner der aufgeführten Arbeitsgruppen ergaben sich, sofern untersucht, Blastozysten aus kontrollinjizierten Oozyten.

Beim Pferd ist bisher von keiner Arbeitsgruppe das Blastozystenstadium erreicht worden. Bei der Ziege wurde auf Parthenogenesekontrollen verzichtet, so dass über die Effizienz dieser Versuche keine Aussage gemacht werden kann.

KIM et al. (1999c) zeigten in ihren Versuchen die positive Entwicklungspotenz von porzinen Oozyten, die mit Spermatiden injiziert wurden, nachdem sie zuvor mit elektrischem Puls künstlich aktiviert worden waren. Dabei erzielten sie eine Blastozystenrate von 30 %, wobei sich nur 9 % der kontrollinjizierten und aktivierten Oozyten parthenogenetisch zu Blastozysten entwickelten.

In Tabelle 8 sind die bisher publizierten Ergebnisse bezüglich Nachkommen nach ICSI bei Haussäugetieren zusammengefasst. Dabei fällt auf, dass bisher nur bei Rind und Schaf mit in vitro gereiften Oozyten der Embryotransfer erfolgreich war, wobei zudem in der Regel spätere embryonale Entwicklungsstadien übertragen wurden. Dies ist ein Hinweis, dass bei diesen Tierarten adäquate In-vitro-Kultivierungs- und Reifungsmethoden zur Verfügung stehen.

Bei anderen Tierarten dagegen konnten bisher nur aus in vivo gereiften Oozyten, die zudem meist als Zygoten übertragen wurden (Ausnahme Katze: Transfer von Morulae), Nachkommen nach ICSI erzeugt werden.