Konventionelle ICSI versus ICSI mit CultActive

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Merve Günay

Konventionelle ICSI versus ICSI mit CultActive

Einsatz von CultActive als ein vielversprechendes Medium bei der künstlichen Befruchtung?

Masterarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades eines Master of Science

im Rahmen des Universitätslehrganges Klinische Embryologie

Wissenschaftlicher Begutachter:

Univ.-Prof. Mag. Dr. Thomas Ebner

Karl-Franzens-Universität Graz und UNI for LIFE

Ludwigshafen am Rhein, September 2020

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Ehrenwörtliche Erklärung

Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die angegebenen Quellen nicht benutzt und die den Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Die Arbeit wurde bisher in gleicher oder ähnlicher Form keiner anderen inländi- schen oder ausländischen Prüfungsbehörde vorgelegt und auch noch nicht veröffent- licht. Die vorliegende Fassung entspricht der eingereichten elektronischen Version.

21.09.2020 Merve Günay

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Danksagung

In Erinnerung an meine geliebte Mutter.

Ich möchte mich bei all jenen bedanken, die mich sowohl fachlich als auch persönlich bei der Anfertigung meiner Masterarbeit unterstützt haben.

Als erstes gebührt mein Dank meinem wissenschaftlichen Betreuer Univ.-Prof. Mag.

Dr. Thomas Ebner für die Hilfsbereitschaft, welche er mir stets entgegenbrachte und die Begutachtung meiner Masterarbeit.

Ebenso danke ich Ao.Univ.-Prof. Mag. DDr. Erwin Petek für die Bereitschaft, die Ver- antwortung des Zweitgutachters zu übernehmen. Auch bedanke ich mich bei Dr.

Nicole Hirschmann (Laborleitung Kinderwunschzentrum Ludwigshafen) für die Unter- stützung im Rahmen der Themenfindung für meine Arbeit.

Mein besonderer Dank gilt meiner Familie, die mich immer in allen Situationen unter- stützen und mir jederzeit beratend zur Seite standen. Für die Liebe und Kraft, die Sie mir jeden Tag schenkten und die aufmunternden Worte, die Sie mir entgegenbrachten.

Herzlich bedanken möchte ich mich auch bei meinem Vater und meinen Geschwistern Sevde und Sena, die mich stets ermutigt haben weiterzumachen.

Ein besonderer Dank gebührt insbesondere meinem Ehemann Halil dafür, dass er mir dieses Studium ermöglicht und zur Qualitätssicherung meiner Arbeit wesentlich beige- tragen hat.

Herzlich bedanken möchte ich mich auch bei meinen wunderbaren Töchtern Sara und Lina, die es in dieser Zeit nicht immer leicht mit mir hatten.

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Zusammenfassung

Viele Kinderwunschpaare können ihren Wunsch nicht auf natürliche Wege erfüllen.

In Deutschland ist etwa jedes siebte Paar ungewollt kinderlos. Immer mehr Paare suchen Hilfe bei der assistierten Reproduktion. Diesen wird hierbei, je nach Anam- nese und gründlicher Untersuchung, eine Therapie empfohlen. Dabei wird grund- sätzlich zwischen der Insemination, In-vitro-Fertilisation (IVF) und Intrazytoplasma- tische Spermieninjektion (ICSI) unterschieden. Die Ursache der ungewollten Kin- derlosigkeit liegt zu 35 % bei der Frau und zu 35 % beim Mann. In 20 % der Fälle sind beide als Ursache zu sehen und bei 10 % ist der Grund idiopathisch.

Die vorliegende Masterarbeit setzt den Fokus auf das ICSI-Verfahren und vergleicht die konventionelle ICSI-Methode mit der ICSI-Methode unter Einsatz von CultActive, einem Calcium-Ionophor Medium. Im Unterschied zur konventionellen Methode wird hierbei aufgrund der Tatsache, dass das Calcium für die Befruchtung der Eizelle und der Weiterentwicklung der Embryonen von essenzieller Bedeutung ist, dieses intrazellulär künstlich erhöht. Dadurch soll ein möglicher Calcium Mangel verhindert werden.

Zudem beschäftigt sich die Arbeit mit der Frage, ob die Anwendung von CultActive unter bestimmten Indikationen sinnvoll ist. Dabei werden unterschiedliche Aspekte wie die Fertilisationsrate, Schwangerschaftsrate, klinische Schwanger- schaftsrate und die Lebendgeburtenrate in Betracht gezogen.

Im Rahmen dieser Studie wurden insgesamt 248 Patienten mit einem Durch- schnittsalter von 33 (± 4,5) Jahren herangezogen. Dabei wurden diese in Gruppe 1 (Therapie ohne CultActive) und Gruppe 2 (Therapie mit CultActive) aufgeteilt. Bei allen Patienten liegen grundsätzlich Indikationen wie Befruchtungsversagen, verminderte Befruchtungsrate, Entwicklungsprobleme oder schwere männliche Inferti- lität (wie Kryptozoospermie, Azoospermie oder TESE-Spermien) vor.

Das Ergebnis dieser Studie besagt, dass bei Vorliegen eines totalen Befruch- tungsversagens im Vorzyklus, einer verminderten Befruchtungsrate (≤ 30,0 %) o- der von Entwicklungsproblemen im Vorzyklus durch den Einsatz von CultActive ein Benefit (höhere Erfolgsquoten) erzielt werden konnte. Bei schwerer männlicher Infertilität wurde im Rahmen dieser Studie ein gegenteiliges Ergebnis erzielt. Dies ist jedoch mit großer Wahrscheinlichkeit darauf zurückzuführen, dass Gruppe 2 deutlich schwerwiegendere Infertilitätsfaktoren aufwiesen als Gruppe 1.

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Abstract

Many couples who wish to have children cannot fulfil their wishes in a natural way.

In Germany about every seventh couple is unintentionally childless. More and more couples are seeking help with assisted reproduction. Depending on the anamnesis and thorough examination, a therapy is recommended to these couples. Basically there are three treatment therapies to be distinguished: Insemination, In-vitro-fertilization (IVF) and Intracytoplasmic sperm injection (ICSI). The cause of unwanted childlessness is 35 % female and 35 % male. In 20 % of the cases both are to be seen as the cause and in 10 % the reason is idiopathic.

This master thesis focuses on the ICSI procedure and compares the conventional ICSI method with the ICSI method using CultActive, a ready-to-use calcium ionophore medium. In contrast to the conventional method, with CultActive calcium is increased artificially within the cell which may facilitate the fertilization of the egg cell and the further development of the embryos. This is to prevent a possible calcium deficiency.

A total number of 248 patients with an average age of 33 (± 4,5) years were included in this study. Of these, no CultActive was used in 151 (group 1). They were divided into group 1 (therapy without CultActive) and group 2 (therapy with CultActive). All patients had indications such as fertilization failure in the pre-cycle, reduced fertilization rate, developmental problems or severe male infertility (such as cryptozoo- spermia, azoospermia or TESE sperm).

The results of this study indicate that in cases of a total fertilization failure in the pre- cycle, reduced fertilization rate (≤ 30,0 %) or developmental problems in the pre- cycle, a benefit (higher success rates) could be achieved by using CultActive. In cases of severe male infertility, this study showed the opposite result. However, this is most likely due to the fact that group 2 had significantly more severe infertility factors than group 1.

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... 3

Abbildungsverzeichnis ... 5

Tabellenverzeichnis ... 6

Abkürzungsverzeichnis ... 7

1 Einleitung ... 9

2 Die Reife von Gameten ... 10

2.1 Oogenese ... 11

2.2 Spermatogenese ... 14

3 Die Fertilisation ... 18

3.1 Kapazitation ... 18

3.2 Akrosomenreaktion ... 19

3.3 Fusion ... 19

3.4 Die Imprägnation ... 21

3.5 Eizellaktivierung ... 21

3.5.1 Mechanische Aktivierung ... 24

3.5.2 Elektrische Aktivierung ... 24

3.5.3 Chemische Aktivierung ... 25

3.6 Entstehung der Vorkerne und die Befruchtungskontrolle ... 26

3.7 Syngamie... 30

4 Methoden der Assistierten Reproduktionstechnik ... 30

4.1 Intrauterine Insemination (IUI) ... 31

4.2 In-vitro-Fertilisation (IVF) ... 31

4.3 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ... 32

5 Material und Methoden ... 32

5.1 Material ... 32

5.1.1 Technische Geräte ... 33

5.1.2 Verbrauchsmaterialien ... 34

5.1.3 Medien ... 35

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5.2 Methoden... 35

5.2.1 Hormonelle Stimulation, Ovulationsinduktion und Lutealphase .. 36

5.2.2 Eizellentnahme ... 38

5.2.3 Spermienaufbereitung ... 39

5.2.3.1 Dichtegradientenaufbereitung aus dem Ejakulat ... 39

5.2.3.2 Dichtegradientenaufbereitung von TESE-Spermien ... 41

5.2.4 Denudation der Eizellen ... 43

5.2.5 ICSI ... 43

5.2.6 Calcium-Ionophor (CultActive) und ihre Anwendung ... 45

5.2.7 Das Vitrifizieren und Erwärmen von Eizellen ... 47

5.2.8 Die Beurteilung und der Transfer von Embryonen ... 49

5.2.8.1 Embryoentwicklung und Bewertungssysteme... 49

5.2.8.2 Assisted Hatching ... 52

5.2.8.3 Embryotransfer ... 53

6 Auswertung der Studienergebnisse ... 54

6.1 Fertilisationsrate ... 54

6.2 Schwangerschaftsraten ... 56

6.2.1 Schwangerschaftsrate ... 57

6.2.2 Klinische Schwangerschaftsrate ... 57

6.2.3 Lebendgeburtenrate ... 58

7 Zusammenfassung und Fazit ... 59

Literaturverzeichnis ... 65

Anhang ... 69

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Follikelreifungsstadien ... 13

Abbildung 2: Beschreibung der Oogenese ... 14

Abbildung 3: Querschnitt durch ein Hodenkanälchen beim Erwachsenen ... 15

Abbildung 4: Spermatogenese im Überblick... 17

Abbildung 5: Spermienfunktion und -interaktion mit der Eizelle... 20

Abbildung 6: Eizell-Spermium-Fusion und Aktivierung der Eizelle ... 22

Abbildung 7: Vorkerne und ihre Nukleoli (16-20 Stunden nach Imprägnation) ... 27

Abbildung 8: Scoring-Systeme zu möglichen Vorkernausprägungen ... 29

Abbildung 9: Spermien nach Dichtegradientzentrifugation ... 40

Abbildung 10: ICSI-Schale bei Spermien aus dem Ejakulat ... 41

Abbildung 11: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ... 44

Abbildung 12: ICSI-Schale bei TESE-Spermien ... 45

Abbildung 13: CultActive-Schale ... 46

Abbildung 14: Teilungsschema von Embryonen ... 50

Abbildung 15: Diagramm Fertilisationsrate ... 55

Abbildung 16: Diagramm Schwangerschaftsraten ... 56

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Sequentielle Abläufe der Fertilisierung ... 23

Tabelle 2: Konsens-Bewertungssystem für Vorkerne ... 30

Tabelle 3: Übersicht der eingesetzten Geräte ... 34

Tabelle 4: Übersicht der eingesetzten Verbrauchsmaterialien ... 35

Tabelle 5: Übersicht der eingesetzten Medien ... 35

Tabelle 6: Konsensbewertungssystem für Embryonen im Cleavage-Stadium ... 49

Tabelle 7: Konsensbewertungssystem für Tag-4-Embryonen ... 51

Tabelle 8: Konsensbewertungssystem für Blastozysten ... 51

Tabelle 9: Fertilisationsrate (Kryptozoo-, Azoospermie und TESE) ... 56

Tabelle 10: SS-Rate (Kryptozoo-, Azoospermie und TESE) ... 57

Tabelle 11: Klinische SS-Rate (Kryptozoo-, Azoospermie und TESE) ... 58

Tabelle 12: Lebendgeburtenrate (Kryptozoo-, Azoospermie und TESE) ... 59

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Abkürzungsverzeichnis

AH Assisted Hatching

AOA Artificial Oocyte Activation

ART Assistierte Reproduktionstechnik

ATP Adenosintriphosphat

CA CultActive

Ca²⁺ Calcium

cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat

CD9 Tetraspanin-29

COC Cumulus-Oozyent-Komplex

DAG Diacylglycerin

DNA Deoxyribonucleic Acid

DS Diluent Solution

ES Equilibration Solution

ESchG Embryonenschutzgesetz

FSH Follikel stimulierendes Hormon

GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormon

hCG Humanes Choriongonadotropin

HFEA Human Fertilization and Embryology Authority

ICM Inner Cell Mass

ICSI Intrazytoplasmatische Spermieninjektion

IP3 Inositoltrisphosphat

IUI Intrauterine Insemination IVF In-vitro-Fertilisation

LH Luteinisierendes Hormon

MESA Mikrochirurgische Epididymale Spermienaspiration

mICSI Mitochondriale ICSI

NOA Nicht-obstruktive Azoospermie

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NPB Nucleolar Precursor Body

NS Nicht signifikant

OA Obstruktive Azoospermie

OHSS Ovarielles Hyperstimulationssyndrom PIP2 Phosphatidylinositolbisphosphat

PLCζ Phospholipase C zeta

PN Pronukleus

PVP Polyvinylpyrrolidon

RNA Ribonucleic Acid

rpm Revolutions per minute

SET Single-Embryo-Transfer

SS Schwangerschaft

TE Trophektoderm

TS Thawing Solution

TESE Testikuläre Spermienextraktion VS Vitrification Solution

WHO World Health Organization

WS Wash Solution

ZP Zona pellucida

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Einleitung

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1 Einleitung

Weltweit sind bislang mehr als 6,5 Millionen Kinder durch künstliche Befruchtung mit der In-vitro-Fertilisation (IVF) oder der Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) auf die Welt gekommen.¹ Für viele und immer mehr Menschen stellen die Methoden der Reproduktionsmedizin den einzigen Ausweg aus der Kinderlosigkeit dar. Aus diesem Grund ist die Wissenschaft stets bemüht, Methoden und Verfahren der Reproduktionsmedizin weiter zu verbessern und die Erfolgsraten zu erhöhen.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung, ob der Einsatz von CultActive bei der ICSI-Methode, im Vergleich zur konventionellen ICSI-Methode ohne CultActive Einsatz, bei bestimmten Indikationen einen höheren Erfolg ver- spricht. Das Ziel ist es, die Auswirkungen des CultActive Einsatzes anhand von As- pekten wie Fertilisationsrate, Schwangerschaftsrate, klinische Schwangerschafts- rate und die Lebendgeburtenrate näher zu beleuchten und dadurch den Unterschied zur konventionellen ICSI-Methode transparent zu machen. Dazu wurden insgesamt 248 Patienten mit einem Durchschnittsalter von 33 (± 4,5) Jahren herangezogen.

Zugrunde lagen hierbei folgende Indikationen: Totales Befruchtungsversagen im Vorzyklus, verminderte Befruchtungsrate (≤ 30,0 % im Vorzyklus), Entwicklungs- probleme im Vorzyklus mit einem Arrest im 2PN-Stadium oder Embryostadium und schwere männliche Infertilität (Kryptozoospermie, Azoospermie oder TESE-Sper- mien). Aus den erhobenen Daten wurden zwei Gruppen hergeleitet. Gruppe 1 mit 213 Patienten stellt dabei jene Gruppe dar, bei denen kein CultActive im Rahmen der Therapie eingesetzt wurde. Gruppe 2 mit 97 Patienten hingegen beinhaltet Pa- tienten, die einer Therapie mit Einsatz von CultActive unterzogen wurden. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass Patienten aus Gruppe 1 (Ausnahme stellen hierbei Patienten mit schwerer männlicher Infertilität dar), aufgrund ihrer später er- neut durchgeführten Therapie mit Einsatz von CultActive, ebenfalls in Gruppe 2 inkludiert (retrospektiv analysiert) sind. Dies ermöglicht, bis auf die genannte Aus- nahme, einen direkten Vergleich der Ergebnisse beider Gruppen. In Bezug auf die

1Vgl. Pagenstedt, G.: Zahlen und Erfolgschancen der künstlichen Befruchtung in Deutschland, https://fertila.de/zahlen-und-erfolgsquoten-zur-kinderwunsch-behandlung-in-deutschland/, 4. Juli 2020.

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Die Reife von Gameten

10 Ausnahme ist zu berücksichtigen, dass bei Gruppe 2 vergleichsweise schwerwiegendere Infertilitätsfaktoren – wie Kryptozoospermie (< 500000 pro ml), Azoosper- mie (vereinzelte, zum Teil immotile Spermien nach Aufbereitung auffindbar) oder TESE-Spermien (überwiegend immotile Spermien) – als bei Gruppe 1 vorlagen.

Zum besseren Verständnis der Grundlagen einer erfolgreichen Befruchtung, wird zunächst in Kapitel 2 auf das Thema der Reife von Gameten und somit die Game- togenese (Oogenese und Spermatogenese) eingegangen. Anschließend wird in Kapitel 3 die Fertilisation beschrieben, um den Unterschied zur ICSI-Methode (siehe Kapitel 5) zu verdeutlichen. Zudem werden die unterschiedlichen Möglichkeiten (physiologisch und künstlich (unter anderem mit CultActive Einsatz)) der Eizellakti- vierung, welcher ein wichtiger Prozess auf dem Weg zur erfolgreichen Befruchtung der Eizelle ist, näher beschrieben. Abgeschlossen wird dieses Kapitel mit der Be- schreibung und Beurteilung der Vorkernbildung und der darauffolgenden Embryo- bildung (Syngamie). Um einen Überblick über das Spektrum von möglichen Metho- den der Assistierten Reproduktionstechnik (ART), wozu auch die ICSI-Methode ge- hört, zu geben, werden diese in Kapitel 4 kurz erläutert. In Kapitel 5 werden alle in dieser Studie verwendeten Materialien aufgelistet und Methoden, von der Stimula- tion der Eizellen bis zum Embryotransfer, erläutert. Das Hauptaugenmerk dieser Masterarbeit stellt Kapitel 6 dar, in welchem die Auswertung der Ergebnisse dieser Studie erfolgt. Die statistischen Ergebnisse beider (oben erwähnten) Patientengrup- pen über die Fertilisationsrate, Schwangerschaftsrate, klinische Schwangerschafts- rate und Lebendgeburtenrate werden gegenübergestellt. Zudem erfolgt eine Bewer- tung der genannten Quoten vor dem Hintergrund von vier Indikationen (Befruch- tungsversagen, verminderte Befruchtungsrate, Entwicklungsprobleme (2PN- oder Embryoarrest) und schwere männliche Infertilität). Abschließend erfolgt in Kapitel 7 eine Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Studie, woraus ein Fazit gezogen wird.

2 Die Reife von Gameten

Eine Fertilisation kann grundsätzlich nur stattfinden, wenn beide Gameten die ge- netische und die zytoplasmatische Reifung beendet haben. Spermien beenden die Meiose, bevor sie in die Eizelle eindringen. Eizellen beenden die Kernreifung

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11 (zweite meiotische Teilung) erst nach der Fertilisation. Die genannten Reifungspro- zesse werden in den folgenden Unterkapiteln jeweils näher beschrieben.

2.1 Oogenese

Die Oogenese umfasst die Bildung und Reifung von Eizellen. Die Bildung von Ei- zellen findet im Wesentlichen pränatal statt. Dabei entstehen aus Oogonien (Stammzellen der Oogenese) befruchtungsfähige Eizellen. Die Oogonien vermeh- ren sich durch die Mitose in den Eierstöcken. Diese Vermehrungsperiode durch mitotische Teilungen wird vor der Geburt abgeschlossen. Noch während der Embryo- nalzeit treten Oogonien als primäre Oozyten in die Prophase der ersten Reifeteilung (Meiose) ein. Hier sind sie von einem einschichtigen flachen Follikelepithel als Primordialfollikel bezeichnet wird. Im Primordialfollikel arretiert die Meiose im letzten Abschnitt der Prophase, dem sogenannten Diktyotänstadium. Somit wird an dieser Stelle die Weiterentwicklung der Eizelle unterbrochen. Sie bleiben von der Geburt bis zur Pubertät in diesem Ruhestadium (Diktyotän). In der Pubertät wird in jedem Ovarialzyklus die Reifung von 15 bis 20 Primordialfollikel durch die Ausschüttung von FSH (Follikel stimulierendes Hormon) aus der Hypophyse stimuliert.² Ab diesem Zeitpunkt werden die Epithelzellen, welche die Eizelle umgeben, kubisch, was in seiner Gesamtheit nunals Primärfollikel bezeichnet wird. Zudem wird nun die Ba- salmembran zwischen dem Epithel und dem Stroma lichtmikroskopisch sichtbar.

Ebenso deutet sich eine Glykoproteinhülle, die sogenannte Zona pellucida, an.

Während die Eizelle weiter wächst, wird im nächsten Schritt das Epithel mehrschich- tig (Stratum granulosum) und die Zona pellucida deutlicher erkennbar. Nun befindet sich die Eizelle im sogenannten Sekundärfollikel. Im nächsten Schritt der Entwick- lung entsteht eine Follikelhöhle (Antrum folliculare), welche mit einer Flüssigkeit (Li- quor folliculare) gefüllt ist, was man als Tertiärfollikel kennt. Die Oozyte liegt dabei in einem Zellhaufen aus Granulosazellen, dem sogenannten Eihügel (Cumulus oo- phorus). Die Granulosazellen bilden die Corona radiata, welche auch nach der Ovu- lation auf dem Weg in die Tube an der Oozyte bleibt. Des Weiteren entwickelt sich das umgebende Bindegewebe der Follikelhöhle zu Theca interna und Theca ex- terna. Die gefäß- und zellreiche Theca interna produziert Androgene, welche über

2Vgl. Sadler, T. W. (2014): Taschenlehrbuch Embryologie, 12. Auflage, Stuttgart New York, S. 29 f.

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12 Diffusion durch die Basalmembran in die Granulosazellen gelangen. Dort werden sie zu Östrogen (besonders Östradiol) aromatisiert.³ Durch weitere Größenzu- nahme entstehen nun die sprungreifen Graafschen Follikel. Die Regulierung erfolgt über das FSH aus der Hypophyse, wobei nur ein Leitfollikel von den 15 bis 20 heranreifenden Follikel bis zur Ovulation reift. Die restlichen Follikel degenerieren. Un- mittelbar vor der Ovulation wird die erste Reifeteilung der Oozyte mit dem Ausstoß von einem Polkörperchen beendet. Nahtlos tritt die sekundäre Oozyte in die zweite Reifeteilung ein und verharrt bis zur Fertilisierung in der Metaphase II. Die zweite Reifeteilung ist erst mit der Befruchtung und dem Ausstoß des zweiten Polkörper- chens beendet. Ist die Oozyte reif, beginnen die Thecazellen etwa 24 Stunden vor der Ovulation vermehrt Östrogen zu produzieren. Dieser Östrogenanstieg verur- sacht in der Hypophyse eine Ausschüttung des sogenannten luteinisierenden Hor- mons (LH), welches seinerseits den Follikelsprung induziert. Das Ausstoßen der reifen Oozyte mitsamt Zona pellucida und Corona radiata aus dem Follikel wird Ovulation genannt. Sie wird vom Eileiter, genauer dessen Fimbrientrichter aufge- nommen und in den Pars ampullaris weitergeführt. Nach der Ovulation bildet sich der Gelbkörper aus dem Follikel (Granulosa- und Thecazellen). Dieser bildet Pro- gesteron, welche verhindert, dass die zuvor aufgebaute Gebärmutterschleimhaut abgebaut wird. Ohne eine Befruchtung beziehungsweise ohne Implantation des Embryos (nach etwa 9 Tagen), baut sich der Gelbkörper ab, womit auch der Pro- gesteronwert fällt.⁴ Infolgedessen kommt es zur Menstruation. Wird jedoch die Ei- zelle befruchtet und nistet sich ein Embryo ein, kommt es zur Ausschüttung des humanen Choriongonadotropin Hormons (hCG), welches anstelle des LH den Gelb- körper weiter stimuliert. Somit wächst der Gelbkörper und wird zum Corpus luteum graviditatis. In den ersten zwei Monaten der Gravidität ist er allein für die Produktion von Progesteron und Östrogene zuständig. Später wird die Produktion immer mehr von der Plazenta übernommen.⁵

3Vgl. Lüllmann-Rauch, R./Asan, E. (2019): Taschenlehrbuch Histologie, 6. Auflage, Stuttgart New York, S. 594 ff.

4Vgl. Lüllmann-Rauch, R./Asan, E. (2019): Taschenlehrbuch Histologie, 6. Auflage, Stuttgart New York, S. 600.

5Vgl. Lüllmann-Rauch, R./Asan, E. (2019): Taschenlehrbuch Histologie, 6. Auflage, Stuttgart New York, S. 600 f.

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13 Die einzelnen Phasen der Eizellreifung und der Oogenese werden in Abbildung 1 und Abbildung 2 veranschaulicht.

Abbildung 1: Follikelreifungsstadien

Quelle: Lecturio (2017): Embryologie: Spermatogenese und Oogenese, https://www.lecturio.de/ma- gazin/spermatogenese-und-oogenese/, 4. Juli 2020.

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14 Abbildung 2: Beschreibung der Oogenese

Quelle: Lüllmann-Rauch, R./Asan, E. (2019): Taschenlehrbuch Histologie, 6. Auflage, Stuttgart New York, S. 593.

2.2 Spermatogenese

Die Spermatogenese umfasst die Bildung der Spermien von der Spermatogonie bis zum reifen Spermium, welche circa 10 Wochen dauert. Dieser Reifungsprozess findet von der Pubertät bis ins hohe Alter im Keimepithel der Hodenkanälchen statt.

Die Hoden befinden sich außerhalb der Körperhöhle, da zur Bildung der Spermien eine reduzierte Körpertemperatur erforderlich ist. Die mitotischen Teilungen spielen sich nahe der Basalmembran ab. Die anschließende Meiose und Spermiogenese findet weiter in Richtung Lumen statt, wo die reifen Spermien schließlich ausge- schleust werden. Im Keimepithel der Hodenkanäle liegen Keimzellen verschiedener Reifegrade. Zudem befinden sich dort auch Sertoli-Zellen, welche zur Ernährung und dem Schutz der entstehenden Keimzellen dienen und ihre Reifung regulieren.

Weitere Aufgaben umfassen die Bildung von androgenbindendem Protein und Inhi- bin. Des Weiteren befinden sich Leydig-Zellen im lockerem Bindegewebe, welches die Hodenkanälchen umgibt. Abbildung 3 dient zur Verdeutlichung der Entwicklung

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15 der Keimzellen, beginnend mit den Spermatogonien außen an der Basalmembran des Samenkanälchens. Keimzellen schreiten lumenwärts mit der Reife der Sper- mien, sodass das reife Spermium im Lumen zu sehen ist.⁶

Abbildung 3: Querschnitt durch ein Hodenkanälchen beim Erwachsenen

Quelle: Universitäten Fribourg, Lausanne und Bern: Embryogenese – Spermatogenese, http://www.embryology.ch/allemand/cgametogen/spermato01.html, 4. Juli 2020.

Die Spermatogenese kann in drei Phasen unterteilt werden. Diese werden nachfolgend näher erläutert:⁷

1) Proliferation (Vermehrung der Spermatogonien): Im Keimepithel des ge- schlechtsreifen menschlichen Hodens wird zwischen zwei Populationen von Spermatogonien unterschieden. Typ-A-Spermatogonien, die der Basalmemb- ran des Samenkanälchens anliegen, sind die Stammzellen. Diese dienen der Vermehrung durch mitotische Teilung, welche basal in den Tubuli seminiferi stattfindet. Nach der Teilung (Mitose) bleibt eine Tochterzelle als Stammzelle erhalten, wohingegen sich die andere Zelle mehrfach teilt und somit die Typ-B- Spermatogonien entstehen. Diese haben meist nur geringe Verbindung zur Ba-

6Vgl. Lüllmann-Rauch, R./Asan, E. (2019): Taschenlehrbuch Histologie, 6. Auflage, Stuttgart New York, S. 572.

7Vgl. Lüllmann-Rauch, R./Asan, E. (2019): Taschenlehrbuch Histologie, 6. Auflage, Stuttgart New York, S. 572 ff.

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16 salmembran. Außerdem verdoppeln die Typ-B-Spermatogonien ihre DNA, gelangen durch die Blut-Hoden-Schranke und werden somit primäre Spermatozy- ten.

2) Meiose (Reifeteilung der Spermatozyten): Primäre Spermatozyten (2n, 2C) teilen sich während der ersten Meioseteilung in zwei sekundäre Spermatozyten (1n, 2C), die sich während der zweiten Meioseteilung in je zwei Spermatiden (1n, 1C) teilen. Somit wird die Chromatinausstattung der Keimzellen von 2n2C auf 1n1C reduziert, wodurch aus zwei sekundären Spermatozyten schließlich vier Spermatiden entstehen.

3) Spermiogenese (Differenzierung): Runde Spermatiden werden in längliche Spermien mit verdichtetem Kern und einer Geißel umgewandelt. Hierbei handelt es sich nicht um eine Teilung, sondern um eine Differenzierung in Sperma- tozoen (Spermien), welche etwa 2 Wochen dauert und wie folgt beschrieben werden kann:

 Spermatiden-DNA wird stark kondensiert. Diese starke Kompaktierung der DNA erfolgt durch kleine stark basische Protamine, welche die Histone größtenteils ersetzen.

 Das Akrosom beinhaltet hydrolytische Enzyme (unter anderem Akrosin), welche bei der Befruchtung für die Eizell-Penetration wichtig sind. Sie wird vom Golgi-Apparat gebildet und entsteht durch die Fusion von Lysoso- men.

 Das Mittelstück des Spermiums dient als Kontrollmechanismus für die Mo- tilität. Mitochondrien ordnen sich manschettenartig um den proximalen Teil des Axonemas an.

 Im Rahmen der Geißelbildung entsteht das für die Motilität verantwortliche Apparat aus Mikrotubuli und Dynein (Axonema).

 Bei der Freilassung schnürt sich überschüssiges Cytoplasma als Restkör- per (Residualkörper) ab und wird von Sertoli-Zellen phagozytiert und abgebaut.

Die nachfolgende Abbildung 4 dient der zusätzlichen visuellen Veranschaulichung der Spermatogenese.

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17 Abbildung 4: Spermatogenese im Überblick

Quelle: TeachMe Physiology: Gametogenese, https://teachmephysiology.com/reproductive-system/embryology/gametogenesis/, 4. Juli 2020.

Obwohl die notwendigen morphologischen Strukturen für die Aktivität der Geißel während der Spermiogenese im Hoden aufgebaut werden, sind testikuläre Sperma- tozoen nicht vollständig differenziert und somit hauptsächlich unbeweglich. Sper- matozoen erlangen erst über ihren intensiven Kontakt mit der Wand des Nebenho- dens (Nebenhodenepithel) und den von ihr gebildeten Substanzen mittels vielfälti- ger Prozesse ihre Motilität.⁸ Der Nebenhoden besteht aus Kopf, Körper und dem Schwanz. Die Spermatozoen beginnen im Kopf des Nebenhodens Motilität zu zei- gen und sollten mit Erreichen des Schwanzes vollständig progressiv vorwärtsbe- weglich sein. Die Motilität wird durch cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), systolisches Ca²⁺ und dem pH bestimmt.⁹ Außerdem dient der Nebenhoden als Speicherort für die Spermatozoen, welche ihre Befruchtungsfähigkeit schließlich

8Vgl. Lüllmann-Rauch, R./Asan, E. (2019): Taschenlehrbuch Histologie, 6. Auflage, Stuttgart New York, S. 580 f.

9Vgl. Buffone, M. G. u.a. (2014): Central role of soluble adenylyl cyclase and cAMP in sperm physiology, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4262597/, 4. Juli 2020.

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Die Fertilisation

18 erst mit der Kapazitation im weiblichen Genitaltrakt erreichen. Dies stellt somit die Endphase der Spermienreifung dar.

3 Die Fertilisation

Bis ein Spermium eine Eizelle befruchten kann, muss es zunächst in einzelnen Ab- schnitten des weiblichen Genitaltraktes eine Vielzahl an Prozessen durchlaufen.

Diese sind unter anderem das aktive Schwimmen (Motilität), der sekundäre Rei- fungsprozess (Kapazitation), die Wegfindung zur Eizelle (z.B. durch Chemotaxis), die Akrosomreaktion sowie die Bildung einer Fusionspore mit dem Oolemma. In den folgenden Unterkapiteln werden die wesentlichen Phasen und Prozesse auf dem Weg zur Befruchtung der Eizelle näher erläutert.

3.1 Kapazitation

Die Kapazitation ist die Endphase der Spermienreifung und gleichzeitig die Voraus- setzung für die Akrosomreaktion, da ein frisch ejakuliertes Spermium nicht in der Lage ist, eine Eizelle auf natürlichem Wege zu fertilisieren. Nach der Ejakulation beginnt das Flagellum, bedingt durch den pH-Wert des Seminalplasmas (6,7 - 7,4), zu schlagen und das Spermium schwimmt aktiv. Durch den Kontakt des Spermiums mit dem Epithel des Eileiters, beginnt ein komplexer physiologischer Reifungspro- zess, die sogenannte Kapazitation. Dieser führt zu strukturellen und funktionellen Veränderungen des Spermiums und dauert etwa fünf bis sechs Stunden.

Das Spermium erlangt erst danach die Kompetenz, eine Eizelle zu fertilisieren. Bei der Kapazitation kommt es zu Veränderungen der Glykoproteinzusammensetzung in der Zellmembran der Spermien. Verschiedene Ca²⁺-abhängige, in der Spermien- membran eingelagerte Kanäle sind für die Kapazitation mitverantwortlich.¹⁰ Hierbei ändert sich zudem das Bewegungsmuster und die Schwimmkraft des Spermiums grundlegend. Es entsteht ein mikroskopisch sichtbares Motilitätsmuster, welches aus kraftvollen Schlägen des Spermienschwanzes und großen Ausschlägen mit schnellen, aber nicht progressiven Bewegungen besteht. Diese Bewegung wird als Hyperaktivität bezeichnet. Somit unterscheidet sich die Beweglichkeit von unkapa- zitierten (frisch ejakulierten) zu kapazitierten Spermien deutlich. Letztere weisen

10Vgl. Elder, K. u.a. (2018): In-Vitro Fertilization, Third Edition, Cambridge, S. 51 f.

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Die Fertilisation

19 eine hohe Frequenz und niedrige Amplitude auf, womit das Spermium eine höhere Durchdringungskraft erhält. In der Hyperaktivität des Spermiums besteht somit die sichtbare Folge der Kapazitation.¹¹

3.2 Akrosomenreaktion

Die Auslösung der Akrosomenreaktion erfolgt durch den Kontakt des Spermiums mit der Zona pellucida. Dessen Proteine sind für das Induzieren des Prozesses verantwortlich. Im Gegensatz zur Kapazitation, die einen reversiblen und über Stunden andauernden Prozess darstellt, erfolgt die Akrosomenreaktion schnell und irrever- sibel. Hierbei werden lytische Enzyme aus dem Akrosom des Spermiums zur Pe- netration der Zona pellucida umfasst. Trifft das Spermium bis zu 24 Stunden nach der Ovulation auf eine befruchtungsfähige Eizelle, muss es zunächst die Schicht der Cumuluszellen und die Corona radiata durchdringen. Dies gelingt mit Hilfe des Hyaluronidase-Enzyms. Erst im Anschluss kann die Bindung an die Zona pellucida erfolgen und die Akrosomenreaktion ausgelöst werden.¹² Dies geschieht durch den Kontakt des Spermiums mit dem spermienbindenden Zona-pellucida-Protein (ZP3).

Mit der Kapazitation wird der Bereich der akrosomalen Kopfkappe verändert, sodass die nun folgende Akrosomreaktion ermöglicht wird. Durch die Verschmelzung von Spermienzellmembran und der äußeren Membran des Akrosoms entstehen Po- ren an vielen Stellen des Spermiumkopfes. Dadurch können Inhaltstoffe des Akro- soms (vor allem Hyaluronidase) austreten. Außerdem werden Enzyme (Akrosin) ausgeschüttet, welche dem Spermium das Durchdringen der Zona pellucida ermög- licht.¹³

3.3 Fusion

Der erste Kontakt des Spermiums und der Eizelle wird unter anderem durch In- tegrine auf der Oozyte und den Disintegrinen Spermiums hergestellt. Nach dem Zellkontakt verschmelzen die Zellmembrane des Spermiums an der postakrosoma- len Stelle und des Oolemmas der Eizelle miteinander. Es wird angenommen, dass

11Vgl. Nieschlag, E. u.a. (2009): Andrologie, 3. Auflage, Münster Halle, S. 76 f.

12Vgl. Nieschlag, E. u.a. (2009): Andrologie, 3. Auflage, Münster Halle, S. 78 f.

13Vgl. Sadler, T. W. (2014): Taschenlehrbuch Embryologie, 12. Auflage, Stuttgart New York, S. 65 ff.

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Die Fertilisation

20 sich das Protein Izumo 1 auf der Spermienoberfläche und der Rezeptor Juno auf der Eizelle zusammenfinden müssen, damit es zu einer Fusion und somit auch zu einer Befruchtung kommen kann.¹⁴ Der am Oolemma exprimierte CD9-Oberflä- chenrezeptor wird dadurch im intrazellulären Kontaktbereich akkumuliert, welcher die Rekrutierungskinetik von Izumo 1 beschleunigt und somit ebenfalls eine wichtige Rolle für die Fusion spielt. Dieser Kontakt führt zur Ausschüttung lysosomaler En- zyme aus der Rindengranula der Eizelle (Kortex), der sogenannten kortikalen Re- aktion sowie zur Zona-pellucida-Reaktion. Hierbei verändert die Zona pellucida schlagartig ihre Struktur, womit unter anderem die Inaktivierung spezifischer Sper- mienrezeptoren an der Oberfläche der Zona einhergeht. Dadurch wird das Eindrin- gen weiterer Spermien (Polyspermie) verhindert.¹⁵ Die Befruchtung findet in der Re- gel in der Ampulle der Tuba uterina statt. Die Fusion mit dem Oolemma beginnt im perivitellinem Spalt. Spermien, die sich im perivitellinem Spalt befinden, haben die Akrosomenreaktion und somit auch die für die Versorgung der Eizelle notwendigen Veränderungen bereits abgeschlossen. Die physiologischen Funktionen der Sper- mien und ihre Interaktion mit der Eizelle werden in Abbildung 5 veranschaulicht.

Abbildung 5: Spermienfunktion und -interaktion mit der Eizelle

Quelle: Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 464.

14Vgl. Bianchi, E./Wright, G. J. (2014): Izumo meets Juno – Preventing polyspermy in fertilization, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4111690/, 3. Juni 2020.

15Vgl. Sadler, T. W. (2014): Taschenlehrbuch Embryologie, 12. Auflage, Stuttgart New York, S. 67.

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Die Fertilisation

21

3.4 Die Imprägnation

Wie bereits in Kapitel 3.3 erläutert, kommt es nach der Andockung des Spermiums am Oolemma zu einer Verschmelzung beider Zellmembranen. Somit gelangen die innerhalb des Spermiums gelegenen Strukturen in das Zytoplasma der Eizelle. Die- ser Vorgang wird als Imprägnation der Eizelle bezeichnet. Dabei wird unter anderem der Kern des Spermiums mit kondensierter DNA, das Zentrosom und das Kinozilium übertragen. Infolgedessen wird das Kinozilium aufgelöst. Das vom Vater stam- mende Erbmaterial, welches sich im Kern befindet, wird dekondensiert und für den Aufbau des väterlichen Vorkerns genutzt. Das Zentrosom spielt bei der späteren Annäherung der Vorkerne eine wichtige Rolle. Nach erfolgter Teilung wird es au- ßerdem für die Ausbildung der ersten Teilungsspindel des neuen Lebewesens verantwortlich sein. An dieser Stelle sei erwähnt, dass alle Zentrosomen in den Kör- perzellen eines Menschen aus diesem einen väterlichen Zentrosom stammen. An- dere Anteile des Spermiums wie zum Beispiel die Kinozilien oder gar väterliche Mi- tochondrien, welche während der Befruchtung ins Zytoplasma der Eizelle gelangen, werden eliminiert (z.B. durch Ubiquitinierung). Demzufolge sind alle Mitochondrien in den Körperzellen von mütterlicher Herkunft.¹⁶

3.5 Eizellaktivierung

In den letzten zehn Jahren wurde der Spermienfaktor Phospholipase C zeta (PLCζ) identifiziert und maßgeblich für die Eizellaktivierung verantwortlich gemacht. Im De- tail geht die Aktivierung der Eizelle wie nachfolgend beschrieben vonstatten.

Die Bindung des Spermatozoons an das Oolemma induziert die Freisetzung von PLCζ ins Ooplasma. Dies generiert die Hydrolyse vom membranständigen Phos- phatidylinositolbisphosphat (PIP2) zu Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG). Dabei ist DAG für die Zonareaktion verantwortlich und verhindert somit eine Polyspermie. IP3 bindet an seinen Rezeptoren am endoplasmatischen Retikulum, welches als Calcium-Speicher fungiert und öffnet dort Ca²⁺-Kanäle. Folglich führt es zu einem Ca²⁺-Anstieg im Zytoplasma (siehe Abbildung 6). Des Weiteren führt es zu einem spezifischen Ca²⁺-Oszillationsmuster, welches so lange aufrechterhalten bleibt, bis sich die beiden Vorkerne ausgebildet haben. Infolge der Ca²⁺-Oszillation

16Vgl. Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 83.

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Die Fertilisation

22 wird die Eizelle aktiviert.¹⁷ Bedingt durch die Eizellaktivierung werden verschiedene biochemische Vorgänge, wie die Bildung der Vorkerne und die Embryoentwicklung, angestoßen. Der Meiosearrest wird aufgehoben, sodass der zweite Polkörper gebildet und die Meiose abgeschlossen werden kann. Bleiben die Ca²⁺-Oszillationen in der Eizelle aus, geht dies immer mit einem Fertilisationsversagen einher. Dies erklärt die deutlich geringere Menge an PLCζ in den Spermien von infertilen Män- nern im Vergleich zu Männern mit normaler Befruchtungsrate.¹⁸ Bei einer unbe- fruchteten Eizelle bleibt die nach der Ovulation begonnene zweite Reifeteilung in der Metaphase stehen.

Abbildung 6: Eizell-Spermium-Fusion und Aktivierung der Eizelle

Quelle: Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 84.

Bevor in den folgenden Unterkapiteln auf die unterschiedlichen Wege der künstli- chen Eizellaktivierung eingegangen wird, werden in Tabelle 1 die in den Kapiteln 3.1 bis 3.5 erläuterten, sequentiellen Abläufe der Fertilisierung, kurz zusammenge- fasst:

17Vgl. Parrington, J. u.a. (2007): Flipping the switch: How a sperm activates the egg at fertilization, DEVELOPMENTAL DYNAMICS, Vol. 236, Issue 8, 2027-2038, S. 2028.

18Vgl. Nieschlag, E. u.a. (2009): Andrologie, 3. Auflage, Münster Halle, S.79 f.

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Die Fertilisation

23

Phase Kennzeichen

Kapazitation Durch Veränderungen an der Spermienoberfläche erhält das Spermium erst im weiblichen Genitaltrakt die Kompetenz zur Befruchtung der Eizelle.

Spermienmotilität und Chemotaxis Im Isthmus der Tube erfolgt eine gezielte Verzöge- rung der Kapazitation und Anlage eines Spermienre- servoirs, gefolgt von Hyperaktivität und Freisetzung der Spermien in Richtung Tubenampulle durch chemotaktische Reize nach erfolgter Ovulation.

Zonabindung und Akrosomreaktion Das Spermium bindet über spezifische Rezeptoren Proteine an der Zona pellucida. Durch Verschmel- zung des Akrosoms mit der äußeren Spermien- membran werden lytische Enzyme freigesetzt, die den expandierten Cumulus und die Zona pellucida bis zur Eizellmembran durchdringen.

Spermium-Eizell-Fusion Durch Mikrovilli und spezifische Fusionsproteine des Oolemma wird die Spermienadhäsion und Fusion mit der Spermienmembran vermittelt. Zudem gelangt das Spermienchromatin in die Eizelle.

Aktivierung der Eizelle Vermittelt über den PLCζ aus dem Spermium, erfolgt die Aktivierung der Eizelle mit Aufhebung des meiotischen Arrests, Dekondensation des Chromatins und Ausbildung der Vorkerne.

Tabelle 1: Sequentielle Abläufe der Fertilisierung

Quelle: Vgl. Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 83.

Unter bestimmten Indikationen, wie zum Beispiel Befruchtungsversagen, verminderte Befruchtungsrate (≤ 30,0 %), Entwicklungsprobleme und bei schwerer männ- licher Infertilität, wird für eine mögliche Folgebehandlung eine artifizielle Eizellakti- vierung (AOA) in Erwägung gezogen. Dabei existieren unterschiedliche Methoden, die Eizelle künstlich zu aktivieren. Diese sind die mechanische, elektrische oder chemische Aktivierung. Bei allen Methoden spielt das Calcium eine zentrale Rolle, da im Zytoplasma, der für die Eizellaktivierung essenzielle Ca²⁺-Gehalt erhöht wird.

Dieser künstliche Eingriff löst in der Regel nur einen einmaligen, langanhaltenden Ca²⁺-Anstieg aus. Im Vergleich dazu löst die natürliche Aktivierung durch die PLCζ des Spermiums, ein typisches Oszillationsmuster aus. Hier ist zu erwähnen, dass Säugeroozyten gegenüber Schwankungen der Ca²⁺-Oszillationen relativ tolerant sind, solange die Gesamtmenge der freigesetzten Ca²⁺ davon unbeeinträchtigt bleibt und den kritischen Schwellenwert erreicht.¹⁹

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Die Fertilisation

24 3.5.1 Mechanische Aktivierung

Mithilfe von modifizierten ICSI-Techniken kann die Eizellaktivierung ausgelöst werden. Bei der ICSI nach Tesarik et al. werden mittels ICSI-Pipetten wiederholt Oo- plasma disloziert und so vom Zentrum in die Peripherie gebracht. Dadurch sollen intrazelluläre Speicher zur Ca²⁺-Ausschüttung angeregt werden.²⁰ Bei der mito- chondralen ICSI (mICSI) nach Ebner et al. hingegen werden stoffwechselaktive Mi- tochondrien aus der Peripherie im Zentrum der Eizelle akkumuliert. Damit soll erreicht werden, dass am Ort der Befruchtung, wo das Spermium injiziert wird, mehr Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) bereitsteht.²¹ Diese Methode wird als schonender betrachtet und geht mit einer geringeren Degenerationsrate einher.

Dennoch konnten bei Paaren mit vorangegangenem Befruchtungsversagen durch beide Methoden, hinsichtlich der Befruchtungs- und Schwangerschaftsrate, Erfolge erzielt werden.²²

3.5.2 Elektrische Aktivierung

Gemäß der Methodik von Baltaci et al. ist es möglich, mit einem einzelnen elektri- schen Impuls, Eizellen zur Öffnung von Poren in der Plasmamembran anzuregen.

Durch den Ca²⁺-Einstrom aus dem umgebenden Medium, kommt es zu einem ra- schen Anstieg des Ca²⁺-Gehaltsim Zytoplasma.²³ Sowohl die elektrische als auch die mechanische (künstliche) Aktivierung stellen mehr oder weniger invasive Ein- griffe dar, die eine entsprechende technische Fähigkeit des Embryologen vorrau- setzen.²⁴

20Vgl. Tesarik, J. u.a. (2002): Use of a modified intracytoplasmic sperm injection technique to overcome sperm-borne and oocyte-borne oocyte activation failures, Fertility and Sterility, Vol. 78, Issue 3, 619-624, S. 623 f.

21Vgl. Ebner T, u.a. (2004): Complete oocyte activation failure after ICSI can be overcome by a modified injection technique, Human Reproduction, Vol. 19, Issue 8, 1837-1841, S. 1839 ff.

23Vgl. Baltaci, V. u.a. (2010): The effectiveness of intracytoplasmic sperm injection combined with piezoelectric stimulation in infertile couples with total fertilization failure, Fertility and Sterility, Vol. 94, Issue 3, 900-904, S. 900 ff.

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Die Fertilisation

25 3.5.3 Chemische Aktivierung

Eizellaktivierende Substanzen, die den Pegel an intrazellulärem Calcium (auch wenn sie keine typischen Oszillationsmuster aufweisen) hochhalten, werden bei der modifizierten ICSI-Technik bevorzugt eingesetzt. Hier kommt es durch das Öffnen von Membrankanälen oder das aktive Entleeren intrazellulärer Speicher zu einem intrazellulären Calciumanstieg. Dieser führt nach Erreichen des Schwellenwertes zur Aktivierung der Eizelle. Calcium-Ionophore (oder auch Ca²⁺-Ionophore) gehören zur Gruppe der chemischen Aktivatoren, welche anstelle von Oszillationen, einen einzelnen, anhaltenden Ca²⁺-Peak erzeugen. Dadurch wird ein Calciummangel in der Eizelle verhindert beziehungsweise ausgeglichen. Allen voran ist der „Ready- to-Use“ Calcium-Ionophor A23187 (Calcimycin, GM508 CultActive von Gynemed) hervorzuheben, welches weit verbreitet verwendet wird und auch im Rahmen dieser Arbeit zum Einsatz kommt.

Alternativ können auch selbst fabrizierte Ionomycinlösungen verwendet werden.

Darüber hinaus existierten weitere chemische Substanzen wie Strontiumchlorid, Puromycin, Phorbol-Ester und Thimerosal. Diese werden jedoch als weniger effek- tiv betrachtet und können unter Umständen die Ausbildung der meiotischen Spindel beeinträchtigen.²⁵ Hinsichtlich der Oszillationen stellt die Verwendung von rekombi- nanter PLCζ die physiologischste Methode dar. Hierzu liegen bereits Publikationen über erste Erfolge im Tiermodell vor.²⁶

Nach der Human Fertilization and Embryology Authority (HFEA), einer der weltweit strengsten Behörden für menschliche Befruchtung und Embryologie, wird die An- wendung von CultActive als eine Technik eingestuft, in der die Beweislage noch uneinheitlich ist und daher weitere Studien erfordert. Dennoch gelten Methoden mit Einsatz von Ca²⁺-Ionophoren, vergleichsweise als die am besten untersuchten Techniken der artifiziellen Eizellaktivierung.²⁷

25Vgl. Nasr-Esfahani, M. u.a. (2010): Artificial oocyte activation and intracytoplasmic sperm injection, Fertility and Sterility, Vol. 94, Issue 2, 520-526, S. 521.

27Vgl. Human Fertilisation & Embryology Authority: Artificial egg activation calcium Ionophore, https://www.hfea.gov.uk/treatments/explore-all-treatments/treatment-add-ons/, 4. Juli 2020.

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Die Fertilisation

26

3.6 Entstehung der Vorkerne und die Befruchtungskontrolle

Nach dem Eindringen eines Spermiums in die Eizelle, formt sich eine kleine Aster aus den Centriolen. Diese bringt den männlichen Vorkern in die Mitte der Eizelle, um auf den dekondensierenden weiblichen Vorkern zu treffen. Ebenso bewegt sich auch der weibliche Vorkern auf den sich formenden männlichen Vorkern zu. Mikro- tubuli breiten sich von einem Punkt zwischen den beiden nebeneinanderliegenden Vorkernen aus, Centriolen duplizieren sich und wandern zu entgegengesetzten Po- len. Dies geschieht in der mitotischen Prophase, um die erste mitotische Spindel der Zygote anzuordnen. Im Falle einer Polyspermie (Eizelle wurde von mehr als einem Spermium fertilisiert), entstehen mehrere Astern, die jeweils von einem Sper- mium ausgehen.

Ungefähr sechs Stunden nach der Insemination bildet sich vom Spermien-Centro- som aus eine kleine Mikrotubuli-Spermien-Aster. Die aktivierte Eizelle stößt den zweiten Polkörper aus. Während der Spermatogenese ist die Genexpression unter- drückt. Spermien-Chromatin ist dicht in eine porenlose Kernhülle gepackt, alkali- sche Aminosäuren (Protamine) komprimieren die DNA und unterdrücken so die Transkription. Mit Protamine verbundene Disulfide verhärten den Spermienkopf und stellen somit die wichtige Eigenschaft zur Penetration der Zona her.

Nach Eindringen des Spermiums in das Ooplasma, löst sich die Kernhülle auf. Unter Einfluss von Faktoren des Ooplasmas schwillt das stark kondensierte Chromatin an und breitet sich aus, sodass Chromatinfilamente in das Cytoplasma abgegeben werden. Während des Dekondensierens des Spermien-Chromatins, geht die Eizelle von der Metaphase II in die Telophase II über. In dieser Phase beendet das Sper- mien-Chromatin seine Dekondensation, woraufhin der weibliche Vorkern entsteht.

Während Spermien-Protamine durch Histonen ersetzt werden, entwickeln sich die Hüllen des weiblichen und männlichen Vorkerns.²⁸

Vier bis sieben Stunden nach der Fusion, ist je eine Kernmembran um das dekon- densierte weibliche und männliche Chromatin entstanden. Diese zwei (sichtbaren) Vorkerne sind stets haploide Chromosomensätze und bewegen sich aufeinander zu. Der mütterliche Vorkern ist den Polkörpern nächstliegend. Der väterliche entsteht in der Nähe der Spermieneintrittsstelle. Dieser befindet sich für gewöhnlich mit

28Vgl. Elder, K. u.a. (2018): In-Vitro Fertilization, Third Edition, Cambridge, S. 58 f.

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Die Fertilisation

27 einem gewissen Abstand zu den Polkörpern.²⁹ Die Vorkerne enthalten Nukleoli, welche auch als Kernkörperchen bezeichnet werden. Hiervon ist im Zellkern eukaryo- tischer Zellen mindestens eines vorhanden. Nukleoli setzen sich im Wesentlichen aus DNA, RNA und Protein zusammen und sind nicht von einer Membran umhüllt.

Die Befruchtung ist 16 bis 20 Stunden nach der Fusion sichtbar (Abbildung 7).

Abbildung 7: Vorkerne und ihre Nukleoli (16-20 Stunden nach Imprägnation)

Quelle: Universitäten Fribourg, Lausanne und Bern: Die Ausbildung der Zygote – Annäherung der Vorkerne, http://www.embryology.ch/allemand/dbefruchtung/zygote02.html, 4. Juli 2020.

Mit Hilfe von Mikrotubuli bewegen sich der väterliche und mütterliche Vorkern aufeinander zu. Nahe des sich bildenden väterlichen Vorkerns, wachsen sie aus dem väterlichen Zentrosom sternförmig aus (Ausbildung eines Asters aus dutzenden Mikrotubuli). Die Mikrotubuli des Asters ziehen die Vorkerne aneinander ins Zent- rum der Eizelle. In den Vorkernen findet die Synthese des DNA Duplikats statt. Da- bei werden die Vorkerne größer.³⁰

29Vgl. Universitäten Fribourg, Lausanne und Bern: Die Ausbildung der Zygote – Einführung in die Bildung und Entwicklung der Vorkerne, http://www.embryology.ch/allemand/dbefruchtung/zy- gote01.html#bildungmannlich, 4. Juli 2020.

30Vgl. Universitäten Fribourg, Lausanne und Bern: Die Ausbildung der Zygote – Annäherung der Vorkerne, http://www.embryology.ch/allemand/dbefruchtung/zygote02.html, 4. Juli 2020.

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Die Fertilisation

28 Eine befruchtete Eizelle, die sich im sogenannten Vorkern- beziehungsweise Pro- nukleus-Stadium (PN-Stadium) befindet, lässt die Vorkerne sichtbar werden. Zei- chen einer regelrechten Befruchtung sind die Bildung eines zweiten Polkörperchens und die Kondensation zweier Vorkerne. Im Rahmen einer künstlichen Befruchtung mit der ICSI-Methode, kann eine Beurteilung der Vorkerne etwa 16 bis 20 Stunden nach der Spermieninjektion der Eizelle erfolgen. Zur Beurteilung der Vorkerne kommen unterschiedliche Scoring-Systeme in Frage. Grundsätzlich erfolgt hierbei, ab- hängig von ihrer Größe sowie Stellung, Anzahl und Verteilung ihrer Nukleoli, eine Einteilung in verschiedene Grade. Die Beurteilung im PN-Stadium ist besonders wichtig, da frühe morphologische Kriterien mit der späteren embryonalen Entwick- lung korrelieren und somit eine Aussage über die spätere Implantations- und Schwangerschaftsrate ermöglichen. Zur Veranschaulichung werden in Abbildung 8 die unterschiedlichen Scoring-Systeme nach Scott et al. und Tesarik et al. darge- stellt. Gemäß den Autoren, ergibt sich aus Grad 1 und 2 eine höhere Anzahl an qualitativ guten Blastozysten mit einer besseren Implantationsrate als aus den restlichen Graden.³¹

31Vgl. IVF-SAAR Saarbrücken: Vorkernbeurteilung – (P)ro(N)ucleus-Scoring, http://www.ivf- saar.de/Medizinische_Informationen_Schwanger_werden_Behandlungen_Vorkern-Beurtei- lung.htm, 4. Juli 2020.

(32)

Die Fertilisation

29 Abbildung 8: Scoring-Systeme zu möglichen Vorkernausprägungen

Quelle: Elder, K. u.a. (2018): In-Vitro Fertilization, Third Edition, Cambridge, S. 171.

Darüber hinaus existiert ein im Consensus Workshop von Istanbul (2011) empfoh- lenes Scoring-System (siehe Tabelle 2), welches auch im Rahmen dieser Studie zum Tragen kommt. Bei diesem Scoring-System werden die Vorkernstadien in drei Kategorien eingeteilt. Dabei entspricht Kategorie 1 einem symmetrischen Vorkern- muster, welches äquivalent zu Z1 und Z2 im Scoring-System von Scott et al. (siehe Abbildung 8) ist. Die nicht symmetrischen Vorkerne, welche andere Anordnungen aufweisen (einschließlich peripher gelegener Vorkerne), werden als Kategorie 2 eingestuft. Zuletzt werden abnormale Vorkerne, die zum Teil keinen oder nur ein Nuk- leolus aufweisen, als Kategorie 3 eingeteilt.

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Methoden der Assistierten Reproduktionstechnik

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Kategorie Bewertung Beschreibung

1 Symmetrisch Äquivalent zu Z1 und Z2.

2 Asymmetrisch Andere Anordnungen, einschließlich peripher gelegener Vorkerne.

3 Anormal Vorkerne mit 0 oder 1 NPB.

Tabelle 2: Konsens-Bewertungssystem für Vorkerne

Quelle: Vgl. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment (2011): proceedings of an expert meeting, Human Reproduction, Vol. 0, Issue 0, 1-14, S. 9.

Abschließend sei erwähnt, dass trotz der Empfehlung gemäß des Consensus Work- shops von Istanbul (2011), jedes Labor das für sich passende Scoring-System aus- wählt.³²

3.7 Syngamie

Nach Bildung der Vorkerne wandern diese zueinander, bis sie sich berühren. Der noch stark kondensierte Spermienkern nimmt an Größe zu (männlicher Vorkern) und nähert sich dem weiblichem Vorkern. Gleichzeitig wird die DNA zur Vorberei- tung für die erste mitotische Teilung synthetisiert und die Vorkernmembrane werden abgebaut. Es bildet sich die mitotische Metaphase-Spindel aus, wodurch es zur Duplikation des proximalen Centriols kommt. Somit ein Paar von polaren Centriolen gebildet und die Chromosomen entlang des Spindeläquators ausgerichtet. Die Ebene der Zellteilung wird durch astrale Mikrotubuli vermittelt, welche sich von der mitotischen Spindel bis zur Plasmamembran erstrecken. Zwischen 18 und 24 Stun- den nach Gametenfusion treffen die beiden Chromosomensätze aufeinander, was als Syngamie bezeichnet wird. Eine Teilungsfurche entsteht nach Beendigung der ersten mitotischen Ana- und Telophase und die Zygote verwandelt sich zu einem Zwei-Zell-Embryo.³³

4 Methoden der Assistierten Reproduktionstechnik

In diesem Kapitel werden die verschiedenen Formen der assistierten Reprodukti- onstechnik (ART), welche durch die immer später werdenden Kinderwünsche stets an Bedeutung gewinnen, kurz vorgestellt.

32Vgl. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment (2011): proceedings of an expert meeting, Human Reproduction, Vol. 0, Issue 0, 1-14, S. 11.

33Vgl. Elder, K. u.a. (2018): In-Vitro Fertilization, Third Edition, Cambridge, S. 60.

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Methoden der Assistierten Reproduktionstechnik

31

4.1 Intrauterine Insemination (IUI)

Die IUI zählt zu den ältesten reproduktionsmedizinischen Therapieformen. Hierbei werden die im Labor aufbereiteten Spermien, unter Anwendung eines Inseminati- onskatheters, in die Gebärmutter der Patientin übertragen. Um den optimalen Zeit- punkt der Insemination zu bestimmen, werden mehrere Ultraschalluntersuchungen zur Kontrolle des heranreifenden Follikels durchgeführt. Das Ziel besteht darin, die Anzahl der motilen befruchtungsfähigen Spermien, zum Zeitpunkt der Ovulation, in unmittelbarer Nähe der Eizelle zu maximieren. Die IUI wird bei männlicher Infertilität häufig als Therapie der ersten Wahl ausgewählt, da sie weniger invasiv und kosten- günstiger als die nachfolgend beschriebenen Therapieformen ist.³⁴

4.2 In-vitro-Fertilisation (IVF)

Bei der IVF findet der physiologische Befruchtungsvorgang in einem künstlich ge- schaffenen Milieu außerhalb des Körpers der Patientin statt. Die mittels einer Folli- kelpunktion entnommenen Cumulus-Oozyten-Komplexe (COC) inkubieren etwa zwei bis drei Stunden in einer Nährlösung im Brutschrank, welche nicht denudiert werden dürfen, da die Cumuluszellen den Lockstoff Progesteron für die Spermien sezernieren. Dieser unterstützt das Spermium in vieler Hinsicht die COC zu durchdringen. Anschließend werden einzelne oder mehrere COCs mit einer festgelegten Anzahl an beweglichen aufbereiteten Spermien, in einem dafür geeigneten Kultur- schälchen, versetzt. Hierbei werden 20.000 bis 25.000 Spermien pro Eizelle inse- miniert. Gemäß der traditionellen Vorgehensweise können die Eizellen mit den Sa- menzellen über Nacht koinkubiert werden. Alternativ kann eine kürzere Koinkubati- onszeit von circa zwei Stunden eingehalten werden, um eine Anreicherung freier Sauerstoffradikale in der Kultur zu vermeiden.³⁵ Am nächsten Tag (16 bis 20 Stun- den nach der Insemination) erfolgt die Befruchtungskontrolle (siehe Kapitel 3.6), nachdem die Eizellen mit einem Stripper-Tip von Cumuluszellen und Spermien be- freit und in eine Kuluturschale überführt wurden. Die IVF ist insbesondere bei tuba- rer und ungeklärter Infertilität die bevorzugte Behandlungsmethode.³⁶

35Vgl. Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 219 f.

36 Vgl. Nieschlag, E. u.a. (2009): Andrologie, 3. Auflage, Münster Halle, S. 483.

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Material und Methoden

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4.3 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)

Bei der ICSI-Methode handelt es sich um ein Verfahren, bei dem das Spermium mittels einer feinen Nadel in das Zytoplasma der Eizelle, welches vorher mit einer enzymatischen Verdauung und mechanischer Feinpräparation denudiert wurde, injiziert wird. Diese Methode hat heute die konventionelle IVF, bei der Behandlung von Paaren mit männlicher Infertilität, ersetzt. Die ICSI-Methode, welche auch Hauptbestandteil dieser Arbeit ist, wird in Kapitel 5.2.5 ausführlich erläutert. An dieser Stelle wurde auf sie lediglich der vollständigkeitshalber eingegangen.

5 Material und Methoden

Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden insgesamt 248 Patientinnen mit einem Durchschnittsalter von 33 (± 4,5) Jahren herangezogen. Die jeweiligen Kinder- wunschtherapien fanden zwischen den Jahren 2016 und 2020 im Kinderwunsch- zentrum Ludwigshafen statt. Patientinnen, bei denen es zu einer Vitrifikation von 2PN-Zellen mit späterer Implantation im Kryozyklus kam, wurden ebenfalls in die Studie inkludiert. In den folgenden Unterkapiteln werden die zum Einsatz gekom- menen Materialien wie technische Geräte, Verbrauchsmaterialien und Medien vorgestellt. Des Weiteren wird das methodische Vorgehen näher beschrieben.

5.1 Material

Um die Ergebnisse der Kinderwunschtherapien mit und ohne einen CultActive Ein- satz gegenüberstellen zu können, werden die Patienten in zwei Gruppen aufgeteilt.

Bei Gruppe 1 handelt es sich um Patienten mit einer der folgenden Indikationen:

Totales Befruchtungsversagen, verminderte Befruchtungsrate (≤ 30,0 %), Entwick- lungsprobleme (2PN oder Embryoarrest ohne Transfer) oder schwere männliche Infertilität (Kryptozoospermie, Azoospermie oder TESE-Spermien). Mit Ausnahme der letzteren Indikation, wo eine prospektive Analyse der Daten durchgeführt wird, wird bei den restlichen Indikationen eine retrospektive Analyse durchgeführt. Hier- bei werden die Eizellen nach der Spermieninjektion, nach konventioneller Art (ohne CultActive), in das Kulturmedium zur weiteren Kultivierung bis zum Transfer umgesetzt. Bei Gruppe 2 handelt es sich um Patienten, die ebenfalls Indikationen wie ein totales Befruchtungsversagen, eine verminderte Befruchtungsrate (≤ 30,0 %), ein

(36)

33 Entwicklungsproblem (2PN oder Embryoarrest ohne Transfer) oder schwere männ- liche Infertilitätsfaktoren (schwerwiegendere als bei Gruppe 1) wie Kryptozoosper- mie (< 500000 pro ml), Azoospermie (vereinzelte, zum Teil immotile Spermien nach Aufbereitung auffindbar) oder TESE-Spermien (überwiegend immotile Spermien) aufweisen. Im Gegensatz zu Gruppe 1, werden die Eizellen der Patientinnen aus Gruppe 2, unmittelbar nach der Spermieninjektion, für 15 Minuten in das gebrauchs- fertige CultActive umgesetzt. Anschließend werden die Eizellen zwei Waschschrit- ten im „WASH“ Medium unterzogen, bevor sie in das Kulturmedium überführt und ebenfalls bis zum Transfer darin kultiviert werden

5.1.1 Technische Geräte

Die von der Eizellentnahme bis zum Transfer eingesetzten Geräte werden in der folgenden Tabelle 3, unter Nennung der jeweiligen Herstellernamen, aufgelistet:

Nr. Gerät Hersteller

1 Brutschrank C16 Labotect

2 Brutschrank C200 1 Labotect

3 Brutschrank C200 2 Labotect

4 Cryo Unit Labotect

5 ICSI Mikroskop mit Mikromanipulator Nikon Eclipse, Integra Ti

6 Inkubator Melag

7 Kitazato Stickstoffbox Gynemed

8 Kryocontainer Labotect

9 Laborwaage Kern

10 Makler-Kammer Gynemed

11 Multipette Eppendorf

12 N2-Handschuhe Cryo-Gloves

13 N2-Schutzbrille OBI Eigenmarke

14 Pinzette Fischer Scientific

15 Pipette 1-10 μl Thermo Scientific

16 Pipette 1-100 μl Starlab, Thermo Scientific

17 Pipette 1-1000 μl Starlab, Thermo Scientific

18 Stereomikroskop Eclipse Ci Nikon

19 Stereomikroskop SMZ800N Nikon

20 Stereomikroskop SMZ800 Nikon

21 Sterilwerkbank IVFtech

22 Stoppuhr TFA Dostmann

(37)

34

23 Stripper Gynemed

24 Vortex Labfish

25 Zentrifuge Rotofix 32A Hettich

Tabelle 3: Übersicht der eingesetzten Geräte

Quelle: Eigene Darstellung

5.1.2 Verbrauchsmaterialien

Die von der Eizellentnahme bis zum Transfer eingesetzten Verbrauchsmaterialien werden in der folgenden Tabelle 4, unter Nennung der jeweiligen Herstellernamen, aufgelistet:

Nr. Verbrauchsmaterial Hersteller

1 Auffanggefäß Starlab

2 Einmalhandschuhe Lohmann & Rauscher

3 Einmalhandschuhe (steril) Serviprax

4 Einmal-Nadelführung Civco

5 Einmaltransferpipette Sarstedt

6 Embryotransferkatheter (Set) Labotect

7 FP-Nadel (einlumig) Labotect

8 Gesichtsmaske Lohmann & Rauscher

9 Goblet Origio

10 Hatchingpipette Mikrotech IVF

11 Haltenadel Origio

12 Halter für Kryo-Goblets Vitrolife

13 ICSI-Injektionspipette Mikrotech IVF

14 ICSI-Schale BD Falcon

15 Introcan-Kanüle Braun

16 Kulturschale Sparmed

17 Mikropistill Eppendorf

18 Petrischale (90mm x 17 mm) Thermo Scientific 19 pH-Indikatorstäbchen (4,5-10) Machery-Nagel 20 Pipettenspitzen 10 μl, 100μl und 1000 μl Starlab

21 Sammelschale (35 mm x 10 mm) Sparmed

22 S-Cryolock BioCare/Irvine Scientific

23 Sterile Vials Greiner

24 Steriler Probenbecher Sarstedt

25 Stripper-Tip 135 μm Research Instruments

26 Testsimplets Waldeck

27 Transferschale BD Falcon