Eizellentnahme

Nachdem die Patientinnen entweder nach dem Agonisten- oder Antagonisten-Pro-tokoll hormonell stimuliert werden, wählt der Arzt den optimalen Zeitpunkt für die Ovulation aus. Etwa 36 Stunden nach Auslösung der Ovulation mittels hCG, erfolgt die Eizellentnahme. Der Eingriff erfolgt dabei unter Vollnarkose und mittels einer ultraschallkontrollierten vaginalen Follikelpunktion. Bei dieser Methode werden die reifen Ovarialfollikel, unter vaginosonographischer Sicht, mit einer hohlen Nadel ab-punktiert. Wichtig ist dabei, dass die Punktionsflüssigkeit, welche die Eizellen mit den Cumuluszellen beinhaltet, in ein Röhrchen punktiert und auf einen Wärmeblock gestellt wird. Dabei muss die Temperatur der Oozyte konstant auf 37°C bleiben. Die Temperatur stellt in jedem Schritt der In-vitro-Fertilisation einen besonders wichti-gen Parameter dar. Die mit der Punktionsflüssigkeit gefüllten Röhrchen werden un-verzüglich unter dem Mikroskop auf Eizellen untersucht. Die identifizierte Oozyte wird mittels einer Pipette in ein zuvor mit dem FLUSH Medium vorbereitetes Sam-melschälchen auf einem Wärmeblock überführt. Nachdem die gesamte Punktions-flüssigkeit untersucht und alle Oozyten in das Sammelschälchen überführt wurden,

41Vgl. Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 129.

Material und Methoden

39 kommen diese in eine weitere vorbereitete 4-Well-Schale. Diese ist mit einem äqui-librierten Kulturmedium (Cult Medium).Anschließend wird diese Schale in einen In-kubator gestellt, worin die Oozyten bis zum nächsten Bearbeitungsschritt (Denuda-tion) circa 2 Stunden lang ruhen. Der Wert des Inkubators muss im mittleren pH-Bereich liegen (7,20 - 7,35). Zudem muss der für die Kulturbedingung eines Labors geeignete CO2-Gehalt von 5% - 6% genau eingehalten werden. Dieser Wert ist für die Aufrechterhaltung des physiologischen pH-Wertes in Kulturmedien essenziell.⁴² 5.2.3 Spermienaufbereitung

Während der oben genannten Ruhezeit der Oozyten, erfolgt die Aufbereitung des Ejakulats. Diese beginnt (gemäß den WHO-Kriterien) nach einer 30- bis 60-minüti-gen Verflüssigungszeit, da das Seminalplasma selbst bei geringerer Konzentration zytotoxisch ist. Zudem enthält das Seminalplasma häufig Bakterien anderer Zellen und Debris, welche entfernt werden müssen. Durch die Aufbereitung erfolgt die An-reicherung beweglicher und normal geformter Spermien sowie die Einleitung des Kapazitationsvorgangs und die Trennung der Spermien von Leukozyten. Hierzu kommen unterschiedliche Spermaaufbereitungsmethoden mit physikalischen und/oder biologischen Prinzipien in Frage. Diese sind die Filtration, das einfache Waschen, die Swim-up-Methode und die Dichtegradientenzentrifugation. Das zu-letzt erwähnte Verfahren kommt im Rahmen dieser Studie zum Einsatz und wird in den nächsten beiden Unterkapiteln ausführlich erläutert. Mit dieser Methode werden die besten Ergebnisse erzielt, weshalb sie unter anderem auch für Patienten mit schwerwiegenden Spermienbefunden geeignet ist.

5.2.3.1 Dichtegradientenaufbereitung aus dem Ejakulat

Bei der vorliegenden Studie wird das Ejakulat zunächst, nachdem die Ejakulatpara-meter pH-Wert, Viskosität, Konzentration, Motilität und Morphologie, nach den WHO-Kriterien (2010) beurteilt worden sind, mittels von Dichtegradienten aufberei-tet. Bei dieser Methode werden motile und normal geformte Spermien durch die Zentrifugalkraft und durch Unterschiede in ihrer relativen Zelldichte getrennt. Diese Technik beruht darauf, dass zwei Medien mit unterschiedlicher Dichte in ein Rea-genzglas eingebracht werden, wodurch die Spermien aktiv gegen den Gradienten

42Vgl. Cohen, J. (2019): ´There is only one thing that truly important in an IVF laboratory: everything´, Cairo Consensus Guidelines on IVF Culture Conditions, RBMO, Vol. 00, Issue 0, S. 4 f.

Material und Methoden

40 schwimmen müssen. Nach der Zentrifugation bildet sich am Boden ein Pellet aus, worin sich die motilen (vitalen) Spermien befinden (siehe Abbildung 9).

Abbildung 9: Spermien nach Dichtegradientzentrifugation

Quelle: Vgl. Weigel, M. (2004): Assistierte Reproduktion bei chronischer Hepatitis B-, Hepatitis C- und HIV-Infektion, JOURNAL FÜR FERTILITÄT UND REPRODUKTION, Vol. 14, Issue 3, 13-22, S. 18.

Dieses Verfahren erfolgt bei der Studie nach einer laborinternen Arbeitsanweisung.

Hiernach kommt das gewonnene Sperma, welches sich in einem Probenbecher be-findet, in ein oder mehrere 15 ml Röhrchen, welche jeweils mit 2,5 ml Dichtegradient (45 %) gefüllt ist. Dazu wird maximal 3 ml Sperma pro 15 ml Röhrchen gleichmäßig mit einer Transferpipette aufgeteilt. Anschließend wird das Ejakulat 20 Minuten lang bei 1.500 rpm zentrifugiert. Danach wird der Überstand mittels einer Transferpipette abgenommen. Die vitalen, für die Therapie benötigten Spermien im unteren Pellet werden im 4 ml SpermAir-Medium resuspendiert und in ein 5 ml Röhrchen überführt.

Bei Vorhandensein von mehreren zentrifugierten Röhrchen, werden alle Sedimente in ein 5 ml Röhrchen überführt. Das 5 ml Röhrchen wird anschließend erneut für fünf Minuten bei 1500 rpm für den Waschschritt zentrifugiert. Nach dieser Zentrifu-gation wird der Überstand dekantiert und verworfen. Der Pellet wird, gemischt mit 500 μl SpermAir-Medium, in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und schließ-lich erneut für fünf Minuten bei 1500 rpm zentrifugiert. Anschließend wird der Über-stand bis auf 20 bis 50 μl, abhängig von der im Nativ bestimmten Anzahl an beweg-lichen Spermien, abgezogen und verworfen. Nun ist die Probe für die anstehende ICSI bereit. Unmittelbar vor der ICSI, werden die Spermien in die ICSI-Schale, in

Material und Methoden

41 den L-förmigen WASH-Tropfen, pipettiert (siehe Abbildung 10). Dabei ist die Schale mit einem Mineralöl beschichtet, welches unter anderem den Erhalt einer konstan-ten Temperatur in der Schale begünstigt.

Abbildung 10: ICSI-Schale bei Spermien aus dem Ejakulat

Quelle: Eigene Darstellung

Anschließend werden motile, morphologisch unauffällige Spermien mit einer ICSI-Nadel aufgesaugt und in den Polyvinylpyrrolidon (PVP) Tropfen überführt. Hier wer-den sie mechanisch, durch Drücken der Geißel an wer-den Schälchenbower-den, immobili-siert. Dieser Vorgang wird durch den hochviskösen PVP erleichtert, da die Motilität der Spermien darin stark eingeschränkt wird. Die Immobilisierung der Spermien ist wichtig, da hierdurch der natürliche Befruchtungsprozess nachgeahmt und PLCζ für die Eizellaktivierung (siehe Kapitel 3.5) zugänglich gemacht wird.

5.2.3.2 Dichtegradientenaufbereitung von TESE-Spermien

Sind im Ejakulat keine Spermien vorhanden, wird von einer Azoospermie gespro-chen. In diesem Fall können (sofern vorhanden) Spermien aus dem Hoden (TESE

= Testikuläre Spermienextraktion) oder Nebenhoden (MESA = Mikrochirurgische Epididymale Spermienaspiration) entnommen werden. Es wird zwischen zwei Arten der Azoospermie unterschieden. Eine obstruktive Azoospermie (OA) liegt vor, wenn eine normale Spermienproduktion (Spermatogenese im Hoden) vorliegt, jedoch auf-grund eines Verschlusses die Spermien nicht in das Ejakulat gelangen. Der Grund

Material und Methoden

42 für den Verschluss kann angeboren, durch Verletzungen oder Entzündungen be-dingt sein. Von einer nicht-obstruktiven Azoospermie (NOA) wird gesprochen, wenn das Problem im Hoden, bei der Spermienproduktion, liegt. Die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Spermien im Hoden ist davon abhängig, welche Art von Störung zugrunde liegt. ⁴³

Im Rahmen dieser Studie wird die ICSI bei 41 Patienten anhand von TESE-Sper-mien durchgeführt. Bei der TESE wird mittels mikrochirurgischer Technik Hodenpa-renchymgewebe entnommen und in ein Röhrchen mit Nährmedium (beispielsweise SpermAir-Medium) überführt. Anschließend werden die Proben nach laborinterner Arbeitsanweisung kryokonserviert. Dabei werden die Hodenbiopsate nach ihrer je-weiligen Hodenseite getrennt und jeweils in eine Petrischale überführt. Diese ist auf der oberen Hälfte mit 1000 μl und auf der unteren Hälfte mit 4 x 50 μl SpermAir vorbereitet. Im oberen Teil werden die Biopsate jeweils mit zwei Kanülen in vier Stücke zerkleinert und anschließend in die vier unteren SpermAir-Tropfen verteilt.

Weiter werden in sterile Vials 294 μl SpermAir und 206 μl SpermStore pipettiert und vermischt. Die sich im unteren SpermAir-Tropfen befindenden Gewebeproben wer-den nun in diese Vials überführt und verschlossen, worin sie 20 Minuten bei Raum-temperatur äquilibrieren. Anschließend erfolgt die Kryokonservierung mittels Cryo Unit. Die in der Petrischale verbliebenen Gewebereste werden mit 80 μl SpermMobil versetzt und einer ersten Beurteilung unterzogen. Nach zwei bis fünf Tagen erfolgt mit einem geringen Teil der Proben ein Probeauftau. Dabei werden diese wie für eine ICSI-Therapie (weiter unten beschrieben) weiterbearbeitet. Ziel des Probeauf-taus ist es, die Proben dahingehend zu beurteilen, ob Spermien vorhanden sind und somit eine Therapie in Frage kommt. Ist das Ergebnis positiv, wird die ICSI-Therapie geplant und durchgeführt.

Am Tag der ICSI-Behandlung werden die kryokonservierten Proben aus dem Kryo-container herausgeholt und weiterbearbeitet. Die benötigten Vials werden in ein 30°C Wasserbad gelegt und aufgetaut. Die aufgetauten Hodenbiopsate werden in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und mit Mikropistill in 200 μl SpermAir zerkleinert. Der Überstand aus dem Vial wird ebenfalls in ein separates Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und fünf Minuten bei 2744 rpm zentrifugiert. Nach der

43Vgl. Nieschlag, E. u.a. (2009): Andrologie, 3. Auflage, Münster Halle, S. 162 f.

Material und Methoden

43 Zentrifugation wird der Überstand entfernt, das Sediment mit 200 μl SpermAir re-suspendiert und anschließend mit dem 200 μl Volumen konzentriertes Hodenbiop-sat in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, welches mit 1 ml Dichtegradient (45

%) gefüllt ist. Dieses wird anschließend zehn Minuten bei 2744 rpm zentrifugiert, woraufhin der Dichtegradient mittels einer Transferpipette abgezogen wird. Der Pel-let wird mit 1 ml SpermAir gemischt und fünf Minuten bei 1700 rpm zentrifugiert.

Zuletzt wird der Überstand entfernt und der Pellet mit 25 μl SpermMobil und 25 μl SpermAir resuspendiert. Schließlich werden die aufbereiteten TESE-Spermien in die ICSI-Schale, worin sie immobilisiert (siehe Kapitel 5.2.3.1) und für die anschlie-ßende ICSI vorbereitet werden sollen, überführt.

5.2.4 Denudation der Eizellen

Nachdem sich die Eizellen im Inkubator für circa 2 Stunden von der Punktion erholt haben, werden sie unmittelbar vor der ICSI durch enzymatische Verdauung und mechanischer Feinpräparation, von dem sie umgebende Cumuluszellen befreit (Denudation). Dieser Vorgang ist erforderlich, damit der Reifegrad der Eizelle fest-gestellt und die Mikroinjektion erleichtert werden kann. Der Ablauf der Denudation gestaltet sich wie folgt: Die Eizellen kommen etwa ein bis zwei Stunden nach der Follikelentnahme in eine Denudierungsschale, welche mit Cumulase- und WASH-Tropfen bestückt ist. Darin inkubierten sie für zehn Minuten im Brutschrank. An-schließend werden sie mit einem Stripper-Tip mehrfach auf- und abpipettiert, bis sie fast vollständig von Cumuluszellen befreit sind. Schließlich werden sie in die ICSI-Schale, worin sich die bereits aufbereiteten und immobilisierten Spermien befinden, überführt.

5.2.5 ICSI

Wie bereits in Kapitel 4.3 erwähnt, handelt es sich bei diesem Verfahren um eine Methode, bei der das Spermium mittels einer feinen Nadel in das Zytoplasma der Eizelle injiziert wird. Dabei werden nach Möglichkeit Spermien, welche eine normale Morphologie sowie eine Vorwärtsmotilität aufweisen, verwendet. Unmittelbar vor dem ICSI-Vorgang wird die Eizelle nach ihrem Reifegrad beurteilt. Es können nur reife Eizellen, welche einen Polkörper aufweisen und sich somit in der Metaphase II befinden, injiziert werden. Zur Beurteilung der Eizelle wird sie mittels einer Halte-pipette festgehalten, sodass das erste Polkörperchen am oberen oder unteren Pol

Material und Methoden

44 der Eizelle zu sehen ist (siehe Abbildung 11). Dadurch wird verhindert, dass die meiotische Spindel, welche sich in der Regel unter der Membran nahe des Polkör-perchens befindet, beim Injektionsvorgang beschädigt wird. Anschließend wird mit einer Mikropipette zuerst die Zona pellucida und danach die elastische Vitellin-membran penetriert. Vor der eigentlichen Übertragung der Samenzelle, wird ein Teil der Vitellinmembran mit dem Zytoplasma der Eizelle in die Mikropipette aspiriert.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Membran geöffnet und die Eizelle aktiviert wird. An dieser Stelle bildet sich der sogenannte Einstichtrichter. Nachdem das Spermium in das Zytoplasma der Eizelle injiziert und die Mikropipette (unverzüglich) zurückgezogen wird, schließt sich die Membran unmittelbar. In Abbildung 11 wird eine intrazytoplasmatische Spermieninjektion der Eizelle dargestellt. Das immobili-sierte Spermium befindet sich dabei noch in der ICSI Nadel.

Abbildung 11: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)

Quelle: Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 219.

Prinzipiell ist das Vorgehen bei der ICSI-Methode sowohl bei Spermien aus dem Ejakulat als auch aus einer TESE identisch. Der einzige Unterschied besteht ledig-lich darin, dass die Suche und das Immobilisieren von Spermien aus der TESE in der Regel mehr Zeit in Anspruch nimmt. Zudem werden andere ICSI-Schalen (siehe Abbildung 12) vorbereitet, da sich in TESE-Proben mehr Zellen befinden, welche die Spermiensuche erschweren und die ICSI-Nadel leichter verstopfen können.

Material und Methoden

45 Abbildung 12: ICSI-Schale bei TESE-Spermien

Quelle: Eigene Darstellung

5.2.6 Calcium-Ionophor (CultActive) und ihre Anwendung

Calcium spielt bei der Aktivierung der Eizelle und den darauffolgenden Zellteilungen eine wichtige Rolle. Bei auffällig niedrigen Befruchtungsraten und Auffälligkeiten bei der embryonalen Entwicklung, kann die Ursache in einem Mangel an Calcium lie-gen. Dadurch kann entweder die Samenzelle die Eizelle nicht aktivieren (keine Be-fruchtung) oder nachfolgende Zellteilungen können aufgrund von Calciummangel nicht adäquat stattfinden (verzögerte oder keine Weiterentwicklung der Embryo-nen). Solche Calciummangelzustände können unmittelbar nach der Befruchtung, durch das künstliche Anreichern von Calcium in der Eizelle, vermieden werden.

Dabei sieht das Verfahren wie folgt aus: Die ICSI wird wie in Kapitel 5.2.5 beschrie-ben durchgeführt. Anschließend werden die injizierten Eizellen für 15 Minuten in 30 μl Tropfen des Calcium-Ionophors (GM508 CultActive von Gynemed) überführt.

Hierfür wird im Vorfeld eine CultActive-Schale vorbereitet und das Medium für min-destens vier Stunden in 5% - 7% CO2 bei 37°C äquibiliert. Anschließend werden die so behandelten Eizellen in zwei Waschschritten gewaschen und in einem mit Kul-turmedium vorbereitete Schale überführt, worin sie weiter kultiviert werden. In Ab-bildung 13 wird eine CultActive-Schale, welche mit CultActive- und Waschtropfen bestückt ist, dargestellt.

Material und Methoden

46 Abbildung 13: CultActive-Schale

Quelle: Gynemed: GM508 CultActive, https://gynemed.de/produkte/gm508-cultactive/, 4. Juli 2020.

In dieser Studie wird bei Vorliegen einer der folgenden Indikationen das CultActive, im Rahmen der ICSI-Therapie, eingesetzt:

 Totales Befruchtungsversagen (im Vorzyklus),

 Verminderte Befruchtungsrate (≤ 30,0 % im Vorzyklus),

 Entwicklungsprobleme (2PN- oder Embryoarrest im Vorzyklus),

 Schwere männliche Infertilitätsfaktoren wie Kryptozoospermie, Azoospermie oder TESE-Spermien (überwiegend immotile Spermien).

Eine Kryptozoospermie liegt gemäß WHO-Kriterien vor, wenn im Ejakulat weniger als eine Million Spermien pro ml ausgezählt werden. In dieser Studie wird bei einer Kryptozoospermie nur dann CultActive eingesetzt, wenn die Spermienkonzentration bei unter 500000 pro ml liegt.

Eine Azoospermie liegt gemäß WHO-Kriterien vor, wenn im Ejakulat bei der Nativ-auszählung keine Spermien vorzufinden sind. In dieser Studie wird bei einer Azoospermie nur dann CultActive eingesetzt, wenn nach der Spermienaufbereitung vereinzelte Spermien auffindbar sind oder Spermien keine Motilität aufweisen.

TESE-Spermien wurden bereits in Kapitel 5.2.3.2 ausführlich erläutert. In dieser Studie wird bei TESE-Patienten CultActive eingesetzt, sofern die Spermien keine beziehungsweise nur eine geringe Motilität aufweisen.

Material und Methoden

47 5.2.7 Das Vitrifizieren und Erwärmen von Eizellen

Wie bereits in Kapitel 3.6 beschrieben, werden die Eizellen 16 bis 20 Stunden nach der ICSI auf ihre Befruchtung kontrolliert. In dieser Studie erfolgt dies nach dem im Consensus Workshop von Istanbul (2011) empfohlenen Scoring-System (siehe Ta-belle 2). Demnach werden nur regelrecht befruchtete Eizellen weiter kultiviert und die restlichen verworfen.

Falls überzählige befruchtete Eizellen entstehen oder aus einem medizinischen Grund ein „Freeze all“ erfolgen muss, wird dies anhand der Vitrifikation (ultraschnel-les Einfrieren) durchgeführt. Dieses Verfahren verspricht eine Überlebensrate von über 90,0 % der Vorkernzellen.⁴⁴ Hierbei wird wie folgt vorgegangen: Auf einem Zettel werden die Tropfen markiert, aus welchen die regelrecht befruchteten Eizel-len vitrifiziert werden solEizel-len. Anschließend werden die für das Vitrifizieren benötig-ten Volumina der Medien Equilibration Solution (ES) und Vitrification Solution (VS) aus dem Vit Kit-Freeze entnommen und in Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert.

Darin sollen sie die Zimmertemperatur annehmen. Im nächsten Schritt werden Eti-ketten mit Informationen zur Patientenidentifikation und über das Datum sowie die Anzahl der vitrifizierten 2PN-Zellen erstellt und auf Cryolocks geklebt. Stickstoff wird in eine kleine Stickstoffbox gefüllt, damit die vitrifizierten 2PN-Zellen ohne Luftkon-takt in die Kryocontainer überführt werden können. Sobald die beschriebenen Vor-bereitungen abgeschlossen sind, wird der Vitrifikationsvorgang gestartet.

Die zu vitrifizierenden 2PN-Stadien (maximal zwei pro Cryolock und mit minimalem Medienübertrag) mittels einem Stripper-Tip aus der Kulturschale entnommen und in 50 μl ES-Tropfen, welcher zuvor in eine Petrischale pipettiert wurde, überführt. Die Zellen schrumpfen zunächst, bevor sie sich während der Inkubationszeit von sechs bis zehn Minuten wieder ausdehnen. Mit Ausdehnung der 2PN-Stadien ist die Äqui-librierung abgeschlossen. Die im Anschluss stattfindende Vitrifikation darf höchs-tens 110 Sekunden dauern. Hierbei werden die Zellen in 50 μl VS überführt, welcher ebenfalls im Vorfeld auf die Petrischale pipettiert wurde. Dort werden die Zellen (mindestens 30 Sekunden) gerührt, damit sie vollständig mit der VS in Berührung kommen. Anschließend werden sie schnellstmöglich, mit möglichst wenig VS, auf

44Vgl. Diedrich, K. u.a. (2019): Reproduktionsmedizin, 2. Auflage, Berlin Heidelberg, S. 241.

Material und Methoden

48 dem Cryolock platziert. Der beladene Cryolock wird in eine Stickstoffbox einge-taucht und sofort gerührt. Das Rühren verhindert ein zu langsames Einfrieren und die daraus resultierende Kristallisation. Ab diesem Zeitpunkt darf die Kühlkette, bis zum Erwärmen, nicht mehr unterbrochen werden. Unter Stickstoff wird der Cryolock mit den Zellen in Schutzröhrchen gepackt und in ein Goblet überführt. Das Goblet wird in einem Halter für Kryo-Goblets gespannt und unverzüglich unter Stickstoff in vorher ausgewählte Köcher des Kryocontainers transferiert. Darin wird es schließ-lich bis zum Kryozyklus aufbewahrt.

Ist der Zeitpunkt des Kryozyklus gekommen, beginnt das Erwärmungsverfahren.

Dazu werden die Medien Thawing Solution (TS), Diluent Solution (DS) und Wash Solution (WS) vom Vit Kit-Thaw verwendet. Die benötigten Volumina der Medien DS und WS werden in Eppendorf-Reaktionsgefäße aliquotiert und zur Annahme der Raumtemperatur gelassen. Die benötigten Volumina von TS hingegen, werden ebenfalls in Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert und in einen Inkubator gestellt, wo sie bei 37°C ohne CO2 erwärmt werden. Nach circa 30 Minuten haben die Me-dien die gewünschten Temperaturen angenommen, womit das Erwärmen der Zel-len beginnen kann. Zunächst wird das TS in eine der Vertiefungen einer 4-Well-Platte und 50 μl DS auf eine Petrischale pipettiert. Die Stickstoffbox wird mit genü-gend flüssigem Stickstoff gefüllt, worin die Kryo-Goblets mit den Zellen eingetaucht werden. Dabei gilt zu beachten, dass die Überführung der Goblets vom Kryo-container in die Stickstoffbox unverzüglich erfolgt. Als nächstes wird das Schutz-röhrchen des Cryolocks unter flüssigem Stickstoff entnommen und der Cryolock so-fort in vorgewärmtes TS in einer 4-Well-Schale überführt. Die Zellen werden unter dem Mikroskop identifiziert und mit dem Stripper-Tip für eine Minute auf den Boden der Schale gelegt. Anschließend werden sie ins DS überführt und gerührt, damit die Zellen mit dem Medium vollständig in Berührung kommen. Darin verweilen sie für vier Minuten. In dieser Zeit wird 2 x 50 μl WS auf eine Petrischale pipettiert. Darin werden die Zellen im nächsten Schritt jeweils für vier Minuten gewaschen. Nach den Waschvorgängen werden die 2PN-Stadien in eine zuvor vorbereitete und äquilib-rierte Kulturschale überführt. Dort erfolgt die Begutachtung darüber, ob vitale oder nichtvitale 2PN-Zellen vorliegen. Anschließend werden sie zur weiteren Kultivierung bis zum Embryotransfer in dieser Kulturschale aufbewahrt.

Material und Methoden

49 5.2.8 Die Beurteilung und der Transfer von Embryonen

In den folgenden Unterkapiteln wird die Embryoentwicklung und neben anderen das in dieser Studie angewandte Bewertungssystem zur Beurteilung der Embryoqualität näher beschrieben. Des Weiteren wird auf das sogenannte Assisted Hatching und schließlich auf den Embryotransfer eingegangen.

5.2.8.1 Embryoentwicklung und Bewertungssysteme

Der Embryotransfer stellt den letzten Schritt einer IVF-Behandlung dar. In der Regel geschieht dies zwischen Tag 2 und Tag 5 nach der ICSI. In diesem Zeitraum werden Embryonen täglich (morgens) einem Embryo-Scoring unterzogen. Hierzu werden sie unter einem Lichtmikroskop untersucht und beurteilt. Sich zu langsam teilende Embryonen korrelieren mit einer einer schlechteren Schwangerschaftsrate als sich normal teilende Embryonen.⁴⁵ Im Vergleich haben sich zu schnell teilende Embryo-nen eher eine Chance auf eine Schwangerschaft. Zur Beurteilung von EmbryoEmbryo-nen kommen unterschiedliche Beurteilungssysteme in Frage. In der vorliegenden Studie wird das im Consensus Workshop von Istanbul (2011) empfohlene Embryo-Grading System angewandt (siehe Tabelle 6,7 und 8). Dabei werden die Embryonen je nach Entwicklungsstadium und anhand der Zellzahl sowie -größe beurteilt. In Tabelle 6

Der Embryotransfer stellt den letzten Schritt einer IVF-Behandlung dar. In der Regel geschieht dies zwischen Tag 2 und Tag 5 nach der ICSI. In diesem Zeitraum werden Embryonen täglich (morgens) einem Embryo-Scoring unterzogen. Hierzu werden sie unter einem Lichtmikroskop untersucht und beurteilt. Sich zu langsam teilende Embryonen korrelieren mit einer einer schlechteren Schwangerschaftsrate als sich normal teilende Embryonen.⁴⁵ Im Vergleich haben sich zu schnell teilende Embryo-nen eher eine Chance auf eine Schwangerschaft. Zur Beurteilung von EmbryoEmbryo-nen kommen unterschiedliche Beurteilungssysteme in Frage. In der vorliegenden Studie wird das im Consensus Workshop von Istanbul (2011) empfohlene Embryo-Grading System angewandt (siehe Tabelle 6,7 und 8). Dabei werden die Embryonen je nach Entwicklungsstadium und anhand der Zellzahl sowie -größe beurteilt. In Tabelle 6

Im Dokument Konventionelle ICSI versus ICSI mit CultActive (Seite 41-0)