Entwicklung porziner Oozyten nach parthenogenetischer Aktivierung

Auch für artifiziell aktivierte porzine Oozyten liegen Untersuchungen zur Entwicklungsfähigkeit im frühen Embryonalstadium vor.

In Tabelle 9 sind parthenogenetische Teilungs- (pTR) und Blastozystenraten (pBR) unterschiedlicher Aktivierungsmethoden vergleichend dargestellt. Es handelt sich dabei ausschließlich um in vitro gereifte Oozyten. Für die Kulturphase wurde neben der in vitro Kultivierung teilweise auch die In-vivo-Kultur im ligierten Eileiter nach Embryotransfer verwendet. Die übliche Kultivierungszeit zur Bestimmung der Blastozystenrate betrug dabei 6-7 Tage. JOLIFF und PRATHER (1997) und KURE-BAYASHI et al. (2000) verlängerten die in vivo Kultur nach elektrischer Aktivierung jedoch auf 12 bzw. sogar auf 17-29 Tage und bewiesen die Effizienz ihrer Aktivierungsmethoden:

JOLIFF und PRATHER (1997) erhielten nach 12 Tagen neun Embryonen im Elongationsstadium und einen Embryo in ovoider Form. Diese parthenogenetischen Embryonen entsprachen morphologisch normal befruchteten Embryonen in diesem Entwicklungsstadium.

KURE-BAYASHI et al. (2000) beschrieben nach Übertragung von 19-49 aktivierten (elektrische Stimulation + Cytochalasin B) diploiden Oozyten pro Empfängertier Implantationsfähigkeit und Organbildung der Embryonen bis zur Ausbildung der Gliedmaßenknospen. Bei mehreren Feten war Herzschlag erkennbar. Allerdings wiesen viele der zurückgewonnenen Feten deutliche Missbildungen wie Kopfdeformationen und Acephalus, fehlende Augenbildung, zu geringe Körpergröße und Herz- und Leberzysten auf.

Die elektrische Aktivierung ist, auch unter Berücksichtigung der in der Tabelle 9 beschriebenen pBR, somit als eine äußerst effektive künstlichen Aktivierungsmethoden für porzine Oozyten anzusehen. Eine physiologische und vollständige parthenogenetische Entwicklung zum lebensfähigen Individuum scheint jedoch nicht möglich zu sein.

Ebenfalls ein sehr effektiver Aktivator ist Thimerosal, das zu pBR um 40 % führt. Auch Kombinationen der elektrischen Aktivierung mit Cycloheximid (NUSSBAUM u. PRATHER 1995), Cytochalasin B (JOLIFF u. PRATHER 1997) und Colcemid (NAGAI et al. 1999) erbrachten gute parthenogenetische Blastozystenbildungsraten mit Raten um die 20 %.

Tabelle 9: Literaturübersicht der Ergebnisse unterschiedlicher Aktivierungsmethoden in vitro gereifter porziner Oozyten bezüglich parthenogenetischer Teilungs- (pTR) und Blastozystenraten (pBR)

Aktivierung Autor Kultur Kultur-dauer (h)

pTR (%)

pBR (%) Elektrische Aktivierung LIU u. MOOR 1997 In vitro 48 52,2-78,8 -

WANG et al. 1998a In vitro 48 / 168 74 11 Ca²⁺-Ionophor FUNAHASHI et al. 1994b In vitro 48 / 120 20 0

WANG et al. 1998a In vitro 48 / 168 39 5 WANG et al. 1999 In vitro 48 / 168 49 16

JILEK et al. 2000 In vitro 48 / 144 32-50 1 Thimerosal (+DTT) MACHATY et al. 1997b In vitro 144 - 42

MACHATY et al. 1997b In vivo 144 - 42,9

CaCl2-Injektion MACHATY et al. 1996 In vivo 168 - 14,7

Cytosolic Sperm Factor

(CSF) MACHATY et al. 2000 In vitro 168 51,7 2

Protein-Kinase-Inhibitor:

Staurosporin JOLIFF u. PRATHER

1997 In vivo 168 - 4

Protein-Synthese-Inhibitoren + elektrische

Akt.

NUSSBAUM u.

PRATHER 1995 In vivo 144 - 23

G-Protein-Stimulation

(GTP-γ^-S) MACHATY et al. 1995 In vivo 168 - 13,1

Stimulation eines G-Protein gekoppelten

Rezeptors KIM et al. 1998a In vivo 144 - 17,4

Elektrische Aktivierung

+ Cytochalasin B JOLIFF u. PRATHER

1997 In vivo 168 - 18

Ethanol + 6-DMAP LEAL u. LIU 1998 In vitro 36 48 -

Elektrische Stimulation +

Colcemid NAGAI et al. 1999 In vitro 168 - 22,4

Ca²⁺-Ionophor +

Cycloheximid JILEK et al. 2000 In vitro 48 / 144 49-62 1

2.4 Erzeugung von Nachkommen mit vorbestimmtem Geschlecht

2.4.1 Geschlechtsspezifische Trennung von Spermien mittels Flowzytometrie

Das genetische Geschlecht bei Säugetieren wird bei der Befruchtung durch das befruchtende Spermium festgelegt, je nachdem ob es ein X-Chromosom trägt (Gynäkospermium: weiblich determinierend) oder ob es ein Y-Chromosom trägt (Androspermium: männlich determinierend) (GLEDHILL 1988; SCHNORR 1989).

Die Möglichkeiten zur Geschlechtsdiagnose können dadurch grob in zwei Bereiche gegliedert werden:

1. die präkonzeptionelle Geschlechtsbestimmung, bei der die Spermien vor der Befruchtung in X- und Y-Chromosom tragende Samenzellen separiert werden, oder 2. die postkonzeptionelle Geschlechtsbestimmung, bei der die Diagnose an

präimplantativen Embryonen oder an Feten durchgeführt wird.

Bei den postkonzeptionellen Methoden ist an Embryonen und Feten jedoch nur noch die Identifizierung des Geschlechtes möglich und eine Änderung könnte theoretisch nur durch Abortauslösung erreicht werden (SEIDEL u. JOHNSON 1999). Präimplantative Embryonen können durch Entnahme einzelner Blastomeren und Einsatz molekularer Sonden mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) auf ihr Geschlecht untersucht werden. Allerdings ist hierfür eine Eröffnung der Zona pellucida erforderlich, was zu einer Beeinträchtigung der Embryonenqualität führt. Embryonen mit nicht erwünschtem Geschlecht werden nicht übertragen, der wirtschaftliche Nutzen ist somit begrenzt (z. B. POMP et al. 1995;

GUTIERREZ-ADAN et al. 1997; SHEA 1999).

Eine einfache Methode wäre die präkonzeptionelle Geschlechtsbestimmung durch eine vorherige Trennung der Samenzellen in X-chromosomale und Y-chromosomale Spermien, um dann die Fraktion des gewünschten Geschlechts bei einer Besamung einzusetzen.

Als bisher einzige zuverlässige und praktikable Methode zur Geschlechtsbestimmung von Spermien gilt die flowzytometrische Trennung der Samenzellen, basierend auf dem DNA-Unterschied zwischen X- und Y-chromosomalen Spermien (SEIDEL u. JOHNSON 1999;

JOHNSON 2000).

JOHNSON und CLARKE (1988) zeigten erstmals die Befruchtungsfähigkeit sortierter Spermienköpfe, indem sie diese in das Zytoplasma von Hamsteroozyten injizierten. Die ersten Nachkommen aus gesextem Sperma nach chirurgischer Besamung beim Kaninchen erhielten JOHNSON et al. (1989). Die Würfe zeigten eine Geschlechterverteilung von 94 %

weiblichen und 81 % männlichen Nachkommen, je nach eingesetzter Spermienfraktion, die keine morphologischen oder genetischen Schäden aufwiesen.

Die praktische Anwendung gesexten Spermas blieb zunächst jedoch aufgrund geringer Sortierraten eingeschränkt. Heute ist die sogenannte „Beltsville Sperm Sexing Technology“

(BSST) durch den Einsatz des MoFlo^-„High Speed Cell Sorters“ (Fa. Cytomation, Ft.

Collins, Co, USA) (JOHNSON u. WELCH 1999) und durch die Verwendung einer modifizierten Auslassdüse („orienting nozzle“) ergänzt und so weit verbessert (RENS et al.

1998), dass die kommerzielle Anwendung beim Rind bereits erfolgt (RENS et al. 2001). Im High-Speed-Flowzytometer lassen sich pro Stunde 6-10 Millionen Spermien mit einer Reinheit von 95-98 % für das gewünschte Geschlecht sortieren (JOHNSON 2000).

In Abbildung 5 ist die Funktionsweise eines Flowzytometers zum Sortieren von Säugerspermien schematisch dargestellt.

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Flowzytometeres zum Sortieren von Säugerspermien (modifiziert nach RATH et al. 1996)

Hüllstrom

Hüllstrom Spermien

90° Detektor

0° Detektor UV-Laser-Strahl

Verlust Signal

X/Y Fluoreszenz

Y X

- +

Signal Lateralfluoreszenz

Ablenkungs -platten

= Spermientropfen

Für den Sortiervorgang wird ejakuliertes Sperma zunächst verdünnt und mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342, der an die DNA bindet, für eine Stunde bei 35 °C inkubiert. Eine uniforme Färbung ist für eine maximale Trennung der Samenzellen entscheidend. Im Flowzytometer werden die Spermien von einem Trägerstrom erfasst, der mittels Vibrationen in einen Tröpfchenstrom zerteilt wird, wobei jeder Tropfen maximal eine Samenzelle enthält. Als Trägermedium beschreibt JOHNSON (2000) PBS mit einem 0,1%igen BSA-Zusatz. Aufgrund des unterschiedlichen DNA-Gehaltes ergibt sich im Laserstrahl ein unterschiedlich starkes Fluoreszenzsignal, aufgrund dessen eine elektrische Aufladung der einzelnen Spermientropfen erfolgt. Im nachgeordneten elektrischen Feld werden die Tropfen ihrer Ladung entsprechend abgelenkt und in getrennten Auffanggefäßen gesammelt. Nur Spermien, die ein eindeutiges Fluoreszenzsignal aussenden, werden in den Sortiervorgang mit einbezogen, alle anderen verbleiben in einem neutralem Tropfen und werden nicht mit sortiert (RATH et al. 1996).

Durch den Sortiervorgang werden die Spermien aufgrund extremer Druckveränderungen, hoher Verdünnung, Temperaturwechsel, Zentrifugation und Färbung vielen Stressfaktoren ausgesetzt (JOHNSON 2000). Um die Lebensfähigkeit der Spermien optimal zu erhalten, muss das Auffangmedium den Bedürfnissen der Spermien entsprechend angepasst werden.

Der Zusatz von Eidotter hat sich dabei bewährt (JOHNSON et al. 1989; JOHNSON 1991).

Ebenso ist die Zugabe von Seminalplasma empfehlenswert, da so der Anteil an frühzeitig kapazitierten Spermien deutlich verringert und die Lebensspanne der Zellen verlängert werden kann (MAXWELL et al. 1996, 1998). Ein Zusatz von 10 % Seminalplasma hat aber möglicherweise aufgrund der enthaltenden dekapazitierenden Faktoren einen negativen Effekt auf die Entwicklungsraten nach IVF (MAXWELL u. JOHNSON 1997; MAXWELL et al.

1998).

Das Erreichen einer 100%igen Reinheit des geschlechtsspezifisch sortierten Spermas ist bei den meisten Haussäugetieren kaum möglich, jedoch ist eine Reinheit von durchschnittlich 95-98 % als realistisch anzusehen, wie durch Reanalyse der sortierten Spermien bewiesen werden kann (JOHNSON 2000). Der Grund für die unterschiedliche Sortierbarkeit der Spermien verschiedener Säugerspezies ist unter anderem auf speziesspezifische Unterschiede der DNA-Differenz zwischen X- und Y-chromosomalen Spermien (z. B. Schaf:

4,2 %; Schwein: 3,6 %; Mensch: 2,8 %) zurückzuführen (JOHNSON 2000).

2.4.2 Einsatz von gesexten Spermien bei IVF und ICSI

Aufgrund der bisher noch eingeschränkten Verfügbarkeit an gesexten Spermien für eine normale Besamungsdosis beim Schwein müssen bislang noch vermehrt andere biotechnische Verfahren für die effektive Anwendung des gesexten Spermas eingesetzt werden (SEIDEL u. JOHNSON 1999). Zu nennen sind beim Schwein dabei die tief intrauterine oder die chirurgische Besamung mit reduzierter Spermiendosis (KRÜGER et al.

1999; KRÜGER u. RATH 2000) und In-vitro-Fertilisation (IVF) (RATH et al. 1997, 1999;

ABEYDEERA et al. 1998c) oder intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit anschließendem Embryotransfer (O´BRIAN et al. 1996; KLOCKE 1999).

JOHNSON und SEIDEL berichteten 1999, dass bis zu diesem Zeitpunkt mehr als 1500 Nachkommen bei Mensch und Tier nach Befruchtung mit flowzytometrisch sortierten Spermien geboren worden sind, die meisten davon nach intrauteriner oder chirurgischer Besamung. Diese Zahl ist bis heute deutlich gestiegen.

Die Geburt von Nachkommen nach IVF und Embryotransfer mit gesextem Sperma beschrieben erstmals CRAN et al. (1993) beim Rind, wobei sechs Kälber von sechs mit dem korrekten Geschlecht geboren worden sind. RATH et al. (1997) erzeugten erstmals Nachkommen beim Schwein nach IVF mit gesextem Sperma, wobei alle geborenen Ferkel entsprechend den eingesetzten X-chromosomalen Spermien weiblichen Geschlechts waren (100 % korrektes Geschlecht). ABEYDEERA et al. (1998c) verwendeten für IVF statt in vivo gereifte Oozyten in vitro gereifte porzine Oozyten und erhielten nach Embryotransfer 23 weibliche Ferkel von 24 Ferkeln (96 %) und neun männliche Ferkel von neun (100 %). RATH et al. (1999) setzten ebenfalls in vitro gereifte porzine Oozyten zur IVF ein und erhielten 33 weibliche von insgesamt 34 Ferkeln (97 %), während in einer Kontrollgruppe mit ungesexten Spermien 52 % männliche und 48 % weibliche Ferkel geboren wurden.

Mit Hilfe der intrazytoplasmatischen Spermieninjektionen konnten ebenfalls erfolgreich Nachkommen erstellt werden. Als erstes berichteten CATT et al. (1996) über die Geburt eines männlichen Lamms nach ICSI mit gesexten, Y-chromosomalen Spermien (siehe auch Kapitel 2.3.2.3, Tabelle 8). In der Humanmedizin konnten nach IVF, intrauteriner Besamung und ICSI mit X-chromosomalen Spermien insgesamt 13 Mädchen von 14 Babys geboren werden (93 %) (FUGGER et al. 1998). Ein Jahr später veröffentlichten HAMANO et al.

(1999) die Geburt von 10 Kälbern aus mit Y-chromosomalen Spermien injizierten, in vitro gereiften Oozyten. Das Geschlechterverhältnis lag bei acht Bullen- und zwei Kuhkälbern (80 %). SCHMID et al. (1998) konnten nach ICSI mit sortierten X-Spermien beim Pferd Embryonen im Acht-Zellstadium erhalten, ein Embryotransfer schlug fehl. Jedoch wurden

sieben Embryonen mittels PCR auf ihr Geschlecht hin untersucht und alle wurden als weiblich identifiziert (100 %).

Zum Einsatz von geschlechtsspezifisch sortierten Spermien zur ICSI beim Schwein gibt es bisher erst zwei Untersuchungen. O´BRIAN et al. (1996) untersuchten vergleichend die Aktivierungs- und Befruchtungsraten ungesexter und gesexter Spermien nach ICSI. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschied zwischen ungesexten (68 % und 28 %) und gesexten (82 % und 31 %) Spermien. KLOCKE (1999) berichtete nach Injektion von X-chromosomalen Spermien in in vivo gereifte Oozyten von einer Teilungsrate von 20,1 ± 5,6 %. Für in vitro gereifte, mit gesexten Spermien injizierte Oozyten ergab sich eine Teilungsrate von 17,4 %. Nach fünftägiger In-vitro-Kultur konnten weder mit in vivo noch mit in vitro gereiften Oozyten Blastozysten erhalten werden. Es wurde ein Embryotransfer (14 Embryonen im Zwei- und Vier-Zellstadium) durchgeführt, aus dem sich jedoch keine Trächtigkeit ergab.

Bisher wurde noch nicht über die Geburt von Ferkeln nach ICSI mit gesextem Sperma berichtet.

3 Material und Methoden

Abbildung 5 zeigt eine zusammenfassende, schematische Übersicht der Versuchsabläufe zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion.

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Versuchsabläufe zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI)

- spermieninjizierte Oozyten - kontrollinjizierte Oozyten - nicht injizierte Oozyten Aktivierung der

44-48 h In-vitro-Reifung in NCSU 37

Beurteilung der Vorkerne durch Lacmoid-Färbung

In-vitro-Kultur in NCSU 23

3.1 In-vitro-Maturation (IVM) porziner Oozyten

3.1.1 Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe

Für alle Versuche wurden ausschließlich in vitro gereifte Oozyten verwendet. Die einzige Ausnahme bildete der letzte Versuchsabschnitt, bei dem Embryotransfers mit Embryonen aus in vivo gereiften Oozyten, die mit sortierten Spermien injiziert worden sind, durchgeführt wurden.

Zur Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) wurden auf einem nahegelegenen Schlachthof Ovarien präpuberaler Jungsauen (unbekannter Herkunft) gesammelt und in einem auf ca. 38 °C vorgewärmten Thermogefäß zum Institut transportiert.

Im Labor wurden die Ovarien zunächst mit auf 38,5 °C erwärmter physiologischer Kochsalzlösung (mit Zusatz von Penicillin G und Streptomycin) gespült.

Die Gewinnung der Oozyten erfolgte anschließend durch Punktion aller Follikel, die einen Durchmesser von 2-5 mm aufwiesen. Dazu wurden Kanülen mit einer Nadelstärke von 18-gauge (Microlance 3, Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland) verwendet, die das Punktat über einen Adapteraufsatz in ein steriles Auffanggefäß (50 ml Zentrifugenröhrchen, Fa.

Greiner, Frickenhausen) leiteten, in dem die Follikelflüssigkeit mit den darin befindlichen KOK gesammelt wurde. Dieses Auffanggefäß war über ein Schlauchsystem mit einer Unterdruckpumpe (VM AR – 5100, Fa. Cook, Queensland 4113, Australien) verbunden, deren Vakuum so eingestellt wurde, dass in einer Minute 20 ml Flüssigkeit aspiriert werden konnte. Es wurden im Normalfall vier Anschlüsse zur Follikelpunktion verwendet.

Nach Punktion aller geeigneten Follikel wurden die Auffanggefäße mit auf 38,5 °C erwärmtem PBS + 1 % NBCS (PBS: Dulbecco´s phosphatgepufferte Salzlösung, # D-6650, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA; NBCS: newborn calf serum) aufgefüllt und für zehn Minuten stehen gelassen, damit die KOK absedimentieren konnten. Anschließend wurde der Überstand abgegossen und der Vorgang ein zweites Mal wiederholt.

Jeweils 1-2 ml des nach erneutem Abgießen des Überstands verbliebenen Pellets aus KOK und Follikelwandzellen wurden in eine Petrischale (Ø 94 mm) gegeben und mit 10 ml PBS + 1 % NBCS verdünnt. Unter einem Stereomikroskop wurden die verwendbaren KOK bei 20-50facher Vergrößerung mit Hilfe einer selbstausgezogenen Glaspipette (Pasteurpipette,

# 7477 20, Fa. Brand, Wertheim) herausgesucht und in einem Petrischälchen (Ø 32 mm) mit 2 ml PBS + 1 % NBCS nach zweimaligem Waschen gesammelt.

Es wurden nur solche KOK ausgewählt, die von mindestens drei kompakten Lagen Kumuluszellen umgeben waren und ein feingranuliertes, homogenes Zytoplasma aufwiesen.

3.1.2 In-vitro-Maturation porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU 37 Zur In-vitro-Maturation der gewonnenen KOK wurde als Medium NCSU 37 (North Carolina State University, siehe Anhang) verwendet, welches mit Follikelflüssigkeit aus unreifen Follikeln, Insulin, Cystein, Glutamin, EGF und Merkaptoethanol supplementiert und anschließend sterilfiltriert (Einmal-Filterhalter FP 030/3, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) worden war.

Von dem Maturationsmedium wurden je 500 µl in die Vertiefungen von Five Well Dishes (# 19021005, Fa. Minitüb, Tiefenbach) pipettiert und vor Versuchsbeginn für einige Stunden bei 38,5 °C und einer 5%igen CO₂-Atmosphäre in feuchtigkeitsgesättigter Luft in einem Brutschrank (Nuaire NU 2700 E, Fa. Zapf Instrument, Sarstedt) zur Äquilibrierung vorinkubiert.

Die selektierten KOK wurden fünfmal in dem äquilibrierten Maturationsmedium gewaschen, bevor sie in Gruppen zu jeweils 50 KOK in die Vertiefungen der Embryokulturschale mit je 500 µl NCSU 37 gesetzt wurden.

Für die ersten 24 Stunden der Maturation wurden dem Medium db-cAMP sowie die gonadotropen Hormone PMSG und hCG zugegeben. Für den zweiten Tag erfolgte die Reifung der KOK in äquilibriertem NCSU 37 ohne Zusatz von PMSG, hCG und db-cAMP.

Nach insgesamt 44-48 Stunden Inkubation bei 38,5 °C und 5 % CO₂ in feuchtigkeits-gesättigter Luft wurde die Reifung beendet.

3.1.3 Denudierung und Vorbereitung der in vitro gereiften porzinen Oozyten für ICSI

Nach Beendigung der Reifung wurden die Oozyten von den expandierten Kumuluszellen befreit. Dies erfolgte durch wiederholtes Pipettieren der KOK in PBS + 1 % NBCS mit einer 100 µl-Eppendorf-Pipette in mehreren Schritten, wodurch eine mechanische Ablösung der Kumuluszellen von den Oozyten erreicht wurde.

Bis zur weiteren Verarbeitung lagerten die entkumulierten Zellen in einer Petrischale (∅ 35 mm) mit 2 ml PBS + 10 % NBCS im Brutschrank.

3.1.4 Bestimmung der Maturationsrate

An jedem Versuchstag wurden aus den Maturationsgruppen insgesamt 15-20 Oozyten zufällig ausgewählt, um die Maturationsrate zu überprüfen.

Diese Oozyten wurden zuerst für eine Stunde in einer Paraformaldehyd-Triton-X-100-Lösung (siehe Anhang) bei 38,5 °C inkubiert, um eine Andauung der Zona pellucida zu erreichen, damit der verwendete Fluoreszensfarbstoff später besser in die Oozyten eindringen konnte.

Anschließend wurden die Oozyten dreimal in PBS gewaschen und für eine Stunde bei Raumtemperatur in PBS aufbewahrt.

Fünf Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff-Lösung (Hoechst 33342, siehe Anhang) wurden nach Ablauf dieser Zeit mit 500 µl Mounting Medium (siehe Anhang) in einem 2 ml-Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf, Hamburg) gemischt, wovon ein 10 µl-Tropfen auf einen Objektträger pipettiert wurde, in den die Oozyten mit möglichst wenig PBS zentral hinein gesetzt und mit einem Deckgläschen abgedeckt wurden. Um ein Eintrocknen der Flüssigkeit zu verhindern, wurde der Rand des Deckgläschens rundherum mit Nagellack versiegelt.

Die Beurteilung erfolgte unter einem Fluoreszenzmikroskop (BX 60, mit Filtereinsatz:

U-URBC, F 06398, Fa. Olympus, Hamburg) bei 100- bis 400facher Vergrößerung. Eine Oozyte galt als gereift, wenn sowohl die Chromosomenplatte als auch der Polkörper sichtbar waren und die Oozyte sich somit in der Metaphase II (M II) der Meiose befand.

3.2 In-vivo-Maturation porziner Oozyten

3.2.1 Versuchstiere

Für Embryotransferversuche zur Entwicklungskapazität von Embryonen, die mittels intrazytoplasmatischer Injektion von flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierten Spermien erstellt werden sollten, wurden in vivo gereifte Oozyten verwendet. Als Spendertiere für in vivo gereifte Oozyten dienten präpuberale, mindestens fünf Monate alte, geschlechts- und allgemeingesunde Jungsauen der Deutschen Landrasse aus institutseigener Zucht mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 87,9 ± 12,22 kg, die nach Superovulation zur Oozytengewinnung geschlachtet wurden.

3.2.2 Gewinnung in vivo gereifter porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe Die Superovulation der Spendertiere erfolgte durch die intramuskuläre Injektion von 1500 I.E.

PMSG (Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin, Intergonan^, Fa. Intervet, Tönisvorst).

Zweiundsiebzig Stunden später erhielten die Tiere eine intramuskuläre Injektion von 500 I.E.

hCG (human Chorionic Gonadotropin, Ovogest^, Fa. Intervet, Tönisvorst) und weitere 36 Stunden später erfolgte die Schlachtung im institutseigenem Schlachthaus.

Der Genitaltrakt der Tiere wurde direkt nach dem Entbluten entnommen und in einem vorgewärmten (38 °C) Thermogefäß in das Labor transportiert. Dort wurden die Ovarien isoliert und bis zur Follikelpunktion in 38 °C warmer physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt. Auf einem 38 °C warmen Heiztisch (HAT 400, Fa. Minitüb, Tiefenbach) und mit Hilfe einer 1 ml Spritze mit aufgesetzter Kanüle (18-gauge, Microlance 3, Fa. Dickinson, Drogheda, Irland) wurden alle mindestens 5 mm großen Follikel punktiert, vorsichtig gespült und anschließend deren Inhalt aspiriert. Als Spülmedium wurde sterilfiltriertes PBS mit Zusatz von 1 % NBCS verwendet. Die Aspirate wurden als Mikrodrops einzeln in einer Petrischale (∅ 94 mm, Fa. Greiner, Nürtingen) nebeneinander abgesetzt und unter einem Stereomikroskop (SMZ-2T, Fa. Nikon, Düsseldorf) mit aufgelegter Heizplatte (39 °C) bei 35- bis 50facher Vergrößerung nach Oozyten abgesucht.

Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Kumulus-Oozyten-Komplexe in Petrischälchen (∅ 35 mm, Fa. Greiner, Nürtingen) mit 2 ml PBS + 1 % NBCS nach Schlachttier getrennt im Brutschrank aufbewahrt.

3.2.3 Denudierung und Vorbereitung der in vivo gereiften Oozyten für ICSI Das Entkumulieren der in vivo gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe erfolgte enzymatisch mit Hilfe einer EDTA-Trypsin-Lösung (0,2 % Ethylen-Diamin-Tetraacetat; 0,1 % Trypsin in Ca²⁺- und Mg²⁺- freiem PBS mit 1 mg/ml PVA). Dazu wurden die Oozyten für 20 Minuten in die auf 38,5 °C vorgewärmte EDTA-Trypsin-Lösung gesetzt und anschließend durch wiederholtes Aufziehen in eine 100 µl-Eppendorf-Pipette in drei Waschschritten in PBS mit Zusatz von 1 % NBCS von den Kumuluszellen befreit. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Oozyten in PBS + 10 % NBCS im Brutschrank bei 38,5 °C aufbewahrt.

3.3 Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe

Die morphologische Beurteilung der Qualität der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe erfolgte in Anlehnung an die von LEIBFRIED und FIRST (1979) aufgestellten Beurteilungskriterien für KOK des Rindes. Danach werden Zytoplasma und die Expansion der Kumuluszellen bewertet und in vier Klassen eingeteilt, wie es in Tabelle 10 beschrieben ist.

Für die Versuche wurden nur solche KOK eingesetzt, die den Klassen 1 und 2 zuzuordnen waren und ein dunkles, homogenes Zytoplasma aufwiesen.

Tabelle 10: Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK)

Klasse 1 hochgradig expandiert

Die Kumuluszellen sind weit auseinandergerückt und liegen sowohl in der Peripherie als auch in der

Nähe der Zona pellucida einzelnd.

Klasse 2 mittelgradig expandiert

Die Kumuluszellen sind weit auseinandergerückt, aber mehrere Zellen sind noch

zusammenhängend.

Klasse 3 geringgradig expandiert

Die Kumuluszellen sind deutlich

auseinandergewichen, liegen der Zona pellucida aber noch eng an.

Klasse 4 nicht expandiert Die Kumuluszellen liegen dicht

aneinandergedrängt der Zona pellucida eng an.

3.4 Gewinnung und Aufbereitung der verwendeten Spermien

3.4.1 Nebenhodenschwanzspermien

Das in 0,25 ml Kunststoff-Röhrchen (System Minitüb, Tiefenbach) in flüssigem Stickstoff tiefgefrorene Nebenhodenschwanzsperma wurde in einem auf 39 °C vorgewärmten Wasserbad für ca. 30 Sekunden aufgetaut. Anschließend wurde der Inhalt des Röhrchens mit 10 ml Spermaverdünner (Androhep^TM, # 13529/0010, Fa. Minitüb, Tiefenbach), der auf 38 °C vorgewärmt worden war, verdünnt und für drei Minuten bei 389 x g zentrifugiert.

Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesogen und das verbliebene Pellet mit 0,5 ml vorgewärmtem Androhep^TM resuspendiert.

In einer folgenden Verdünnungsreihe wurde die Spermienkonzentration auf eine relativ geringe Spermiendichte von ca. 3-5 x 10⁵ Samenzellen pro Milliliter eingestellt, um ein problemloses Einfangen der Spermien für die Einzelspermieninjektion zu ermöglichen.

3.4.2 Flüssigkonservierte Spermien

Für alle Versuche mit flüssigkonservierten Spermien wurden Ejakulate desselben Ebers verwendet.

Die Samengewinnung erfolgte an einem Phantom mit Hilfe der sogenannten

„Handmethode“, wobei die einzelnen Spermafraktionen getrennt aufgefangen wurden.

Davon wurde die spermienreiche Phase unmittelbar nach Probennahme mit vorgewärmtem Androhep^TM (# 13529/0010, Fa. Minitüb, Tiefenbach) in einem Verhältnis von 1 : 2 vorverdünnt.

Für die Versuche mit ungesexten Spermien wurde hiervon ein Aliquot abgenommen und in weiteren Verdünnungsschritten mit Androhep^TM auf die für ICSI benötigte Konzentration von 3-5 x 10⁵ Spermien pro Milliliter eingestellt.

3.4.3 Flowzytometrisch sortierte, flüssigkonservierte Spermien

Für die flowzytometrische Sortierung wurde flüssigkonserviertes Sperma wie unter 3.4.2.

Für die flowzytometrische Sortierung wurde flüssigkonserviertes Sperma wie unter 3.4.2.

Im Dokument Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien in aktivierte Oozyten beim Schwein (Seite 41-0)