Grundlagen der Oozytenaktivierung

Die Aktivierung der Oozyte ist die Voraussetzung für die weitere Entwicklung zur Zygote und zum Embryo. Bekannt ist, dass es durch die Fusion von Spermium und Oozyte zu einem initialen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Ionen-Konzentration kommt, in dessen Folge der intrazelluläre Ca²⁺-Gehalt bis zur Bildung der Vorkerne oszilliert (DAY et al. 2000; JONES et al. 1995). Die Ca²⁺-Oszillationen sind wiederum das auslösende Signal für weitere Vorgänge im Rahmen der Oozyten-Aktivierung (OZIL 1990; VITULLO u. OZIL 1992):

⇒ Sie bewirken die Exozytose der kortikalen Granula, die zu einer Modifikation von Oolemm und Zona pellucida führt. Der Inhalt der kortikalen Granula entleert sich dabei in den perivitellinen Raum und es kommt zu physikochemischen und biochemischen Zustandsänderungen der Plasmamembran und zur Aushärtung der Zona pellucida (CRAN u. CHENG 1986), so dass ein Polyspermieblock aufgebaut wird, der das Eindringen weiterer Spermien in die Oozyte verhindert (HUNTER 1991).

⇒ Die Ca²⁺-Oszillationen führen auch zur Fortsetzung der Meiose, so dass der zweite Polkörper ausgeschleust wird und die Vorkerne gebildet werden. Ein hoher Gehalt an aktivem „Maturation Promoting Factor“ (MPF), der für die Oozytenreifung beim Säuger essentiell ist (WU et al. 1997; MOTLIK et al. 1998), erhält die Arretierung in der Metaphase II aufrecht. Durch ein Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau einer der Untereinheiten des MPF, des Cyclin B, bleibt die hohe MPF-Aktivität unter Kontrolle zytostatischer Faktoren bestehen (KUBIAK et al. 1993). Als Folge der Ca²⁺-Oszillationen im Rahmen der Befruchtung kommt es zu einer Störung dieses Gleichgewichtes und die MPF-Aktivität nimmt deutlich ab (FULKA et al. 1992). Somit kann die Blockierung der Meiose überwunden werden und der Zellzyklus läuft mit Ausbildung des weiblichen und männlichen Vorkerns und der Ausschleusung des zweiten Polkörperchens weiter (TAIEB et al. 1997). Eine wichtige, aber bisher noch nicht vollständig geklärte Rolle spielt dabei die „Mitogen-activated Protein Kinase“ (MAPK) (LIU u. YANG 1999).

⇒ Außerdem kommt es im Rahmen der Ca²⁺-Oszillationen zu einer Änderung im Proteinmuster, die als Kennzeichen einer vollständigen Aktivierung angesehen werden kann. DING et al. (1992a) stellten fest, dass es beim Schwein aufgrund der Befruchtung zu einem plötzlichen Absinken der Konzentration von 46 kDa-Proteinen kommt. Ebenso tritt eine progressive Reduzierung eines 25 kDa-Proteins gekoppelt mit einem Anstieg eines 22 kDa-Proteins auf. DING et al. (1992a) beschrieben weiterhin, dass diese Veränderungen nicht auf eine Änderung der Proteinsynthese zurückzuführen sind, sondern auf posttranslationale Modifikationen, die im Verlauf der Befruchtung stattfinden.

Die Proteinsynthese ist für die Befruchtung im Gegensatz zur Oozytenreifung nicht essentiell (DING et al. 1992b). Eine Änderung des Proteinmusters aufgrund der Befruchtung konnte auch bei anderen Säugetieren beschrieben werden (z. B. Maus:

ENDO et al. 1986; Schaf: MOOR u. GANDOLFI 1987).

⇒ Vom Seeigel und einigen anderen Invertebraten ist es bekannt, dass es während der Befruchtung zu einem für die vollständige Aktivierung notwendigen, intrazellulären Anstieg des pH-Wertes kommt (SHEN u. STEINHARDT 1979). Allerdings wiesen KLINE und ZAGRAY (1995) sowie PHILIPS und BALTZ (1996) bei der Maus keinen intrazellulären pH-Anstieg während der Befruchtung nach. Gleiches stellten BEN-YOSEF et al. (1996) für die Ratte fest. Für das Schwein liegen Untersuchungsergebnisse bezüglich der pH-Veränderungen bei in vitro gereiften Oozyten nach künstlicher Aktivierung vor. So konnten RUDDOCK et al. (2000) einen Anstieg des pH durch die artifizielle Aktivierung der Oozyten mit 7 % Ethanol, mit Ca²⁺-Ionophor und mit Thimerosal nachweisen. Untersuchungen bezüglich pH-Veränderungen im Rahmen der physiologischen Befruchtung beim Schwein fehlen.

Bezüglich des Mechanismus, wie durch das Spermium die Ca²⁺-Oszillationen ausgelöst werden, bestehen zwei Theorien:

1. Bei der Fusion des Spermiums mit der Oozyte wird ein lösliches Protein aus dem Zytoplasma (cytosolic sperm factor: CSF) der Samenzelle in die Oozyte freigesetzt, das über einen noch ungeklärten Weg die Ca²⁺-Oszillationen auslöst und nicht spezies-spezifisch ist.

Das Vorhandensein eines aktivierenden CSF ist verschiedentlich beschrieben worden (Seeigel: DALE et al. 1985; Kaninchen, Maus: STICE u. ROBL 1990; Hamster: SWANN 1990; Mensch: HOMA u. SWANN 1994; PALERMO et al. 1997; Rind: WU et al. 1998).

So konnten PARRINGTON et al. (1996) ein lösliches Spermien-Protein nachweisen, Oscillin, das die für eine normale Befruchtung charakteristischen Ca²⁺-Oszillationen in

Mäuse-Oozyten auslösen konnte. Im Spermienkopf sitzt dieses Protein auf Höhe des Äquatorialsegmentes, der Bereich, an dem die Spermien-Oozyten-Fusion ihren Anfang nimmt. MACHATY et al. (2000) zeigten außerdem, dass durch Injektion eines porzinen CSF in Oozyten vom Schwein alle Folgen der Aktivierung vollständig ausgelöst wurden.

Der Mechanismus wie der CSF die Ca²⁺-Freisetzung bewirkt, bleibt jedoch noch unklar.

Untersuchungen von WU et al. (2001) weisen allerdings darauf hin, dass CSF die Phospholipase C stimuliert und somit über Produktion von Inositol-1,4,5 Triphosphat (IP₃) die Ca²⁺-Freisetzung bewirkt. PERRY et al. (1999b, 2000) führten als Ergebnisse ihrer Untersuchungen beim Rind an, dass nur das Zusammenspiel mehrerer hitzestabiler und hitzeempfindlicher Spermien-Proteine eine Aktivierung auszulösen vermag.

2. Die zweite Theorie nimmt an, dass das Spermium an einen Rezeptor in der Plasmamembran der Oozyte bindet, der mit einem G-Protein oder einer Protein-Tyrosin-Kinase (KIM et al. 1999a) gekoppelt ist, die über die Aktivierung der Phospholipase C die Produktion von Inositol-1,4,5 Triphosphat (IP₃) bewirken, was zur Freisetzung von Ca²⁺ -Ionen aus intrazellulären Speichern führt. So konnten MACHATY et al. (1995) nachweisen, dass gereifte porzine Oozyten einen G-Protein vermittelten Signaltransduktionsweg besitzen. Durch Stimulation desselben mit Guanosin-5´-0-(3´-Thiotriphosphat) (GTP-γ-S, ein GTP-Analog) konnten sie Ca²⁺-Oszillationen und die folgenden Ereignisse der Oozyten-Aktivierung auslösen. Die Anwesenheit des G-Protein vermittelten Signalwegs in porzinen Oozyten wurde in nachfolgenden Versuchen bestätigt (KIM et al. 1998a; MACHATY et al. 1997a). Jedoch ist dadurch nicht bewiesen, dass das Spermium bei der Befruchtung auf diesem Weg die Oozyte aktiviert.

Im Anschluß an eine erfolgreiche Aktivierung einer vollständig gereiften Oozyte durch das Spermium kommt es schließlich zur synchronen Ausbildung des männlichen und des weiblichen Vorkerns, zur Verschmelzung der beiden und zur nachfolgenden Zellteilung.

Die beschriebene, bei einer Befruchtung auftretende Aktivierung einer Oozyte kann auch spontan erfolgen, ohne dass eine Samenzelle daran beteiligt ist. In diesem Fall kann es zu einer parthenogenetischen Entwicklung der Oozyte mit Zellteilung und Blastozystenbildung kommen.