In vitro Maturation porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU 37

State University, siehe Anhang) verwendet, welches mit Follikelflüssigkeit aus unreifen Follikeln, Insulin, Cystein, Glutamin, EGF und Merkaptoethanol supplementiert und anschließend sterilfiltriert (Einmal-Filterhalter FP 030/3, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) worden war.

Von dem Maturationsmedium wurden je 500 µl in die Vertiefungen von Five Well Dishes (# 19021005, Fa. Minitüb, Tiefenbach) pipettiert und vor Versuchsbeginn für einige Stunden bei 38,5 °C und einer 5%igen CO₂-Atmosphäre in feuchtigkeitsgesättigter Luft in einem Brutschrank (Nuaire NU 2700 E, Fa. Zapf Instrument, Sarstedt) zur Äquilibrierung vorinkubiert.

Die selektierten KOK wurden fünfmal in dem äquilibrierten Maturationsmedium gewaschen, bevor sie in Gruppen zu jeweils 50 KOK in die Vertiefungen der Embryokulturschale mit je 500 µl NCSU 37 gesetzt wurden.

Für die ersten 24 Stunden der Maturation wurden dem Medium db-cAMP sowie die gonadotropen Hormone PMSG und hCG zugegeben. Für den zweiten Tag erfolgte die Reifung der KOK in äquilibriertem NCSU 37 ohne Zusatz von PMSG, hCG und db-cAMP.

Nach insgesamt 44-48 Stunden Inkubation bei 38,5 °C und 5 % CO₂ in feuchtigkeits-gesättigter Luft wurde die Reifung beendet.

3.1.3 Denudierung und Vorbereitung der in vitro gereiften porzinen Oozyten für ICSI

Nach Beendigung der Reifung wurden die Oozyten von den expandierten Kumuluszellen befreit. Dies erfolgte durch wiederholtes Pipettieren der KOK in PBS + 1 % NBCS mit einer 100 µl-Eppendorf-Pipette in mehreren Schritten, wodurch eine mechanische Ablösung der Kumuluszellen von den Oozyten erreicht wurde.

Bis zur weiteren Verarbeitung lagerten die entkumulierten Zellen in einer Petrischale (∅ 35 mm) mit 2 ml PBS + 10 % NBCS im Brutschrank.

3.1.4 Bestimmung der Maturationsrate

An jedem Versuchstag wurden aus den Maturationsgruppen insgesamt 15-20 Oozyten zufällig ausgewählt, um die Maturationsrate zu überprüfen.

Diese Oozyten wurden zuerst für eine Stunde in einer Paraformaldehyd-Triton-X-100-Lösung (siehe Anhang) bei 38,5 °C inkubiert, um eine Andauung der Zona pellucida zu erreichen, damit der verwendete Fluoreszensfarbstoff später besser in die Oozyten eindringen konnte.

Anschließend wurden die Oozyten dreimal in PBS gewaschen und für eine Stunde bei Raumtemperatur in PBS aufbewahrt.

Fünf Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff-Lösung (Hoechst 33342, siehe Anhang) wurden nach Ablauf dieser Zeit mit 500 µl Mounting Medium (siehe Anhang) in einem 2 ml-Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf, Hamburg) gemischt, wovon ein 10 µl-Tropfen auf einen Objektträger pipettiert wurde, in den die Oozyten mit möglichst wenig PBS zentral hinein gesetzt und mit einem Deckgläschen abgedeckt wurden. Um ein Eintrocknen der Flüssigkeit zu verhindern, wurde der Rand des Deckgläschens rundherum mit Nagellack versiegelt.

Die Beurteilung erfolgte unter einem Fluoreszenzmikroskop (BX 60, mit Filtereinsatz:

U-URBC, F 06398, Fa. Olympus, Hamburg) bei 100- bis 400facher Vergrößerung. Eine Oozyte galt als gereift, wenn sowohl die Chromosomenplatte als auch der Polkörper sichtbar waren und die Oozyte sich somit in der Metaphase II (M II) der Meiose befand.

3.2 In-vivo-Maturation porziner Oozyten

3.2.1 Versuchstiere

Für Embryotransferversuche zur Entwicklungskapazität von Embryonen, die mittels intrazytoplasmatischer Injektion von flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierten Spermien erstellt werden sollten, wurden in vivo gereifte Oozyten verwendet. Als Spendertiere für in vivo gereifte Oozyten dienten präpuberale, mindestens fünf Monate alte, geschlechts- und allgemeingesunde Jungsauen der Deutschen Landrasse aus institutseigener Zucht mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 87,9 ± 12,22 kg, die nach Superovulation zur Oozytengewinnung geschlachtet wurden.

3.2.2 Gewinnung in vivo gereifter porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe Die Superovulation der Spendertiere erfolgte durch die intramuskuläre Injektion von 1500 I.E.

PMSG (Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin, Intergonan^, Fa. Intervet, Tönisvorst).

Zweiundsiebzig Stunden später erhielten die Tiere eine intramuskuläre Injektion von 500 I.E.

hCG (human Chorionic Gonadotropin, Ovogest^, Fa. Intervet, Tönisvorst) und weitere 36 Stunden später erfolgte die Schlachtung im institutseigenem Schlachthaus.

Der Genitaltrakt der Tiere wurde direkt nach dem Entbluten entnommen und in einem vorgewärmten (38 °C) Thermogefäß in das Labor transportiert. Dort wurden die Ovarien isoliert und bis zur Follikelpunktion in 38 °C warmer physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt. Auf einem 38 °C warmen Heiztisch (HAT 400, Fa. Minitüb, Tiefenbach) und mit Hilfe einer 1 ml Spritze mit aufgesetzter Kanüle (18-gauge, Microlance 3, Fa. Dickinson, Drogheda, Irland) wurden alle mindestens 5 mm großen Follikel punktiert, vorsichtig gespült und anschließend deren Inhalt aspiriert. Als Spülmedium wurde sterilfiltriertes PBS mit Zusatz von 1 % NBCS verwendet. Die Aspirate wurden als Mikrodrops einzeln in einer Petrischale (∅ 94 mm, Fa. Greiner, Nürtingen) nebeneinander abgesetzt und unter einem Stereomikroskop (SMZ-2T, Fa. Nikon, Düsseldorf) mit aufgelegter Heizplatte (39 °C) bei 35- bis 50facher Vergrößerung nach Oozyten abgesucht.

Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Kumulus-Oozyten-Komplexe in Petrischälchen (∅ 35 mm, Fa. Greiner, Nürtingen) mit 2 ml PBS + 1 % NBCS nach Schlachttier getrennt im Brutschrank aufbewahrt.

3.2.3 Denudierung und Vorbereitung der in vivo gereiften Oozyten für ICSI Das Entkumulieren der in vivo gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe erfolgte enzymatisch mit Hilfe einer EDTA-Trypsin-Lösung (0,2 % Ethylen-Diamin-Tetraacetat; 0,1 % Trypsin in Ca²⁺- und Mg²⁺- freiem PBS mit 1 mg/ml PVA). Dazu wurden die Oozyten für 20 Minuten in die auf 38,5 °C vorgewärmte EDTA-Trypsin-Lösung gesetzt und anschließend durch wiederholtes Aufziehen in eine 100 µl-Eppendorf-Pipette in drei Waschschritten in PBS mit Zusatz von 1 % NBCS von den Kumuluszellen befreit. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Oozyten in PBS + 10 % NBCS im Brutschrank bei 38,5 °C aufbewahrt.

3.3 Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe

Die morphologische Beurteilung der Qualität der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe erfolgte in Anlehnung an die von LEIBFRIED und FIRST (1979) aufgestellten Beurteilungskriterien für KOK des Rindes. Danach werden Zytoplasma und die Expansion der Kumuluszellen bewertet und in vier Klassen eingeteilt, wie es in Tabelle 10 beschrieben ist.

Für die Versuche wurden nur solche KOK eingesetzt, die den Klassen 1 und 2 zuzuordnen waren und ein dunkles, homogenes Zytoplasma aufwiesen.

Tabelle 10: Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK)

Klasse 1 hochgradig expandiert

Die Kumuluszellen sind weit auseinandergerückt und liegen sowohl in der Peripherie als auch in der

Nähe der Zona pellucida einzelnd.

Klasse 2 mittelgradig expandiert

Die Kumuluszellen sind weit auseinandergerückt, aber mehrere Zellen sind noch

zusammenhängend.

Klasse 3 geringgradig expandiert

Die Kumuluszellen sind deutlich

auseinandergewichen, liegen der Zona pellucida aber noch eng an.

Klasse 4 nicht expandiert Die Kumuluszellen liegen dicht

aneinandergedrängt der Zona pellucida eng an.

3.4 Gewinnung und Aufbereitung der verwendeten Spermien

3.4.1 Nebenhodenschwanzspermien

Das in 0,25 ml Kunststoff-Röhrchen (System Minitüb, Tiefenbach) in flüssigem Stickstoff tiefgefrorene Nebenhodenschwanzsperma wurde in einem auf 39 °C vorgewärmten Wasserbad für ca. 30 Sekunden aufgetaut. Anschließend wurde der Inhalt des Röhrchens mit 10 ml Spermaverdünner (Androhep^TM, # 13529/0010, Fa. Minitüb, Tiefenbach), der auf 38 °C vorgewärmt worden war, verdünnt und für drei Minuten bei 389 x g zentrifugiert.

Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesogen und das verbliebene Pellet mit 0,5 ml vorgewärmtem Androhep^TM resuspendiert.

In einer folgenden Verdünnungsreihe wurde die Spermienkonzentration auf eine relativ geringe Spermiendichte von ca. 3-5 x 10⁵ Samenzellen pro Milliliter eingestellt, um ein problemloses Einfangen der Spermien für die Einzelspermieninjektion zu ermöglichen.

3.4.2 Flüssigkonservierte Spermien

Für alle Versuche mit flüssigkonservierten Spermien wurden Ejakulate desselben Ebers verwendet.

Die Samengewinnung erfolgte an einem Phantom mit Hilfe der sogenannten

„Handmethode“, wobei die einzelnen Spermafraktionen getrennt aufgefangen wurden.

Davon wurde die spermienreiche Phase unmittelbar nach Probennahme mit vorgewärmtem Androhep^TM (# 13529/0010, Fa. Minitüb, Tiefenbach) in einem Verhältnis von 1 : 2 vorverdünnt.

Für die Versuche mit ungesexten Spermien wurde hiervon ein Aliquot abgenommen und in weiteren Verdünnungsschritten mit Androhep^TM auf die für ICSI benötigte Konzentration von 3-5 x 10⁵ Spermien pro Milliliter eingestellt.

3.4.3 Flowzytometrisch sortierte, flüssigkonservierte Spermien

Für die flowzytometrische Sortierung wurde flüssigkonserviertes Sperma wie unter 3.4.2.

beschrieben gewonnen und mit Androhep^TM vorverdünnt. Ein Milliliter verdünntes Sperma mit einer eingestellten Dichte von 150 x 10⁶ Samenzellen pro Milliliter wurde mit 10 µl Fluoreszenzfarbstoff (Hoechst 33342, bisBenzimid, 5 mg/ml, Fa. Sigma, St.Louis, MO, USA) versetzt und bei 35 °C für eine Stunde inkubiert. Anschließend erfolgte bei Raumtemperatur eine Gegenfärbung der Spermien mit 1 µl des Lebensmittelfarbstoffs FD & C #40 (Fa.

Warner Jenkinson Company Inc., St. Louis, MO, USA) aus einer Stocklösung mit der Konzentration 25 mg/ml, um akrosomendefekte Spermien zu separieren. Vor der flowzytometrischen Sortierung wurde die Probe durch ein Nylonnetz mit einer Porenweite von 51 µ (Fa. Reichelt Chemietechnik, Heidelberg) filtriert.

Die flowzytometrische Sortierung der gefärbten Samenzellen erfolgte nach der „Beltsville Sperm Sexing Technology“ nach JOHNSON und WELCH (1999) mit einem „High Speed Cell Sorter“ (MoFlo^ Cytomation, Fort Collins, CO, USA). Als Lichtquelle diente ein 5 W

Argon-Ionen-Laser mit einer Lichtleistung von 200 mW. Der Wellenlängenbereich des Lasers zur Emissionsanregung lag zwischen 351 und 364 nm. PBS mit Zusatz von 0,002 % BSA Fraktion V (Fa. Sigma, St.Louis, MO, USA), 50 µg/ml Penicillin G und 60 µg/ml Streptomycin und einem pH-Wert von 7,5 diente als Hüllstrom. Es wurde mit einem Arbeitsdruck von 3,9 bar und einer Flußrate von 27000 Samenzellen pro Sekunde sortiert. Die Sortierrate betrug 2700 bis 3000 Spermien pro Sekunde, die durchschnittliche Reinheit der sortierten Spermienpopulationen umfasste 95 % für Y-chromosomale und 92 % X-chromosomale Spermien.

Als Auffanggefäße dienten um 2 mm gekürzte 15 ml-Zentrifugenröhrchen (Fa. Greiner, Frickenhausen), in die 0,5 ml „Auffangmedium“ vorgelegt wurden. Bei diesem Medium handelte es sich um den Überstand einer bei 850 x g für zehn Minuten zentrifugierten 2 %-TEST-Eidotter-Lösung (siehe Anhang), der bis zum Einsatz bei -20 °C gelagert wurde. Nach dem Auftauen wurde das Auffangmedium ebenfalls mit Hilfe des 51 µ-Nylon-Filters filtriert und anschließend mit 1 % Seminalplasma supplementiert.

Zur Konzentrierung des gesexten Spermas wurden die Samenzellen nach dem Sortiervorgang für 20 Minuten bei 850 x g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und das Spermienpellet mit 0,5 ml Androhep^TM resuspendiert. Dabei wurde den sortierten Spermien erneut 1 % Seminalplasma zum Endvolumen zugesetzt. In einer folgenden Verdünnungsreihe erfolgte die Einstellung der Spermienkonzentration auf die für ICSI benötigte Dichte von 3-5 x 10⁵ Spermien pro Milliliter. Für alle Versuche mit sortiertem Sperma wurden nur die y-chromosomalen Spermien verwendet.

3.5 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)

3.5.1 Mikroinjektionsausstattung

Die Versuche wurden an einer Mikromanipulationseinheit mit inversem Mikroskop (Axiovert 135, Fa. Zeiss, Göttingen) bei 100- bis 400facher Vergrößerung durchgeführt. Das Mikroskop war mit einer Hoffmann Modulation-Contrast-Optik^ (HMC, Fa. Modulation Optics Inc., Greenvale, New York, USA) ausgestattet, wodurch eine besonders kontrastreiche Darstellung gewährleistet wurde.

Der Objekt-Kreuztisch (Fa. Minitüb, Tiefenbach) war beheizbar und auf eine Arbeitstemperatur von 38,5 °C eingestellt. Auf dem Heiztisch war eine Metallplatte fixiert, die mit einer entsprechenden Aussparung versehen war, um eine Petrischale von 55 mm Durchmesser aufzunehmen.

Für die Spermieninjektionen wurden zwei verschiedene Mikromanipulatoren verwendet:

Auf der linken Seite des Mikroskops befand sich für die Führung und Halterung der Oozyten-Haltepipette ein manueller Mikromanipulator (# 11520138, Fa. Leitz, Wetzlar), während auf der rechten Seite des Mikroskops für Halterung und Führung der Injektionspipette eine elektrische Mikromanipulations-Einheit (LN-MINI 25 XYZ motorisch, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) angebracht war. Die gesamte Mikromanipulationseinheit ist in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 6: Mikromanipulationseinheit

Der mechanische Manipulator für die Haltepipette besaß eine Halterung, mit deren Hilfe der Kapillarenhalter mit der Haltepipette am Gerät fixiert wurde. Der Kapillarenhalter war über einen ca. 80 cm langen Schlauch (∅ ca. 5 mm) mit einer 1 ml-Einmalspritze verbunden.

Durch Bewegen des Spritzenstempels ließen sich Über- und Unterdruck in der Haltepipette erzeugen, so dass durch Ansaugen und Abstoßen die Oozyte bewegt und fixiert werden konnte. Die Haltepipette wurde mit Hilfe einer Gummidichtung in dem Kapillarenhalter fixiert.

Bei den Haltepipetten handelte es sich um Schmelzpunktbestimmungsröhrchen mit einer Länge von 90 mm und einem Durchmesser von 1,5 mm (# 3005, Fa. Assistent), die selbst bearbeitet wurden:

Zuerst wurden die Röhrchen mit Hilfe eines Mikropipetten-Pullers (# Mpp1, Fa. Research Instruments, Cornwall, U.K.) ausgezogen und anschließend an einer Mikroschmiede (# P430, 25800501, Fa. Bachhofer, Reutlingen) weiter bearbeitet. Nachdem sie bei einem äußerem Durchmesser von ca. 120 µm senkrecht und gerade abgebrochen worden waren, wurde dieses Ende der Pipette an die glühende Glaskugel der Mikroschmiede herangeführt, um die Ränder der Spitze soweit zusammenzuschmelzen, dass die Öffnung der Pipette nur noch 30-40 µm betrug. Als letztes wurde dieses Ende der Pipette ca. 1,5 mm vor der Spitze in einem Winkel von 30° abgebogen.

Der elektrische Manipulator für die Injektionspipette bestand aus drei Teilen: zum einen aus der Fixiereinheit, die direkt am Mikroskop befestigt war und zur Führung und Halterung der Mikropipette diente und über Schrittmotoren in drei verschiedenen Achsen beweglich war, zum anderen aus dem Tastenfeld mit Trackball, womit die Mikromanipulationseinheit gesteuert wurde, und aus der Steuerungseinheit (SM2/2-96-023, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen).

Für die Spermieninjektion wurde auf einer Ebene im Proportional-Modus (P-Modus) gearbeitet, bei dem sich der Manipulator proportional zu den Bewegungen des Trackballs bewegte. Es wurden die Achsen X, Y, Z und D unterschieden.

Die Achsen X und Y dienten zu Bewegungen in alle Richtungen auf einer bestimmten Ebene der Injektionspipette, während es mit Hilfe der Z-Achse möglich war, die Ebene bzw. Höhe der Pipette zu verändern. Die D-Achse veränderte nicht die Position der Mikropipette, sondern konnte über eine motorisch dosierte Spritze die Ölsäule in der Injektionsipette bewegen (Abbildung 7).

Z Y

X

Abbildung 7: Bewegungsachsen des Mikromanipulators

Es war möglich, die Bewegungsgeschwindigkeit der Pipette und der Ölsäule genau zu definieren: Zum einen konnte eine grobe Einteilung in die Bereiche „HIGH“ (1-6 mm/sec) und

„LOW“ (0,04-0,68 mm/sec) festgelegt werden, zum anderen konnten in jedem Bereich

Öl

D

weitere Abstufungen in 32 Schritten durch Drücken der Tasten XYZ↑ oder XYZ↓, bzw. D↑ oder D↓ vorgenommen und gespeichert werden. Die gewählten Geschwindigkeiten wurden auf dem Display des Tastenfeldes angezeigt. In Tabelle 11 sind die für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion verwendeten Geschwindigkeitsstufen aufgeführt.

Tabelle 11: Gespeicherte Geschwindigkeitsstufen für ICSI

„LOW“ „HIGH“

Stufe entspricht

mm/sec. Stufe entspricht

mm/sec.

D 11 0,24 19 3,81

XYZ 15 0,32 23 4,44

Die verwendete Injektionspipette (# 5175 112.008, Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) wurde mit Hilfe von Spannzange und Mutter fest in einem Kapillarenhalter (# KP-000100, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) verankert. Es kamen Injektionsnadeln mit folgenden Abmessungen zum Einsatz:

Tabelle 12: Abmessungen der verwendeten Injektionspipette für ICSI

(# 5175 112.008, Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, 51145 Köln)

Innerer Durchmesser der Spitze: 5,5 µm Äußerer Durchmesser der Spitze: 7,0 µm Länge des Schenkels: 1000 µm

Winkel: 35°

Orientierung der Öffnung: seitlich

Der Kapillarenhalter mit der Injektionsnadel wurde in eine Kapillarenhalterung an der Manipulationseinheit eingeklemmt. Mit Hilfe einer Stellschraube konnte diese Halterung in einem Winkel zwischen 35-60° fixiert werden. Für die Spermieninjektionen wurde ein Winkel von ca. 40° gewählt.

Über das andere Ende des Kapillarenhalters wurde ein Druckschlauch (# 05011515, Angiodyn^ HD-Schlauch, Fa. Braun, Melsungen) geschoben und mit einer Mutter festgeklemmt. Der Druckschlauch führte zu einem Dreiwegehahn (# 05012155, Angiodyn^ HD-Hahn, Fa. Braun, Melsungen), der eine Verbindung mit einer gasdichten Spritze (Hamilton Microliter^TM Syringe, Fa. Hamilton Bonaduz AG, 7402 Schweiz) und einem weiteren Schlauch erlaubte. Die Hamilton-Spritze wurde in eine motorische Dosiereinheit (LN-Mini-25-Manipulator mit Dosieradapter, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) eingespannt, wodurch der Konus der Spritze über die oben erwähnte D-Achse bewegt und Öl in die Injektionsnadel gedrückt werden konnte.

Am Ende des zweiten Schlauches wurde eine 10 ml-Spritze (Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland) befestigt, mit deren Hilfe das verwendete Öl (# M-3516, mineral oil, light white oil, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) in das System eingefüllt werden konnte. Dazu wurde der Zugang zur Hamilton-Spritze durch den Dreiwegehahn verschlossen. In dem mit Öl gefüllten Schlauchsystem durften keine Luftblasen enthalten sein.

3.5.2 Durchführung der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) Die Spermieninjektionen wurden in einem Petrischalendeckel (∅ 55 mm, Fa. Greiner, Nürtingen) durchgeführt, der exakt in die Aussparung des Objekttisches passte.

In die Mitte des Deckels wurde ein 10 µl Tropfen der Spermiensuspension gegeben und mit einem 8 µl Tropfen Polyvinylpyrrolidon (PVP 10%ig, # 10890001, Fa. Gück, Berlin) überdeckt und vermischt. Aufgrund der hohen Viskosität des PVP (Molekulargewicht: 360.000) verlangsamten sich die Bewegungen der Spermien, so dass das Immobilisieren und Einfangen der Spermien erleichtert wurde.

Um den Spermientropfen herum wurden in gleichmäßigen Abständen zehn 20 µl-Tropfen PBS + 10 % NBCS pipettiert (Abbildung 8) und anschließend wurden alle Tropfen mit Mineralöl (# M-3516, mineral oil, light white oil, Fa. Sigma, St. Louis, USA) vollständig bedeckt. In jeden PBS-Tropfen wurden jeweils zwei entkumulierte Oozyten pipettiert.

= Spermientropfen = Oozytentropfen

Abbildung 8: Schematische Darstellung des „ICSI-Schälchens“ mit Spermien- und Oozytentropfen

Zur Aufnahme eines Spermiums wurde die Injektionspipette von rechts in den Spermientropfen „hinein gefahren“. Nachdem die Ölsäule in der Pipette ca. eine halbe Spermienlänge vor der Pipettenspitze zum Stillstand gebracht worden war, wurde ein Spermium rausgesucht, das morphologisch intakt erschien und noch Bewegungsaktivität zeigte.

Zur Immobilisierung der Samenzelle wurde die Pipettenspitze vertikal über dem Mittelstück abgesenkt und das Spermium auf den Boden der Petrischale gedrückt. Um die Mittelstückmembran leicht anzureißen, wurde die Pipette ein- bis zweimal vorsichtig hin- und herbewegt. Anschließend wurde die Samenzelle so gedreht, dass sie mit dem Schwanz zuerst von der Injektionspipette aufgenommen werden konnte. Befand sich das Spermium in der Pipette, wurde die Ölsäule wieder zum Stillstand gebracht, und die Injektionsnadel wurde aus dem Tropfen „herausgefahren“.

Anschließend wurde eine Oozyte in einem PBS-Tropfen mit Hilfe der Haltepipette fixiert und auf Vorhandensein und Lage eines Polkörpers untersucht. Die Oozyte wurde so von links (neun Uhr) angesaugt, dass der Polkörper auf der Linie zwischen zwölf und sechs Uhr zu liegen kam. Die Spermieninjektion erfolgte in der Drei-Uhr-Position (Abbildung 9). Dabei wurde die Samenzelle zunächst direkt in der Spitze der Pipette positioniert, um die injizierte Menge des PVP-Androhep-Gemisches im Zytoplasma möglichst gering zu halten. Nachdem die Injektionsnadel durch Zona pellucida und Oolemm hindurch in die Oozyte eingeführt worden war, wurde erst eine geringe Menge Zytoplasma angesaugt, um abzusichern, dass sich die Pipettenspitze wirklich im Zytoplasma der Oozyte befand. Danach wurde das Spermium mit dem Kopf zuerst in das Zytoplasma der Oozyte injiziert und, sobald die Ölsäule wieder zum Stillstand gebracht worden war, die Pipette aus der Oozyte herausgezogen.

Zur Kontrolle parthenogenetischer Entwicklungsvorgänge wurden an jedem Versuchstag auch kontroll- und nicht injizierte Oozyten in die Versuche miteinbezogen. Kontrollinjizierte Oozyten wurden dabei exakt wie die spermieninjizierten behandelt, außer dass sich kein Spermium in der Injektionsnadel befand.

Die Oozyten der nicht injizierten Kontrollgruppen wurden genau wie die der injizierten Gruppen behandelt, jedoch ohne sie der Mikromanipulation zu unterziehen.

Anschließend wurden die Oozyten bis zur Weiterkultivierung in PBS + 10 % NBCS im Brutschrank bei 38,5 °C und 5%iger CO₂-Atmosphäre in feuchtigkeitsgesättigter Luft aufbewahrt.

Abbildung 9: Intrazytoplasmatische Injektion eines Spermiums in eine gereifte Oozyte (Polkörper auf sechs Uhr)

Spermium

Polkörper

3.6 Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI

Für die zusätzliche Aktivierung porziner Oozyten zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion wurden folgende Methoden angewandt: die Injektion einer CaCl2-Lösung, die Koinkubation mit Ca²⁺-Ionophor und die Aktivierung durch einen einzelnen elektrischen Puls. Für diese Versuche wurden die Oozyten nur mit unsortierten, tiefgefrorenen, aufgetauten Nebehodenschwanzspermien injiziert. Die Auswertung erfolgte nach 20-stündiger In-vitro-Kultur anhand der Vorkernbildung.

3.6.1 Aktivierung durch CaCl2-Injektion

Bei der künstlichen Aktivierung der Oozyten mit CaCl₂ wurde zusammen mit dem Spermium eine bestimmte Menge einer CaCl2-Lösung in die Oozyte injiziert.

Das CaCl₂ (CaCl₂H₂, # C 7902, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde in einer Konzentration von 30 mM in einer 0,9%igen NaCl-Lösung gelöst und anschließend, nach Zugabe von 2 % NBCS, sterilfiltriert (Einmal-Filterhalter FP 030/3, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel).

Zehn Mikroliter dieser vorbereiteten Lösung wurden im ICSI-Schälchen unterhalb des Spermientropfens abgesetzt. Zusätzlich wurde für eine entsprechende Kontrollgruppe ein 10 µl Tropfen einer sterilfiltrierten 0,9%igen NaCl-Lösung unterhalb des CaCl2-Tropfens in das ICSI-Schälchen pipettiert. Seitlich und oberhalb dieser Tropfen wurden neun Tropfen PBS + 10 % NBCS für die Oozyten verteilt, und anschließend wurden alle Tropfen ebenfalls mit Öl (# M-3516, mineral oil, light white oil, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) vollständig bedeckt. Für eine Spermieninjektion mit zusätzlicher Aktivierung durch CaCl₂ wurde die Injektionspipette mit der aufgenommenen Samenzelle in den CaCl₂-Tropfen gefahren. Dort wurde soviel des PVP-Androhep-Gemisches aus der Pipette herausgespült bis sich das Spermium in der Pipettenspitze befand, anschließend wurde ausreichend CaCl₂-Lösung in die Pipette aufgenommen und die Ölsäule wieder zum Stillstand gebracht.

Vor der Injektion von CaCl₂ und Spermium in die Oozyte wurde die Samenzelle so positioniert, dass der Kopf eine Spermienlänge von der Pipettenspitze entfernt war.

Anschließend erfolgte der Injektionsvorgang wie unter 3.5.2 beschrieben. Es wurden somit ca. 1,2 pl CaCl₂-Lösung zusammen mit dem Spermium in die Oozyte injiziert. Die Berechnung des Injektionsvolumens erfolgte nach der in Tabelle 13 angegebenen Formel.

Tabelle 13: Formel zur Berechnung des injizierten Volumens der CaCl₂-Lösung

5,5 µm = Innendurchmesser der Injektionspipette 50 µm = Länge eines Eberspermiums

An jedem Versuchstag wurde zur Überprüfung der aktivierenden Eigenschaften des CaCl₂ in einige Oozyten nur CaCl2 und kein Spermium injiziert. Genauso erfolgte die Überprüfung der aktivierenden Eigenschaften der 0,9%igen NaCl-Lösung ohne CaCl₂.

Spermien-, kontroll- und nicht injizierte Oozyten ohne zusätzliche Injektion von CaCl₂ oder NaCl wurden jeweils als Kontrollgruppen mituntersucht.

3.6.2 Aktivierung durch Ca-Ionophor

3.6.2 Aktivierung durch Ca-Ionophor

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