Aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
dem Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg Angewandte Tumorvirologie
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Sulindac als anti-neoplastische Substanz zur Behandlung des humanen Zervixkarzinoms
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Theresia Elisabeth Karl
aus Heilbronn
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. med. vet. Ludwig Haas PD Dr. med. Dr. phil. Patrick Finzer
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Ludwig Haas 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2005
Vorab öffentlich präsentierte Teilergebnisse dieser Arbeit:
KARL, T., N. SEIBERT, M. STÖHR, H. OSSWALD, F. RÖSL u. P. FINZER (2005):
Sulindac induces degradation of the human papillomavirus (HPV) oncoprotein E7, causes growth arrest and apoptosis in HeLa cells.
Posterpräsentation auf dem Annual Meeting 2005, Gesellschaft für Virologie, Hannover; 16. – 19.03.2005
KARL, T., N. SEIBERT, M. STÖHR, H. OSSWALD, F. RÖSL u. P. FINZER (2005):
Sulindac induces degradation of the HPV oncoprotein E7 and causes growth arrest and apoptosis in HeLa cells.
Posterpräsentation auf dem 22nd International Papillomavirus Conference and Clinical Workshop,
Vancouver B.C., Canada; 30.04. – 06.05.2005
Vorab zur Veröffentlichung eingereichte Teilergebnisse dieser Arbeit:
KARL, T., N. SEIBERT, M. STÖHR, H. OSSWALD, F. RÖSL u. P. FINZER:
Sulindac induces specific degradation of the HPV oncoprotein E7, growth arrest and apoptosis in cervical carcinoma cells.
Meiner Familie gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...1
2. Literaturübersicht...3
2.1 Papillomviren...3
2.1.1 Taxonomische Einordnung und Aufbau...3
2.1.2 Medizinische Bedeutung der Papillomviren...3
2.1.2.1 Humane Papillomviren...3
2.1.2.2 Papillomviren der Tiere...6
2.1.3 Die Replikation der Papillomviren...7
2.1.4 Virale Oncoproteine...9
2.2 Der Zellzyklus...9
2.2.1 Zellzyklus und Krebs...11
2.2.2 HPV und Zellzyklus...11
2.3 Apoptose...12
2.3.1 Apoptose und Krebs...13
2.3.2 HPV und Apoptoseregulation...13
2.4 Therapie des Zervixkarzinoms...14
2.4.1 Standardtherapie...14
2.4.2 Prävention...14
2.5 Nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAIDs) in der Krebstherapie und –prävention...15
2.5.1 Wirkmechanismus der NSAIDs...16
2.5.2 Mögliche Rolle von COX-2 in der Tumorentwicklung...17
2.5.3 Sulindac...18
3. Material und Methoden...20
3.1 Material...20
3.1.1 Chemikalien und Reagenzien...20
3.1.2 Verbrauchsmaterialien und Hilfsmittel...21
3.1.3 Laborausstattung...21
3.1.4 Reagenzien für die Zellkultur...22
3.1.5 Materialien für die Tierversuche...23
3.1.6 Chemikalien und Materialien für die Histologie/Immunhistochemie...23
3.1.7 Lösungen...24
3.1.8 Polyacrylamidgele...27
3.1.9 Kits...28
3.1.10 Antikörper...28
3.2 Methoden...30
3.2.1 Zellexperimentelle Methoden...30
3.2.1.1 Tumorzellen...30
3.2.1.2 Zellkulturtechniken...30
3.2.1.2.1 Stammhaltung...30
3.2.1.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen...31
3.2.1.2.3 Aussaat der Zellen...31
3.2.1.2.4 Behandlung der Zellen...32
3.2.1.3 Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie (FCM-Analyse)...32
3.2.1.3.1 Zellernte für die FCM-Analyse...32
3.2.1.3.2 Durchflusszytometrie...33
3.2.1.3.3 Aufbereitung von gefrorenem, solidem Gewebe für die Durchflusszytometrie...33
3.2.1.4 Analyse von Proteinen...34
3.2.1.4.1 Isolierung von Gesamtzellextrakten für Western Blot Analyse...34
3.2.1.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen (BRADFORD, 1976)...34
3.2.1.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (LÄMMLI, 1970)...34
3.2.1.4.4 Western Blot-Technik...35
3.2.2 Tierexperimentelle Methoden...38
3.2.2.1 Tiermodell...38
3.2.2.2 Tierversuch...39
3.2.2.2.1 Inokulation von Tumorzellen in Nacktmäuse...39
3.2.2.2.2 Behandlung...40
3.2.2.2.3 Versuchsende...41
3.2.2.3 Aufarbeitung der Tumore...41
3.2.2.4 Histologische und immunhistochemische Methoden...42
3.2.2.4.1 Hämatoxylin-Eosin (HE-Färbung) der formalinfixierten Gewebeschnitte.42 3.2.2.4.2 Morphometriemessung...42
3.2.2.4.3 Ki-67 Immunhistochemie nach der Avidin-Biotin-Streptavidin-Komplex-Methode...43
3.2.2.4.4 TUNEL-Assay...44
3.2.2.5 Statistik...45
4. Ergebnisse...46
4.1 In-vitro-Ergebnisse...46
4.1.1 Sulindac und Sulindac-Sulfid hemmen das Wachstum der Zervixkarzinomzelllinie HeLa...46
4.1.2 Sulindac-Sulfid hemmt das Wachstum von Zervixkarzinomzellen unabhängig vom HPV-Typ und der viralen Kopienzahl...48
4.1.3 Sulindac und Sulindacsulfid supprimieren die Expression des HPV Oncoproteins E7 in HeLa-Zellen...49
4.1.4 Sulindac-Sulfid supprimiert die E7-Expression in HPV16- und HPV18-positiven Zervixkarzinomzelllinien...50
4.1.5 Suppression von HPV E7 ist unabhängig von der COX-Hemmung...51
4.1.6 Sulindac und Sulindacsulfid induzieren Apoptose in HeLa-Zellen...52
4.1.7 Sulindac-Sulfid induziert Apoptose unabhängig vom HPV-Typ und der viralen Kopienzahl...54
4.2 In-vivo – Ergebnisse...56
4.2.1 Etablieren eines Tiermodells...56
4.2.1.1 Inokulationstelle...57
4.2.1.2 Inokulierte Zellzahl...57
4.2.1.3 Fütterung...57
4.2.1.4 Futtermenge und Dosis...59
4.2.2 Sulindac hemmt das Tumorwachstum heterotransplantierter
HeLa-Tumoren in Nacktmäusen...59
4.2.2.1 Versuchsverlauf...59
4.2.3 Histologische und immunhistochemische Untersuchungen der Tumoren...61
4.2.3.1 Hämalaun-Eosin(HE)-Färbung...61
4.2.3.1.1 Morphologie...61
4.2.3.1.2 Morphometrie...63
4.2.3.2 TUNEL-Assay...65
4.2.3.3 Ki-67...68
4.2.4 FCM-Analyse der Tumorzellen...69
5. Diskussion...71
5.1 in vitro...71
5.1.1 Wachstumshemmung...72
5.1.2 Apoptose...74
5.2 in vivo...75
5.2.1 Etablieren eines Tiermodells...77
5.2.2 Tumorhemmung...79
5.2.3 Therapie...81
6. Zusammenfassung...83
7. Summary...85
8. Literatur...87
9. Eidesstattliche Erklärung...105
10. Danksagung...107
Abkürzungsverzeichnis
i. a. im allgemeinen
Abb. Abbildung
A Ampère
AP alkalische Phosphatase
APS Ammoniumpersulfat
Aqua bidest. Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser) BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. zirka
cm Zentimeter
cdk cyclin-abhängige Kinase (cyclin-dependent kinase) CIN zervikale intraepitheliale Neoplasie
CKI cdk-Inhibitor
CO2 Kohlenstoffdioxid
COX Cyclooxygenase
d. h. das heißt
DKFZ deutsches Krebsforschungszentrum DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamin-tetraacetat
et al. et alii oder et aliae (und andere)
Fa. Firma
FAP familiäre adenomatöse Polyposis coli
FCM flow cytometry analysis (Durchflusszytometrie) FCS fetales Kälberserum
g Gramm
× g Vielfaches der Erdbeschleunigung
G-Phase Gap-Phase (gap = Lücke)
h Stunde
HCl Salzsäure
HPV humanes Papillomvirus
IC50 inhibitory concentration 50 (Konzentration, bei der die Enzymaktivität um 50 % gehemmt wird)
kg Kilogramm
l Liter
M Molar
µ mikro (×10-6) m milli (×10-3)
min Minute(n)
M-Phase Mitose-Phase
Nr. Nummer
pH potentia Hydrogenii
PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PMSF Phenylmethansulfonylfluorid
PVDF Polyvinylidonfluorid rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
s. c. subkutan (unter die Haut)
SDS Sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat)
SDS-PAGE Natrium(Sodium) Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
sec Sekunde
S-Phase Synthesephase
SR Sulforhodamin
Tab. Tabelle
TBS Tris-buffered saline TBS-T Tris-buffered saline / Tween 20 TEMED N, N, N´, N´-Tetramethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
U Units bzw. Einheiten u. a. unter anderem
V Volt
z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
1 × einfach
10 × zehnfach
Einleitung 1
1. Einleitung
Das Zerixkarzinom ist weltweit die zweithäufigste Krebserkrankung bei Frauen. Auch in Deutschland erkranken ca. 5800 Frauen pro Jahr an dieser Krebsart, und etwa 2600 Patientinnen sterben daran. Das Zervixkarzinom ist mit einer Infektion mit sogenannten „high-risk“-Typen der humanen Papillomviren (HPV) assoziiert, deren virale Oncoproteine E6 und E7 immortalisierendes und transformierendes Potential besitzen.
Als therapeutische Maßnahmen werden chirurgische Methoden, Bestrahlung und Chemotherapeutika, meist Cisplatin, eingesetzt. Dies ist vielfach mit gravierenden Nebenwirkungen und oftmals erheblichen Belastungen für die Patientinnen verbunden. Die Suche nach neuen, besser verträglichen Behandlungen scheint deshalb notwendig.
Für nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAIDs = nonsteroidal anti-inflammatory drugs) sind anti-neoplastische Eigenschaften bei geringer systemischer Toxizität beschrieben worden. Bei der Behandlung der familiären adenomatösen Polyposis (FAP), einer dominant vererbten Präkanzerose, wird das NSAID Sulindac in der Klinik bereits erfolgreich zur Prävention eingesetzt. Es ist jedoch bisher nicht bekannt, ob diese Substanz auch in virus-induzierten Tumoren wie dem Zervixkarzinom wirksam ist.
Im Rahmen dieser Arbeit soll der Effekt von Sulindac auf verschiedene Zervix- karzinomzelllinien in vitro getestet und Untersuchungen zu seinem Wirk- mechanismus - mit besonderer Berücksichtigung des Einflusses auf die viralen Oncoproteine - durchgeführt werden.
Um sein therapeutisches Potential genauer bestimmen und einschätzen zu können, sollen Versuche am Tier über die Wirkung von Sulindac Aufschluss geben. Bei Unterschieden hinsichtlich des Tumorwachstums zwischen Kontrollgruppe und therapierten Tieren soll durch anschließende histologische bzw. immunhisto- chemische Methoden der zugrundeliegende Mechanismus untersucht werden.
Einleitung 2
Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen zeigen, ob Sulindac anti-neoplastische Wirkung auf Zervixkarzinomzellen hat und somit für einen möglichen Einsatz, sowohl in der Therapie, als auch in der Prävention HPV-positiver Tumore, geeignet ist. Darüber hinaus soll ein Einblick in den Wirkmechanismus von Sulindac erbracht werden.
Literaturübersicht 3
2. Literaturübersicht
2.1 Papillomviren
2.1.1 Taxonomische Einordnung und Aufbau
Papillomviren bilden die Virusfamilie der Papillomaviridae. Ihre Nukleinsäure liegt als doppelsträngige, zirkulär geschlossene DNA von 7200 – 8000 Basenpaaren als Superhelix vor. Papillomviren besitzen keine Hülle, und ihr ikosaedrisches Kapsid weist einen Durchmesser von 55 nm auf (FAVRE et al., 1997). Sie haben eine hohe Tenazität, besonders gegenüber Lipidlösungsmitteln, Säure- und Hitzebehandlung.
Papillomviren sind weit verbreitet: Spezifische Virustypen werden bei Menschen, Primaten, Halbweltaffen, Raubtieren, Huftieren, Elefanten, Nagern, Meeressäugern, Vögeln und Reptilien isoliert (Übersicht DE VELLIERS et al., 2004). Trotz ihrer weiten Verbreitung erweisen sich die meisten Papillomviren als streng wirtsspezifisch und können nur Epithelzellen der Haut und der Schleimhaut infizieren.
2.1.2 Medizinische Bedeutung der Papillomviren
2.1.2.1 Humane Papillomviren
Bisher sind über 118 verschiedene HPV-Typen identifiziert (ZUR HAUSEN, 2000, DE VILLIERS et al., 2004). Kutane HPV-Typen infizieren die Basalzellen der Haut, HPV- Typen der Mukosa hingegen die Basalzellen der Schleimhaut (LOWY u. HOWLEY, 2001).
Kutane Typen
Kutane Papillomviren werden durch direkten Kontakt mit infizierten Hautregionen oder über kontaminierte Gegenstände übertragen. Über Mikroläsionen infizieren sie das verhornte Plattenepithel der Haut und rufen meist erst nach mehreren Monaten lokale Zellproliferationen im infizierten Bereich hervor, die sich als vielgestaltige Warzen äußern. Gewöhnliche Warzen (Verrucae vulgares) treten vor allem an
Literaturübersicht 4
Händen und Beinen als erhabene Hautläsionen mit Hyperkeratose auf. Wenig erhaben sind flache Warzen (Verrucae planae juveniles), die meist an den Handrücken und im Gesicht wachsen. Plantare Warzen (Verrucae plantares) kommen vorwiegend an den Fußsohlen vor und können als Dornwarzen tief in die Hautschichten hineinreichen. Bei den meisten Warzen handelt es sich um gutartige, Erkrankungen der Haut, die sich nach einiger Zeit spontan zurückbilden (MASSING u. EPSTEIN, 1963).
Eine seltene hereditäre Hauterkrankung ist die Epidermodysplasia verruciformis, bei der eine multiple Warzenbildung am ganzen Körper auftritt. Sie ist mit bestimmten kutanen Papillomviren assoziiert. Die anfangs gutartigen Warzen können sich zu malignen Tumoren entwickeln, wobei UV-Strahlung ein Co-Faktor darzustellen scheint, da sich die Entartungen v. a. an bevorzugt lichtexponierten Körperpartien manifestieren (LUTZNER et al., 1984).
Bei Patienten, die nach einer Organtransplantation immunsupprimierende Medikamente erhalten, tritt an sonnenexponierten Körperstellen oft Hautkrebs auf, der nicht zur Gruppe der Melanome gehört und ebenfalls mit humanen Papillomviren assoziiert zu sein scheint (SHAMANIN et al., 1996, STOCKFLETH et al., 2004).
Mukosale Typen
Bei den Schleimhauterkrankungen, die mit Papillomviren assoziiert sind, unterscheidet man Läsionen, die im Kopf-Hals-Bereich vorkommen, und solche, die im anogenitalen Bereich zu finden sind. Dabei können sowohl gutartige als auch bösartige Tumore entstehen (LOWY u. HOWLEY, 2001).
Larynxpapillome findet man im Bereich der Mundhöhle und des Kehlkopfs, dabei häufig auch an den Stimmbändern. Bei der juvenilen Form können die Papillome bei üppigem Wachstum durch ihre Lage die Atemwege obstruieren und müssen chirurgisch entfernt werden; eine maligne Entartung ist selten (HERRERO, 2003).
Bei der adulten Form treten die Papillome meist solitär auf. In vielen Fällen wird HPV16 isoliert (MCKAIG et al., 1998, DE VILLIERS et al., 2004). Tabak- und Alkoholkonsum scheinen die Entwicklung von Tumoren im Bereich von Mundhöhle, Kehlkopf und Rachen zu begünstigen (HERRERO et al., 2003).
Literaturübersicht 5
Auch in Tumoren im anogenitalen Bereich werden verschiedene HPV-Typen nachgewiesen (BJØRGE et al., 2002). Humane Papillomviren gelten als die Hauptursache des Zervixkarzinoms. Jährlich nimmt die Zahl der betroffenen Frauen weltweit um 500.000 zu (WAGGONER, 2003). Der Gebärmutterhalskrebs ist nach dem Brustkrebs die zweithäufigste Krebserkrankung bei Frauen weltweit (BOSCH u.
SANJOSE, 2003) und verursacht jährlich über 230.000 Todesfälle (PARKIN et al., 2001). In vielen Entwicklungsländern, wo etwa 80 % der neuen Fälle auftreten, ist dieser Tumor sogar die häufigste durch Krebs verursachte Todesursache (PARKIN et al., 1997, WAGGONER, 2003).
Dabei gelingt in 99,7 % der Zervixkarzinome der Nachweis von HPV-DNA (WALBOOMERS et al., 1999). Von den ca. 40 HPV-Typen, die nachgewiesener- maßen den Genitaltrakt infizieren, scheinen mindestens 14 davon an der Entstehung des Gebärmutterhalskrebses beteiligt zu sein (BOSCH et al., 1995, CLIFFORD et al., 2003). Diese gehören zu der Gruppe der „high-risk“-Typen (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 73, 82), die mit invasiv wachsenden Zervixkarzinomen und anderen anogenitalen Tumoren assoziiert sind, während „low-risk“-Typen (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72) gutartige genitale Warzen (Condylomata acuminata) verursachen (ORIEL, 1981). Die am häufigsten vorkommenden Typen sind HPV16 (50 – 60 %) und HPV18 (10 – 12 %) (BOSCH u. MUÑOZ, 2002, BOSCH u.
SANJOSE, 2003). Vom Zeitpunkt der Infektion, die meist zu Beginn der sexuellen Aktivität erworben wird, bis zum tatsächlichen Ausbruch der Krebserkrankung vergehen meist 20 bis 30 Jahre. Bei der Mehrheit verschwindet die HPV-Infektion wieder, und nur ein kleiner Teil der betroffenen Frauen entwickelt eine progrediente Entartung des Zervixepithels.
Das Zervixkarzinom entwickelt sich in mehreren Stufen mit verschiedenen Vorstadien. In Deutschland und Europa wird vorwiegend die Unterteilung in leichte, mäßige, schwere Dysplasie und Carcinoma in situ verwendet. In den 70er Jahren wurde der Begriff der cervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN) eingeführt, wobei zwischen CIN I, II und III unterschieden wurde (RICHART, 1973). Die einzelnen Stadien der Erkrankung können in die jeweils höhere Entwicklungsstufe übergehen, persistieren oder sich auch zurückentwickeln (OSTOR, 1993). Das Stadium des
Literaturübersicht 6
invasiven Gebärmutterhalskrebses charakterisieren der Durchbruch der Basal- membran und der Fähigkeit, über das Lymph- und Gefäßsystem zu metastasieren (STEHMAN et al., 2003).
Eine HPV-Infektion scheint allein für eine bösartige Entartung einer Läsion nicht auszureichen. Als Cofaktoren bei diesem Prozess spielen offensichtlich Immun- suppression, z. B. durch eine HIV-Infektion (HO et al., 1994, WILLIAMS et al., 1994, PALEFSKY, 2003), Tabakkonsum (DALY et al., 1998, HARRIS et al., 2004), hormonelle Kontrazeptiva (ARBEIT et al., 1996, KJELLBERG et al., 2000, DE VILLIERS, 2003), die Anzahl der Sexualpartner (KARLSSON et al., 1995, WINER et al., 2003) und genetische Prädisposition (HORNG et al., 2004) eine Rolle.
2.1.2.2 Papillomviren der Tiere
Systematische Studien und Beobachtungen lassen vermuten, dass alle Säugetiere, einige (oder alle) Vögel und wahrscheinlich sogar Wirbellose mit Papillomviren infiziert sind (BERNARD u. CHAN, 1997). Aus papillomatösen Veränderungen von Primaten, Halbweltaffen, Raubtieren, Huftieren, Elefanten, Meeressäugern, Nagern (mit Ausnahme der Labormäuse), Vögeln und Reptilien lassen sich wirtsspezifische Papillomviren isolieren.
In der Veterinärmedizin haben die Rinderpapillomviren (BPV) eine besondere Bedeutung. BPV1 verursacht filiforme, fransig-zottige Fibropapillome der Zitzenhaut und eher knollige Fibropapillome der Penis- oder Scheidenschleimhaut; durch BPV2 kommt es zu typischen blumenkohlartigen bis korallenförmigen Fibropapillomen der Haut an Vorderkörper, Unterbauch, Gliedmaßen und/oder Perineum; BPV3 führt zu anderweitigen Papillomen der Haut; BPV4 bewirkt Plattenepithel-Papillome der Maul-, Schlund-, Vormagen- und Harnblasenschleimhaut, die maligne entarten können. BPV5 ist mit reiskornähnlichen Fibropapillomen der Euterhaut assoziiert;
BPV6 induziert filiform-fransige Papillome der Euterhaut (STÖBER, 2002). Bei der Entstehung von Krebs im oberen Gastrointestinaltrakt und der Harnblase durch BPV4 scheinen karzinogene bzw. mutagene und immunsupprimierende Stoffe im
Literaturübersicht 7
Adlerfarn als Inhaltsstoff des Futters eine zusätzliche Rolle zu spielen (JARRETT, 1978, CAMPO et al., 1992).
Wirtschaftliche Bedeutung erlangt die Erkrankung, wenn die Papillome zur Ein- schränkung des Allgemeinbefindens (Probleme beim Fressen und Atmen) oder der Nutzbarkeit (Melken, Deckeinsatz) führen.
Darüber hinaus spielen die Rinder-Papillomviren eine besondere Rolle, da sie bei anderen Tierarten Tumore induzieren können. Die Übertragung von tumorigenen Viren auf heterologe Arten unter natürlichen Bedingungen ist bisher noch wenig erforscht (ZUR HAUSEN, 2001). Bei Pferden, Eseln und Maultieren kann eine Infektion mit BPV1 und BPV2 zur Bildung des equinen Sarkoids führen (OLSEN u.
COOK, 1951, CHAMBERS et al., 2003). Dieser lokal invasiv wachsende fibroblastische Hauttumor ist die häufigste dermatologische Neoplasie der Pferde.
Bisher gibt es keine effektive Therapie, und eine Entfernung der Tumore ist durch eine hohe Rezidivrate gekennzeichnet. Da bei Landwirten und Tierärzten gehäuft Warzen auftreten, bestanden lange Vermutungen über eine Infektion des Menschen mit Rinder-Papillomviren. Inzwischen entkräfteten serologische und molekular- biologische Untersuchungen diesen Verdacht (ORTH et al., 1981).
Das COPV (canine oral papillomavirus) verursacht Papillome im Maul- und Rachenraum bei Hunden. Diese können so stark ausgeprägt sein, dass eine Nahrungsaufnahme nicht mehr möglich ist. Eine Streuung in andere Organe oder maligne Entartung zu Plattenepithelkarzinomen ist möglich, was meist eine Euthanasie der Hunde erfordert (NICHOLLS u. STANLEY, 1999).
2.1.3 Die Replikation der Papillomviren
Für eine Infektion mit Papillomviren ist das Vorhandensein epidermaler oder mukosaler proliferationsfähiger Epithelzellen des Stratum basale nötig (ZUR HAUSEN, 1996). Die Infektion erfolgt über Mikroläsionen der Haut bzw. Schleimhaut, bei denen das Stratum basale des Plattenepithels freigelegt und die Zellen vom Virus infiziert werden (FEHRMANN u. LAIMINS, 2003).
Literaturübersicht 8
Vermutlich erfolgt die Aufnahme des Virus in die Zelle durch Endocytose; ein Rezeptor für den Eintritt des Virus in die basalen Epithelzellen ist noch nicht identifiziert (EVANDER et al., 1997, JOYCE et al., 1999, GIROGLOU et al., 2001).
Nach der Infektion werden im Zellkern 50 bis 100 extrachromosomal vorliegende Virusgenomkopien gebildet und die „frühen“ Proteine (siehe 2.1.4) synthetisiert.
Verlässt eine Tochterzelle die Basalmembran, wandert sie in die suprabasalen Regionen und beginnt sich zu differenzieren. Im Gegensatz zu nichtinfizierten Keratinozyten treten HPV-infizierte Zellen in die Synthese-Phase des Zellzyklus (S-Phase) ein, wenn sie die suprabasalen Schichten erreichen (DOORBAR et al., 1997). Dieser Eintritt in die S-Phase führt zu einer tausendfachen Vervielfältigung des zirkulären Virusgenoms pro Zelle (LAMBERT, 1991). Gleichzeitig entstehen
„späte“ Virusproteine (siehe 2.1.4), die Kapsidproteine, die im Stratum granulosum zu infektiösen Virionen zusammengesetzt werden. Anschließend werden die Virionen über sich abschilfernde Zellen des Stratum corneum in die Umgebung freigesetzt und können weitere Haut- oder Schleimhautzellen infizieren (LAIMINS, 1993) (Abb. 1). Die andere Tochterzelle fährt fort, sich an der Basalmembran zu teilen. Die Population breitet sich lateral aus und bildet über Jahre ein Virusreservoir. So entsteht eine persistierende Infektion, bei der trotz Absterben der virus- produzierenden Zellen weiterhin kontinuierlich virale Partikel freigesetzt werden.
tausende Virusgenome pro Zelle
Virus infiziert eine nicht- differenzierte Zelle der Basalmembran
Virus und Zelle
replizieren gemeinsam
Vervielfältigung der Virus-DNA in sich nicht teilenden Zellen Virus-beladene Zellen bereit zur Abschilferung
Expression der E-Gene in sich teilenden Zellen Expression der E- und L- Gene in sich differenzier- enden Zellen
Zusammenfügung der Viruspartikel
Tausende Viruskopien pro Zelle
Abbildung 1: Replikation des humanen Papillomvirus (HPV) (nach STANLEY, 2003).
Literaturübersicht 9
2.1.4 Virale Oncoproteine
Das HPV-Genom kodiert mindestens sechs verschiedene frühe und zwei späte Proteine. Die frühen Proteine (E = „early“) in „high-risk“-HPV-Typen werden vor der produktiven Replikation exprimiert, während die späten Proteine (L = „late“) während der Synthese der neuen Virionen entstehen (FEHRMANN u. LAIMINS, 2003).
Letztere, L1 und L2, sind Strukturproteine, die das Viruskapsid bilden.
Die frühen Proteine E6 und E7 sind virale Oncoproteine, die humane Zellen immortalisieren können (MCDOUGALL, 1994). In Zervixtumoren bleiben ihre Gene stets erhalten und transkriptionell aktiv (SCHWARZ et al., 1985).
Im Gegensatz zu „low-risk“ Typen wird das E6-Protein der „high-risk“ Typen im Zellkern akkumuliert (TAO et al., 2003), wo es mit Transkriptionsfaktoren und anderen zellulären Proteinen interagieren kann. Sein transformierendes Potential wird maßgeblich durch Interaktion mit dem Tumorsuppressorprotein p53 bestimmt (WERNESS et al., 1990).
Das E7-Protein besitzt in Kombination mit dem E6-Protein, aber auch alleine, transformierende Eigenschaften in verschiedenen Zellarten (PHELPS et al., 1988, MÜNGER et al., 1989). E7 interagiert dabei mit Mitgliedern der Retinoblastom(Rb)- Tumorsuppressor-Familie.
2.2 Der Zellzyklus
Sowohl für die Replikation der Papillomviren (siehe 2.1.3) als auch für deren transformierende Eigenschaften spielt der Zellzyklus eine entscheidende Rolle. Der Zellzyklus eukariotischer Zellen ist in vier Phasen unterteilt (Abb. 2). Nach der Zellteilung in der Mitosephase (M-Phase) folgt eine Zwischenphase G- oder Gap- Phase (engl.: gap = Lücke), die G1-Phase, eine postmitotische Wachstumsphase. Es schließt sich die Synthesephase (S-Phase) an, in der die Reduplikation der DNA stattfindet. Die folgende zweite gap-Phase, die G2-Phase, ist eine kurze prä- mitotische Vorbereitungsphase. Hören Zellen auf zu proliferieren, nehmen sie am Zellzyklus nicht mehr teil und treten in ein Ruhestadium ein, das als G0-Phase bezeichnet wird (MALUMBRES u. BARBACID, 2001).
Literaturübersicht 10
Um zu gewährleisten, dass die Phasen in der richtigen Reihenfolge genau einmal durchlaufen werden, passiert die Zelle sog. Kontrollpunkte am G1/S-Übergang, in der S-Phase und in der Mitosephase. Diese Kontrollpunkte stellen sicher, dass kritische Vorgänge während einer bestimmten Zellzyklusphase abgeschlossen sind, bevor eine neue Phase eingeleitet wird. So wird verhindert, dass genetisch abnorme Zellen entstehen bzw. sich teilen können (KING u. CIDLOWSKI, 1998).
Das Durchlaufen des Zellzyklus wird im wesentlichen durch zwei Proteinfamilien gesteuert: den cdks (= cyclin-dependent protein kinases) und den Cyclinen. Die cdks erlauben ein Fortschreiten durch die verschiedenen Phasen, indem sie bestimmte Proteine phosphorylieren. Ihre Kinaseaktivität ist abhängig vom Vorhandensein aktivierender Untereinheiten, den Cyclinen. Die Menge der spezifischen Cycline steigt in der Zellzyklusphase an, in der sie benötigt werden, und sinkt ab, wenn sie nicht gebraucht werden (KING u. CIDLOWSKI, 1998, MASSAGUÉ, 2004 ).
G1
S G2
M
cdk2 Cyclin
cdk2 Cyclin
cdk2 Cyclin
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zellzyklusphasen (G1, S, G2 und M) und die Cycline mit den cyclin-abhängigen Kinasen (cdk), die die G1-Phase und ihren Übergang in die S-Phase regulieren.
Literaturübersicht 11
2.2.1 Zellzyklus und Krebs
Um die genetische Stabilität einer Zelle zu garantieren, muss diese in der G1-Phase des Zellzyklus entscheiden, ob durch ihren inneren Zustand und ihre äußere Umgebung die Voraussetzungen für die Verdopplung des Genoms und die Zellteilung bestehen. Sind diese nicht gegeben, so bleibt die Zelle in der G1-Phase, führt Reparaturen durch, und der Zellzyklus kann daraufhin fortgesetzt werden. Die Alternative zur Reparatur ist die Elimination der beschädigten Zelle durch Apoptose (KING u. CIDLOWSKI, 1998).
In Tumorzellen funktionieren diese Kontrollmechanismen nicht, was zu unkontrollierter Zellteilung führt. Da DNA-Schäden nicht mehr repariert werden, entstehen Mutationen, die der Tumorzelle zusätzliche Wachstumsvorteile verschaffen können. Zahlreiche Oncogene kodieren für Proteine, die die Kontroll- mechanismen des Zellzyklus außer Kraft setzen und die Zellen zur Proliferation zwingen (SHERR u. ROBERTS, 2004).
2.2.2 HPV und Zellzyklus
In Zervixkarzinomzellen beeinträchtigen die viralen Oncoproteine E6 und E7 der
„high-risk“-HPV-Typen die zellulären Kontrollmechanismen.
In Zellen wird nach verschiedenen Stresseinflüssen wie DNA-Schädigung das Protein p53 induziert (FRITSCHE et al., 1993, MALTZMAN u. CZYZYK, 1994), das zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase führt. Dadurch werden Reparatur- prozesse in der Zelle ermöglicht. Bei irreversibler DNA-Schädigung induziert p53 Apoptose, um die geschädigte Zelle zu eliminieren (LOWE et al., 1993). E6 bindet an p53 und führt zu dessen Degradation über das Ubiquitin-Proteasom-System (SCHEFFNER et al., 1990). Dies verursacht die Aufhebung des Zellzyklusarrests und erhöht die Wahrscheinlichkeit weiterer genetischer Veränderungen (FEHRMANN u. LAIMINS, 2003). Gleichzeitig bewirkt die Degradation von p53 einen antiapaptotischen Effekt (WERNESS et al., 1990). Darüber hinaus aktivieren E6- Proteine der „high-risk“ HPVs indirekt Telomerase und unterstützen damit die Proliferation der infizierten Zelle (KLINGELHUTZ et al., 1996). Diese Funktionen
Literaturübersicht 12
fördern die Induktion genomischer Instabilität in HPV-infizierten Zellen und damit die Entstehung von Tumoren (DUENSING u. MÜNGER, 2004)
E7 interagiert mit Rb-Proteinen, die eine wichtige Rolle bei der Zellzyklusregulation am G1/S-Übergang spielen. Die Bindung von E7 an den Tumorsuppressor pRb führt zu dessen verstärktem ubiquitin-vermittelten Abbau (BOYER et al., 1996). Dadurch fällt die hemmende Wirkung von pRb auf den Transkriptionsfaktor E2F weg, wodurch Gene induziert werden, die für den Eintritt in die S-Phase benötigt werden (BAGCHI et al., 1990, BANDARA et al., 1991). Außerdem binden und inaktivieren E7-Proteine die Zellzyklusinhibitoren p21 und p27, wodurch die Proliferation infizierter Zellen gefördert wird (ZERFASS-THOME et al., 1996, JONES et al., 1997a). Weiterhin interagiert E7 mit den S-Phase-Genen Cyclin A und Cyclin E (ZERFASS et al., 1995), wodurch ebenfalls die Zellproliferation induziert wird.
2.3 Apoptose
Einen physiologischen Mechanismus zur Elimination viral infizierter Zellen stellt die sogenannte Apoptose, der programmierte Zelltod, dar (IGNEY u. KRAMMER, 2002).
Das Wort „Apoptose“ ist griechischen Ursprungs und bedeutet „das Abfallen der Blätter“. Im Gegensatz zur Nekrose, bei der die Zelle anschwillt, Zellorganellen zerstört werden und der Körper mit einer Immunantwort reagiert, werden bei der Apoptose die Zellen kleiner, die Zellmembranen bilden „Blasen“ („membrane blebbing“) und die Chromatinsubstanz legt sich in kompakten Konglomeraten der Kernmembran innen an („Kondensation“). Schließlich zerfällt der Zellkern in große Granula. Da der Zellinhalt nicht freigesetzt wird und die Phagozytose rasch einsetzt, folgt keine Immunreaktion bzw. Entzündung (MCCARTHY, 2002). Die Vorgänge laufen im Zeitraum von Minuten bis wenigen Stunden ab.
Die Apoptose stellt die Grundlage einer geregelten Embryogenese, Gewebehomöostase und Funktion des Immunsystems dar (VAN OPHOVEN et al., 1999). Einzelne Zellen oder Zellverbände werden gezielt inmitten einer sonst nicht berührten Zellpopulation entfernt, und im Zusammenspiel mit der Proliferation wird
Literaturübersicht 13
das Gleichgewicht im Organismus aufrechterhalten. Außerdem werden überzählige, hinderliche oder potentiell gefährliche Zellen abgetötet (HENGARTNER, 2000).
Man unterscheidet zwei Signalwege der Apoptoseinduktion: Der extrinsische Weg wird über Todesrezeptoren vermittelt (SCHMITZ et al., 2000), der intrinsische Weg durch die Mitochondrien (HENGARTNER, 2000). Beide Wege führen zu einer Aktivierung von Caspasen, hochselektiven Cystein-Proteasen, die sich kaskadenartig gegenseitig aktivieren. Schließlich zerstören Exekutionscaspasen das Zellgerüst und die Kernmatrix und aktivieren Endonukleasen, die die DNA zerlegen (IGNEY u.
KRAMMER, 2002). Der intrinsische Weg der Apoptoseinduktion beginnt durch zell- schädigende Ereignisse wie Hypoxie, direkte DNA-Schädigung oder Oncoproteine;
pro-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie greifen dabei an der mitochondrialen Membran an (GROSS et al., 1999).
2.3.1 Apoptose und Krebs
An der Entstehung verschiedener Krankheiten, u. a. Krebs, sind ebenfalls Apoptose- vorgänge beteiligt. Für ein unbegrenztes Wachstum muss bei der Tumorentstehung die Apoptose unterdrückt werden (HANAHAN u. WEINBERG, 2000).
Die Apoptose spielt nicht nur bei der Tumorentstehung eine große Rolle, sondern die Wiederherstellung von Apoptosemechanismen ist für die chemotherapeutische Elimination von Tumorzellen von großer Bedeutung (REED, 2003). Deshalb könnte ein Abzielen auf die pro- und antiapoptotischen Proteine eine wichtige Richtung in der Krebsbehandlung sein (HU u. KAVANAGH, 2003).
2.3.2 HPV und Apoptoseregulation
Die Unterdrückung der Apoptose fördert maßgeblich die Entwicklung von der Dysplasie bis zur invasiven und metastasierenden Tumorzelle (IGNEY u.
KRAMMER, 2002). Um den Tod der infizierten Zelle während der Karzinogenese zu verhindern, greifen die viralen Oncoproteine E6 und E7 in die Apoptoseregulation ein (JONES et al., 1997b, FINZER et al., 2002a). E6 inaktiviert beispielsweise
Literaturübersicht 14
proapoptotische Moleküle wie p53, Bak und Bax durch Proteolyse (ZUR HAUSEN, 2002).
2.4 Therapie des Zervixkarzinoms
Das Zervixkarzinom stellt weiterhin eine bedrohliche Erkrankung dar (siehe 2.1.2.1 mukosale Typen). Allein in Deutschland erkranken jährlich rund 5800 Frauen am Zervixkarzinom (FISCHER et al., 1997).
2.4.1 Standardtherapie
Die derzeitigen Standardbehandlungen sind die Chirurgie, Bestrahlung und/oder Chemotherapie: Durch die Chirurgie werden die veränderten Gewebe bis zur totalen Hysterektomie entnommen. Lokale Bestrahlung wird erfolgreich bei fortgeschrittenen Zervixkarzinomen eingesetzt, die Prognose wird im wesentlichen durch die Tumor- größe bestimmt (ROSE, 2002). Dabei stellt die Beeinflussung benachbarter Organe (z. B. Fibrose des Darms, Harnblase etc.) eine schwerwiegende Nebenwirkung dar (STEHMANN et al., 2003). Bei der Chemotherapie wird hauptsächlich Cisplatin eingesetzt, das mit einer Ansprechrate zwischen 23 und 50 % das effektivste Mono- präparat ist (SAVARESE u. COGNETTI, 2003). Die Wirksamkeit kann durch Kombination mit Bestrahlung erheblich gesteigert werden (MORRIS et al., 1999) und wird heute als Standardtherapie des fortgeschrittenen Zervixkarzinoms empfohlen (ROSE et al., 1999). Nebenwirkungen der Chemotherapeutika sind eine hohe Toxizität; bei fortgeschrittener Erkrankung steht oft ein palliativer Ansatz im Vordergrund.
2.4.2 Prävention
Die Prävention des Zervixkarzinoms lässt sich in primäre, sekundäre und tertiäre Strategien einteilen. Primäre Strategien zielen auf eine Reduktion der Neuerkrankungen ab und umfassen z. B. die Vermeidung von Risikofaktoren.
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Sekundäre Strategien beinhalten die Früherkennung der asymptomatischen Phase durch den Papanicolaou-Screening-Test, bei dem mit einem Watteträger Zellen von Portiooberfläche und Zervixkanal entnommen und nach Spezialfärbung ausgewertet werden (PAPANICOLAOU, 1928). Je nach Ergebnis reichen zytologische Kontrollen aus, oder es werden kolposkopische Untersuchungen durchgeführt. Zur definitiven Klärung von Epithelatypien kann eine konusförmige Gewebeprobe entnommen (Konisation) und anschließend histologisch untersucht werden. Tertiäre Präventions- strategien konzentrieren sich auf die Früherkennung und Reduktion von wiederkehrenden Karzinomen bei bereits behandelten Patientinnen (ROCK et al., 2000).
2.5 Nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAIDs) in der Krebstherapie und –prävention
Die Ergebnisse der Standardtherapie bei fortgeschrittenem Zervixkarzinom bleiben jedoch vielfach enttäuschend bei oftmals erheblichen Nebenwirkungsbelastungen für die einzelnen Patientinnen (WAGGONER, 2003). Daher ist die weitere Suche nach neuen, nicht-toxischen und wirksameren Behandlungsansätzen dringend geboten.
Von Interesse sind dabei die nichtsteroidalen antiinflammatorischen Substanzen („nonsteroidal anti-inflammatory drugs“, NSAIDs).
Diese sind in Abgrenzung zu den Corticosteroiden aromatische organische Säuren ohne Steroidgrundgerüst. Sie besitzen entzündungshemmende, analgetische und antipyretische Wirkung (GOLBS u. SCHERKL, 1996). Das älteste bekannte NSAID ist das Salicin, ein Bestandteil der Weiderinde, dessen Wirkung seit der Frühzeit bekannt ist. Salicin wird zu Salicylsäure metabolisiert.
Die Hauptindikation der NSAIDs in der Humanmedizin ist die Behandlung von Schmerzen und entzündlichen und degenerativen Gelenkerkrankungen (DUBOIS et al., 1998), während in der Veterinärmedizin die entzündungshemmende Wirkung dieser Stoffe im Vordergrund steht. Weiterhin wird Aspirin auch in der Prophylaxe von (Re-)Infarkten des Herzens eingesetzt (HUR et al., 2005). Darüber hinaus zeigen epidemiologische Studien einen Zusammenhang zwischen der regelmäßigen
Literaturübersicht 16
Einnahme von NSAIDs und einer geringeren Todesrate durch Speiseröhren-, Magen-, Brust-, Lungen-, Prostata-, Harnblasen- und Eierstockkrebs (MORAN, 2002, THUN et al., 2002). Auch in vitro hemmen sie das Wachstum verschiedener Krebs- zelllinien und induzieren Apoptose.
2.5.1 Wirkmechanismus der NSAIDs
NSAIDs vermitteln ihre entzündungshemmende Wirkung durch die Hemmung der enzymatischen Aktivität der Cyclooxygenase (COX) (VANE, 1971).
Cyclooxygenasen katalysieren die Synthese von Prostaglandinen aus Arachidon- säure (Abb. 3). Der erste Schritt der Prostaglandinsynthese ist die Hydrolyse von Membranphospholipiden, um freie Arachidonsäure zu produzieren. Dieser Schritt wird durch Phospholipase A2 katalysiert. Anschließend katalysieren Cyclo- oxygenasen eine Reaktion, bei der molekularer Sauerstoff in Arachidonsäure eingebaut wird und ein instabiles Zwischenprodukt, PGG2, entsteht, das schnell zu PGH2 umgewandelt wird. Spezifische Isomerasen katalysieren die Weiterentwicklung zu Prostaglandinen und Thromboxan A2 (DANNENBERG u. SUBBARAMAIAH, 2003).
Es gibt mindestens zwei Isoformen der Cyclooxygenasen: COX-1 und COX-2.
COX-1 wird in den meisten Geweben konstitutiv exprimiert und scheint für die Produktion von Prostaglandinen verantwortlich zu sein, die normale physiologische Funktionen kontrollieren, wie die Integrität der Magenschleimhaut oder die Durchblutung der Niere (DUBOIS et al., 1998). COX-2 ist in den meisten Geweben nicht nachweisbar. Durch mitogene und entzündliche Stimuli wird sie jedoch induziert, was zur verstärkten Prostaglandinsynthese führt. COX-2 wird z. B. bei Fieber im Gehirn, bei Infektionen in Darmepithelzellen und während Entzündungen induziert. Darüber hinaus ist COX-2 bei der Sensibilisierung von Schmerzrezeptoren beteiligt und erleichtert im Rückenmark die Weiterleitung der Schmerzstimuli.
Literaturübersicht 17
Membranphospholipide
Arachidonsäure
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Spezifische Isomerasen
TXA2 PGE2 PGD2 PGI2 PGF2 Phospholipase A2
Cyclooxygenase
Peroxidase
COX
Membranphospholipide
Arachidonsäure
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Spezifische Isomerasen
TXA2 PGE2 PGD2 PGI2 PGF2 Phospholipase A2
Cyclooxygenase
Peroxidase
COX
Abbildung 3: Arachidonsäuremetabolismus: Arachidonsäure, die durch Phospholipase A2 aus Membranphospholipiden freigesetzt wird, wird durch Cyclooxygenasen in zwei Schritten zu Prostaglandin H2 metabolisiert. Dieses wird durch spezifische Isomerasen in eine Anzahl von Prostaglandine und Thromboxan umgewandelt.
2.5.2 Mögliche Rolle von COX-2 in der Tumorentwicklung
In Kolorektaltumoren ist die COX-2-Konzentration in bis zu 90 % der Fälle erhöht, während in normaler Darmschleimhaut eine niedrige bis nicht nachweisbare COX-2- Expression vorherrscht (EBERHART et al., 1994, SANO et al., 1995). Auch in vielen anderen Krebsarten und Krebsvorstufen ist z. T. COX-2 induziert (SOSLOW et al., 2000, GUPTA u. DUBOIS, 2001, DANNENBERG u. SUBBARAMAIAH, 2003), u. a.
auch im Zervixkarzinom (GAFFNEY et al., 2001, KULKARNI et al., 2001). COX-2 kann durch Wachstumsfaktoren, Zytokine, Oncogene und Tumorpromotoren stimuliert werden (SMITH et al., 2000), und eine vermehrte COX-2-Expression tritt gemeinsam mit Apoptosehemmung (SUN et al., 2002), Angiogenese (TSUJII et al., 1998) und einer verstärkten Metastasierungsfähigkeit (TSUJII et al., 1997) auf.
In verschiedenen Tierexperimenten und pharmakologischen Studien konnte gezeigt werden, dass COX-Hemmer das Wachstum von Tumoren und die Entstehung von Metastasen reduzieren. Allerdings mehren sich in letzter Zeit Hinweise, dass NSAIDs
Literaturübersicht 18
auch COX-unabhängige Wirkungen auslösen. Beispielsweise lässt sich die tumorhemmende Wirkung der NSAIDs nicht allein auf die COX-Hemmung zurück- führen: Einige NSAIDs hemmen die Proliferation und induzieren Apoptose bei Krebszellen, die weder COX-1 noch COX-2 exprimieren (HANIF et al., 1996).
2.5.3 Sulindac
Zu den NSAIDs gehört der unspezifische COX-Inhibitor Sulindac, der auch zur Chemoprävention der familiären adenomatösen Polyposis coli (FAP) erfolgreich eingesetzt wird. Bei dieser autosomal-dominant vererbten Erkrankung entwickeln alle betroffenen Patienten im Laufe ihres Lebens multiple Polypen im gesamten Verdauungstrakt. Sulindac hemmt das Wachstum der Polypen und bewirkt den Rückgang von existierenden Polypen (WADDEL u. LOUGHRY, 1983, LABAYLE et al., 1991).
Sulindac (cis-5-Fluor-2-methyl-1-(p-methylsulfinylbenzyliden)inden-3-acetat) ist ein negativ geladenes Molekül, das sich frei durch Plasmamembranen bewegen kann (WADDELL, 1998).
COOH F
S O O COOH
F
S O COOH
F
S
irreversibel reversibel
Sulindac Sulindac-Sulfon
Sulindac-Sulfid
Abbildung 4: Molekularer Aufbau von Sulindac und seinen Metaboliten.
Literaturübersicht 19
Sulindac stellt eine Weiterentwicklung des NSAID Indomethacin mit dem Ziel einer Verminderung der gastrointestinalen Wirkungen dar. Sulindac kann durch Reduktion in das Sulindac-Sulfid und durch Oxidation in das gegenüber COX-1 wie COX-2 inaktive Sulindac-Sulfon übergehen (Abb. 4). Nach oraler Aufnahme und Absorption im Dünndarm unterliegt Sulindac Oxidation und Reduktion. Dünndarm- und Leber- epithel wandeln einen Teil der verschiedenen Sulindacmetabolite in entsprechende Acyl-Glucuronide um. Sulindac wird auch im Kolon durch bakterielle Enzyme reduziert und absorbiert (SHEN u. WINTER, 1977, STRONG et al., 1985). Nach Acyl-Glucuronidierung sind beide Formen im Blutplasma zu 95 % an Albumin gekoppelt und besitzen so als aktive Formen die Halbwertszeit von Albumin (ca. 20 Tage) (KROEMER u. KLOTZ, 1992). Durch die Kopplung an Albumin wird auch die Aufnahme von Sulindac in entzündliche oder maligne Gewebe erleichtert und gesteigert (RUSSEVA u. ZHIVKOVA, 1999).
Material und Methoden 20
3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien und Reagenzien
Acrylamid/Bisacrylamid Sigma-Aldrich, Taufkirchen Ammoniumpersulfat (APS) Serva, Heidelberg
Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen BenchMark (Proteinmarker) Gibco Life Technologies, Eggenstein Bradford-Reagenz (Biorad Protein Assay) BioRad, München
Lowry
Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DAPI Serva, Heidelberg
DMSO Merck, Darmstadt
DNase I Grade I Promega, Mannheim
EDTA Roche Diagnostics, Mannheim
Ethanol p.a. Merck, Darmstadt
Formaldehydlösung p.a., 37 % Merck, Darmstadt Glycerin p.a., 87 % Merck, Darmstadt
Glycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Isopropanol p.a. Merck, Darmstadt
Macrodex Schiwa, Glandorf
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Methanol p.a. Merck, Darmstadt
Milchpulver Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid p.a. Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Nonidet-P40 Roche Diagnostics, Mannheim
PMSF Gibco Life Technologies, Eggenstein
PBS Gibco Life Technologies, Eggenstein
Proteinstandard Gibco Life Technologies, Eggenstein
Material und Methoden 21
Salzsäure konz. (32 %) p.a. Merck, Darmstadt
SR101 Eastman Kodak, Rochester, USA
TEMED Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tri(hydroxymethyl)aminoethan (Tris) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tris Base Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tween 20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3.1.2 Verbrauchsmaterialien und Hilfsmittel
Einmalspritzen (steril) Becton and Dickinson, Heidelberg Eppendorf tubes (0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml) Eppendorf, Hamburg
Faltenfilter Schleicher & Schuell, Dassel
Frischhaltefolie Igefa, Bremen
Glaspipetten Renner, Darmstadt
Hyperfilms TM ECL Amersham-Pharmacia, Freiburg
Kryoröhrchen Greiner, Nürtingen
Pipettenspitzen Greiner, Nürtingen
Plastikküvetten (1 ml) Greiner, Nürtingen PVDF-Membran (Immobilon P; 0,5 µm) Millipore, Eschborn
Röntgenfilme Amersham-Pharmacia, Freiburg
Sterilfilter Millipore, Eschborn
Whatman-Papier Schleicher & Schuell, Dassel Zellkulturflaschen Greiner, Nürtingen Zellkulturschalen Greiner, Nürtingen
3.1.3 Laborausstattung
Analysewaage (2004 MP) Sartorius, Göttingen Begasungsbrutschrank ( B5061, EC/CO2) Heraeus, Hanau
Blotkammer (semi-dry; Hoefer, SemiPhor) Amersham-Pharmacia, Freiburg
Material und Methoden 22
Elektrophoresekammer, vertikal Amersham-Pharmacia, Freiburg (Hoefer SE600)
Handrührgerät Bosch
Hochspannungsgerät EPS 600 Amersham-Pharmacia, Freiburg Heizblock / Schüttler Eppendorf, Hamburg
Lichtmikroskop CK2 Olympus
Neubauer-Zählkammer Bender & Hobein, Bruchsal pH-Meter Calimatic 765 Knick
Photometer Ultraspec 3000 Amersham-Pharmacia, Freiburg Ultrazentrifuge Centricon T-1065 Kontron, München
Ultraschallgerät Sonifier 250 Branson/Heinemann, Schwäbisch Gmünd
Vortexer Heidolf, Rust
Waage 1216 MP Sartorius, Göttingen
Wasserbad Julabo, Seelbach
Zentrifuge Minifuge Heraeus, Hanau Zentrifuge 2K15 Sigma, Deisenhofen
3.1.4 Reagenzien für die Zellkultur
Dulbecco´s modified Eagle´s Medium Gibco Life Technologies, Eggenstein Dimethylsulfoxid p.a. Merck, Darmstadt
Fetal Calf Serum Gibco Life Technologies, Eggenstein NS-398 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Phosphate Buffered Saline Gibco Life Technologies, Eggenstein Penicillin 10.000 U/ml / Streptomycin Gibco Life Technologies, Eggenstein
10.000 U/ml
SC-560 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sulindac Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sulindac-Sulfid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypanblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Material und Methoden 23
Trypsin / EDTA-Lösung Gibco Life Technologies, Eggenstein
3.1.5 Materialien für die Tierversuche
Ascorbinsäure Fluka, Deisenhofen
D(-)-Fructose extra pure Riedel-deHaën, Seelze Döschen für Formalinkonservierung Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat Fluka, Deisenhofen Na2HPO4 · 2 H2O
Einbettförmchen Cryomold Vogel, Giessen Einbettmedium Tissue Tek Jung, Nussloch Einmalkanülen 0,65 × 30 mm (Nr. 14) Rose, Trier
Einmalskalpelle Feather
Einstreu Animal bedding Granular Altromin, Lage Gelatine aus Schweinehaut Fluka, Deisenhofen Lactalbumin-Hydrolysat Fluka, Deisenhofen Latex OP-Handschuhe Gammex Ansell Medical, München L-Lysin-Monohydrat Alfa Aesar, Karlsruhe Multivitamine für Nager Albrecht, Aulendorf Natriumdihydrogenphosphat Fluka, Deisenhofen NaH2PO4 · 2 H2O
Standardfutter ssniff NM V1244-727 SSNIFF, Soest
Sulindac Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Zucht-/Haltungsfutter Nackt-Ratten/Mäuse Altromin, Lage Standard-Diät 1431 FORTI
3.1.6 Chemikalien und Materialien für die Histologie/Immunohistochemie Adhäsions-Objektträger Histobond® Marienfeld, Lauda-Königshofen Amino-ethyl-carbazol Sigma, Taufkirchen
Citrat Merck, Darmstadt
Material und Methoden 24
Dimethylformamid (DMSO) Roth, Karlsruhe
Eisessig Merck, Darmstadt
Eosin Sigma, Taufkirchen
Essigsäure Riedel de-Haën, Seelze
Eukitt® Einschlussmittel Kindler, Freiburg Fixogum Montagekleber Marabuwerke, Tamm Immu-Mount Eindeckelmedium Shandon, Pittsburgh Meyers Hämalaun AppliChem, Darmstadt
Hämalaunlösung Merck, Darmstadt
Natriumacetat Merck, Darmstadt
Natriumcitrat Fluka, Deisenhofen
Xylol Riedel-deHaën, Seelze
3.1.7 Lösungen
AEC-Färbelösung 4 mg Amino-ethyl-carbazol (AEC) lösen in
500 µl Dimethylformamid;
2,1 ml 0,1 M Essigsäure mit
7,9 ml 0,1 M Natriumacetat mischen,
500 µl davon ersetzen durch das gelöste AEC, filtrieren (Porengröße 0,45 µm), lichtgeschützt (Alufolie) aufbewahren, kurz vor Färbung 5 µl 30 % H2O2 hinzufügen
Blocking-Puffer (Western Blot) TBS-T + 5 % Milch
BSA-Lösung 1 % BSA in PBS
Citratpuffer pH 6,0 18 ml 0,1 M Zitronensäure
82 ml 0,1 M Natriumcitrat
900 ml bidest. Wasser
Material und Methoden 25
DAPI-Stammlösung 10 mg DAPI in
28,5 ml bidest. Wasser
bei 4 – 8 °C im Dunkeln lagern
Einfriermedium 10 % DMSO
30 % FCS 60 % DMEM
sterilfiltrieren durch 0,22 µm-Filter
Lagerung bei –20 °C
Eosin-Färbelösung 1 % Eosin in
70 %igem Ethanol, zusätzlich
1 Tropfen Eisessig pro Küvette
Formalinlösung 3,3 g Na2HPO4 · 2 H2O und 0,8 g NaH2PO4 · 2 H2O
in Wasser lösen, auffüllen auf 450 ml, 50 ml Formalin zufügen
Glycin/HCl-Puffer 0,1 M Glycin pH 2,9
HCl – Ethanol – Lösung 0,5 % HCl 25 % in
Ethanol 70 %
Lämmli-Puffer (10 x) 0,25 M Tris Base 1,9 M Glycin 1 % SDS
Macrodex-Lösung 6 % in physiol. NaCl-Lösung
Material und Methoden 26
PBS 123 mM Natriumchlorid
7,6 mM Di-Natriumhydrogenphosphat-
dihydrat
10 mM Kaliumdihydrogenphosphat
pH 7,2 – 7,8
Phosphat-DAPI-Färbelösung 7,1 g Natriumhydrogenphosphat
0,5 ml DAPI-Stammlösung
ad 100 ml bidest. Wasser
Lagerung bei RT im Dunkeln
RIPA-Puffer 100 mM Tris/HCl pH 8,0
150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 % Nonidet-P40
0,1 % SDS
kurz vor Gebrauch frisch in Isopropanol gelöstes PMSF (10 µg / ml) zufügen (10 µl / ml RIPA)
TBS (1 x) 20 mM Tris/HCl pH 7,5
137 mM NaCl
1 M hydrochloric acid
TBS-T (1 x) 20 mM Tris/HCl pH 7,5
137 mM NaCl
1 M hydrochloric acid
0,01 % Tween
Towbin Puffer (10 x) 0,25 M Tris Base 1,9 M Glycin
Material und Methoden 27
Transferpuffer (Western Blot) 1 x Towbin
10 % Methanol
Tris-Puffer 1 M Tris,
je nach Bedarf mit HCl auf pH 6,8 – 8,8 einstellen
dabei auf RT kühlen,
da sich der pH-Wert verschiebt
Trypanblau-Lösung 0,25 % Trypanblau
Western Ladepuffer (5 x) 10 % SDS
0,02 % Bromphenolblau
12,5 % 2-Mercaptoethanol
0,3 M Tris/HCl pH 6,8
5 mM EDTA pH 8 50 % Glycerol
zur Lösung auf 37°C erhitzen
Zitronensäure/Tween 2,1 g Citrat
0,5 g Tween 20
ad 100 ml bidest. Wasser
bei 4 – 8 °C lagern
3.1.8 Polyacrylamidgele
Sammelgel (4 %) 0,22 M Tris/HCl pH 6,8 0,1 % SDS
4 % Acrylamid/Bisacrylamid
0,5 % Ammoniumpersulfat
0,16 % TEMED
Material und Methoden 28
Trenngel (12 %) 0,22 M Tris/HCl pH 6,8 0,1 % SDS
12 % Acrylamid/Bisacrylamid
0,5 % Ammoniumpersulfat
0,07 % TEMED
3.1.9 Kits
ECL-Western Blotting Detection Reagents Amersham-Pharmacia, Freiburg In vivo Cell Death Detection Kit, POD Roche-Diagnostics, Mannheim Avidin-Biotin-Streptavidin-Kit VectorLaboratories, Burlingame, USA
3.1.10 Antikörper
Antikörper für Western Blot
Erstantikörper: HPV18-E7 (N-19) sc-1590 Ziege polyklonal IgG, Lot J161
Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Verdünnung 1:500
HPV16-E7 NM2
Maus (MICHEL, 2003; der Antikörper wurde freundlicherweise von M. Müller, DKFZ, zur Verfügung gestellt)
Verdünnung 1:4
Anti-actin Code 691001
Maus monoklonal, Lot 7010, Klon 4 ICN Biomedicals, Inc., Aurora
Verdünnung 1:5000
Material und Methoden 29
Zweitantikörper: anti-goat IgG-HRP, sc-2020 HRP-konjugiert, Lot K169
Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg
Verdünnung 1:5000
Anti-mouse IgG-HRP W402B, 16066001
Promega, Mannheim
Verdünnung 1:10 000
Antikörper für die Immunohistochemie Erstantikörper: Ki-67 Antigen human
Kaninchen polyklonal, NCL Ki67p
Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK
Verdünnung 1:700
Zweitantikörper: Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)
Biotin-SP-konjugiert, Code 111-065-045
Lot 48697
Dianova, Hamburg
Verdünnung 1:250
Material und Methoden 30
3.2 Methoden
3.2.1 Zellexperimentelle Methoden
3.2.1.1 Tumorzellen
Für die In-vitro-Versuche wurden die folgenden humanen Zervixkarzinomzelllinien verwendet:
HeLa-Zellen: Sie entstammen epithelialen Zellen eines Adenokarzinoms und enthalten 20 - 50 Kopien von HPV18 DNA (KAHN et al., 1999). SW756-Zellen ent- stammen Biopsiematerial eines Plattenepithelkarzinoms und sind HPV18-positiv mit ca. 10 - 50 DNA-Kopien (SCHNEIDER-GÄDICKE u. SCHWARZ, 1986). Die CaSki- Zelllinie wurde aus Zellen einer Zervixkarzinommetastase im Dünndarm- mesenterium etabliert (PATILLO et al., 1977). CaSki-Zellen enthalten 60 - 600 Kopien an HPV16-DNA pro Zelle (MEISSNER, 1999). SiHa-Zellen stammen aus Fragmenten einer primären operativ entnommenen Gewebeprobe eines Platten- epithelkarzinoms der Zervix. Die Zellen besitzen 1 – 2 Kopien des HPV16-Genoms (KAHN et al., 1999).
3.2.1.2 Zellkulturtechniken
3.2.1.2.1 Stammhaltung
Die verwendeten Zellen werden im Brutschrank bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 – Gehalt kultiviert. Sie wachsen als Monolayer-Kulturen. Dem verwendeten Kulturmedium DMEM wird 10 % FCS, 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin zugesetzt. Zum Passagieren der Zellen wird das Medium mit einer Glaspipette abgezogen und verworfen. Der Zellrasen wird mit ca. 10 ml PBS gewaschen, anschließend werden 1 – 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben und auf dem Zellrasen verteilt, um die Zellen vom Flaschenboden zu lösen. Nach 3 – 5 minütiger Inkubation im Brutschrank wird die Trypsinierung durch Zugabe von FCS-haltigem Medium gestoppt. Je nach Dichte und Wachstumsgeschwindigkeit werden die Zellen 1 : 10 bis 1 : 40 gesplittet. Die verbleibenden Zellen werden in ca. 25 ml frisches
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Kulturmedium aufgenommen, so dass sie bei erneuter Aussaat von ca. 3 mm Flüssigkeit bedeckt sind, und im Brutschrank inkubiert.
3.2.1.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zum Einfrieren werden die Zellen durch Trypsinierung vom Boden des Kulturgefäßes abgelöst und in FCS-haltigem Zellkulturmedium resuspendiert. Durch Zentrifugation bei Raumtemperatur (800 rpm für 5 min) wird das Kulturmedium von den Zellen getrennt. Das Zellpellet wird in Einfriermedium gelöst und je 1 ml in ein 2 ml- Kryoröhrchen überführt. Die Röhrchen werden in reichlich Zellstoff verpackt und auf –70 °C heruntergekühlt. Nach mindestens einem Tag werden die tiefgefrorenen Zellen in den Flüssigstickstofftank überführt.
Eingefrorene Zellen werden in der Hand langsam aufgetaut, in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und 5 min bei 800 rpm bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, um das im Einfriermedium enthaltene DMSO zu entfernen. Die Zellen werden in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und in eine Zellkulturflasche überführt. Am folgenden Tag erfolgt ein Mediumwechsel. Vor der ersten Versuchsdurchführung werden die Zellen mindestens zweimal passagiert.
3.2.1.2.3 Aussaat der Zellen
Zur Aussaat der Zellen für Versuche werden subkonfluente Zellen mit PBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA-Lösung vom Flaschenboden gelöst und in FCS- haltigem Medium resuspendiert. Für die Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen wird eine kleine Menge der Zellsuspension 1 : 2 mit Trypanblau-Lösung verdünnt, die nur tote Zellen anfärbt. Die Zahl der vitalen Zellen pro ml erfolgt mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer unter Berücksichtigung der Verdünnung mit der Färbelösung. Je nach Versuchsziel werden die Zellen in Kulturmedium verdünnt und in unterschiedlicher Zahl und unterschiedlich großen Zellkulturschalen ausgesät.
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3.2.1.2.4 Behandlung der Zellen
Am Tag nach der Aussaat der Zellen wird das Kulturmedium aus den Schalen entfernt und durch frisches Medium, das die gelösten Behandlungssubstanzen enthält, ersetzt.
3.2.1.3 Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie (FCM-Analyse)
Die Durchflusszytometrie („flow cytometry analysis“) wird u. a. dazu verwendet, um die Zellzyklusverteilung einer Zellpopulation oder den Anteil apoptotischer Zellen zu bestimmen. Dafür wird die Menge an DNA mittels LASER gemessen. Durch die Quantifizierung der DNA kann die Zelle aufgrund ihres jeweiligen DNA-Gehalts von 2n bis 4n in die verschiedenen Phasen (G1, S, G2/M) eingeordnet werden.
Während der Apoptose entstehen in der Zelle durch Doppelstrangbrüche und Fragmentation der DNA Oligonucleotide. Während der Zellfixierung, bei der die Membranen porös werden, können die niedermolekularen DNA-Fragmente die Zelle verlassen und so deren DNA-Gehalt verringern. Diese Zellen erscheinen auf dem Diagramm als hypodiploid oder „sub-G1-peak“. Die Durchflusszytometrie wurde in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Zytometrie durchgeführt.
3.2.1.3.1 Zellernte für die FCM-Analyse
Zunächst wird das Medium abgenommen und in ein 15 ml Falcon Tube gegeben, damit apoptotische Zellen im Überstand aufbewahrt werden. Anschließend werden die Zellen mit PBS gewaschen. Das PBS wird nicht verworfen, sondern ebenfalls im Falcon Tube aufgefangen, da sich beim Waschen Zellen vom Zellkulturschalenboden lösen. Danach werden die Zellen trypsiniert, in ca. 10 ml Medium aufgenommen und in das Falcon Tube überführt, in dem sich bereits das ursprüngliche Medium und das PBS mit den abgelösten Zellen befinden. Bei 1500 rpm und 4 °C werden die Zellen 5 min lang abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wird dabei dreimal in 5 ml PBS gewaschen. Anschließend wird das Pellet in 1 ml PBS
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resuspendiert und in 10 ml 70 %igem Ethanol gelöst. Bis zur FCM-Analyse werden die Proben im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt.
3.2.1.3.2 Durchflusszytometrie
Nach Ethanolfixierung und Zentrifugation werden die Zellen mit einer Färbelösung resuspendiert, die den Fluoreszenzfarbstoff DAPI (2,4-Diamidin-2-phenylindol- dihydrochlorid) zur Färbung der DNA und Sulforhodamin 101 (SR101) zur Proteingegenfärbung enthält. Die gefärbten Zellen werden in einem feinen Flüssig- keitsstrom durch eine Kapillare gesaugt. Ein UV-LASER-Strahl regt die blaue und rote Fluoreszenz von DAPI bzw. SR101 an, die mit optischen Filtern aufgetrennt und von separaten Detektoren in elektrische Spannungssignale umgewandelt werden.
Die Durchflusszytometriedaten werden mittels Computer zur Zellzyklusanalyse und Quantifizierung der Apoptose weiterverarbeitet (DEAN u. JETT, 1974, STÖHR et al., 1976, STÖHR et al., 1978).
3.2.1.3.3 Aufbereitung von gefrorenem, solidem Gewebe für die Durchflusszytometrie
Den tiefgefrorenen Tumoren werden je zwei ca. stecknadelkopfgroße Proben entnommen. Das eingefrorene Gewebestück wird bei Raumtemperatur aufgetaut und in 0,5 ml Macrodex-Lösung mit einer Schere zu einem homogenen Brei zerkleinert, der anschließend in 3,5 ml Zitronensäure/Tween-Lösung aufgenommen wird. Nach vorsichtigem Schütteln (20 min bei RT) und Filtration (Maschenweite 60 µm) wird die Zellsuspension zentrifugiert (10 min bei 100 × g) und das Sediment in 1 ml Phosphat- DAPI-Färbelösung überführt und die Messung vollzogen (siehe 3.2.1.3.2) (OTTO, 1994, EHEMANN et al., 1999, leicht modifiziert).
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3.2.1.4 Analyse von Proteinen
3.2.1.4.1 Isolierung von Gesamtzellextrakten für Western Blot Analyse
Die Zellkulturschalen mit adhärent wachsenden Zellen werden auf Eis gestellt. Nach Abnahme des Mediums werden die Zellen zweimal vorsichtig mit ca. 10 ml PBS gewaschen und mit RIPA-Puffer inkubiert (500 µl / 10 cm Schale). Nach fünf- minütiger Inkubation wird das Lysat abgeschabt, in 15 ml Falcon-Tubes überführt und fortan auf Eis gelagert. Die Lysate werden ultraschallbehandelt (Duty-cycle 50 %, level 5), um die Membranen zu zerstören und die DNA zu scheren. Nachdem die Suspension 30 min auf Eis inkubiert hat, wird sie zentrifugiert (14.000 × g, 5 min, 4 °C), um die Proteine von den Zelltrümmern zu trennen. Der Überstand mit den Proteinen wird abgenommen und in 1,5 ml Eppendorf Tubes bei –70 °C gelagert.
3.2.1.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen (BRADFORD, 1976)
Bei dieser Methode wird die Farbänderung ausgenutzt, die entsteht, wenn der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G250 an Proteine bindet. Dabei kommt es zu einer Verschiebung der Absorption zu 595 nm (blau), bei der die Protein- konzentration der zu analysierenden Lösung bestimmt und mit der von Standard- Proteinlösungen verglichen wird. Als Proteinstandard wird eine Rinderserum- Albumin(BSA)-Lösung verwendet, mit dem eine Eichgerade erstellt wird, deren Absorptionswerte den Konzentrationen von 1 – 10 µg / µl entsprechen. Zur Erstellung der Eichgerade und Vermessung der Proben werden die gewünschten Mengen der BSA-Lösung bzw. 1 – 4 µl der Proben mit bidest. Wasser auf 800 µl aufgefüllt und 200 µl Bradford-Reagenz dazugegeben. Nach mindestens 2 min Stehenlassen bei Raumtemperatur werden die Absorptionswerte mittels Photometer gemessen.
3.2.1.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (LÄMMLI, 1970) Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dient der Auftrennung und Analyse von Proteinen. Unter denaturierenden Bedingungen lagern sich SDS- Moleküle an die Proteine proportional zu deren Länge und damit deren Gewicht an.
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Dadurch werden so viele negative Ladungen gebunden, dass die Ladungen der Aminosäuren des Proteins selbst keine Rolle spielen und zur Anode wandern.
Die Proteinextrakte werden in Westernladepuffer aufgenommen und durch Kochen denaturiert. Der Puffer enthält SDS und β-Mercaptoethanol, die die Neubildung von Sekundärstrukturen verhindern.
Das SDS-Polyacrylamid-Gel besteht aus einem Sammel- und einem Trenngel. Das Sammelgel hat große Poren und einen niedrigen pH-Wert. Die Proteine passieren es schneller und sammeln sich unabhängig vom Ladungsvolumen an der Grenze zum Trenngel. Im Trenngel, das kleinere Poren und einen höheren pH-Wert hat, werden die Proteine nach der Größe aufgetrennt. Durch die Verwendung von Protein- standards kann die Größe der analysierten Proteine bestimmt werden.
Zuerst wird das Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet, um einen glatten Gelrand zu gewährleisten und die Polymerisation unter Sauerstoffabschluß zu beschleunigen. Nach einer Stunde ist das Gel polymerisiert, der Alkohol wird abgegossen, das Sammelgel auf das Trenngel gegossen und der Kamm luftblasen- frei im Sammelgel fixiert. Nach der Polymerisation wird der Kamm entfernt, und das Gel kann mit den Proben (50 µg Protein pro Spur) beladen werden. Die elektro- phoretische Auftrennung der Proteine erfolgt bei Raumtemperatur in 1 × Lämmli- Puffer innerhalb 3 – 5 Stunden bei 25 – 50 mA.
3.2.1.4.4 Western Blot-Technik
Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine werden durch den Transfer auf eine Membran immobilisiert. Dabei bleibt das Trennmuster und die Immunreaktivität der Proteine erhalten.
Der Transfer erfolgt durch eine elektrische Spannung, wobei die SDS-beladenen Proteine wieder zur Anode wandern. Danach wird die Membran mit einem gegen ein bestimmtes Protein gerichteten Antikörper inkubiert. An diesen bindet dann ein Zweitantikörper, der gegen den Erstantikörper gerichtet ist und mit Meerrettich- peroxidase konjugiert ist. Dieses Enzym katalysiert unter alkalischen Bedingungen mit Wasserstoffperoxid die Oxidation von Luminol zu einem Dioxetan, das instabil ist.
Bei dessen Zerfall entsteht Licht, das mittels Autoradiographie nachgewiesen wird.