Tierärztliche Hochschule Hannover
Funktionelle Charakterisierung
calciumregulatorischer Mechanismen bei Eberspermien mittels Durchflusszytometrie
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Annett Noack
WPST Guben, jetzt Guben
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorik
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski
2. Gutachter/ in: PD Dr. med. vet. Sabine Leonhard-Marek
Tag der mündlichen Prüfung: 06. 05. 2014
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung.……….……….. …..1
2 Literaturübersicht……….………….. …..2
2.1 Die Bedeutung von Calcium für Spermien..……….…... …..2
2.1.1 Kapazitation………..……… …..2
2.1.2 Hyperaktivität……….…………...…..4
2.1.3 Chemotaxis………...…..5
2.1.4 Akrosomreaktion……….. …..7
2.1.5 Motilitätsaktivierung bei Fischspermien………..8
2.2 Calciumspeicher bei Spermien……….…………. …..9
2.2.1 Akrosom………... …..9
2.2.2 Redundant Nuclear Envelope (RNE)………10
2.2.3 Mitochondrien………... …………11
2.3 Regulation des intrazellulären Calciumgehaltes bei Spermien………….... …12
2.3.1 Cation channel of sperm (CatSper)……….. …12
2.3.2 Spannungsgesteuerte Calciumkanäle.…….………....…...…13
2.3.3 Nucleotidgesteuerte Calciumkanäle……….….14
2.3.4 Progesterongesteuerte Calciumkanäle……….14
2.3.5 Plasmamembran-Calcium-ATPasen (PMCAs)………16
2.3.6 Secretory Pathway Calcium-ATPasen (SPCAs)……….…16
2.3.7 IP3-rezeptorgesteuerte Calciumkanäle………...………..17
2.3.8 Ryanodinrezeptorgesteuerte Calciumkanäle………...…18
2.3.9 Sarco-/ endoplasmatische Reticulum Calcium-ATPasen (SERCAs)……….……….19
3 Material und Methode……….…..20
3.1 Versuchsübersicht………... …20
3.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien………..…21
3.3 Fluoreszenzfarbstoffe……….. ………21
3.4 Inhibitoren………..………23
3.5 HBS-Inkubationsmedien………. …………23
3.6 Tiere und Samengewinnung………...24
3.7 Standardspermatologie………... …………25
3.8 Samenverdünnung……….. …26
3.9 Beladen der Spermien mit Fluo-4 AM und Dichtegradientenzentrifugation…26 3.10 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)………..28
3.11 Durchflusszytometer……… …30
3.12 Erhebung des Membranstatus……….. …31
3.12.1 Grundeinstellungen………..…31
3.12.2 Durchführung der Messungen………... …………32
3.12.3 Auswertung………... …………33
3.13 Time-Gate-Messungen………... …………34
3.13.1 Grundeinstellungen………..…………34
3.13.2 Durchführung der Messungen………... …………35
3.13.3 Auswertung………... …………36
3.14 Versuche……… …………39
3.14.1 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thapsigargin……….…………39
3.14.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mittels des angewandten Versuchsaufbaus………..…………40
3.14.3 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thimerosal……… …41
3.14.4 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin auf Eberspermien und kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen……….…43
3.14.5 Einfluss von 100 µM Thimerosal auf Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen……….…43
3.14.6 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin und 100 µM Thimerosal auf den intrazellulären Calciumgehalt und die Akrosomintegrität von Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen……….…44
3.15 Statistische Auswertung………..…46
4 Ergebnisse……….. …47
4.1 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thapsigargin………..…………47 4.1.1 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thapsigargin auf den
prozentualen Anteil plasmamembrandefekter Spermien………...…47 4.1.2 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thapsigargin auf den
intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien...50 4.1.3 Entstehung zweier Subpopulationen plasmamembranintakter
Spermien mit unterschiedlich hohem intrazellulärem
Calciumgehalt………...…………53 4.1.4 Wahl der geeigneten Wirkkonzentration Thapsigargin………….. …56 4.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mittels des angewandten
Versuchsaufbaus………..…………57 4.3 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von
Thimerosal……….…………58 4.3.1 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thimerosal auf den
prozentualen Anteil plasmamembrandefekter Spermien...…………59 4.3.2 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thimerosal auf den intra-
zellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien...59 4.3.3 Wahl der geeigneten Wirkkonzentration Thimerosal……..…………62 4.4 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin auf Eberspermien unter kapazitierenden
und nicht kapazitierenden Bedingungen………..63 4.4.1 Einfluss unterschiedlicher Inkubationszeiten vor Zugabe von
1,25 µM Thapsigargin auf den prozentualen Anteil
plasmamembrandefekter Spermien……….…….…63 4.4.2 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin nach unterschiedlichen
Inkubationszeiten auf den intrazellulären Calciumgehalt
plasmamembranintakter Spermien………...…66 4.4.3 Entstehung zweier Subpopulationen plasmamembranintakter
Spermien mit unterschiedlich hohem intrazellulärem
Calciumgehalt………...…71 4.4.4 Wahl der geeigneten Inkubationszeiträume……….…………74
4.5 Einfluss von 100 µM Thimerosal auf Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen……….. ………74 4.5.1 Einfluss unterschiedlicher Inkubationszeiten vor Zugabe von 100 µM
Thimerosal auf den prozentualen Anteil plasmamembrandefekter Spermien………... …………74 4.5.2 Einfluss von 100 µM Thimerosal nach unterschiedlichen
Inkubationszeiten auf den intrazellulären Calciumgehalt
plasmamembranintakter Spermien………... …………77 4.5.3 Wahl der geeigneten Inkubationszeiträume……….…………80 4.6 Wirkung von 1,25 µM Thapsigargin und 100 µM Thimerosal auf den intra-
zellulären Calciumgehalt und die Akrosomintegrität von Eberspermien….…82 4.6.1 Einfluss kapazitierender und nicht kapazitierender
Inkubationsbedingungen auf den prozentualen Anteil
plasmamembrandefekter Spermien………..…………82 4.6.2 Einfluss kapazitierender und nicht kapazitierender
Inkubationsbedingungen auf den intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien………..……….…85 4.6.3 Quotient F/ F0………... …………89 4.6.4 Einfluss kapazitierender und nicht kapazitierender Inkubations-
bedingungen auf die Entstehung zweier Subpopulationen plasmamembranintakter Spermien mit unterschiedlich hohem
intrazellulärem Calciumgehalt………93 4.6.5 Einfluss kapazitierender und nicht kapazitierender Inkubations-
bedingungen auf den prozentualen Anteil akrosomreagierter
Spermien………95 5 Diskussion………...………..101
5.1 Eignung der Durchflusszytometrie zur Erfassung des intrazellulären
Calciumgehaltes von Eberspermien………101 5.2 Einfluss der Inkubationsmedien auf den intrazellulären Calciumgehalt von
Eberspermien………... ..103 5.3 Dosis-Wirkungskurven der Modulatoren……….. ………..105
5.4 Einfluss der Modulatoren auf den intrazellulären Calciumgehalt und die
Akrosomintegrität von Eberspermien……… ………..107
5.5 Schlussfolgerung………....112
6 Zusammenfassung……… ..113
7 Summary……….……..…115
8 Literaturverzeichnis………..117
9 Anhang……….………..128
9.1 Graphiken und Tabellen………..…... ………..128
9.2 Chemikalien………...…...…..138
9.3 Rezepte………...….………..139
9.4 Messpositionen für die CASA-Messungen………...…….142
9.5 Geräte und Verbrauchsmaterialien………..144
10 Abbildungsverzeichnis………...……….………..147
11 Tabellenverzeichnis………153
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung AC Adenylatcyclase
ALH gemittelte maximale seitliche Kopfauslenkung von der mittleren Bahn (amplitude of lateral head-displacement)
a. u. willkürlich gewählte Einheiten (arbitrary units)
BCF Frequenz des Kreuzens des gewundenen Bewegungspfades mit der gemittelten Bewegungsbahn (beat cross frequency)
BSA bovines Serumalbumin BTS Beltsville Thawing Solution bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius ca. circa
Ca2+ Calciumionen CaCl2 Calciumchlorid
cAMP zyklisches (cyclic) Adenosin-3',5'-monophosphat CASA computerassistierte Spermienanalyse
CatSper Cation channel of sperm
cGMP zyklisches (cyclic) Guanosin-3',5'-monophosphat CO2 Kohlenstoffdioxid
DAP Länge der gemittelten Bahn (distance average path) DCL Länge der gewundenen Bahn (distance curvilinear) d. h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure (Deoxyribonucleic acid) DSL Länge der direkten Strecke (distance straight-line) EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat ER endoplasmatisches Reticulum
et al. et alii
FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL 1 & 3 Filter Nummer 1 und 3
FSC Vorwärtsstreulicht (forward scatter)
g Erdbeschleunigung (gravitational acceleration)
HBS Hepes-gepufferte Salzlösung (hepes buffered saline) HVA high voltage activated
Hz Hertz
i.d.R. in der Regel
IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat KB künstliche Besamung
l Liter
La3+ Lanthanionen LIN linearity
LVA low voltage activated mg Milligramm
min Minute ml Milliliter
mM Millimol
μg Mikrogramm μl Mikroliter μm Mikrometer
µM Mikromol
M Mol
Mrd. Milliarde/ Milliarden MW Mittelwert
n Probandenzahl
PI Propidiumjodid (propidium iodide) PKA Proteinkinase A
PLC Phospholipase C
PMCA Plasmamembranständige Calcium-ATPase
PNA peanut agglutin, Lektin der Erdnuss (arachis hypogea) RNE redundant nuclear envelope
s Sekunde
sAC lösliche Adenylatzyklase (soluble adenylyl cyclase) SD Standardabweichung (standard deviation)
SERCA sarco-/ endoplasmatische Reticulum Calcium-ATPase SOC store operated calcium entry
SPCA secretory pathway calcium-ATPase SR sarcoplasmatisches Reticulum SSC Seitwärtstreulicht (side scatter) STR straightness
Tab. Tabelle Th Thapsigargin Thim Thimerosal
TRP transient receptor potencial
TRPV1 Vanilliodrezeptor Typ 1 (transient receptor potential vanilloid type 1)
u. und
u. a. unter anderem
VAP Geschwindigkeit auf der gemittelten Bahn (velocity average path) VCL Geschwindigkeit auf der gewundenen Bahn (velocity curvilinear) VSL Geschwindigkeit auf der direkten Strecke (velocity straight-line) WOB wobble
z. B. zum Beispiel
ZDS Zentralverband der Deutschen Schweineproduktion ZP Zona Pellucida
ZP3 Zona Pellucida-Glykoprotein 3 z. T. zum Teil
1
1 Einleitung
In der Schweinezucht dominiert die künstliche Besamung (KB). Da Eberspermien besonders empfindlich auf Abkühlung reagieren, erfolgt die Konservierung bei 15 bis 18°C in flüssigen Verdünnermedien. Dies betrifft weltweit ca. 99 % aller KB-Portionen (JOHNSON et al. 2000). Die Lagerungsfähigkeit des so präparierten Spermas ist auf wenige Tage begrenzt. Ausschlaggebend für die Stabilität von Eberspermien ist die funktionelle Integrität der Membranen zur Aufrechterhaltung der Ionenbalance zwischen intra- und extrazellulärem Raum. Da Calciumionen als second messenger fungieren, ist der intrazelluläre Calciumgehalt von Säugetierspermien streng reguliert (BAILEY u. STOREY 1994). Über die Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes werden die fertilitätsrelevanten Vorgänge Kapazitation, Hyperaktivität und Akrosom- reaktion initiiert und gesteuert (VISCONTI 1998 et al., BERNABO 2010b et al., DARZON et al. 2011). Bei Eberspermien steigt die Permeabilität der Plasma- membran für Calciumionen während der Lagerung und der Abkühlung (WHITE et al.
1993). Daher werden zur Flüssigkonservierung Calciumchelatoren eingesetzt. Auch bei kryokonservierten Eberspermien ist vermutlich eine Calciumfehlregulierung ursächlich für die verminderte Qualität. Es kommt zu so genannten „capacitation like changes“, welche zur schnelleren Destabilisierung sowie verfrühten Akrosomre- aktionen nach dem Auftauen führen (GREEN u. WATSON 2001). Bei Eberspermien sind die calciumregulatorischen Strukturen noch weitgehend unbekannt. Bisher wurden in Hals und Mittelstück Inositol-1, 4, 5,-triphosphat (IP3)-Rezeptoren nach- gewiesen (GUGSSA et. al. 2010). Diese werden mit der Freisetzung von Calcium- ionen aus intrazellulären Speichern assoziiert (WALENSKY u. SNYDER 1995).
Ziel der vorliegenden Studie war es, auf funktioneller Ebene Erkenntnisse über die Beteiligung von IP3- und ryanodinrezeptorgesteuerten Calciumkanälen sowie der sarco-/ endoplasmatischen Retikulum Calcium-ATPase (SERCA) an der Regulation der Calciumhomöostase von Eberspermatozoen zu erhalten. Diese Strukturen wurden in durchflusszytometrischen Experimenten über Modulatoren angesprochen.
Unter variierenden Inkubationsbedingungen wurden insbesondere die Wirkungen auf den intrazellulären Calciumgehalt und die Akrosomintegrität betrachtet.
2
2 Literaturübersicht
2.1 Die Bedeutung von Calcium für Spermien
Calciumionen stellen die zentralen Signalüberträger bei der funktionellen Reifung von Säugetierspermien dar. Die befruchtungsrelevanten Prozesse Kapazitation, Hyperaktivität und Akrosomreaktion sind unmittelbar calciumabhängig (VISCONTI et al. 1998, BERNABO et al. 2010b, DARZON et al. 2011). Daher ist der intrazelluläre Calciumgehalt von Säugetierspermien normalerweise streng reguliert und wird über eine Vielzahl von Mechanismen kontrolliert (BAILEY u. STOREY 1994, DARZON et al. 2011). Regulationsvorgänge innerhalb der Samenzellen werden über posttranslationale Signalkaskaden gesteuert, wobei Calciumionen als second messenger fungieren (PUBLICOVER et al. 2007, COSTELLO et al. 2009, DARZON et al. 2011). Der Anstieg des zytosolischen Calciumgehaltes erfolgt durch Einstrom extrazellulären Calciums über plasmamembranständige Calciumkanäle oder durch Freisetzung aus intrazellulären Calciumspeichern (BREITBART 2002, NAVARRO et al. 2008, COSTELLO et al. 2009).
2.1.1 Kapazitation
Säugetierspermien sind unmittelbar nach dem Verlassen des männlichen Genitaltraktes weder in vivo noch in vitro fähig, eine Eizelle zu befruchten. Erst eine Reihe komplexer, physiologischer Reifungsprozesse, welche insgesamt als
„Kapazitation“ bezeichnet werden, befähigen die Samenzellen zur Interaktion mit den Eizellen. In vivo laufen diese Signalkaskaden im weiblichen Genitaltrakt (vor allem dem Ovidukt) und in Interaktion mit diesem ab. Um Spermien von Säugetieren in vitro zu kapazitieren, stehen speziesspezifische Medien zur Verfügung, welche neben energieliefernden Substraten auch Calcium, Bicarbonat und Serumalbumin enthalten (VISCONTI et al. 1998).
Ein vollständiges Verständnis der Kapazitation bei Säugetierspermien konnte bisher nicht erreicht werden. Dennoch werden in der Literatur speziesübergreifende Gemeinsamkeiten beschrieben:
3
Unter dem Einfluss von extrazellulärem Bicarbonat verändert sich die Zusammensetzung der Plasmamembran, woraus eine erhöhte Fluidität resultiert. Bei Eberspermien treten diese Veränderungen in vitro innerhalb weniger Minuten auf (GADELLA und VAN GESTEL 2004). So genannte „lipid rafts“, cholesterinreiche
Mikrodomänen in der Plasmamembran, werden neu formiert (VAN GESTEL et al. 2005), woraus wiederum eine gesteigerte Permeabilität für Bicarbonat
resultiert. Die Alkalinisierung des Zytosols durch einströmendes Bicarbonat führt zur Öffnung plasmamembranständiger Calciumkanäle und infolgedessen zur Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes. HARRISON et al. (1993) verwendeten den calciumbindenden Fluoreszenzfarbstoff Fluo-3 AM für durchflusszytometrische Untersuchungen über die Calciumregulation bei Eberspermien. Die Autoren detektierten vergleichbare Fluoreszenzanstiege bei mit Bicarbonat oder dem Calciumionophor A23187 versetzten Spermien. Nach Zugabe des Calciumchelators Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N′, N′-tetraacetat (EGTA) in das Inkubationsmedium verringerte sich die intrazelluläre Calciumkonzentration wieder.
Anhand der Reversibilität des intrazellulären Calciumanstieges wurde von der Intaktheit der verwendeten Spermien ausgegangen.
Die erhöhten intrazellulären Konzentrationen an Calcium und Bicarbonat aktivieren eine lösliche Adenylatcyclase (sAC). Dadurch wird vermehrt zyklisches Adenosin- 3′,5′-monophosphat (cAMP) synthetisiert. Unter dem Einfluss von cAMP wird die Proteinkinase A (PKA) zur Tyrosinphosphorylierung von zellulären Proteinen stimuliert (BREITBART 2002, DARZON et al. 2006). In Untersuchungen von HARRISON und MILLER (2000) stieg der cAMP-Gehalt in Eberspermien bereits 60 s nach Aktivierung der sAC durch Bicarbonat an. Auch VISCONTI et al. (1995) beschrieben an murinen Spermien die Abhängigkeit der sAC-Aktivierung von Calcium und Bicarbonat im extrazellulären Medium. Durch Zugabe von zellpermeablem, biologisch aktivem cAMP konnte allerdings auch in nicht kapazitierenden Medien (ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat) eine Tyrosinphosphorylierung initiiert werden. Bei Eberspermien gilt Bicarbonat als essentieller, physiologischer Effektor der Kapazitation in vitro und in vivo (GADELLA u. VAN GESTEL 2004, PETRUNKINA et al. 2005, RODRIGUEZ-MARTINEZ et al.
4 2005).
Im weiteren Verlauf der Kapazitation sammelt sich Cholesterol im apikalen Bereich der Plasmamembran und wird unter dem Einfluss von extrazellulärem Serumalbumin entfernt. GADELLA und VAN GESTEL (2004) beschrieben für Eberspermien, dass dieser Effekt, verglichen mit anderen Umverteilungsprozessen innerhalb der Plasmamembran, relativ spät nach Beginn der Inkubation unter kapazitierenden Bedingungen einsetzt (> 90 min).
Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern im Rahmen der Kapazitation wird in der Literatur vor allem in Zusammenhang mit Hyperaktivität und Akrosomreaktion postuliert (HO u. SUAREZ 2001, ROSSATO et al. 2001, BREITBART 2002, PUBLICOVER et al. 2007).
2.1.2 Hyperaktivität
Calcium ist der ausschlaggebende second messenger für die Initiierung der Hyperaktivität bei Säugetierspermien (SUAREZ 2008, DARZON et al. 2011). Die Hyperaktivität oder hyperaktivierte Motilität tritt als spezialisiertes Bewegungsmuster in Zusammenhang mit der Befruchtung im Ovidukt auf. Dabei vergrößert sich die Amplitude des Flagellenschlages und die Bewegungen werden unregelmäßig und asymmetrisch. Dies befähigt Spermien, die muköse Umgebung des Ovidukts zu passieren sowie die Cumuluszellen und die Zona Pellucida der Eizelle zu durchdringen (SUAREZ et al. 1992 (Eberspermien), HO u. SUAREZ 2001 (Rinderspermien), REN et al. 2001 (Mäusespermien), SCHMIDT u. KAMP 2004 (Eberspermien)). YANAGIMACHI (1982) belegte an Hamsterspermien die Abhängigkeit der Hyperaktivität von extrazellulärem Calcium. SUAREZ (2008) beschrieb, dass für die Initiierung und Aufrechterhaltung der Hyperaktivität von humanen und Säugetierspermien sowohl extra- als auch intrazelluläres Calcium erforderlich ist.
In der Vergangenheit wurde die hyperaktivierte Motilität in der Literatur als ein Teil der Kapazitationskaskade bzw. der Akrosomreaktion betrachtet (YANAGIMACHI 1994).
Untersuchungen von BOATMAN und ROBBINS (1991) erbrachten jedoch bereits Hinweise auf eine eigenständige Signalkaskade zur Induktion der Hyperaktivität. Die
5
Autoren konnten bei Hamsterspermien Hyperaktivität und Akrosomreaktion durch Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen Bicarbonat unabhängig voneinander auslösen, wobei die Induktion der Hyperaktivität mehr Bicarbonat erforderte. Bei der Initiierung der Hyperaktivität steigt die intrazelluläre Calciumkonzentration insbesondere im Bereich des Spermienschwanzes, wobei Calcium direkt am Axonem der Flagelle wirksam wird (LINDEMANN et al. 1991 (Rattenspermien), SUAREZ et al. 1993 (Hamsterspermien), SUAREZ u. DAI 1995 (Hamsterspermien)). Auch HO und SUAREZ (2003) postulierten, dass Hyperaktivität und Kapazitation bei bovinen Spermien unterschiedlichen Signalkaskaden folgen. MARQUEZ und SUAREZ (2004) bestätigten die Abhängigkeit der Hyperaktivität von extrazellulärem Calcium an mit Procain hyperaktivierten Rinderspermien. Da bei den hyperaktivierten Spermien keine Tyrosinphosphorylierung (s. Kapitel 2.1.1) stattgefunden hatte, vermuteten die Autoren unterschiedliche Calciumsignalkaskaden für hyperaktivierte Motilität und Kapazitation.
Die Untersuchung hyperaktiver Eberspermien konnte erstmals von SCHMIDT und KAMP (2004) mittels computerassistierter Spermienanalyse (CASA) detailliert quantifiziert werden. Die Autoren verwendeten Inkubationsmedien ohne bzw. mit 25 % Seminalplasma. Weitere Komponenten waren das Calciumionophor A 23187 sowie Calcium. In Abwesenheit von Seminalplasma konnte die Hyperaktivität mit 50 µM/ l CaCl2 bei ca. 60 % der Spermien initiiert und für mindestens 40 min aufrechterhalten werden. In Anwesenheit von Seminalplasma waren für einen etwa gleichwertigen Effekt 700 µM/ l CaCl2 erforderlich. Die Autoren vermuteten die calciumchelierende Wirkung von Citrat aus dem Seminalplasma als Ursache. Die Beteiligung intrazellulärer Calciumspeicher bei der Hyperaktivität von Eberspermien ist bisher nicht geklärt.
2.1.3 Chemotaxis
Nicht eindeutig belegt in der Literatur ist die Bedeutung von Chemotaxis bei der Kapazitation von humanen und Säugetierspermien. EISENBACH (1999) beschrieb, dass eine Ligandenbindung chemotaktischer Eizellsignale zu veränderten Motilitätsmustern von Säugetierspermien führt, aus denen die „zielgerichtete“
6
Bewegung entlang eines Botenstoffgradienten resultiert. Auch SUAREZ (2008) zog ein Zusammenwirken chemotaktisch wirksamer Moleküle aus der Umgebung der Eizelle und der hyperaktivierten Motilität bei Säugetierspermien in Betracht. Die Autorin betonte jedoch, dass bisher kein Nachweis chemotaktischer Signalmoleküle aus Follikelflüssigkeiten, Cumuluszellen oder Eizellen bei Säugetieren geführt wurde.
Aus dem Genitaltrakt der Frau konnten bisher ebenfalls keine chemotaktisch wirksamen Substanzen identifiziert werden (HARPER u. PUBLICOVER 2005).
JIMINEZ-GONZALES et al. (2006) postulierten, dass die Bindung chemotaktischer Signalmoleküle an olfaktorische Rezeptoren humaner Spermien über Modulationen des Calciumgehaltes wirksam werden.
Laut EISENBACH und GIOJALAS (2006) sind bei Säugetierspermien ausschließlich kapazitierte Samenzellen zur Beantwortung chemotaktischer Signale befähigt. Durch ein zeitlich versetztes Zusammenspiel von Kapazitation und Chemotaxis werden, insbesondere bei periodisch zyklischen Spezies, die Möglichkeiten der Befruchtung optimiert. WALENSKY et. al. (1995) identifizierten im Mittelstück von Rattenspermien einen potenziellen Rezeptor für chemotaktische Signalmoleküle. Die Autoren vermuteten eine durch Ligandenbindung an einem G-Protein gekoppelten Rezeptor ausgelöste Aktivierung der Adenylatcyclase oder der Phospholipase C (PLC) und daraus resultierend den Anstieg des intrazellulären Gehaltes an cAMP. Über eine gleichzeitige Zunahme von Inositol-1, 4, 5,-triphosphat (IP3) würde der intrazelluläre
Calciumgehalt durch Freisetzung aus Calciumspeichern im Mittelstück (s. Kapitel 2.2) steigen und in die Regulation der Motilität eingreifen.
Die Relevanz von Chemotaxis ist für marine Invertebraten mit äußerer Befruchtung in der Literatur besser belegt als für Säugetierspermien. Da die Abgabe der Spermien in potentiell gametenreiches Wasser erfolgt, werden speziesspezifische Signale vermutet. Laut DARZON et al. (2006) ist für alle bisher untersuchten chemotaktischen Kaskaden mariner Spezies extrazelluläres Calcium erforderlich.
Daher wird die Zunahme des intrazellulären Calciumgehaltes durch Einstrom aus dem extrazellulären Medium vermutet. EISENBACH und GIOJALAS (2006) vermuteten eine motilitätsregulierende Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes nach Bindung chemotaktischer Liganden bei den Spermien mariner Invertebraten.
7 2.1.4 Akrosomreaktion
Die Akrosomreaktion gilt als finaler Schritt kapazitierter Säugetierspermien zur Befruchtung der Eizelle. Dabei fusioniert die äußere Akrosommembran mit der Plasmamembran. Anschließend erfolgt die akrosomale Exocytose mit der Freisetzung hydrolytischer Enzyme (BREITBART 2002, DARZON et al. 2011). Bei den Spermien von Säugetieren kann die Akrosomreaktion in vitro durch das Glycoprotein ZP3, einen gelösten Bestandteil der Zona Pellucida (ZP), sowie Progesteron induziert werden. Durch die ZP3-Bindung wird in Säugetierspermien eine calciumabhängige Kaskade ausgelöst, an deren Ende die Akrosomreaktion steht (JIMINEZ-GONZALES et al. 2006 (humane Spermien), DARZON et al. 2011 (speziesübergreifend)). Die exakten ZP3-Bindungsstellen der verschiedenen Säugetierspezies sind bisher nicht abschließend lokalisiert und charakterisiert worden.
Teilweise wird in der Literatur davon ausgegangen, dass die für die Akrosomreaktion benötigten Calciumionen ausschließlich durch Einstrom aus dem extrazellulären Milieu nach Öffnung plasmamembranständiger Calciumkanäle bereitgestellt werden (YANAGIMACHI 1994 (Hamsterspermien), MEIZEL u. TURNER 1993 (humane Spermien), SPUNGIN u. BREITBART 1996 (Rinderspermien), ROSSATO et al. 2001 (humane Spermien)). Auch in Untersuchungen von VISCONTI et al. (1995) konnte bei murinen Spermien trotz Zugabe von Bicarbonat und cAMP in calciumfreier Lösung zwar eine Tyrosinphosphorylierung, aber keine Akrosomreaktion ausgelöst werden.
In weiteren Studien wird angenommen, dass die Akrosomreaktion zunächst durch Calciumfreisetzung aus im Akrosom lokalisierten Speichern und infolgedessen auch durch einen Einstrom extrazellulärer Calciumionen über plasmamembranständige
Calciumkanäle initiiert wird. Diese Kaskade wird als „kapazitativer“ oder
„store-operated“ Calciumanstieg (SOC) bezeichnet und tritt auch bei somatischen Zellen auf (PUTNEY et al. 2001). Dabei führt vermutlich die Öffnung IP3 –rezeptor- gesteuerter Calciumkanäle an den Membranen intrazellulärer Calciumspeicher zu einem zeitlich versetzten Influx von Calciumionen aus dem extrazellulären Medium (WALENSKY u. SNYDER 1995 ( Hunde-, Hamster-, Ratten- und Mäusespermien),
8
PUBLICOVER u. BARRAT 1999 (humane und Säugetierspermien), O'TOOLE et al.
2000 (Mäusespermien), BREITBART 2002 (Rinder- und Schafspermien)). Genaue Nachweise über die beteiligten Rezeptoren und Kanäle bei den Spermien der verschiedenen Tierarten sind Gegenstand aktueller Forschungen. Bei Eberspermien ist bisher nur die Beteiligung von extrazellulärem Calcium bei der Initiierung der akrosomalen Exocytose belegt (BERNABO et al. 2010a).
2.1.5 Motilitätsaktivierung bei Fischspermien
Die Spermien (der Laich) von Fischspezies mit äußerer Besamung werden durch Calcium zur Motilität angeregt. Entsprechend des Lebensraumes werden die Spermien von Salzwasserfischen unter hypertonen und die von Süßwasserfischen
(und Amphibien) unter hypotonen Bedingungen zur Motilität aktiviert (HARDY et al. 1986, MORISAWA u. SUZUKI 1980). Zahlreiche Ionenkanäle in der
Plasmamembran detektieren die extrazellulären Ionenverhältnisse und reagieren auf diese. MORISAWA und SUZUKI (1980) fanden in ihren Untersuchungen heraus, dass Spermien von Salmoniden durch Kalium im Seminalplasma oder in kaliumhaltiger, seminalplasmaähnlicher Lösung immotil gehalten werden.
TANIMOTO und MORISAWA (1988) beschrieben in weiteren Studien, dass extrazelluläres Calcium die Motilität bei Spermien der Salmonidae (Lachsfische) auch in kaliumsupplementierter Umgebung auslösen kann. Hingegen verhinderte der Calciumkanalblocker Verapamil die Aktivierung der Motilität auch im kaliumfreien Milieu. KRAZNAI et al. (2000) wiesen bei Spermien von Salmonidae und Cyprinidae (Karpfenfischen) eine Hyperpolarisation der Plasmamembran infolge des kaliumarmen Milieus nach dem Laichen nach. Dadurch kann Calcium über die Plasmamembran aus dem extrazellulären Milieu einströmen und der intrazelluläre Calciumgehalt steigt an. Bei den Salmonidae wurde weiterhin die Aktivierung der Adenylatcyclase (AC) und nachfolgend der Anstieg des cAMP-Gehaltes der Spermien nachgewiesen (KRAZNAI et al. 2000).
9 2.2 Calciumspeicher bei Spermien
Calciumspeicher bei Säugetierspermien sind in die Modulation von Kapazitation, Hyperaktivität und Akrosomreaktion involviert. Bei Eberspermien ist bisher nur sehr wenig über die exakten Lokalisationen, Funktionen und Mechanismen der intrazellulären Calciumspeicherung bekannt. Speziesübergreifend werden bei Säugetierspermien das akrosomale Vesikel des Spermienkopfes (WALENSKY u.
SNYDER 1995 (Hunde-, Hamster-, Ratten- und Mäusespermien), HERRICK et al. 2005 (Mäusespermien), DARZON et al. 2011 (Säugetierspermien)), die spiralig
um das Axonem angeordneten Mitochondrien des Mittelstücks (HO u. SUAREZ 2001, 2003 (Rinderspermien)) sowie das „Redundant Nuclear Envelope“ (RNE), ein aus der Kernkondensation hervorgehendes membranöses Organell in der Halsregion, als Calciumspeicher beschrieben (HO u. SUAREZ 2001 und 2003 (Rinderspermien), DARZON et al. 2011 (Säugetierspermien)).
2.2.1 Akrosom
HERRICK et al. (2005) belegten in fluorimetrischen und fluoreszenzmikroskopischen Studien an kapazitierten Nebenhodenspermien von Mäusen einen gegenüber dem Zytoplasma stark erhöhten Calciumgehalt im Akrosom.
Einen wichtigen Hinweis auf akrosomale Calciumspeicherung erbrachten bereits NAKAMURA et al. (1993) mit der Identifizierung von Calreticulin im Akrosom von Rattenspermien. Calreticulin ist in somatischen Zellen ein calciumbindendes Protein des sarcoplasmatischen Reticulums (SR). Auch WALENSKY und SNYDER (1995) vermuteten eine Beteiligung von Calreticulin bei der akrosomalen Calcium- speicherung. Die Autoren wiesen in umfangreichen Untersuchungen IP3-Rezeptoren (s. Kapitel 2.3.7) an den Akrosomen von Hunde-, Hamster-, Ratten- und Mäusespermien nach. In weiterführenden Experimenten an den Ratten- und Mäusespermien konkretisierten die Autoren die Lokalisation der IP3-Rezeptoren an der äußeren Akrosommembran. Die Stimulation dieser Rezeptoren wird mit der Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern assoziiert. Den Autoren gelang es weiterhin, mittels Thapsigargin die akrosomale Exocytose bei Ratten- und
10
Mäusespermien auszulösen. Thapsigargin inhibiert die sarco-/ endoplasmatische Reticulum Calcium-ATPase (SERCA, s. Kapitel 2.3.9), welche Calciumionen aus dem Zytoplasma in intrazelluläre Speicher transportiert (LYTTON et al. 1991).
SPUNGIN und BREITBART (1996) lösten bei Rinderspermien Akrosomreaktionen mit Thapsigargin aus. Die Autoren vermuteten eine zunächst ligandenvermittelte Freisetzung akrosomalen Calciums (über IP3-Rezeptoren) mit nachfolgender Öffnung plasmamembranständiger Calciumkanäle und dem Einstrom von extrazellulär. Ein Zusammenhang zwischen der akrosomalen Calciumspeicherung und der Akrosomreaktion wurde daher von den Autoren postuliert. Die Entleerung der akrosomalen Calciumvorräte im Rahmen der Akrosomreaktion wird mittlerweile in der Literatur angenommen (PUBLICOVER u. BARRAT 1999 (humane und Säugetierspermien), O'TOOLE et al. 2000 (Mäusespermien), BREITBART 2002 (Rinder- und Schafspermien), COSTELLO et al. 2009 (Säugetierspermien)).
Über die calciumregulierenden Strukturen am Akrosom von porcinen Spermien wurden bisher lediglich Hinweise auf funktioneller Ebene erbracht (KIM et al. 2008, s. Kapitel 2.3.9). IP3-Rezeptoren scheinen jedoch nicht am Akrosom von Eber- spermien lokalisiert zu sein (s. Kapitel 2.3.7).
2.2.2 Redundant Nuclear Envelope (RNE)
Das RNE ist ein membranöses, mehrlagiges Zellorganell in der Halsregion des Spermienkopfes. Das RNE entwickelt sich während der Spermatogenese durch die Kondensation des Nucleus aus dessen Hüllen (SUAREZ 2008 (Säugetierspermien)).
RNEs wurden in humanen und verschiedenen Säugetierspermien nachgewiesen (KERR 1991 (humane Spermien), FRANKLIN 1968 (Affenspermien), ROUSE u.
ROBSON 1986 (Fledermausspermien), YANAGIMACHI 1994 (Hamsterspermien), TASHIMORI et al. 1995 (Mäusespermien), (HO u. SUAREZ 2003 (Rinderspermien)).
In unausgereiften Säugetierspermien ist das RNE noch mit dem endoplasmatischen Reticulum (ER) verbunden, welches in somatischen Zellen als Calciumspeicher fungiert (COSTELLO et al. 2009). Während der Spermienreifung im männlichen Genitaltrakt werden überschüssige Zellorganellen entfernt. Das Verbleiben des RNE in maturen Säugetierspermien wird von HO und SUAREZ (2001, 2003) sowie
11
SUAREZ (2008) als Indiz auf dessen Bedeutung für die Funktion ejakulierter Spermien betrachtet. Tatsächlich ergaben Studien von HO und SUAREZ (2001, 2003) an Rinderspermien Hinweise auf eine Funktion als Calciumspeicher. Die Autoren wiesen in fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen das RNE in der Halsregion der Samenzellen nach. Des Weiteren wurden, wenn auch ohne vollständige räumliche Überlagerung, IP3-Rezeptoren sowie Calreticulin im Spermienhals identifiziert. Anschließende elektronenmikroskopische Untersuchungen des Spermienhalses zeigten eine membranöse Struktur mit umfangreichen Cisternae, an die sowohl Calreticulin als auch die IP3-Rezeptoren assoziiert waren.
Die Autoren vermuteten aufgrund der möglichen Calciumspeicherung (Calreticulin) sowie der Möglichkeit zur Calciumfreisetzung (IP3-Rezeptoren) ein spezialisiertes Kompartiment des RNE, welches als intrazellulärer Calciumspeicher fungiert und die Hyperaktivität initiiert. HARPER et al. (2004, 2005) sowie JIMINEZ-GONZALES et al. (2006) postulierten ebenfalls die Steuerung der Motilitätsmuster humaner Spermien über das RNE.
2.2.3 Mitochondrien
HO und SUAREZ (2001, 2003) vermuteten eine Funktion der Mitochondrien von Rinderspermien als intrazelluläre Calciumspeicher. Die Autoren zweifelten allerdings an der Modulation der Hyperaktivität durch mitochondriale Calciumfreisetzung, da keine IP3-Rezeptoren auf diesen Organellen nachgewiesen werden konnten, Hyperaktivität aber mit Thimerosal, welches IP3-gesteuerte Calciumkanäle öffnet, ausgelöst werden konnte. Eine Blockade der mitochondrialen Calciumfreisetzung (mittels CGP-37157, welches spezifisch den mitochondrialen Na+-/Ca2+-Austauscher inhibiert) blieb ebenfalls ohne Effekt auf die Hyperaktivität. Die Autoren schlossen aber eine Beteiligung der mitochondrialen Calciumvorräte bei der Aufrechterhaltung hyperaktiver Bewegungsmuster über längere Zeiträume nicht aus. Die Fragestellung nach der Relevanz von Mitochondrien als intrazelluläre Calciumspeicher bedarf weiterer Untersuchungen. Die Funktion von Mitochondrien als Calciumspeicher von Säugetierspermien wird teilweise in der Literatur angenommen, da Mitochondrien in somatischen Zellen als wichtige Calciumspeicher fungieren (COSTELLO et al. 2009).
12
2.3 Regulation des intrazellulären Calciumgehaltes bei Spermien
Die Translokation von Calciumionen erfolgt in Säugetierspermien über die Plasmamembran oder die Membranen intrazellulärer Calciumspeicher. Die Regulation des intrazellulären Calciumgehaltes wird dabei maßgeblich von zwei Transportmechanismen dominiert: Einerseits werden Calciumionen aus dem Zytosol entgegen dem elektrochemischen Gradienten in die intrazellulären Speicher oder aus den Samenzellen heraus transportiert. Diese Funktionen übernehmen Calcium- ATPasen unter Energieverbrauch. Andererseits müssen Calciumionen über die Plasmamembran oder aus intrazellulären Speichern entsprechend des zellphysiologischen Bedarfs in das Zytosol gelangen können. Dafür stehen diverse Ionenkanäle zur Verfügung, welche über verschiedene second messenger moduliert werden (COSTELLO et al. 2009).
Nachfolgend wird eine Übersicht über die bisher bekannten Calciumkanäle der Plasmamembran sowie die plasmamembranständige Calcium-ATPase (PMCA) und die Secretory Pathway Calcium-ATPase (SPCA) gegeben (s. Kapitel 2.3.1 bis 2.3.6).
Die im Rahmen der vorliegenden Studie untersuchten, vermutlich an intrazelluläre Calciumspeicher assoziierten Strukturen werden in den Kapiteln 2.3.7, 2.3.8 und 2.3.9 näher beschrieben.
2.3.1 Cation channel of sperm (CatSper)
Die als cation channel of sperm bezeichneten Calciumkanäle weisen strukturelle Ähnlichkeit mit spannungsgesteuerten Calciumkanälen von Säugetierspermien auf (FELIX 2005). Erste Untersuchungen erfolgten 2001 durch REN et al. (CatSper 1) und QUILL et al. (CatSper 2) an murinen Spermien. LOBELEY et al. (2003) beschrieben nachfolgend CatSper 3 und 4. CatSpers sind pH-sensitiv und reagieren unter alkalinisierten (kapazitierenden) Bedingungen, wobei die genauen Agonisten noch nicht hinreichend identifiziert werden konnten.
Mittlerweile wurden auch an den Spermien von Menschen, Schimpansen und Hunden orthologe CatSpers nachgewiesen. Aber nur bei humanen und murinen Spermien konnten bisher alle vier CatSper-Varianten nachgewiesen werden.
13
Lokalisiert sind diese Calciumkanäle in der Plasmamembran auf dem Hauptstück der Flagelle. Eine Beteiligung an der Hyperaktivitätsregulation ist für CatSper 1 (REN et al. 2001) und CatSper 2 (QUILL et al. 2003) nachgewiesen worden. CatSper 1 bis 4-knock out-Mäuse sind infertil. Daher stellen CatSpers die bisher einzigen bekannten Calciumkanäle bei Säugetierspermien dar, über die unmittelbar die männliche Fertilität beeinflusst werden kann (JIMINEZ-GONZALES et al. 2006, NAVARRO et al. 2008).
2.3.2 Spannungsgesteuerte Calciumkanäle
Diese Calciumkanäle reagieren auf die Depolarisation der Plasmamembran.
Entsprechend ihrer Reaktivität werden sie in high voltage-activated (HVA) oder low voltage-activated (LVA) eingeteilt. Calciumkanäle des Typs HVA reagieren bei einer Änderung des Membranpotentials auf ca. ≥ - 30 mV und kehren nach der Aktivierung nur langsam in den inaktiven Status zurück. Calciumkanäle des Typs LVA reagieren bei einer Änderung auf ca. ≥ - 60 mV und werden schneller wieder inaktiviert als der HVA-Typ (PUBLICOVER u. BARRAT 1999, FELIX 2005, DARZON et al. 2011). BABCOCK et al. (1983, 1987) nahmen bereits in früheren Studien spannungsgesteuerte Calciumkanäle in der Plasmamembran von Bullen- und Schafbockspermien an. ARNOULT et al. (1996) vermuteten nach Untersuchungen an Mäusespermien eine Beteiligung dieser Kanäle bei der ZP-induzierten Akrosom- reaktion, da diese durch die spezifische Blockade spannungsgesteuerter Kanäle gehemmt werden konnte. Verschiedene Untertypen wurden in den Spermien von Menschen, Ratten und Mäusen nachgewiesen (JIMINEZ-GONZALES et al. 2006).
KIM et al. (2008) nahmen bei Eberspermien das Vorhandensein spannungs- gesteuerter Calciumkanäle an, da durch die Depolarisation der Plasmamembran eine Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes ausgelöst werden konnte. Nach Kryokonservierung reagierten die Spermien mit geringeren Calciumsignalen. Die Autoren schlossen daraus die Beschädigung der vermuteten Calciumkanäle durch Kryokonservierung. BERNABO et al. (2010a) wiesen an Eberspermien eine Aktivierung von spannungsgesteuerten Calciumkanälen als Folge der Membran- depolarisation durch den Einstrom von Natriumionen über den Transient Receptor
14
Potential Vanilloid Type 1 (TRPV 1, Vanilloidrezeptor Typ 1) nach. Der Calcium- einstrom bedingte die Polymerisation von Aktinfilamenten zwischen der äußeren Akrosommembran und der Plasmamembran. Spannungsgesteuerte Calciumkanäle sind somit an der Initiierung der Akrosomreaktion bei Eberspermien beteiligt.
2.3.3 Nucleotidgesteuerte Calciumkanäle
Diese Calciumkanäle reagieren auf die Bindung von cAMP oder zyklischem Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP). Darüber hinaus weisen sie eine geringe Sensitivität gegenüber Depolarisation auf. Im Gegensatz zu anderen Calciumkanälen der Plasmamembran werden sie nicht deaktiviert (DARZON et al. 2011). Trotz nur geringer Ionenselektivität fungieren sie meistens als Kanäle für den Einstrom von Calcium- und Natriumionen (MEIZEL u. TURNER 1997 (humane Spermien)).
WEYAND et al. (1994) gelang der Nachweis eines nucleotidgesteuerten Calciumkanals auf dem Mittelstück von Rinderspermien. Durch weiterführende Studien von WIESNER et al. (1998) wurde festgestellt, dass dieser Calciumkanal auf cGMP sensitiver als auf cAMP reagiert. Eine durch cGMP stimulierte Beteiligung an der Spermienmotilität wurde aufgrund der Lokalisation im Bereich des Spermienschwanzes angenommen. Die genaue Bedeutung von nucleotid- gesteuerten Calciumkanälen bei Säugetierspermien ist noch weitgehend unverstanden (DARZON et al. 2011).
2.3.4 Progesterongesteuerte Calciumkanäle
Das Steroidhormon Progesteron wird im weiblichen Genitaltrakt während der Ovulation von den Zellen des Cumulus oophorus sezerniert. Die Bindung von Progesteron an einen noch nicht identifizierten Rezeptor in der Plasmamembran verursacht einen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes und induziert die Akrosomreaktion (DARZON et al. 2011 (speziesübergreifend)).
Studien von BEDU-ADDO et al. (2007) und HARPER et al. (2004) an humanen Spermien ergaben unterschiedliche Anstiege des intrazellulären Calciumgehaltes durch Verwendung ähnlicher Konzentrationen Progesteron:
BEDU-ADDO et al. (2007) verwendeten 3,2 µM Progesteron. Die einmalige
15
Exposition mit der gesamten Dosis verursachte einen biphasischen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes mit anschließender Akrosomreaktion. Die Entfernung von extrazellulärem Calcium mit 2 mM EGTA verhinderte die Akrosomreaktion.
HARPER et al. (2004) setzten die Spermien über 15 bis 25 min einem logarithmischen Konzentrationsgradienten zwischen 0 und 3,0 µM Progesteron aus.
Die von den Autoren beabsichtigte Simulation eines physiologischen hormonellen Gradienten im Ovidukt löste oszillierende Anstiege des intrazellulären Calciumgehaltes im Halsbereich der Spermien aus. Da sich die Amplitude des Flagellenschlages synchron zu den Calciumoszillationen vergrößerte, vermuteten die Autoren eine Beteiligung progesterongesteuerter Calciumkanäle bei der Induktion der Hyperaktivität von humanen Spermien. Die Anstiege des intrazellulären Calciumgehaltes wurden auch in calciumfreien Medien detektiert. Daher vermuteten die Autoren, dass Progesteron auch intrazelluläre Calciumspeicher ansprechen kann.
Als Lokalisation wurde das RNE vermutet. Die betroffenen Spermien zeigten keine Akrosomreaktionen.
JIMINEZ-GONZALES et al. (2006) beschrieben ebenfalls an humanen Spermien einen biphasischen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes nach Stimulation mit 3 µM Progesteron. Die Autoren beschrieben allerdings beide Phasen als abhängig von extrazellulärem Calcium und vermuteten eine Öffnung plasmamembranständiger Calciumkanäle durch Progesteron.
In Untersuchungen an Eberspermien stimulierten KIM et al. (2008) frische und nach Kryokonservierung aufgetaute Samenzellen mit 100 µM Progesteron nach Kapazitation in einem calcium- und bicarbonathaltigen Medium. Die Autoren detektierten jeweils eine Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes.
Kryokonservierte Spermien reagierten schwächer. Die Autoren vermuteten daher einen progesterongesteuerten Calciumkanal bei Eberspermien, welcher nach der Kryokonservierung nur noch eingeschränkte Funktionalität besitzt.
LÖSEL et al. (2004) führten Untersuchungen mit Antikörpern gegen einen plasmamembranständigen Progesteronrezeptor (mPR) durch, welcher in porcinen Hepatocyten exprimiert wird. Durch Verwendung dieser Antikörper bei Eberspermien wurde die Rate der durch Progesteron induzierten Akrosomreaktionen verringert. Als
16
Lokalisation wurde die innere Akrosommembran vermutet. Die Autoren fanden darüber hinaus Hinweise auf einen zweiten, digitoninlöslichen Progesteronrezeptor bei Eberspermien.
2.3.5 Plasmamembran-Calcium-ATPasen (PMCAs)
Die PMCA existiert in somatischen Zellen in vier Unterformen und wird in den meisten Geweben von Säugetieren exprimiert. Dort besitzt sie eine generalisierte Funktion in der Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase, indem sie Calciumionen über die Plasmamembran nach extrazellulär transportiert. In Säugetierspermien ist vor allem die PMCA 4 relevant (JIMINEZ-GONZALES et al. 2006). WENNEMUTH et al. (2003) wiesen mittels Immunfluoreszenz die PMCA am Hauptstück der Flagelle von Mäusespermien nach. Spermienkopf und -mittelstück zeigten keine Fluoreszenz.
Die Autoren postulierten eine wichtige Bedeutung der PMCA für die Regulation des intrazellulären Calciumgehaltes. Diese These wird durch die Beobachtung bestärkt, dass männliche PMCA4-knock out-Mäuse infertil sind. Die Spermien dieser Individuen können nicht zur Hyperaktivität stimuliert werden (JIMINEZ-GONZALES et al. 2006). Zur Bedeutung und Lokalisation der PMCA in Eberspermien liegen bisher keine Erkenntnisse vor.
2.3.6 Secretory Pathway Calcium-ATPasen (SPCAs)
HARPER et al. (2005) wiesen in humanen Spermien SPCA1 mittels Western Blot nach. Nachfolgend lokalisierten COSTELLO et al. (2009) die SPCA humaner Spermien hinter dem Nucleus, im Bereich des Spermienhalses, und dem Mittelstück.
In fluorimetrischen Experimenten von HARPER et al. (2005) reagierten humane Spermien deutlicher auf Bis-Phenol als auf Thapsigargin. Während Thapsigargin ausschließlich die SERCA blockiert, wird durch Bis-Phenol zusätzlich auch die SPCA inhibiert. Die Autoren schlussfolgerten daher, dass die Calciumregulation humaner Spermien vorrangig über die SPCA erfolgt. Da vorhergehende Experimente der Autoren (HARPER et al. 2004) Hinweise auf das Vorhandensein von Ryanodinrezeptoren bei humanen Spermien erbracht hatten, vermuteten die Autoren einen von der SPCA befüll- und von Ryanodinrezeptoren entleerbaren
17
Calciumspeicher. Aufgrund der Lokalisation der SPCA hinter dem Nucleus, wurde das RNE vermutet. Da Calciumoszillationen in diesem Bereich der Spermien nicht zu Akrosomreaktionen führten, postulierten die Autoren eine Regulation der Flagellenaktivität
2.3.7 IP3- rezeptorgesteuerte Calciumkanäle
IP3-rezeptorgesteuerte Calciumkanäle öffnen nach Bindung mit IP3. Experimentell stimuliert Thimerosal (s. Kapitel 3.4) die Öffnung dieser Calciumkanäle (HO u.
SUAREZ 2001).PUTNEY et al. (2001) vermuteten bei somatischen Zellen, dass die IP3-vermittelte Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern die Öffnung plasmamembranständiger Calciumkanäle initiiert. Aufgrund der postulierten Funktionsweise wurden IP3-aktivierte Calciumkanäle den so genannten kapazitativen oder speichergesteuerten („store-operated“) Calciumkanälen zugeordnet.
WALENSKY und SNYDER (1995) führten erste umfangreiche Untersuchungen zum Vorhandensein und der Lokalisation von IP3-Rezeptoren an den Spermien von Mäusen, Ratten, Hamstern und Hunden durch. Den Autoren gelang zunächst der Nachweis des G-Proteins Gαq/11 und der β1 Isoform der Phospholipase C, beides Komponenten des Phosphoinositidsystems, über das IP3 generiert wird. Dieser Hinweis wurde am Akrosom und dem Mittelstück des Spermienschwanzes erbracht.
Durch weitere Experimente der Autoren konnten IP3-Rezeptoren bei den Spermien aller untersuchten Spezies mit hohem Expressionsgrad nachgewiesen und über indirekte Immunfluoreszenz lokalisiert werden. IP3-Rezeptoren wurden im Bereich der Akrosome und bei Rattenspermien zusätzlich im vorderen Mittelstück nachgewiesen. Für letztere Lokalisation nahmen die Autoren eine Beteiligung an der Motilitätsregulation an. In anschließenden Untersuchungen bestätigten die Autoren die Lokalisation von IP3-Rezeptoren an der äußeren Membran intakter Akrosome.
HO und SUAREZ (2001) wiesen den Typ 1 IP3-Rezeptor in der Region des Spermienhalses von Bullen- und Hamsterspermien nach. GUGSSA et al. (2010) gelang mittels Immunfluoreszenz der Nachweis von IP3-Rezeptoren in der Halsregion von Eberspermien und, mit geringerem Expressionsgrad, auch im Bereich des Mittelstücks. Da im Bereich des Spermienhalses auch Calmodulin, ein
18
calciumbindendes Protein, nachgewiesen werden konnte, vermuteten die Autoren einen intrazellulären Calciumspeicher, welcher bei Eberspermien die basale Region des Nucleus umgibt. Eine motilitätsregulierende Funktion wurde angenommen.
2.3.8. Ryanodinrezeptorgesteuerte Calciumkanäle
Zur Expression von ryanodinrezeptorgesteuerten Calciumkanälen in Säugetier- spermien gibt es diverse Studien, deren Ergebnisse z. T. nicht eindeutig sind. Um intrazellulär lokalisierte Ryanodinrezeptoren anzusprechen, werden in der Regel Thimerosal (s. Kapitel 3.4) oder Koffein eingesetzt, da Ryanodin nicht zellpermeabel ist (HO u. SUAREZ 2001).
KIM et al. (2008) vermuteten Ryanodinrezeptoren bei Eberspermien. Die Autoren konnten durch Zugabe von Koffein in einem calciumhaltigen Medium einen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes auslösen. HO und SUAREZ (2001) beobachteten an Rinderspermien einen ähnlichen Effekt, der allerdings durch die Chelierung extrazellulärer Calciumionen verringert wurde. Daher vermuteten die Autoren ein Ansprechen plasmamembranständiger (Ryanodin-) Rezeptoren.
Zusätzlich führten HO und SUAREZ (2001) eine Immunfluoreszenzuntersuchung mit Antikörpern gegen Ryanodinrezeptoren durch, aus der keine Belege für die Existenz von ryanodinrezeptorgesteuerten Calciumkanälen bei Rinderspermien hervorgingen.
Die Autoren postulierten aufgrund ihrer Untersuchungen, dass Rinderspermien keine an intrazelluläre Calciumspeicher assoziierten Ryanodinrezeptoren besitzen.
TREVINO et al. (1998) wiesen Typ 3 Ryanodinrezeptoren in ausgereiften Mäusespermien nach. Da sowohl akrosomintakte als auch -reagierte Spermien ähnliche Nachweismuster zeigten, vermuteten die Autoren eine nichtakrosomale Lokalisation. Untersuchungen von HARPER et al. (2004) lieferten Hinweise auf ryanodinrezeptorgesteuerte Calciumkanäle am RNE von humanen Spermien.
2.3.9 Sarco-/ endoplasmatische Reticulum Calcium-ATPasen (SERCAs)
SERCAs transportieren Calciumionen unter Energieaufwand entgegen dem elektrochemischen Gradienten in intrazelluläre Speicher. Da während der Calciumtranslokation diverse Konformitäts- und Bindungszustände durchlaufen
19
werden, geschieht dieser Transport, verglichen mit der Freisetzung über Calciumkanäle, langsam. Pro SERCA-Molekül und Sekunde können nur wenige Ionen transportiert werden (COSTELLO et al. 2009).
LYTTON et al. (1991) beschrieben bei somatischen Zellen das Vorkommen von SERCAs sowohl an den Membranen von IP3- als auch ryanodinrezeptorgesteuerten intrazellulären Calciumspeichern. Die Autoren untersuchten außerdem die Spezifität des SERCA-Inhibitors Thapsigargin für SERCA 1, SERCA 2a und b sowie SERCA 3.
Thapsigargin reagierte spezifisch und mit mathematischer Korrelation zu den verwendeten Konzentrationen mit allen SERCAs.
In Experimenten von MEIZEL und TURNER (1993) an humanen Spermien und WALENSKY und SNYDER (1995) an Mäusespermien konnte unter Zusatz von Thapsigargin die akrosomale Exocytose ausgelöst werden, wodurch die Hypothese einer ATP-abhängigen akrosomalen Calciumspeicherung durch SERCAs bestärkt wurde. BEDU-ADDO et al. (2007) vermuteten hingegen, dass in humanen Spermien keine SERCAs an der intrazellulären Speicherung von Calcium beteiligt sind, da die Spermien nicht auf Thapsigargin reagierten und über Western Blot bzw.
Immunlokalisation keine SERCAs nachweisbar waren. Auch HARPER et al. (2005) zweifelten an der Beteiligung von SERCAs bei der Calciumspeicherung humaner Spermien. LAWSON et al. (2007) wiesen im Gegensatz dazu SERCA 2 im Mittelstück und den Akrosomen humaner, boviner sowie muriner Spermien nach.
KIM et al. (2008) konnten in Versuchen an Eberspermien nach Zugabe von 5 µM Thapsigargin einen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes beobachten.
Da dieser Anstieg bei vormals kryokonservierten Spermien deutlich geringer
ausfiel, schlossen die Autoren auf eine gestörte Calciumspeicherung durch Kryokonservierung. Auf die Expression von SERCAs bei Eberspermien
wurde nur indirekt eingegangen. Die Inhibition der „akrosomalen Calciumpumpe“
durch Thapsigargin wurde angenommen.
20
3 Material und Methode
3.1 Versuchsübersicht
Im ersten Experiment wurde in einer Konzentrationsreihe mit Thapsigargin die optimale Wirkkonzentration des Inhibitors der sarco-/ endoplasmatischen Reticulum Calcium-ATPase (SERCA) ermittelt. Eine mögliche Beeinflussung der Plasma- membranintegrität und des intrazellulären Calciumgehaltes plasmamembranintakter Spermien wurden untersucht. Die Wirkung von Thapsigargin wurde in zwei Inkubationsmedien verglichen, welche sich hinsichtlich des Calciumgehaltes unterschieden.
Im nächsten Schritt wurden mit einer ausgewählten Konzentration Thapsigargin Wiederholungsmessungen unter gleichen Bedingungen ausgeführt. Es wurde demonstriert, dass der Versuchsaufbau zur Erhebung reproduzierbarer Messdaten geeignet war.
Darauf folgend wurde in einer weiteren Konzentrationsreihe die optimale Wirkkonzentration von Thimerosal ermittelt. Thimerosal öffnet IP3- und ryanodinrezeptorgesteuerte Calciumkanäle an den Membranen intrazellulärer Calciumspeicher. Der Versuchsaufbau sollte ebenfalls die Fragestellungen nach der Beeinflussung der Plasmamembranintegrität und des intrazellulären Calciumgehaltes plasmamembranintakter Spermien beantworten. Die Messdaten wurden in zwei Medien erhoben, welche sich hinsichtlich des Calciumgehaltes unterschieden.
Im Anschluss wurde nur noch mit jeweils einer Dosis der Inhibitoren Thapsigargin und Thimerosal gearbeitet. Es folgten zwei gleich aufgebaute Experimente. Die Spermien wurden unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen für unterschiedlich lange Zeiträume inkubiert, bevor der jeweilige Inhibitor zugesetzt wurde. Ein möglicher Einfluss der Inkubationsdauer sowie der verwendeten Inkubationsmedien auf die Plasmamembranintegrität sowie den intrazellulären Calciumgehalt der plasmamembranintakten Samenzellen wurde fokussiert.
Im abschließenden Experiment wurden Thimerosal und Thapsigargin parallel an denselben Spermiensuspensionen eingesetzt. Die Samenzellen wurden unter
21
kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen inkubiert. Neben den bisher betrachteten Parametern wurde zusätzlich ein möglicher Einfluss der Inhibitoren auf die akrosomale Integrität analysiert.
3.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial
Die Herkunft der verwendeten Chemikalien ist in Kapitel 9.2 gelistet. In Kapitel 9.3 finden sich die Rezepte für die verwendeten Gebrauchslösungen. Geräte und Verbrauchsmaterialien sind in Kapitel 9.5 aufgeführt.
Folgende Fluoreszenzfarbstoffe wurden benutzt:
Hoechst 33342 (invitrogen™/ Life Technologies, Carlsbad (USA))
Propidiumiodid (PI, Sigma Aldrich, Schnelldorf)
Fluo-4 AM (invitrogen™/ Molecular Probes, Carlsbad (USA))
Fluoreszeinisothiocyanat-Peanut Agglutinin (FITC-PNA, Axxora, Lörrach).
3.3 Fluoreszenzfarbstoffe
Der blau emittierende Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 diente der Unterscheidung DNA-haltiger (Spermien) und nicht DNA-haltiger (Schmutzpartikel) Messereignisse. Hoechst 33342 permeiert intakte Plasmamembranen und bindet im Zellkern an doppelsträngige DNA. Angeregt wird Hoechst 33342 durch Licht der Wellenlänge 365 nm aus der HBO Quecksilberlampe. Das Emissionsmaximum des Farbstoffes liegt mit 445 nm im blauen bis cyanfarbenen Spektrum. Das Fluoreszenzsignal wird im FL-4-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert.
Hoechst 33342 wurde bei der Erhebung des Membranstatus (s. Kapitel 3.12.2) verwendet.
Der rot emittierende Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid (PI) wurde zur Differenzierung der plasmamembranintakten von den plasmamembrandefekten Zellen verwendet. Das Prinzip der Unterscheidung beruht auf der Permeabilität
22
defekter Plasmamembranen für PI. Intakte Plasmamembranen sind für den Farbstoff nicht passierbar. Im plasmamembrandefekten Spermium dringt PI in die Zelle ein und interkaliert an doppelsträngige DNA und RNA (TAS u. WESTERNENG 1981). Die Anregungsenergie wird vom Argonlaser bereitgestellt. Die Emission des roten Fluoreszenzlichts wird im FL-3-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert. Das Emissionsmaximum liegt bei 617 nm. PI wurde bei jeder Messung eingesetzt.
Der grün emittierende Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM wurde zur Detektion des intrazellulären Calciumgehaltes eingesetzt. Als Azetoxymethylester (AM) permeiert der Farbstoff plasmamembranintakte Zellen. Unter dem Einfluss zytoplasmatischer Esterasen wird Fluo-4 AM zu Fluo-4 deesterifiziert. Fluo-4 verbleibt im Zytoplasma und bindet dort spezifisch Calciumionen (Ca2+). Unter der Anregungsenergie des Argonlasers emittiert das an Ca2+ gebundene Fluo-4 grünes Fluoreszenzlicht mit dem Emissionsmaximum 506 nm. Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist umso höher, je mehr Calciumionen in der Zelle an Fluo-4 gebunden sind. Die Signalstärke erlaubt damit Rückschlüsse auf den intrazellulären Calciumgehalt der untersuchten Spermien. Die Emission des grünen Fluoreszenzlichts wird im FL-1-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert
Der grün emittierende Fluoreszenzfarbstoff FITC-PNA ermöglichte die Differenzierung von Spermien mit intakter oder defekter Akrosommembran. FITC bezeichnet Fluoreszeinisothiocyanat und PNA das daran gekoppelte Peanut Agglutinin. PNA ist ein Lectin aus der Erdnuss und bindet an der Innenseite der äußeren Akrosommembranen von Eberspermien (FLESCH et al. 1998). Die Anregungsenergie wird vom Argonlaser bereitgestellt. Die Emission des grünen Fluoreszenzlichts wird im FL-1-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert. Das Emissionsmaximum liegt bei 520 nm. FITC-PNA wurde bei der Erhebung des Membranstatus eingesetzt. Weiterhin wurde es zur Untersuchung der Modulatorwirkungen auf die Akrosomintegrität verwendet.
23 3.4 Inhibitoren
Thapsigargin wird aus der Pflanze Thapsia garganica extrahiert. Strukturell gehört es zu den Sesquiterpenlactonen. Funktionell wird es als Inhibitor der SERCA- Enzyme eingesetzt (SERCA = sarco-/ endoplasmatisches Retikulum Ca2+-ATPase).
Unter der Blockade durch Thapsigargin ist die Ca2+-ATPase nicht mehr fähig, Calciumionen aus dem Zytoplasma in die intrazellulären Speicher zu pumpen.
Dadurch steigt der intrazelluläre Calciumgehalt in den mit Thapsigargin versetzten Zellen. Durch die Leerung der intrazellulären Calciumspeicher bzw. den Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes können sekundär plasmamembranständige, spannungsgesteuerte Calciumkanäle geöffnet werden. Abhängig vom Calciumgehalt des extrazellulären Mediums kann es infolgedessen zu einem Calciuminflux von extrazellulär kommen (BREITBART 2002).
Thimerosal ist eine organische Verbindung. Das Natriumsalz einer Quecksilber- verbindung wurde in den Experimenten eingesetzt, um IP3- und ryanodinrezeptor- gesteuerte Calciumkanäle zu öffnen, welche an den intrazellulären Calciumspeichern vermutet werden. Diese Kanäle entlassen Calciumionen aus den Speichern in das Zytoplasma. Durch die Öffnung der Calciumkanäle nach Thimerosalzugabe kommt es zu einem Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes (HO u. SUAREZ 2001).
3.5 HBS-Inkubationsmedien
Für alle nachfolgend beschriebenen Experimente wurden HBS-basierte Inkubationsmedien verwendet (s. Kapitel 9.3). Die Medien enthielten 1 mg/ ml bovines Serumalbumin Fraktion V. Es wurden vier HBS-Medien hergestellt, die sich hinsichtlich des Gehaltes von Calcium und Bicarbonat unterschieden:
1) HBSKontrolle ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat 2) HBSCa mit Zusatz von 2 mM Calcium
3) HBSBic mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat
4) HBSBicCa 2 mM mit Zusatz von Calcium sowie 15 mM Bicarbonat .
24
Die Medien wurden auf den pH-Wert 7,4 bei der Gebrauchstemperatur von 38°C und eine Osmolarität von 295 bis 305 mOsmol/ kg eingestellt. Auf ein EGTA-haltiges Inkubationsmedium wurde verzichtet.
Pro 1 ml HBS-Medium wurden 5 µl PI-Stammlösung (1 mg/ ml) hinzugefügt. Die mit PI versetzten Medien wurden in Portionen zu 1990 µl in 3,5 ml Reagenzröhrchen (Sarstedt, Nürnbrecht) vorgelegt. Vor Messbeginn waren alle Medien für mindestens 120 min einer Temperatur von 38°C ausgesetzt. Die Medien ohne Zusatz von Bicarbonat befanden sich verschlossen im Wärmeschrank (Memmert, Schwabach).
Die Medien mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat wurden bei einer Konzentration von 5 % CO2 unverschlossen im CO2-Inkubator (Sanyo, Bad Nenndorf) belassen.
Für die in den Kapiteln 3.14.1, 3.14.2 und 3.14.3 beschriebenen Experimente wurden ausschließlich HBSKontrolle und HBSCa verwendet.
3.6 Tiere und Samengewinnung
Die in den Experimenten verwendeten Ejakulate stammten von neun Ebern aus dem Bestand der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Eber gehörten den Rassen Duroc, Pietrain und Deutsche Landrasse an. Das Alter der Eber betrug im Mittel 2,3 Jahre (Minimum: 1,2 Jahre, Maximum: 4,3 Jahre). Alle Tiere waren klinisch gesund. Die Samengewinnung erfolgte mittels der
„Handmethode“. Die Ejakulate wurden in einem Samenauffangbeutel (US-Bag™, Minitüb GmbH, Tiefenbach), welcher sich in einem Samenauffangbecher (Semen Collection Cup, Minitüb GmbH, Tiefenbach) befand, gesammelt. Sowohl Beutel als auch Becher waren zum Verwendungszeitpunkt auf 38°C temperiert. Nach der Samengewinnung wurde der im Auffangbeutel integrierte Gazefilter inclusive des darin enthaltenen Bulbourethraldrüsensekretes entfernt. Das verbliebene Ejakulat wurde im Samenauffangbeutel luftarm verschlossen und in einer ebenfalls auf 38°C gewärmten Styroporbox umgehend in das institutseigene Labor transportiert.
25 3.7 Standardspermatologie
Im Labor wurde das Ejakulat zügig in einen auf 38°C temperierten, sterilen Glaszylinder umgefüllt. Zunächst wurden Volumen, Farbe und Konsistenz bestimmt.
Danach erfolgte die Untersuchung von Motilität, Spermienkonzentration und Morphologie.
Zur Motilitätsschätzung wurde ein auf 38°C beheizbares Phasenkontrastmikroskop (Anxiostar Plus, Zeiss, Jena) eingesetzt (x 200, Phase 2). Die verwendeten Objektträger (76 x 26 mm, Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig), Deckgläschen (18 x 18 mm, Interessengemeinschaft der Laborfachhändler (IDL) GmbH & Co. KG, Nidderau) sowie Pipettenspitzen (nerbe plus, Winsen/ Luhe) sind auf einer Heizplatte (HT 200, Minitüb GmbH, Tiefenbach) ebenfalls auf 38°C vorgewärmt worden. Mit einer Einkanalpipette (Eppendorf, Hamburg) wurden mindestens zwei senfkorngroße Tropfen (1,5 bis 5,0 µl) nativen Ejakulates auf einen Objektträger verbracht und mit einem Deckgläschen versehen. Darin wurden jeweils mindestens drei Gesichtsfelder betrachtet. Die Gesichtsfelder sollten frei von Luftblasen sein und nicht am Rand des Präparates liegen, da Sauerstoff die Motilität beeinflussen kann. Sowohl vorwärts- als auch ortsbewegliche Spermien wurden als motil eingestuft. Das Gesichtsfeld mit dem höchsten Anteil motiler Samenzellen wurde als repräsentativ erachtet.
Die Spermienkonzentration wurde mit der Zählkammer „Thoma-neu“ (Jürgens, Hannover) im Phasenkontrastmikroskop (Anxiostar Plus, Zeiss, Jena) bestimmt (x 400, Phase 2). Die Auswertung erfolgte in Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966). Aus der Spermienkonzentration, multipliziert mit dem Ejakulatvolumen, wurde die Spermiengesamtzahl ermittelt.
Der prozentuale Anteil morphologisch abweichender Samenzellen wurde aus einer in Formolcitrat fixierten Probe durch Auszählung von 200 Spermien untersucht. Es wurden, abhängig von der Spermienkonzentration, zwischen 5 und 25 µl des nativen Ejakulates mit einer variablen Einkanalpipette in 300 µl Formolcitrat pipettiert. Die Beurteilung erfolgte in Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966) unter Ölimmersion (x 1000, Phase 3) im Phasenkontrastmikroskop (Zeiss 4713849, Zeiss, Jena). Letzter Schritt der Standardspermatologie war die Ermittlung des pH-Wertes