3.14 Versuche
3.14.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mittels des angewandten
Fragestellung
Die Reproduzierbarkeit der Wirkung von Thapsigargin mittels des Versuchsaufbaus aus Kapitel 3.14.1 sollte demonstriert werden.
Versuchsdurchführung
Verwendet wurden 1,25 µM Thapsigargin bzw. das entsprechende Volumen DMSO.
Die Spermien wurden für 5 min bei 38°C in HBSKontrolle sowie HBSCa inkubiert. In beiden Medien wurde eine Kontrollmessung ohne Zugabe von Thapsigargin oder DMSO durchgeführt. Die Messungen unter Zugabe von Thapsigargin bzw. DMSO wurden als Time-Gate-Messungen in zwei Durchgängen pro Eber ausgeführt.
Innerhalb eines Durchganges wurde jede Messung doppelt ausgeführt. Gleiche Probenansätze wurden dabei direkt aufeinander folgend gemessen. Untersucht wurden die Ejakulate von zwei Ebern.
41 Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Aus den gleichen Probenansätzen erhobene Messdateien wurden graphisch gegenübergestellt und verglichen. Die Fragestellung nach der Reproduzierbarkeit der Daten wurde visuell anhand der Graphiken beantwortet.
3.14.3 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thimerosal
Fragestellungen 1) Wird die Plasmamembranintegrität durch Thimerosal negativ beeinflusst?
2) In welcher Konzentration beeinflusst Thimerosal den intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien?
Versuchsdurchführung
Entsprechend dem Versuchsaufbau von Kapitel 3.14.1 wurde eine Konzentrations-reihe mit Thimerosal durchgeführt. Die verwendeten Konzentrationen waren: 6,0/
12,5/ 25,0/ 50,0/ 100 und 200 µM. Da Konzentrationen mit weiter Spannbreite verwendet wurden, sind vor dem Versuch zwei Stammlösungen zu 6 mM und 50 mM hergestellt worden. Lösungsmittel für den pulverförmigen Feststoff Thimerosal war DMSO. Um dem Sicherheitsdatenblatt zu entsprechen, wurden die Stammlösungen im Institut für Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt. In Vorfeld des Experimentes wurden auch die Konzentrationen 1,5 und 3,0 µM untersucht. Da Thimerosal in diesen Konzentrationen nahezu keinen Einfluss auf den intrazellulären Calciumgehalt der Spermien hatte, wurden diese Konzentrationen aus dem Versuchsaufbau ausgeschlossen. Die verwendeten Volumina Thimerosal bzw. DMSO sind in Tab.2 gelistet. Untersucht wurden die Ejakulate von drei Ebern.
42
Tab. 2: Jeder Behandlung mit Thimerosal wurde eine gleichvolumige Menge DMSO in einer Kontrolle gegenüber gestellt. Die höchste verwendete Menge Thimerosal/ DMSO entspricht 4 % Vol. des Probenansatzes. Alle
Konzentrationen > 6,0 µM wurden aus der 50 mM Stammlösung hergestellt.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Thimerosal bewirkte einen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration der plasmamembranintakten Spermien, der als Reaktion der gesamten PI-negativen Spermienpopulation erfolgte. Aufgrund der Reaktionskinetik von Thimerosal wurde keine Unterscheidung hinsichtlich des intrazellulären Calciumgehaltes durchgeführt (Abb. 2).
Abb.2: Nur die plasmamembranintakten Spermien sind dargestellt. Beispiel für die Unterschiede in der Reaktionskinetik nach Behandlung mit Thimerosal (A) und Thapsigargin (B). Die Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes verlief nach Zugabe von Thimerosal als ubiquitäre Reaktion der PI-negativen Spermien.
43
3.14.4 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin auf Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen
Fragestellungen:
1) Besteht eine Interaktion zwischen verlängerten Inkubationszeiten vor Zugabe des Inhibitors und der Plasmamembranintegrität nach Zugabe des Inhibitors?
2) Beeinflussen die Inkubationszeit und der Zusatz von Bicarbonat im Inkubationsmedium den Verlauf des intrazellulären Calciumgehaltes plasmamembranintakter Spermien nach Zugabe des Inhibitors?
Versuchsdurchführung
Die Messungen unter Zugabe von Thapsigargin bzw. DMSO wurden in zwei Durchgängen pro Eber ausgeführt. Im ersten Durchgang wurden die Spermien in HBSKontrolle sowie HBSBic inkubiert. Im zweiten Durchgang wurden HBSCa und HBSBicCa verwendet. Die Spermien wurden für 5, 30 und 60 min bei 38°C im Wärmeschrank bzw. im CO2-Inkubator inkubiert. Auf Messungen ohne Zugabe von Thapsigargin bzw. DMSO (Nullkontrollen) wurde in diesem und allen nachfolgenden Versuchen verzichtet. Untersucht wurden die Ejakulate von drei Ebern.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Die Graphiken wurden als Vergleich der Inkubationszeiten in jeweils einem Inkubationsmedium erstellt.
3.14.5 Einfluss von 100 µM Thimerosal auf Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen
Fragestellungen:
1) Besteht eine Interaktion zwischen verlängerten Inkubationszeiten vor Zugabe des Inhibitors und der Plasmamembranintegrität nach Zugabe des Inhibitors?
2) Beeinflussen die Inkubationszeit und der Zusatz von Bicarbonat im Inkubationsmedium den Verlauf des intrazellulären Calciumgehaltes plasmamembranintakter Spermien nach Zugabe des Inhibitors?
44 Versuchsdurchführung
Der Versuchsaufbau entsprach dem von Kapitel 3.14.4. Als Inhibitor wurde Thimerosal in der Konzentration 100 µM verwendet. Untersucht wurden die Ejakulate von drei Ebern.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Bei der Auswertung wurden die in Kapitel 3.14.3 charakterisierten Unterschiede der Reaktionskinetik, verglichen mit Thapsigargin, berücksichtigt.
3.14.6 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin und 100 µM Thimerosal auf den intrazellulären Calciumgehalt und die Akrosomintegrität von
Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen
Fragestellungen
1) Beeinflussen 1,25 µM Thapsigargin die Akrosomintegrität von Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen?
2) Beeinflussen 100 µM Thimerosal die Akrosomintegrität von Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen?
Versuchsdurchführung
Die Time-Gate-Messungen mit den Inhibitoren bzw. DMSO wurden in vier Durchgängen pro Eber ausgeführt. Dabei wurden in einem Durchgang alle Daten für jeweils ein HBS-Inkubationsmedium erhoben. Die Spermiensuspensionen wurden vor der Zugabe des Inhibitors für 5 min bzw. 60 min bei 38°C inkubiert. Die Zugabe von Thapsigargin, Thimerosal oder DMSO erfolgte jeweils direkt vor Beginn der Messung. Die Messungen unter Verwendung von Fluo-4 AM bzw. FITC-PNA wurden in separaten Messröhrchen durchgeführt.
Der Probenansatz für die Messungen mit FITC-PNA beinhaltete:
1980 µl HBS
10 µl FITC-PNA (600 μg/ ml)
10 µl der ohne Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension.
45
Die Zugabe von FITC-PNA erfolgte 5 min vor der Zugabe von Thapsigargin, Thimerosal oder DMSO um einen möglichen schädigenden Einfluss auf die Spermien durch längere Koinkubation zu vermeiden.
Die Messungen unter Verwendung von FITC-PNA wurden mit der Signalverstärkung für Fluo-4 AM durchgeführt (Kapitel 3.13.1). Untersucht wurden die Ejakulate von sechs Ebern.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Die unter Verwendung von FITC-PNA erhobenen Daten wurden ausschließlich an der plasmamembranintakten Spermienpopulation ausgewertet. Die Spermien waren entweder FITC-PNA-negativ und akrosomintakt oder FITC-PNA-positiv und akrosomdefekt. Die Klassierung in FITC-PNA-negative und -positive Messereignisse erfolgte in den FCS-Bilddateien der Software FlowMax 2.0 für jede Messdatei einzeln.
Die bereits zur Klassierung der PI-Populationen genutzte Region 1 (R1) wurde auf das einparametrische Histogramm der Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal gelegt. Damit wurden die Fluoreszenzsignale von FITC-PNA auf den Anfangsbereich der Messdauer selektiert. Anschließend wurde für jede Messdatei ein Kanalzahlbereich zur Trennung der Spermiensubpopulationen auf der logarithmischen Skala der Grünfluoreszenz bestimmt. Es konnte ein gemeinsamer Trennwert für alle Inkubationsmedien ermitteln werden.
Für jede Messdatei wurde die Anzahl der akrosomintakten und -defekten Spermien pro Sekunde ermittelt. Daraus wurde das prozentuale Verhältnis der Spermiensubpopulationen über die Messdauer berechnet. Letzter Schritt war die Subtraktion der FITC-PNA-positiven Spermien unter Zugabe von DMSO von denen der korrespondierenden Messungen unter Zugabe von Thapsigargin oder Thimerosal.
Die entstandene Differenz ergab den prozentualen Anteil der PI-negativen/
FITC-PNA-positiven Spermien, die auf den Einfluss von Thapsigargin bzw.
Thimerosal zurückzuführen waren.
Um den Verlauf des Anstieges der Population plasmamembranintakter Spermien mit defektem Akrosom in zeitlicher Relation zum Anstieg der plasmamembrandefekten
46
Spermien darzustellen, wurden PI-positive Spermien nach Zugabe von DMSO von dem Anteil PI-positiver Spermien nach Zugabe von Thapsigargin bzw. Thimerosal ebenfalls subtrahiert.
Spektrale Überlagerungen des Emissionsspektrums von FITC-PNA und PI wurden durch mathematische Kompensation ausgeglichen.
3.15 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung aller Daten erfolgte mittels des Programmes IBM SPSS Statistics 20. Die deskriptive Statistik umfasste die Erhebung der Mittelwerte der pro Eber. Alle im Anhang (Kapitel 9.1) dargestellten Daten sind Mittelwerte und Standardabweichungen.
47
4 Ergebnisse
4.1 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thapsigargin
Die verwendeten Proben verfügten vor Beginn der Messreihen über einen Anteil von 85,4 % (SD = 6,7) plasmamembran- sowie akrosomintakter Spermien. Nach Beendigung der Inkubationen lag dieser Anteil bei 88,5 % (SD = 4,6). Der Anteil der motilen Spermien nach Beginn der letzten Inkubation betrug 83,8 % (SD = 6,7).
4.1.1 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thapsigargin auf den prozentualen Anteil plasmamembrandefekter Spermien
Effekt von DMSO
Ohne Zugabe von DMSO blieb der Anteil der plasmamembrandefekten (PI-positiven) Spermien sowohl in HBS ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) als auch in HBS mit 2 mM Calcium (HBSCa) während der gesamten Messdauer bei ca. 15 % stabil. In
HBSKontrolle bewirkte die Zugabe von DMSO keine Zunahme der
plasma-membrandefekten Spermien. Der Anteil PI-positiver Samenzellen betrug während der gesamten Messdauer ca. 15 bis 20 %. In HBSCa war der Anteil PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO mit ca. 20 % geringfügig höher als in den Proben ohne Zusatz von DMSO (Abb. 3).
48
Abb. 3: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) ohne Zugabe von DMSO sowie nach Zugabe von DMSO. Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5,0 µM). Mittelwerte aus n = 3 Ebern.
Effekt von Thapsigargin
Thapsigargin verursachte in jeder verwendeten Konzentration (0,625/ 1,25/ 2,5/
5,0 µM) eine stetige Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation über die Messdauer. In Sekunde 1 betrug der Anteil plasmamembrandefekter Spermien in allen Proben ca. 15 bis 20%.
In HBSKontrolle setzte unter Verwendung von 0,625 und 1,25 µM Thapsigargin die Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation zwischen 130 und 140 s Messdauer ein. Unter Zusatz von 2,5 µM Thapsigargin erhöhte sich der Anteil plasmamembrandefekter Spermien nach 70 bis 80 Sekunden. 5,0 µM Thapsigargin lösten nach 50 bis 60 Sekunden die Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation aus. Nach 341 s betrugen die Anteile PI-positiver Spermien ca. 40 % (0,625 µM), ca.
50 % (1,25 µM), ca. 60 % (2,5 µM) und ca. 80% (5,0 µM) (Abb. 4 A).
In HBSCa erhöhte sich der Anteil PI-positiver Spermien bei Einsatz der gleichen Konzentrationen Thapsigargin früher als in HBSKontrolle. Nach Verwendung von
A B
49
0,625 µM Thapsigargin setzte ab ca. 100 s die Erhöhung des Anteils plasma-membrandefekter Samenzellen ein. Nach Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin bildete sich nach ca. 110 s eine stetig zunehmende Population PI-positiver Spermien. Nach Zusatz von 2,5 µM Thapsigargin erhöhte sich der Anteil plasmamembrandefekter Spermien nach ca. 70 bis 80 s. Die Zugabe von 5,0 µM Thapsigargin bewirkte nach ca. 40 bis 50 s eine Erhöhung der PI-positiven Spermienpopulation. Nach 341 s betrugen die Prozentsätze PI-positiver Spermien ca. 30 % (0,625 µM), ca. 50 % (1,25 µM), ca. 60 % (2,5 µM) und ca. 75% (5,0 µM) (Abb. 4 B). Die in HBSCa
zwischen Sekunde 320 und 341 nach Zugabe von 5,0 µM Thapsigargin aufgetretenen verringerten Werte stellen vermutlich Messartefakte dar.
Abb. 4: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) unter Verwendung von Thapsigargin (Th) in unterschiedlichen Konzentra-tionen (0,625/ 1,25/ 2,5/ 5,0 µM). Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5 µM).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern.
A B
50
4.1.2 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thapsigargin auf den intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien Es wurden nur die PI-negativen Spermien in die Auswertung einbezogen.
Die in HBSKontrolle inkubierten Spermien wiesen zu Beginn der Messung einen niedrigeren intrazellulären Calciumgehalt als die in HBSCa inkubierten Spermien auf.
Die Kurven, die nach Zugabe der gleichen Volumina DMSO und Thapsigargin entstanden, wiesen sowohl in HBSKontrolle als auch HBSCa zu Beginn der Messdauer die gleiche Fluoreszenzintensität von Fluo-4 auf. Während der ersten 30 s der Messdauer wurde in allen Kurven eine Verringerung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 sichtbar. Dies stellt ein vermutlich durch die Pumpe des Durchflusszytometers bedingtes Messartefakt dar.
Effekt von DMSO
Nach Zugabe von DMSO kam es nicht zu einem Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes (Abb. 5 und Abb. 27 im Anhang (s. Kapitel 9.1)).
Effekt von Thapsigargin
Alle verwendeten Konzentrationen Thapsigargin lösten einen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes aus. Höhere Konzentrationen von Thapsigargin führten zu höheren Anstiegen der Fluoreszenzintensität von Fluo-4. Dabei zeigten die nach Zugabe der gleichen Dosis Thapsigargin in HBSKontrolle und HBSCa
entstandenen Kurven einen jeweils ähnlichen Verlauf (Abb. 5 und Abb. 27 im Anhang (s. Kapitel 9.1)).
Nach Zugabe der geringsten Konzentration Thapsigargin (0,625 µM) kam es sowohl in HBSKontrolle als auch HBSCa im Zeitfenster von 20 bis 120 s zu einem geringfügigen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes. Ab ca. 120 s erhöhte sich die Fluoreszenzintensität von Fluo-4 deutlich. Ab ca. 190 s Messdauer war die Zunahme der Fluoreszenzintensität wieder geringer und der Anstieg der Kurve verlief flacher (Abb. 5 A).
Nach Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin stieg der intrazelluläre Calciumgehalt ab ca.
20 s stetig an. Zwischen 220 und 260 s wurden Maxima des mittleren
51
Fluoreszenzsignals von Fluo-4 pro Sekunde erreicht. In HBSKontrolle stagnierte der intrazelluläre Calciumgehalt nach Erreichen der Maxima bis zum Ende der Messdauer. In HBSCa verringerte sich die Fluoreszenzintensität von Fluo-4 geringgradig zum Ende der Messdauer (Abb. 27 A im Anhang (9.1 Graphiken und Tabellen)).
Nach Zugabe von 2,5 µM Thapsigargin stieg der intrazelluläre Calciumgehalt nach 20 bis 30 s deutlich an. Die Steilheit des Anstieges verringerte sich im Zeitfenster von 100 bis 120 s. Die Fluoreszenzintensität von Fluo-4 stagnierte danach zunächst und verringerte sich dann ab ca. 220 s über die verbleibende Messdauer. In HBSKontrolle
sank die Fluoreszenzintensität geringgradig, in HBSCa deutlicher ab. (Abb. 27 B im Anhang (s. Kapitel 9.1)).
Durch Verwendung von 5,0 µM Thapsigargin wurde die höchste Zunahme der Fluoreszenzintensität von Fluo-4 ausgelöst, wobei der Anstieg in HBSCa steiler als in HBSKontrolle verlief. Ab ca. 20 bis 30 s nach Messbeginn stieg der intrazelluläre Calciumgehalt deutlich bis ca. zum Zeitpunkt 80 s an. Zwischen ca. 80 und 160 s stagnierte das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 bei Maximalwerten. Ab 160 bis 180 s Messdauer verringerte sich das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 kontinuierlich. Die zum Ende der Messung erfassten Signalstärken waren geringfügig höher als zu Beginn der Messung (Abb. 5 B).
In den in HBSCa inkubierten Proben kam es ca. 70 s nach Zugabe von DMSO und ca. 340 s nach Zugabe von Thapsigargin zu einer kurzzeitigen Verringerung der Fluoreszenzintensität von Fluo-4. Dabei handelt es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um Messartefakte (Abb. 5 B).
52
Abb. 5: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde (a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von Thapsigargin (Th) oder DMSO. Dargestellt sind die niedrigste (0,625 µM, A) sowie die höchste (5,0 µM, B) verwendete Konzentration Thapsigargin in HBSKontrolle sowie HBSCa. Mittelwerte aus n = 3 Ebern
Quotient F/F0
Es wurden nur die PI-negativen Spermien in die Auswertung einbezogen.
Dargestellt wird das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 pro Sekunde nach Zugabe von Thapsigargin (F) dividiert durch die zugehörigen Messungen nach Zugabe von DMSO (F0): 𝐹/𝐹₀.
F/F0 betrug sowohl in HBSKontrolle als auch HBSCa in Sekunde 1 ca. 1,0. Der Einfluss von Thapsigargin auf den intrazellulären Calciumgehalt setzte erst im Verlauf der Messdauer ein. Nach Zusatz von DMSO kam es nicht zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität von Fluo-4. Die Veränderungen des Quotienten F/F0 spiegeln die in Kapitel 4.1.2 beschriebene Kinetik der Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes unter Thapsigarginwirkung wieder (Abb. 5 und Abb. 27 im Anhang (s. Kapitel 9.1)).Die kurzzeitigen Erhöhungen der Fluoreszenzintensität von Fluo-4 in HBSCa nach ca. 70 und 340 s Messdauer und die Verringerung nach ca. 340 s sind mit hoher Wahrscheinlichkeit als Messartefakte zu bewerten (Abb. 6 B).
A B
53
Abb. 6: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von Thapsigargin (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien. Dargestellt sind alle verwendeten Konzentrationen Thapsigargin (0,625/ 1,25/ 2,5 und 5,0 µM) in HBSKontrolle (A) sowie HBSCa (B). Mittelwerte aus n = 3 Ebern
4.1.3 Entstehung zweier Subpopulationen plasmamembranintakter Spermien mit unterschiedlich hohen intrazellulären Calciumgehalten
Es wurden nur die PI-negativen Spermien in die Auswertung einbezogen.
Nach Zugabe von Thapsigargin entstanden über die Messdauer zwei Spermiensubpopulationen, welche sich hinsichtlich der Fluoreszenzintensität von Fluo-4 unterschieden. Um dies in der Auswertung zu berücksichtigen, wurden die PI-negativen Spermien anhand ihres intrazellulären Calciumgehaltes klassiert. Ein beispielhaftes Histogramm der durchflusszytometrischen Messungen ist in Abb. 7 dargestellt. Nachfolgend wird die Spermiensubpopulation mit deutlich erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4 betrachtet.
A B
54
Abb. 7: Messung nach Zugabe von Thapsigargin. Dargestellt ist beispielhaft das durchflusszytometrische Histogramm der Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal, aufgetragen gegen die Messdauer. Die Markierung zeigt die im Messverlauf entstandene Spermiensubpopulation plasmamembranintakter Spermien mit deutlich erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4.
Anzahl der Messereignisse
0; 1; 2 3 4 5 6; 7 8 9 10 11; 12 13 14 15 16; 17 18 19; 20 >20
Farbe
Nach Zugabe von DMSO entstand keine Spermiensubpopulation mit deutlich erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4.
Thapsigargin bewirkte in HBS mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa) einen höheren Anteil von Spermien mit deutlich erhöhtem intrazellulärem Calciumgehalt als in HBS ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle). In Sekunde 1 betrug der prozentuale Anteil der Spermien mit deutlich erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4 bei ca. 0 % in HBSKontrolle und ca. 3 bis 5 % in HBSCa (Abb. 8 A, B).
In HBSKontrolle setzte nach Zusatz von 0,625 und 1,25 µM Thapsigargin ab ca. 130 s die Bildung der Spermiensubpopulation mit deutlich erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4 ein. Der prozentuale Anteil dieser Spermiensubpopulation stieg stetig an und stagnierte ab ca. 200 s bei 10 %. Nach Zugabe von 2,5 µM Thapsigargin entstand in HBSKontrolle ab. ca. 60 s Messdauer eine Spermiensubpopulation mit hohem intrazellulärem Calciumgehalt. Zwischen 180 und 220 s erreichte diese
Messdauer (341 s) Fluoreszenzintensität von Fluo-4 (a. u.)
55
Spermiensubpopulation einen maximalen Anteil von ca. 20 % der plasmamembran-intakten Samenzellen. Zum Ende der Messdauer verringerte sich dieser Anteil geringfügig auf ca. 15 %. Nach Zugabe von 5,0 µM Thapsigargin entstand nach ca.
40 s eine Spermiensubpopulation mit erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4.
Nach zunächst steilem Anstieg bis ca. 90 s Messdauer flachte die Kurve ab.
Zwischen 150 und 220 s Messdauer verlief die Kurve bei Maxima von ca. 25 %.
Zum Ende der Messdauer verblieben ca. 15 bis 20 % Samenzellen mit erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4 (Abb. 8 A).
Die Zugabe von Thapsigargin führte in HBSCa früher als in HBSKontrolle zur Entstehung einer Spermiensubpopulation mit deutlich erhöhtem intrazellulären Calciumgehalt.
Nach Zugabe von 0,625 µM Thapsigargin kam es in HBSCa ab ca. 130 s Messdauer zum stetigen Anstieg der Spermiensubpopulation mit erhöhtem Fluoreszenzsignal von Fluo-4. Zum Ende der Messdauer betrug der Anteil ca. 20 %. Die Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin löste die Bildung der Spermiensubpopulation ab ca. 80 s aus.
Bis ca. 250 s stieg der Anteil der Spermien mit hohem intrazellulärem Calciumgehalt auf Maxima von ca. 40 % und verringerte sich danach zum Ende der Messdauer auf ca. 30 %. Die Zugabe von 2,5 µM Thapsigargin führte in HBSCa bereits nach ca. 40 s Messdauer zur Entstehung der Spermiensubpopulation mit erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4. Die Kurve verlief mit steilem Anstieg und erreichte nach ca. 200 s Maxima von ca. 55 %. Zum Ende der Messdauer erfolgte ein geringfügiges Absinken auf ca. 50 %. Der steilste und höchste Anstieg der Spermiensubpopulation mit erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4 entstand nach Zugabe von 5,0 µM Thapsigargin in HBSCa. Der Effekt setzte ab ca. 30 s Messdauer ein. Zwischen 100 und 140 s wurden Maxima von ca. 65 % erreicht. Danach sank die Kurve ab und nach 341 s verblieben ca. 50 % der Spermien als Subpopulation mit erhöhtem intrazellulärem Calciumgehalt (Abb. 8 B).
56
Abb. 8: Prozentualer Anteil plasmamembranintakter Spermien mit hohem intra-zellulärem Calciumgehalt in HBSKontrolle (A) sowie HBSCa (B). Dargestellt jeweils alle Konzentrationen Thapsigargin. Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5 µM). Mittelwerte aus n = 3 Ebern
4.1.4 Wahl der geeigneten Wirkkonzentration Thapsigargin
Thapsigargin beeinflusste die Plasmamembranintegrität sowie den intrazellulären Calciumgehalt der Spermien in jeder verwendeten Konzentration. Da nach Zugabe von 2,5 und 5,0 µM Thapsigargin jeweils mehr als 50 % plasmamembrandefekter Spermien entstanden, wurden diese Konzentrationen für die folgenden Experimente ausgeschlossen. Aus der Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin resultierten in HBSKontrolle sowie HBSCa ca. 50 % plasmamembrandefekte Samenzellen. Die Zugabe von 0,625 µM Thapsigargin wirkte sich in HBSKontrolle bei ca. 40 % und in HBSCa bei ca. 30 % der Spermien schädigend auf die Viabilität aus. Die Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin erzeugte jedoch innerhalb der plasmamembranintakten Spermien einen deutlicheren Einfluss auf den intrazellulären Calciumgehalt sowie die Bildung der Spermiensubpopulation mit erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4. Daher wurde nachfolgend ausschließlich die Konzentration 1,25 µM verwendet.
A B
57
4.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mittels des angewandten Versuchsaufbaus
Der Versuch diente dazu, die Reproduzierbarkeit der Daten zu veranschaulichen. Die verwendeten Proben verfügten vor Beginn der Messreihen über einen Anteil von 82,6 % (SD = 3,6) plasmamembran- sowie akrosomintakter Spermien. Nach Beendigung der Inkubationen lag dieser Anteil bei 86,1 % (SD = 0,0). Der Anteil der motilen Spermien nach Beginn der letzten Inkubation betrug 87,5 % (SD = 3,1). Für die weitere Auswertung wurden die Kurven jeder Messung einzeln betrachtet und miteinander verglichen.
Plasmamembranintegrität
Die Zugabe von DMSO hatte bei keiner Messung einen Einfluss auf die Plasmamembranintegrität. Alle Kurven zeigten einen ähnlichen Verlauf (Abb. 28 B, D im Anhang (s. Kapitel 9.1)). In je vier Wiederholungsmessungen an den Ejakulaten von zwei Ebern bewirkte Thapsigargin reproduzierbar die Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation. In HBSKontrolle erhöhte sich der prozentuale Anteil
Die Zugabe von DMSO hatte bei keiner Messung einen Einfluss auf die Plasmamembranintegrität. Alle Kurven zeigten einen ähnlichen Verlauf (Abb. 28 B, D im Anhang (s. Kapitel 9.1)). In je vier Wiederholungsmessungen an den Ejakulaten von zwei Ebern bewirkte Thapsigargin reproduzierbar die Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation. In HBSKontrolle erhöhte sich der prozentuale Anteil