3.6 Tiere und Samengewinnung
Die in den Experimenten verwendeten Ejakulate stammten von neun Ebern aus dem Bestand der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Eber gehörten den Rassen Duroc, Pietrain und Deutsche Landrasse an. Das Alter der Eber betrug im Mittel 2,3 Jahre (Minimum: 1,2 Jahre, Maximum: 4,3 Jahre). Alle Tiere waren klinisch gesund. Die Samengewinnung erfolgte mittels der
„Handmethode“. Die Ejakulate wurden in einem Samenauffangbeutel (US-Bag™, Minitüb GmbH, Tiefenbach), welcher sich in einem Samenauffangbecher (Semen Collection Cup, Minitüb GmbH, Tiefenbach) befand, gesammelt. Sowohl Beutel als auch Becher waren zum Verwendungszeitpunkt auf 38°C temperiert. Nach der Samengewinnung wurde der im Auffangbeutel integrierte Gazefilter inclusive des darin enthaltenen Bulbourethraldrüsensekretes entfernt. Das verbliebene Ejakulat wurde im Samenauffangbeutel luftarm verschlossen und in einer ebenfalls auf 38°C gewärmten Styroporbox umgehend in das institutseigene Labor transportiert.
25 3.7 Standardspermatologie
Im Labor wurde das Ejakulat zügig in einen auf 38°C temperierten, sterilen Glaszylinder umgefüllt. Zunächst wurden Volumen, Farbe und Konsistenz bestimmt.
Danach erfolgte die Untersuchung von Motilität, Spermienkonzentration und Morphologie.
Zur Motilitätsschätzung wurde ein auf 38°C beheizbares Phasenkontrastmikroskop (Anxiostar Plus, Zeiss, Jena) eingesetzt (x 200, Phase 2). Die verwendeten Objektträger (76 x 26 mm, Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig), Deckgläschen (18 x 18 mm, Interessengemeinschaft der Laborfachhändler (IDL) GmbH & Co. KG, Nidderau) sowie Pipettenspitzen (nerbe plus, Winsen/ Luhe) sind auf einer Heizplatte (HT 200, Minitüb GmbH, Tiefenbach) ebenfalls auf 38°C vorgewärmt worden. Mit einer Einkanalpipette (Eppendorf, Hamburg) wurden mindestens zwei senfkorngroße Tropfen (1,5 bis 5,0 µl) nativen Ejakulates auf einen Objektträger verbracht und mit einem Deckgläschen versehen. Darin wurden jeweils mindestens drei Gesichtsfelder betrachtet. Die Gesichtsfelder sollten frei von Luftblasen sein und nicht am Rand des Präparates liegen, da Sauerstoff die Motilität beeinflussen kann. Sowohl vorwärts- als auch ortsbewegliche Spermien wurden als motil eingestuft. Das Gesichtsfeld mit dem höchsten Anteil motiler Samenzellen wurde als repräsentativ erachtet.
Die Spermienkonzentration wurde mit der Zählkammer „Thoma-neu“ (Jürgens, Hannover) im Phasenkontrastmikroskop (Anxiostar Plus, Zeiss, Jena) bestimmt (x 400, Phase 2). Die Auswertung erfolgte in Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966). Aus der Spermienkonzentration, multipliziert mit dem Ejakulatvolumen, wurde die Spermiengesamtzahl ermittelt.
Der prozentuale Anteil morphologisch abweichender Samenzellen wurde aus einer in Formolcitrat fixierten Probe durch Auszählung von 200 Spermien untersucht. Es wurden, abhängig von der Spermienkonzentration, zwischen 5 und 25 µl des nativen Ejakulates mit einer variablen Einkanalpipette in 300 µl Formolcitrat pipettiert. Die Beurteilung erfolgte in Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966) unter Ölimmersion (x 1000, Phase 3) im Phasenkontrastmikroskop (Zeiss 4713849, Zeiss, Jena). Letzter Schritt der Standardspermatologie war die Ermittlung des pH-Wertes
26
mittels pH-Meter (pH-Meter, Multiplex 3000/ pmx, WTW, Weilheim).
Alle verwendeten Ejakulate entsprachen den Gewährschaftsbestimmungen des ZDS (Version Oktober 2005). Der Anteil der als motil eingestuften Spermien durfte im nativen Ejakulat 70 % nicht unterschreiten. Die Spermienkonzentration durfte bei Ebern, die älter als neun Monate waren 0,20 x 106/ µl nicht unterschreiten. Der Anteil morphologisch abweichender Samenzellen durfte 25% nicht überschreiten.
3.8 Samenverdünnung
Alle Versuche mit Thapsigargin und Thimerosal wurden mit einem am Versuchstag frisch hergestellten modifizierten BTS-Medium durchgeführt. Dieser Verdünner enthielt weder EDTA noch Bicarbonat. Dadurch sollte die Beeinflussung von intrazellulärem Calciumgehalt und Kapazitationsverhalten vermieden werden. Der pH-Wert wurde auf 7,4 bei 32°C und die Osmolarität auf 295 bis 305 mOsmol/ kg eingestellt.
Alle verwendeten Ejakulate wurden auf die Spermienkonzentration 20 x 106 verdünnt.
Das Verdünnermedium war zum Verwendungszeitpunkt 32°C warm. In 38°C warmen Ebersamenflaschen (Minitüb GmbH, Tiefenbach) wurden Portionen von je 100 ml Spermiensuspension hergestellt. Das Verdünnen erfolgte durch Vorlegen der benötigten Ejakulatmenge mittels einer auf 38°C temperierten Glaspipette.
Anschließend wurde schrittweise und zügig der Verdünner zugefügt. Durch vorsichtiges Schwenken wurden Ejakulat und Verdünnermedium vermischt. Die Spermiensuspension wurde luftarm verschlossen und stehend für mindestens 90 min bei Raumtemperatur gelagert. Dieses Temperaturregime stellt in der Reproduktions-medizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover die Standardmethodik im Umgang mit Eberspermien dar (SCHMID et al. 2013).
3.9 Beladen der Spermien mit Fluo-4 AM und Dichtegradientenzentrifugation
Die Verwendung von Fluo-4 AM erfolgte stets unter vor Licht geschützten
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Verhältnissen. Für die Beladung der Samenzellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff wurden 3,5 ml Reagenzröhrchen mit passenden Eindrückstopfen (Sarstedt, Nürnbrecht) verwendet. Fluo-4 AM lag in DMSO gelöst als 2 mM Stammlösung vor.
Für alle Versuche unter Verwendung von Thapsigargin oder Thimerosal wurden die Spermiensuspensionen jeweils mit der Konzentration 2 µM Fluo-4 AM beladen. Dem verdünnten Ejakulat wurde eine Menge von 20 ml entnommen und zu je 2 ml auf zehn 3,5 ml Reagenzröhrchen verteilt. Fünf dieser Röhrchen wurden jeweils 2 µl Fluo-4 AM-Stammlösung zugefügt. Die Spermiensuspension in den übrigen fünf Reagenzröhrchen blieb ungefärbt. Die Reagenzröhrchen wurden verschlossen für 30 min bei Raumtemperatur präinkubiert. Nach der Hälfte der Inkubationszeit wurden die Spermiensuspensionen vorsichtig aufgeschwenkt. Die Beladung der Spermien mit Fluo-4 AM erfolgte in Anlehnung an die Methodik von HARRISON et al. (1993).
Nach Ablauf der 30-minütigen Präinkubation wurden die Spermiensuspensionen durch einen diskontinuierlichen Percoll®-Gradienten zentrifugiert. Zu diesem Zweck wurden in einem Reagenzglasständer 4 gläserne 12 ml Zentrifugenröhrchen mit Spitzboden vorbereitet. Jedes Röhrchen wurde zunächst mit 1 ml einer 70%-igen Percoll®-Gebrauchslösung befüllt. Darüber wurden vorsichtig je 2 ml einer 35%-igen Percoll®-Gebrauchslösung geschichtet. Eine deutliche Phasengrenze zwischen den Konzentrationen musste erkennbar sein. Die Percoll®-Gebrauchslösungen wurden bei Raumtemperatur verwendet.
Die ohne bzw. mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspensionen wurden separat zu jeweils 2 x 5 ml auf das vorgelegte Percoll® geschichtet. Dabei wurde ebenfalls auf die Entstehung einer deutlichen Phasengrenze geachtet.
Im nächsten Schritt erfolgte die Zentrifugation der Spermien durch den Percoll® -Gradienten (Megafuge 2.0 R, Hareaus, Hanau). Nach 10 min bei 300 gmax wurde die Zentrifuge ohne Anhalten auf 15 min bei 750 gmax umgestellt. In der Zentrifuge bestand ebenfalls Raumtemperatur. Nach abgeschlossener Zentrifugation wurde mittels einer Wasserstrahlpumpe der Überstand bis auf ca. 0,5 ml entfernt. Die verbliebenen Spermienpellets wurden mit dem auf 32°C gehaltenen BTS erneut auf 20 x 106/ ml eingestellt. Dabei wurden je zwei Spermiensuspensionen á 2 ml ohne bzw. mit Fluo-4 AM hergestellt. Diese wurden in verschlossenen 3,5 ml
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Reagenzröhrchen aufbewahrt. Ein Röhrchen diente als Ersatz bzw. zur Erhebung der Motilitäts- und Bewegungsparameter (s. Kapitel 3.10).
3.10 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)
Die Motilität der verwendeten Spermien wurde bei allen Experimenten mit Thapsigargin und Thimerosal mittels SpermVision® (Minitüb GmbH, Tiefenbach) erfasst.
Es handelt sich bei diesem System um eine computergestützte Motilitätsanalyse.
Zum System gehörten ein Mikroskop (Okular 10, Objektiv 20, BX41TF, Olympus, Hamburg), ein TV-Adapter (U-TV 0.63XC; Olympus, Hamburg), eine Digitalkamera (AccuPiXEL TM6760 CL, Auflösung 600 x 800 Pixel, JAI A/S, Glostrup, Dänemark), eine Heizplatte (HT 300, Minitüb GmbH, Tiefenbach) und ein Computer mit der Software SpermVision® (Version 3.7, Minitüb GmbH, Tiefenbach).
Das Mikroskop war mit einem automatisch fahrendem Kreuztisch und einem beheizbaren Objekttisch ausgestattet. Die Heizung des Objekttisches wurde von der beheizbaren Arbeitsplatte gesteuert. Der TV-Adapter verband das Mikroskop mit der Digitalkamera. Der Computer verarbeitete die Aufnahmen der Digitalkamera. Die Motilitäts- sowie Bewegungsparameter der Spermien wurden im negativen Phasenkontrast untersucht. Für jede Messung wurden 2,9 µl Spermiensuspension in eine Leja-Messkammer mit 20 μm Schichtdicke (SC 20-01-04-B, Leja Products B.V., Nieuw-Vennep, The Netherlands) pipettiert. Pro Messdurchgang wurden mindestens 400 Spermien oder 10 Messfelder erfasst. Das Ansteuern der Messfelder wurde automatisiert durch den fahrbaren Kreuztisch vorgenommen. Partikel mit einer Fläche zwischen 23 und 120 µm2 wurden als potentielle Spermien angesprochen.
Die genauen Messpositionen sind im Anhang (s. Kapitel 9.4) dargestellt. Für jede Messposition wurden aus 30 Einzelbildern die Motilitäts- und Bewegungsparameter der dort vorhandenen Spermien erfasst.
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zurückgelegte Wegstrecken [μm]:
DSL = straight-line distance DCL = curvelinear distance DAP = average path distance
Geschwindigkeiten [μm/s]:
VSL = straight-line velocity VCL = curvilinear velocity VAP =average path velocity
gemittelte maximale seitliche Kopfauslenkung von der mittleren Bahn [μm] : ALH = amplitude of lateral headdisplacement
Frequenz des Kreuzens des gewundenen Bewegungspfades mit der gemittelten Bewegungsbahn [Hz] :
BCF = beat cross frequency
Gerichtetheit der Bewegung:
WOB = VAP / VCL = wobble STR = VSL / VAP = straightness LIN = VSL / VCL = linearity
durchschnittlicher Richtungswechsel des Spermienkopfes:
AOC = average orientation change
Spermien mit einem AOC < 2,5 wurden als immotil eingestuft. Spermien mit einer DSL < 4,5 galten als lokal motil.
Alle Spermien, die nicht durch diese Klassifikation erfasst wurden, galten als progressiv motil. Das SpermVision®-System ermittelte für jede Messung den Prozent-satz der als motil und progressiv motil eingeordneten Spermien. Die Bewegungs-parameter wurden als Mittelwerte für die progressiv motilen Spermien ausgewiesen.
30
Jeweils nach Beginn der letzten Inkubation eines Messdurchgangs wurden ca. 2 ml der ohne Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspensionen in ein Reagenzröhrchen aus Glas überführt. Die Spermiensuspensionen wurden für 5 min in einem auf 38°C temperiertem Wasserbad (WNB 745, Memmert, Schwabach) inkubiert. Im Anschluss wurden die Röhrchen mit vorgewärmtem (38°C) Parafilm (Landgraf Laborsysteme, Langenhagen) verschlossen und vorsichtig 3 x über Kopf geschwenkt. Es wurden 2,9 µl entnommen und in eine vorgewärmte (38°C) Leja-Kammer pipettiert. Beim Pipettieren wurde darauf geachtet, dass ein hängender Tropfen der Spermiensuspension in die Kammer angesaugt wurde und dabei keine Luftblasen entstanden. Nicht vorschriftsmäßig befüllte Felder sowie Felder mit Luftblasen wurden verworfen.
3.11 Durchflusszytometer
Für alle nachfolgend beschriebenen durchflusszytometrischen Erhebungen wurde mit dem Durchflusszytometer „Dako Galaxy“ (Fa. Dako, Hamburg) gearbeitet.
Das Gerät enthält einen Argonlaser (488 nm, 20 mW), und verschiedene Filter. Für grünes Fluoreszenzlicht wird der Filter FL-1 (537,5/ 22,5 nm) verwendet, für rotes Fluoreszenzlicht der FL-3 (630 nm LP) und für blaues Fluoreszenzlicht der FL-4 (465 nm BP). Die zweite Anregungslichtquelle ist eine HBO Quecksilberlampe (300 bis 400 nm, 100 W). Im Strahlengang der Quecksilberlampe befinden sich zwei weitere Filter zur Selektion auf das Anregungsspektrum der Quecksilberlampe. Der erste selektiert auf Wellenlängen von 300 bis 700 nm. Der zweite Filter lässt nur Licht der Wellenlänge zwischen 270 nm und 405 nm passieren. Damit ergibt sich ein Hauptemissionspeak von 365 nm. Die dem Durchflusszytometer zugehörige Software ist FloMax 2.4 (Fa. Partec, Münster).
Als sheath fluid wurde HEPES®-buffered Saline verwendet. Diese HEPES®-buffered saline wurde am Versuchstag frisch hergestellt. Die Osmolarität wurde auf 295 bis 305 mOsmol/ kg eingestellt. Der pH-Wert betrug 7,55 bei Raumtemperatur bzw. 7,40 bei der Gebrauchstemperatur von 38°C. Die Sterilfiltration erfolgte mittels einer Filtriereinheit (PES-Membran; 0,22 µm Porendurchmesser, Millipore; Irland). Die
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sheath fluid wurde während des Versuchs auf 38°C gehalten und durch regelmäßiges Schwenken des Kanisters durchmengt.
Vor der Erhebung der eigentlichen Messdaten musste grundsätzlich die Signalverstärkung für die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe festgelegt werden.
Diese Einstellungen wurden gespeichert und dienten als einheitliche Basis für die folgenden Messungen.
Es wurden zwei Grundeinstellungen festgelegt. Erst wurden die Signalverstärkungen für die Erhebung des Membranstatus (s. Kapitel 3.12) festgelegt, anschließend für die Time-gate-Messungen mit den Inhibitoren (s. Kapitel 3.13). Das Volumen aller Probenansätze wurde auf 2 ml reguliert um eine Divergenz zwischen der Messung des Membranstatus und den Time-Gate-Messungen zu vermeiden. Alle Probenansätze wurden für 5 min bei 38°C im Wärmeschrank inkubiert. Das Vorgehen zur Grundeinstellung des Durchflusszytometers wurde für alle nachfolgend beschriebenen Experimente (s. Kapitel 3.14) angewandt.
3.12 Erhebung des Membranstatus
3.12.1 Grundeinstellungen
Die Signalverstärkungen für alle Parameter wurden an diesem Probenansatz festgelegt:
1960 µl HBSKontrolle
10 µl Hoechst 33342-Stammlösung (150 µg/ ml) 10 µl PI-Stammlösung (1,0 mg/ ml) 10 µl FITC-PNA- Stammlösung (600 µg/ ml) 10 µl ungefärbte Spermiensuspension.
Es wurden die Signalverstärkungen für die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC), Seitwärtsstreuung (SSC) sowie die Signalverstärkungen für die Blaufluoreszenz im FL-4-Kanal, für die Rotfluoreszenz im FL-3-Kanal und die Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal eingestellt.
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Im Histogramm zur Darstellung des FSC wurde eine glockenförmige Verteilung der Messereignisse angestrebt. Signale von Schmutzpartikeln wurden links der Messereignisse dargestellt und durch die Justierung der Signalverstärkung aus dem Histogramm entfernt. In einem zweiten Histogramm wurden FSC (Abszisse) sowie SSC (Ordinate) gegeneinander aufgetragen. Spermien stellten sich in diesem Punktewolkendiagramm in einer „L“- oder Dreiecksform dar. Im FL-4-Kanal wurde das Signal in den Bereich der zweiten und dritten Dekade der logarithmischen Skala verstärkt.
Die Signalverstärkung für die Rotfluoreszenz im FL-3-Kanal musste eine klare Differenzierung zwischen den mit PI angefärbten und den nicht angefärbten
Spermien gewährleisten. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der PI-negativen Spermien wurde dazu mittig um den Wert 1 auf der logarithmischen
Abszisse verschoben. Die PI-positive Spermienpopulation wies eine mindestens zehnfache Fluoreszenzintensität auf.
Bei der Signalverstärkung für die Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal musste ebenfalls eine klare Differenzierung zwischen den mit FITC-PNA angefärbten und den nicht angefärbten Spermien gewährleistet sein. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der FITC-PNA-negativen Spermien wurde dazu mittig um den Wert 1 auf der logarithmischen Abszisse verschoben. Die FITC-PNA-positive Spermiensub-population wies eine mindestens zehnfache Fluoreszenzintensität auf.
3.12.2 Durchführung der Messungen
Vor Beginn und nach Beendigung der Inkubationsreihen wurde für jedes verwendete Ejakulat der Membranstatus festgestellt. Dazu dienten die ohne Fluo-4 AM präinkubierten Spermien. Der Probenansatz beinhaltete:
1960 µl HBSKontrolle
10 µl Hoechst 33342-Stammlösung (150 µg/ ml) 10 µl PI-Stammlösung (1,0 mg/ ml) 10 µl FITC-PNA- Stammlösung (600 µg/ ml) 10 µl Spermiensuspension.
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Pro Messung wurden 10000 Zellen erfasst. Die gerätespezifische Geschwindigkeit war 2. Das Vorgehen zur Erhebung des Membranstatus wurde für alle nachfolgend beschriebenen Experimente angewandt. In Versuchen, die in mehreren Durchgängen (Kapitel 3.13.2) ausgeführt wurden, ist der Membranstatus jeder verwendeten Spermiensuspension erhoben worden.
3.12.3 Auswertung
Das im Folgenden beschriebene Vorgehen zur Auswertung des Membranstatus wurde bei allen Versuchen angewandt.
Die erste Range (RN1) definierte die DNA-haltigen Messereignisse im FL-4-Kanal.
Die zweite Range (RN2) wurde im FSC-Kanal im Bereich 0 bis 150 auf der linearen Abszisse gesetzt. Dadurch wurde eine Eingrenzung auf Messereignisse, die der Größe von Eberspermien entsprachen, vollzogen. Aus den Ranges wurde das logische Gate G1 (RN1 + RN2 = G1) gebildet. G1 wurde auf alle Histogramme gelegt.
Nachfolgend wurden nur noch Spermien betrachtet, die G1 entsprachen. Anhand des FL-1/ FL-3-Punktewolken-histogramms wurde eine mögliche Überlagerung des Emissionsspektrums von FITC-PNA und PI durch mathematische Kompensation ausgeglichen.
Weiterhin wurde im Punktewolkendiagramm eine Trennung der FITC-PNA- bzw.
PI-negativen und -positiven Spermien vollzogen. In den entstandenen Quadranten konnten die prozentualen Anteile folgender Subpopulationen abgelesen werden:
Q1: PI-positiv & FITC-PNA-negativ Q2: PI-positiv & FITC-PNA-positiv Q3: PI-negativ & FITC-PNA-negativ Q4: PI-negativ & FITC-PNA-positiv.
34 3.13 Time-gate Messungen
3.13.1 Grundeinstellungen
Die Signalverstärkungen für alle Parameter wurden an diesen Probenansätzen festgelegt:
1) 1990 µl HBSKontrolle inclusive Propidiumiodid (5 µl PI-Stammlösung
(1 mg/ ml)/ ml), 10 µl der mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension
2) 1985 µl HBSCa inclusive Propidiumiodid (5 µl PI-Stammlösung (1 mg/ ml)/ ml) , 5 µl des Calciumionophors A23187,
10 µl der mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension
Mit dem Probenansatz 1) wurden die Signalverstärkungen für die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC), Seitwärtsstreuung (SSC), Rotfluoreszenz im FL-3-Kanal und Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal festgelegt. Das Vorgehen zur Einstellung der Parameter FSC, SSC und Rotfluoreszenz entsprach dem in Kapitel 3.12.1 beschriebenen (s. oben). Auf den Einsatz von Hoechst 33342 wurde verzichtet, da die Zellen mittels der Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Percoll® -Gradienten von Seminalplasmabestandteilen und Schmutzpartikeln gereinigt waren.
Mit dem Probenansatz 2) wurde die erfolgreiche Beladung der Spermien mit Fluo-4 AM kontrolliert. A23187 ist ein Ionophor für divalente Kationen. Im Versuch diente es der Permeabilisierung der Plasmamembran für Calciumionen aus dem extrazellulären Inkubationsmedium. Unter dem Einfluss des Ionophors und der Calciumionen in HBSCa musste im FL-1-Kanal eine Erhöhung der Signalintensität in den Bereich der dritten Dekade auf der logarithmischen Abszisse zu sehen sein.
35 3.13.2 Durchführung der Messungen
Für jeden Messdurchgang wurde ein Aliquot des verdünnten Ejakulates ohne Zusatz eines Fluoreszenzfarbstoffes oder mit Fluo-4 AM präinkubiert, über einen diskontinuierlichen Percoll®-Gradienten zentrifugiert und erneut verdünnt.
Komplexere, zeitlich aufwändigere Experimente wurden in mehreren Versuchsdurchgängen ausgeführt, um eine mögliche Beeinträchtigung der Spermien durch zu lange Verwendungszeiten zu vermeiden. D. h. es wurden mehrfach Aliquots des verdünnten Samens mit und ohne Fluo-4 AM präinkubiert und durch den Percoll®-Gradienten zentrifugiert.
Als Messdurchgang werden nachfolgend Versuchseinheiten beschrieben, die an demselben Aliquot einer Spermiensusupension nach Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wurden. Vom Beginn der ersten Messung eines Durchganges bis zur Inkubation des letzten Probenansatzes vergingen inclusive Grundeinstellung des Durchflusszytometers maximal 1,5 h. Alle Schritte wurden in 3,5 ml Reagenzröhrchen ausgeführt. Dabei waren die Proben vor Licht geschützt. Die Spermienkonzentration im Reagenzröhrchen betrug 1 x 105 ml. Alle Proben wurden bei 38°C inkubiert. Die in den Medien ohne Zusatz von Bicarbonat inkubierten Proben befanden sich verschlossen im Wärmeschrank, die in den Medien mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat inkubierten Proben befanden sich unverschlossen im CO2 -Inkubator. Vor und nach jedem Messdurchgang wurde die Qualität der verwendeten Spermiensuspensionen anhand des Membranstatus (s. Kapitel 3.12) beurteilt. Nach der letzten Inkubation wurden zusätzlich die Motilitäts- und Bewegungsparameter mittels CASA (s. Kapitel 3.10) erhoben.
Die Fluoreszenzintensitäten im FL-1-(Fluo-4) bzw. FL-3-Kanal (PI) wurden in ein- und zweiparametrischen Histogrammen erfasst. Die zweiparametrische Darstellung umfasste das jeweilige Fluoreszenzsignal auf der logarithmischen Ordinate sowie die Zeit auf der linearen Abszisse. Die Messdauer wurde in 256 Zeitkanälen dargestellt.
Für die spätere Auswertung der Daten mit der Software IBM SPSS Statistics 20 wurden die Messdateien mit einer Auflösung von 4096 Kanälen (Faktor 16) exportiert.
Diese Kanalnummern wurden für die Darstellung der Ergebnisse in Sekunden
36
umgewandelt. Daher wurde eine Messdauer ermittelt, bei der eine jeweils ganzzahlige Anzahl von Kanälen einer Sekunde entspricht. Dies ist annähernd der Fall bei einer Messdauer von 341 s (4096 Kanäle/ 341 s = 12,011 Kanäle/ s). Die gerätespezifische Geschwindigkeit lag bei 2.
3.13.3 Auswertung
Das nachfolgend beschriebene Vorgehen zur Auswertung der Time-Gate-Messungen wurde für alle Versuche mit Thapsigargin und Thimerosal angewandt.
Die erste Range (RN1) definierte im FSC-Kanal im Bereich 0 bis 150 der linearen Abszisse Messereignisse mit der Größe von Eberspermien. Anschließend wurde
eine Region (R1) im zweiparametrischen Histogramm von Zeit und PI-Fluoreszenzintensität erstellt. R1 beinhaltete alle im Bereich der ersten 50 Zeitkanäle detektierten Ereignisse. R1 wurde auf das einparametrische
Histogramm der Fluoreszenzintensität von PI gelegt. Anhand der Spermien, die R1 entsprachen, wurde die Differenzierung in PI-negative und PI-positive Ereignisse vollzogen. Zwei weitere Ranges (RN2 und RN3) wurden im einparametrischen Histogramm der Fluoreszenzintensität von PI gesetzt. RN2 begrenzte die PI-negative Population, RN3 die PI-positive Population.
Zwei logische Gates (G1 und G2) wurden erstellt. G1 bestand aus RN1 und der
PI-negativen Population (G1 = RN1 + RN2). G2 bestand aus RN1 und der PI-positiven Population (G2 = RN1 + RN3). Beide Gates wurden gespeichert und für
alle folgenden Versuche mit Thapsigargin und Thimerosal verwendet.
Im nächsten Schritt wurden die Messdateien vom Typ FCS in zwei Dateien des Typs FCS-A aufgeteilt. Dazu wurden G1 und G2 in jeder FCS-Datei separat auf alle Histogramme gelegt. Die nach plasmamembranintakten und -defekten Spermien-populationen separierten Dateien wurden im FCS-A-Format gespeichert.
Anschließend wurden die FCS-A-Dateien mit der Kanalzahl 4096 (Faktor 16) in das txt-Format exportiert. Der Export ermöglichte die weitere Bearbeitung der Messdaten als sav-Datei mittels der Software IBM SPSS Statistics 20. In den sav-Dateien wurden die Parameter FSC, SSC, FL1, FL3 sowie Time als Zahlenwerte für die
37 einzelnen Messereignisse angegeben.
Erster Bearbeitungsschritt war für alle Dateien die Klassierung des Parameters
„Time“. Es wurden 12 Zeitkanäle zu je einer Sekunde klassiert, d. h. zusammen-gefasst. Zweiter Schritt war die Berechnung des prozentualen Verhältnisses von plasmamembranintakten bzw. -defekten Spermien über die Messdauer. Dazu wurde die Anzahl PI-negativer und PI-positiver Messereignisse pro Sekunde berechnet und in einer neuen sav-Datei zusammengeführt. Für alle weiteren Auswertungsschritte wurden nur noch plasmamembranintakte Spermien betrachtet.
Dritter Schritt war die Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde, basierend auf den pro Sekunde detektierten Messereignissen. Anhand dieser Berechnungen wurde der Quotient der mittleren Fluoreszenzintensität unter Zugabe des Inhibitors und der korrespondierenden Kontrollmessungen mit DMSO (F/F0) ermittelt.
Die Reaktionskinetik von Thapsigargin erforderte einen weiteren Auswertungsschritt:
Thapsigargin verursachte im Verlauf der Messung die Bildung zweier Subpopulationen plasmamembranintakter Spermien mit unterschiedlichen intrazellulären Calciumgehalten (Abb. 1). Daher wurde die gesamte PI-negative Population hinsichtlich ihres intrazellulären Calciumgehaltes in zwei Subpopulationen klassiert. Da der intrazelluläre Calciumgehalt nach Inkubation in HBSKontrolle niedriger als nach Inkubation in HBSCa war, erfolgte die Klassierung für die beiden Inkubationsmedien separat (Abb.1).
Anhand der FCS-Dateien wurde eine Kanalzahl ermittelt, die auf der Skala des Fluoreszenzsignals von Fluo-4 zwischen den Subpopulationen lag. Entsprechend dieser Kanalzahl wurden die Messereignisse klassiert. Aus der Anzahl der klassierten Messereignisse pro Sekunde wurde das prozentuale Verhältnis der Spermien-subpopulationen mit hohem bzw. niedrigem intrazellulären Calciumgehalt berechnet.
Spektrale Überlagerungen des Emissionsspektrums von Fluo-4 und PI wurden durch
Spektrale Überlagerungen des Emissionsspektrums von Fluo-4 und PI wurden durch