3.12 Erhebung des Membranstatus
3.12.3 Auswertung
Das im Folgenden beschriebene Vorgehen zur Auswertung des Membranstatus wurde bei allen Versuchen angewandt.
Die erste Range (RN1) definierte die DNA-haltigen Messereignisse im FL-4-Kanal.
Die zweite Range (RN2) wurde im FSC-Kanal im Bereich 0 bis 150 auf der linearen Abszisse gesetzt. Dadurch wurde eine Eingrenzung auf Messereignisse, die der Größe von Eberspermien entsprachen, vollzogen. Aus den Ranges wurde das logische Gate G1 (RN1 + RN2 = G1) gebildet. G1 wurde auf alle Histogramme gelegt.
Nachfolgend wurden nur noch Spermien betrachtet, die G1 entsprachen. Anhand des FL-1/ FL-3-Punktewolken-histogramms wurde eine mögliche Überlagerung des Emissionsspektrums von FITC-PNA und PI durch mathematische Kompensation ausgeglichen.
Weiterhin wurde im Punktewolkendiagramm eine Trennung der FITC-PNA- bzw.
PI-negativen und -positiven Spermien vollzogen. In den entstandenen Quadranten konnten die prozentualen Anteile folgender Subpopulationen abgelesen werden:
Q1: PI-positiv & FITC-PNA-negativ Q2: PI-positiv & FITC-PNA-positiv Q3: PI-negativ & FITC-PNA-negativ Q4: PI-negativ & FITC-PNA-positiv.
34 3.13 Time-gate Messungen
3.13.1 Grundeinstellungen
Die Signalverstärkungen für alle Parameter wurden an diesen Probenansätzen festgelegt:
1) 1990 µl HBSKontrolle inclusive Propidiumiodid (5 µl PI-Stammlösung
(1 mg/ ml)/ ml), 10 µl der mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension
2) 1985 µl HBSCa inclusive Propidiumiodid (5 µl PI-Stammlösung (1 mg/ ml)/ ml) , 5 µl des Calciumionophors A23187,
10 µl der mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension
Mit dem Probenansatz 1) wurden die Signalverstärkungen für die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC), Seitwärtsstreuung (SSC), Rotfluoreszenz im FL-3-Kanal und Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal festgelegt. Das Vorgehen zur Einstellung der Parameter FSC, SSC und Rotfluoreszenz entsprach dem in Kapitel 3.12.1 beschriebenen (s. oben). Auf den Einsatz von Hoechst 33342 wurde verzichtet, da die Zellen mittels der Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Percoll® -Gradienten von Seminalplasmabestandteilen und Schmutzpartikeln gereinigt waren.
Mit dem Probenansatz 2) wurde die erfolgreiche Beladung der Spermien mit Fluo-4 AM kontrolliert. A23187 ist ein Ionophor für divalente Kationen. Im Versuch diente es der Permeabilisierung der Plasmamembran für Calciumionen aus dem extrazellulären Inkubationsmedium. Unter dem Einfluss des Ionophors und der Calciumionen in HBSCa musste im FL-1-Kanal eine Erhöhung der Signalintensität in den Bereich der dritten Dekade auf der logarithmischen Abszisse zu sehen sein.
35 3.13.2 Durchführung der Messungen
Für jeden Messdurchgang wurde ein Aliquot des verdünnten Ejakulates ohne Zusatz eines Fluoreszenzfarbstoffes oder mit Fluo-4 AM präinkubiert, über einen diskontinuierlichen Percoll®-Gradienten zentrifugiert und erneut verdünnt.
Komplexere, zeitlich aufwändigere Experimente wurden in mehreren Versuchsdurchgängen ausgeführt, um eine mögliche Beeinträchtigung der Spermien durch zu lange Verwendungszeiten zu vermeiden. D. h. es wurden mehrfach Aliquots des verdünnten Samens mit und ohne Fluo-4 AM präinkubiert und durch den Percoll®-Gradienten zentrifugiert.
Als Messdurchgang werden nachfolgend Versuchseinheiten beschrieben, die an demselben Aliquot einer Spermiensusupension nach Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wurden. Vom Beginn der ersten Messung eines Durchganges bis zur Inkubation des letzten Probenansatzes vergingen inclusive Grundeinstellung des Durchflusszytometers maximal 1,5 h. Alle Schritte wurden in 3,5 ml Reagenzröhrchen ausgeführt. Dabei waren die Proben vor Licht geschützt. Die Spermienkonzentration im Reagenzröhrchen betrug 1 x 105 ml. Alle Proben wurden bei 38°C inkubiert. Die in den Medien ohne Zusatz von Bicarbonat inkubierten Proben befanden sich verschlossen im Wärmeschrank, die in den Medien mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat inkubierten Proben befanden sich unverschlossen im CO2 -Inkubator. Vor und nach jedem Messdurchgang wurde die Qualität der verwendeten Spermiensuspensionen anhand des Membranstatus (s. Kapitel 3.12) beurteilt. Nach der letzten Inkubation wurden zusätzlich die Motilitäts- und Bewegungsparameter mittels CASA (s. Kapitel 3.10) erhoben.
Die Fluoreszenzintensitäten im FL-1-(Fluo-4) bzw. FL-3-Kanal (PI) wurden in ein- und zweiparametrischen Histogrammen erfasst. Die zweiparametrische Darstellung umfasste das jeweilige Fluoreszenzsignal auf der logarithmischen Ordinate sowie die Zeit auf der linearen Abszisse. Die Messdauer wurde in 256 Zeitkanälen dargestellt.
Für die spätere Auswertung der Daten mit der Software IBM SPSS Statistics 20 wurden die Messdateien mit einer Auflösung von 4096 Kanälen (Faktor 16) exportiert.
Diese Kanalnummern wurden für die Darstellung der Ergebnisse in Sekunden
36
umgewandelt. Daher wurde eine Messdauer ermittelt, bei der eine jeweils ganzzahlige Anzahl von Kanälen einer Sekunde entspricht. Dies ist annähernd der Fall bei einer Messdauer von 341 s (4096 Kanäle/ 341 s = 12,011 Kanäle/ s). Die gerätespezifische Geschwindigkeit lag bei 2.
3.13.3 Auswertung
Das nachfolgend beschriebene Vorgehen zur Auswertung der Time-Gate-Messungen wurde für alle Versuche mit Thapsigargin und Thimerosal angewandt.
Die erste Range (RN1) definierte im FSC-Kanal im Bereich 0 bis 150 der linearen Abszisse Messereignisse mit der Größe von Eberspermien. Anschließend wurde
eine Region (R1) im zweiparametrischen Histogramm von Zeit und PI-Fluoreszenzintensität erstellt. R1 beinhaltete alle im Bereich der ersten 50 Zeitkanäle detektierten Ereignisse. R1 wurde auf das einparametrische
Histogramm der Fluoreszenzintensität von PI gelegt. Anhand der Spermien, die R1 entsprachen, wurde die Differenzierung in PI-negative und PI-positive Ereignisse vollzogen. Zwei weitere Ranges (RN2 und RN3) wurden im einparametrischen Histogramm der Fluoreszenzintensität von PI gesetzt. RN2 begrenzte die PI-negative Population, RN3 die PI-positive Population.
Zwei logische Gates (G1 und G2) wurden erstellt. G1 bestand aus RN1 und der
PI-negativen Population (G1 = RN1 + RN2). G2 bestand aus RN1 und der PI-positiven Population (G2 = RN1 + RN3). Beide Gates wurden gespeichert und für
alle folgenden Versuche mit Thapsigargin und Thimerosal verwendet.
Im nächsten Schritt wurden die Messdateien vom Typ FCS in zwei Dateien des Typs FCS-A aufgeteilt. Dazu wurden G1 und G2 in jeder FCS-Datei separat auf alle Histogramme gelegt. Die nach plasmamembranintakten und -defekten Spermien-populationen separierten Dateien wurden im FCS-A-Format gespeichert.
Anschließend wurden die FCS-A-Dateien mit der Kanalzahl 4096 (Faktor 16) in das txt-Format exportiert. Der Export ermöglichte die weitere Bearbeitung der Messdaten als sav-Datei mittels der Software IBM SPSS Statistics 20. In den sav-Dateien wurden die Parameter FSC, SSC, FL1, FL3 sowie Time als Zahlenwerte für die
37 einzelnen Messereignisse angegeben.
Erster Bearbeitungsschritt war für alle Dateien die Klassierung des Parameters
„Time“. Es wurden 12 Zeitkanäle zu je einer Sekunde klassiert, d. h. zusammen-gefasst. Zweiter Schritt war die Berechnung des prozentualen Verhältnisses von plasmamembranintakten bzw. -defekten Spermien über die Messdauer. Dazu wurde die Anzahl PI-negativer und PI-positiver Messereignisse pro Sekunde berechnet und in einer neuen sav-Datei zusammengeführt. Für alle weiteren Auswertungsschritte wurden nur noch plasmamembranintakte Spermien betrachtet.
Dritter Schritt war die Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde, basierend auf den pro Sekunde detektierten Messereignissen. Anhand dieser Berechnungen wurde der Quotient der mittleren Fluoreszenzintensität unter Zugabe des Inhibitors und der korrespondierenden Kontrollmessungen mit DMSO (F/F0) ermittelt.
Die Reaktionskinetik von Thapsigargin erforderte einen weiteren Auswertungsschritt:
Thapsigargin verursachte im Verlauf der Messung die Bildung zweier Subpopulationen plasmamembranintakter Spermien mit unterschiedlichen intrazellulären Calciumgehalten (Abb. 1). Daher wurde die gesamte PI-negative Population hinsichtlich ihres intrazellulären Calciumgehaltes in zwei Subpopulationen klassiert. Da der intrazelluläre Calciumgehalt nach Inkubation in HBSKontrolle niedriger als nach Inkubation in HBSCa war, erfolgte die Klassierung für die beiden Inkubationsmedien separat (Abb.1).
Anhand der FCS-Dateien wurde eine Kanalzahl ermittelt, die auf der Skala des Fluoreszenzsignals von Fluo-4 zwischen den Subpopulationen lag. Entsprechend dieser Kanalzahl wurden die Messereignisse klassiert. Aus der Anzahl der klassierten Messereignisse pro Sekunde wurde das prozentuale Verhältnis der Spermien-subpopulationen mit hohem bzw. niedrigem intrazellulären Calciumgehalt berechnet.
Spektrale Überlagerungen des Emissionsspektrums von Fluo-4 und PI wurden durch mathematische Kompensation ausgeglichen.
38
Abb. 1: Nur plasmamembranintakte Spermien sind dargestellt. Unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 unter Zugabe von DMSO (A, B) und Thapsigargin (C,D). Beispielhaft dargestellt sind die Veränderungen des Fluoreszenzsignals von Fluo-4 ohne (A, C) und mit (B, D) Zusatz von 2 mM Calcium im Inkubationsmedium sowie die Entstehung der Subpopulation mit hohem intrazellulären Calciumgehalt unter Zugabe von Thapsigargin (C, D).
Anzahl der Messereignisse
0; 1; 2 3 4 5 6; 7 8 9 10 11; 12 13 14 15 16; 17 18 19; 20 >20
Farbe
Messdauer (341 s) Messdauer (341 s)
Messdauer (341 s) Messdauer (341 s)
Fluoreszenzintensität von Fluo-4 (a. u.)
Fluoreszenzintensität von Fluo-4 (a. u.) Fluoreszenzintensität von Fluo-4 (a. u.)
Fluoreszenzintensität von Fluo-4 (a. u.)
39 3.14 Versuche
3.14.1 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thapsigargin
Fragestellungen
1) Wird die Plasmamembranintegrität durch Thapsigargin negativ beeinflusst?
2) In welcher Konzentration beeinflusst Thapsigargin den intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien?
Versuchsdurchführung
Untersucht wurde die Wirkung von Thapsigargin in den Konzentrationen 0,625/ 1,25/
2,5 und 5,0 µM. Die Präinkubation der Spermien mit Fluo-4 AM erfolgte für 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Spermien durch einen diskontinuierlichen Percoll®-Gradienten zentrifugiert und anschließend erneut verdünnt (s. Kapitel 3.9). Die mit Fluo-4 AM versetzten Spermiensuspensionen wurden für je 5 min in HBS-Inkubationsmedien bei 38°C im Wärmeschrank inkubiert.
Die Medien unterschieden sich hinsichtlich ihres Calciumgehaltes (HBSKontrolle und HBSCa, s. Kapitel 3.5). Die Zugabe von Thapsigargin erfolgte unmittelbar vor den Messungen. Das Experiment wurde in einem Durchgang ausgeführt.
Alle Thapsigarginkonzentrationen wurden einer 5 mM Stammlösung entnommen, welche auch für alle nachfolgenden Versuche mit Thapsigargin verwendet wurde.
Lösungsmittel für den pulverförmigen Feststoff Thapsigargin war Dimethylsulfoxid (DMSO). Jeder Messung unter Zugabe von Thapsigargin stand eine Kontrollmessung mit dem entsprechenden Volumen DMSO gegenüber (Tab.1).
Weiterhin ist pro Inkubationsmedium ein Probenansatz ohne Zugabe von Thapsigargin oder DMSO (Nullkontrolle) gemessen worden.
Der Probenansatz beinhaltete:
1990 µl HBS incl. PI (5 µl PI-Stammlösung (1 mg/ ml)/ ml) 10 µl der mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension.
40
Tab 1: Jeder Behandlung mit Thapsigargin wurde eine gleichvolumige Menge DMSO in einer Kontrolle gegenüber gestellt. Die höchste verwendete Menge
Thapsigargin/ DMSO entspricht 1 % Vol. des Probenansatzes.
Die Zugabe von Thapsigargin bzw. DMSO erfolgte direkt vor der Messung. Die Spermiensuspensionen wurden mittels Vortex (Reax top, Heidolph, Schwabach) gemischt. Bis zum Beginn der Datenaufzeichnung im Durchflusszytometer vergingen 10 bis 12 s. Die Probenansätze wurden kontinuierlich über 341 s (Time-Gate-Messung) gemessen. Untersucht wurden die Ejakulate von drei Ebern.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
3.14.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mittels des angewandten Versuchsaufbaus
Fragestellung
Die Reproduzierbarkeit der Wirkung von Thapsigargin mittels des Versuchsaufbaus aus Kapitel 3.14.1 sollte demonstriert werden.
Versuchsdurchführung
Verwendet wurden 1,25 µM Thapsigargin bzw. das entsprechende Volumen DMSO.
Die Spermien wurden für 5 min bei 38°C in HBSKontrolle sowie HBSCa inkubiert. In beiden Medien wurde eine Kontrollmessung ohne Zugabe von Thapsigargin oder DMSO durchgeführt. Die Messungen unter Zugabe von Thapsigargin bzw. DMSO wurden als Time-Gate-Messungen in zwei Durchgängen pro Eber ausgeführt.
Innerhalb eines Durchganges wurde jede Messung doppelt ausgeführt. Gleiche Probenansätze wurden dabei direkt aufeinander folgend gemessen. Untersucht wurden die Ejakulate von zwei Ebern.
41 Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Aus den gleichen Probenansätzen erhobene Messdateien wurden graphisch gegenübergestellt und verglichen. Die Fragestellung nach der Reproduzierbarkeit der Daten wurde visuell anhand der Graphiken beantwortet.
3.14.3 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thimerosal
Fragestellungen 1) Wird die Plasmamembranintegrität durch Thimerosal negativ beeinflusst?
2) In welcher Konzentration beeinflusst Thimerosal den intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien?
Versuchsdurchführung
Entsprechend dem Versuchsaufbau von Kapitel 3.14.1 wurde eine Konzentrations-reihe mit Thimerosal durchgeführt. Die verwendeten Konzentrationen waren: 6,0/
12,5/ 25,0/ 50,0/ 100 und 200 µM. Da Konzentrationen mit weiter Spannbreite verwendet wurden, sind vor dem Versuch zwei Stammlösungen zu 6 mM und 50 mM hergestellt worden. Lösungsmittel für den pulverförmigen Feststoff Thimerosal war DMSO. Um dem Sicherheitsdatenblatt zu entsprechen, wurden die Stammlösungen im Institut für Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt. In Vorfeld des Experimentes wurden auch die Konzentrationen 1,5 und 3,0 µM untersucht. Da Thimerosal in diesen Konzentrationen nahezu keinen Einfluss auf den intrazellulären Calciumgehalt der Spermien hatte, wurden diese Konzentrationen aus dem Versuchsaufbau ausgeschlossen. Die verwendeten Volumina Thimerosal bzw. DMSO sind in Tab.2 gelistet. Untersucht wurden die Ejakulate von drei Ebern.
42
Tab. 2: Jeder Behandlung mit Thimerosal wurde eine gleichvolumige Menge DMSO in einer Kontrolle gegenüber gestellt. Die höchste verwendete Menge Thimerosal/ DMSO entspricht 4 % Vol. des Probenansatzes. Alle
Konzentrationen > 6,0 µM wurden aus der 50 mM Stammlösung hergestellt.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Thimerosal bewirkte einen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration der plasmamembranintakten Spermien, der als Reaktion der gesamten PI-negativen Spermienpopulation erfolgte. Aufgrund der Reaktionskinetik von Thimerosal wurde keine Unterscheidung hinsichtlich des intrazellulären Calciumgehaltes durchgeführt (Abb. 2).
Abb.2: Nur die plasmamembranintakten Spermien sind dargestellt. Beispiel für die Unterschiede in der Reaktionskinetik nach Behandlung mit Thimerosal (A) und Thapsigargin (B). Die Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes verlief nach Zugabe von Thimerosal als ubiquitäre Reaktion der PI-negativen Spermien.
43
3.14.4 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin auf Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen
Fragestellungen:
1) Besteht eine Interaktion zwischen verlängerten Inkubationszeiten vor Zugabe des Inhibitors und der Plasmamembranintegrität nach Zugabe des Inhibitors?
2) Beeinflussen die Inkubationszeit und der Zusatz von Bicarbonat im Inkubationsmedium den Verlauf des intrazellulären Calciumgehaltes plasmamembranintakter Spermien nach Zugabe des Inhibitors?
Versuchsdurchführung
Die Messungen unter Zugabe von Thapsigargin bzw. DMSO wurden in zwei Durchgängen pro Eber ausgeführt. Im ersten Durchgang wurden die Spermien in HBSKontrolle sowie HBSBic inkubiert. Im zweiten Durchgang wurden HBSCa und HBSBicCa verwendet. Die Spermien wurden für 5, 30 und 60 min bei 38°C im Wärmeschrank bzw. im CO2-Inkubator inkubiert. Auf Messungen ohne Zugabe von Thapsigargin bzw. DMSO (Nullkontrollen) wurde in diesem und allen nachfolgenden Versuchen verzichtet. Untersucht wurden die Ejakulate von drei Ebern.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Die Graphiken wurden als Vergleich der Inkubationszeiten in jeweils einem Inkubationsmedium erstellt.
3.14.5 Einfluss von 100 µM Thimerosal auf Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen
Fragestellungen:
1) Besteht eine Interaktion zwischen verlängerten Inkubationszeiten vor Zugabe des Inhibitors und der Plasmamembranintegrität nach Zugabe des Inhibitors?
2) Beeinflussen die Inkubationszeit und der Zusatz von Bicarbonat im Inkubationsmedium den Verlauf des intrazellulären Calciumgehaltes plasmamembranintakter Spermien nach Zugabe des Inhibitors?
44 Versuchsdurchführung
Der Versuchsaufbau entsprach dem von Kapitel 3.14.4. Als Inhibitor wurde Thimerosal in der Konzentration 100 µM verwendet. Untersucht wurden die Ejakulate von drei Ebern.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Bei der Auswertung wurden die in Kapitel 3.14.3 charakterisierten Unterschiede der Reaktionskinetik, verglichen mit Thapsigargin, berücksichtigt.
3.14.6 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin und 100 µM Thimerosal auf den intrazellulären Calciumgehalt und die Akrosomintegrität von
Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen
Fragestellungen
1) Beeinflussen 1,25 µM Thapsigargin die Akrosomintegrität von Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen?
2) Beeinflussen 100 µM Thimerosal die Akrosomintegrität von Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen?
Versuchsdurchführung
Die Time-Gate-Messungen mit den Inhibitoren bzw. DMSO wurden in vier Durchgängen pro Eber ausgeführt. Dabei wurden in einem Durchgang alle Daten für jeweils ein HBS-Inkubationsmedium erhoben. Die Spermiensuspensionen wurden vor der Zugabe des Inhibitors für 5 min bzw. 60 min bei 38°C inkubiert. Die Zugabe von Thapsigargin, Thimerosal oder DMSO erfolgte jeweils direkt vor Beginn der Messung. Die Messungen unter Verwendung von Fluo-4 AM bzw. FITC-PNA wurden in separaten Messröhrchen durchgeführt.
Der Probenansatz für die Messungen mit FITC-PNA beinhaltete:
1980 µl HBS
10 µl FITC-PNA (600 μg/ ml)
10 µl der ohne Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension.
45
Die Zugabe von FITC-PNA erfolgte 5 min vor der Zugabe von Thapsigargin, Thimerosal oder DMSO um einen möglichen schädigenden Einfluss auf die Spermien durch längere Koinkubation zu vermeiden.
Die Messungen unter Verwendung von FITC-PNA wurden mit der Signalverstärkung für Fluo-4 AM durchgeführt (Kapitel 3.13.1). Untersucht wurden die Ejakulate von sechs Ebern.
Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte nach dem in Kapitel 3.13.3 beschriebenen Prinzip.
Die unter Verwendung von FITC-PNA erhobenen Daten wurden ausschließlich an der plasmamembranintakten Spermienpopulation ausgewertet. Die Spermien waren entweder FITC-PNA-negativ und akrosomintakt oder FITC-PNA-positiv und akrosomdefekt. Die Klassierung in FITC-PNA-negative und -positive Messereignisse erfolgte in den FCS-Bilddateien der Software FlowMax 2.0 für jede Messdatei einzeln.
Die bereits zur Klassierung der PI-Populationen genutzte Region 1 (R1) wurde auf das einparametrische Histogramm der Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal gelegt. Damit wurden die Fluoreszenzsignale von FITC-PNA auf den Anfangsbereich der Messdauer selektiert. Anschließend wurde für jede Messdatei ein Kanalzahlbereich zur Trennung der Spermiensubpopulationen auf der logarithmischen Skala der Grünfluoreszenz bestimmt. Es konnte ein gemeinsamer Trennwert für alle Inkubationsmedien ermitteln werden.
Für jede Messdatei wurde die Anzahl der akrosomintakten und -defekten Spermien pro Sekunde ermittelt. Daraus wurde das prozentuale Verhältnis der Spermiensubpopulationen über die Messdauer berechnet. Letzter Schritt war die Subtraktion der FITC-PNA-positiven Spermien unter Zugabe von DMSO von denen der korrespondierenden Messungen unter Zugabe von Thapsigargin oder Thimerosal.
Die entstandene Differenz ergab den prozentualen Anteil der PI-negativen/
FITC-PNA-positiven Spermien, die auf den Einfluss von Thapsigargin bzw.
Thimerosal zurückzuführen waren.
Um den Verlauf des Anstieges der Population plasmamembranintakter Spermien mit defektem Akrosom in zeitlicher Relation zum Anstieg der plasmamembrandefekten
46
Spermien darzustellen, wurden PI-positive Spermien nach Zugabe von DMSO von dem Anteil PI-positiver Spermien nach Zugabe von Thapsigargin bzw. Thimerosal ebenfalls subtrahiert.
Spektrale Überlagerungen des Emissionsspektrums von FITC-PNA und PI wurden durch mathematische Kompensation ausgeglichen.
3.15 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung aller Daten erfolgte mittels des Programmes IBM SPSS Statistics 20. Die deskriptive Statistik umfasste die Erhebung der Mittelwerte der pro Eber. Alle im Anhang (Kapitel 9.1) dargestellten Daten sind Mittelwerte und Standardabweichungen.
47
4 Ergebnisse
4.1 Konzentrationsreihe zur Ermittlung einer optimalen Wirkkonzentration von Thapsigargin
Die verwendeten Proben verfügten vor Beginn der Messreihen über einen Anteil von 85,4 % (SD = 6,7) plasmamembran- sowie akrosomintakter Spermien. Nach Beendigung der Inkubationen lag dieser Anteil bei 88,5 % (SD = 4,6). Der Anteil der motilen Spermien nach Beginn der letzten Inkubation betrug 83,8 % (SD = 6,7).
4.1.1 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thapsigargin auf den prozentualen Anteil plasmamembrandefekter Spermien
Effekt von DMSO
Ohne Zugabe von DMSO blieb der Anteil der plasmamembrandefekten (PI-positiven) Spermien sowohl in HBS ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) als auch in HBS mit 2 mM Calcium (HBSCa) während der gesamten Messdauer bei ca. 15 % stabil. In
HBSKontrolle bewirkte die Zugabe von DMSO keine Zunahme der
plasma-membrandefekten Spermien. Der Anteil PI-positiver Samenzellen betrug während der gesamten Messdauer ca. 15 bis 20 %. In HBSCa war der Anteil PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO mit ca. 20 % geringfügig höher als in den Proben ohne Zusatz von DMSO (Abb. 3).
48
Abb. 3: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) ohne Zugabe von DMSO sowie nach Zugabe von DMSO. Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5,0 µM). Mittelwerte aus n = 3 Ebern.
Effekt von Thapsigargin
Thapsigargin verursachte in jeder verwendeten Konzentration (0,625/ 1,25/ 2,5/
5,0 µM) eine stetige Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation über die Messdauer. In Sekunde 1 betrug der Anteil plasmamembrandefekter Spermien in allen Proben ca. 15 bis 20%.
In HBSKontrolle setzte unter Verwendung von 0,625 und 1,25 µM Thapsigargin die Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation zwischen 130 und 140 s Messdauer ein. Unter Zusatz von 2,5 µM Thapsigargin erhöhte sich der Anteil plasmamembrandefekter Spermien nach 70 bis 80 Sekunden. 5,0 µM Thapsigargin lösten nach 50 bis 60 Sekunden die Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation aus. Nach 341 s betrugen die Anteile PI-positiver Spermien ca. 40 % (0,625 µM), ca.
50 % (1,25 µM), ca. 60 % (2,5 µM) und ca. 80% (5,0 µM) (Abb. 4 A).
In HBSCa erhöhte sich der Anteil PI-positiver Spermien bei Einsatz der gleichen Konzentrationen Thapsigargin früher als in HBSKontrolle. Nach Verwendung von
A B
49
0,625 µM Thapsigargin setzte ab ca. 100 s die Erhöhung des Anteils plasma-membrandefekter Samenzellen ein. Nach Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin bildete sich nach ca. 110 s eine stetig zunehmende Population PI-positiver Spermien. Nach Zusatz von 2,5 µM Thapsigargin erhöhte sich der Anteil plasmamembrandefekter Spermien nach ca. 70 bis 80 s. Die Zugabe von 5,0 µM Thapsigargin bewirkte nach ca. 40 bis 50 s eine Erhöhung der PI-positiven Spermienpopulation. Nach 341 s betrugen die Prozentsätze PI-positiver Spermien ca. 30 % (0,625 µM), ca. 50 % (1,25 µM), ca. 60 % (2,5 µM) und ca. 75% (5,0 µM) (Abb. 4 B). Die in HBSCa
zwischen Sekunde 320 und 341 nach Zugabe von 5,0 µM Thapsigargin aufgetretenen verringerten Werte stellen vermutlich Messartefakte dar.
Abb. 4: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) unter Verwendung von Thapsigargin (Th) in unterschiedlichen Konzentra-tionen (0,625/ 1,25/ 2,5/ 5,0 µM). Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5 µM).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern.
A B
50
4.1.2 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thapsigargin auf den intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien
4.1.2 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen Thapsigargin auf den intrazellulären Calciumgehalt plasmamembranintakter Spermien