Tab. 3: CASA-Motilitätsparameter (MW ± SD) für alle mit Thapsigargin sowie Thimerosal durchgeführten Versuche
Parameter 4.1
129
* n = 3 Eber progr. Motil. = Anteil progressiv motiler Spermien
** n = 2 Eber DAP = distance average path
*** n = 3 Eber DCL = distance curved line
**** n = 3 Eber DSL = distance straight-line
***** n = 3 Eber VAP = velocity average path
****** n = 6 Eber VCL = velocity curved line
VSL = velocity straight-line
STR = straightness (VSL/VAP) LIN = linearity (VAP/VCL) WOB = wobble (VAP/VCL)
ALH = amplitude of lateral head-displacement BCF = beat cross frequency
130
Tab. 4: Membranintegritätsparameter (MW ± SD) für alle mit Thapsigargin sowie Thimerosal durchgeführten Versuche
Versuche/ Parameter PI-positiv &
4.1 Konzentrationsreihe zur Bestimmung einer optimalen Wirkkonzentration von Thapsigargin*
Vor Time-Gate-Messungen 3,87 0,76 9,13 6,12 85,41 6,72 1,59 0,91
Nach Time-Gate-Messungen 3,05 0,55 6,78 3,69 88,53 4,55 1,64 1,34
4.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mittels des angewandten Versuchsaufbaus**
Vor Time-Gate-Messungen 7,48 3,43 7,80 0,89 82,64 3,61 2,09 1,09
Nach Time-Gate-Messungen 6,44 1,78 5,55 0,30 86,08 0,03 1,94 1,45
4.3 Konzentrationsreihe zur Bestimmung einer optimalen Wirkkonzentration von Thimerosal***
Vor Time-Gate-Messungen 4,29 3,03 6,12 1,40 87,45 3,57 2,13 0,86
Nach Time-Gate-Messungen 5,82 4,83 5,91 2,09 86,27 7,01 1,99 0,56
4.4 Einfluss von 1,25 µM Thapsigargin auf unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen gehaltene Eberspermien****
Vor Time-Gate-Messungen 1,43 0,47 4,27 1,44 93,46 2,00 0,83 0,20
Nach Time-Gate-Messungen 1,49 0,78 4,34 2,03 93,36 2,86 0,80 0,11
4.5 Einfluss von 100 µM Thimerosal auf unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen gehaltene Eberspermien*****
Vor Time-Gate-Messungen 1,80 0,84 4,64 1,91 92,48 2,61 1,93 0,90
Nach Time-Gate-Messungen 2,18 0,57 4,28 1,39 92,64 2,11 0,90 0,41
4.6 Wirkung von 1,25 µM Thapsigargin und 100 µM Thimerosal auf den intrazellulären Calciumgehalt und die Akrosomintegrität von Eberspermien unter kapazitierenden und nicht kapazitierenden Bedingungen******
Vor Time-Gate-Messungen 2,10 1,46 5,63 1,11 90,63 2,57 1,63 0,88
Nach Time-Gate-Messungen 3,16 1,89 5,76 1,02 89,47 2,40 1,61 0,94
*n = 3 Eber **n = 2 Eber ***n = 3 Eber ****n = 3 Eber *****n = 3 Eber ******n = 6 Eber
131
Abb. 27: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde (a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von Thapsigargin (Th) oder DMSO. Dargestellt sind die Konzentrationen 1,25 µM (A) sowie 2,5 µM (B) Thapsigargin in HBSKontrolle sowie HBSCa. Mittelwerte aus n = 3 Ebern
A B
132
Abb. 28: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) nach Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin (Th, A, C) oder DMSO (B, D).
Dargestellt sind Änderungen in HBS (A, B) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (C, D) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa).
Wiederholungsmessungen mit n = 2 Ebern
A B
C D
133
Abb. 29: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde (a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von Thapsigargin (Th (A, C)) oder DMSO (B, D). Dargestellt sind Änderungen in HBS (A, B) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (C, D) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa).
Wiederholungsmessungen mit n = 2 Ebern
A
C
B
D
134
Abb. 30: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von Thapsigargin (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien. Dargestellt sind Änderungen in HBS (A, B) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (C) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). In der Graphik B wurde auf die Darstellung von 1.1_Eber1 wurde verzichtet, um für die übrigen Werte eine bessere Aussagekraft zu erreichen.
Wiederholungsmessungen mit n = 2 Ebern.
C A
B
135
Abb. 31: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde
(a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von DMSO oder Thimerosal (Thim). Dargestellt sind die Konzentrationen 12,5 µM (A),
25,0 µM (B), 50,0 µM (C) sowie 100 µM (D) in HBSKontrolle sowie HBSCa. Mittelwerte aus n = 3 Ebern
A B
C D
136
Abb. 32: Veränderung des Anteils PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO bzw. 1,25 µM Thapsigargin (Th) in HBSKontrolle, HBSCa, HBSBic und HBSBicCa. Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A, C) und 60 min (B, D). Messungen unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Fluo-4 AM (A, B) sowie FITC-PNA (C, D). Mittelwerte aus n = 6 Ebern.
A B
C D
137
Abb. 33: Veränderung des Anteils PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO bzw. 100 µM Thimerosal (Thim) in HBSKontrolle, HBSCa, HBSBic und HBSBicCa. Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A, C) und 60 min (B, D). Messungen unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Fluo-4 AM (A, B) sowie FITC-PNA (C, D). Mittelwerte aus n = 6 Ebern
A B
C D
138 9.2 Chemikalien
Substanz Bezugsquelle Artikelnummer
A23187 (Calcimycin) Alexis Chemicals, 52665-69-7 Lausen (CH)
α-D(+)-Glucose- Monohydrat Carl Roth GmbH+Co.KG, 6780 Karlsruhe
BSA, Fraktion V SERVA Electrophoresis GmbH, 1193-03 Heidelberg
Calciumchlorid Merck, Darmstadt 102392
Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth GmbH+Co.KG, 4720.4 Karlsruhe
DNA Control UV Partec GmbH, Münster 05-4018
FITC-PNA Axxora, Lörrach C-FL-1071-M01
Fluo-4 AM invitrogen™/ Life Technologies F-14201 Carlsbad (USA)
HEPES PUFFERAN® Carl Roth GmbH+Co.KG, HN78 Karlsruhe
Hoechst 33342 invitrogen™/ Life Technologies H-1399 Carlsbad (USA)
Kaliumchlorid AppliChem GmbH, Darmstadt A3582 Kaliumhydroxid AppliChem GmbH, Darmstadt A3871 Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich, Schnelldorf M5921
Natriumchlorid Carl Roth GmbH+Co.KG, HN00
Karlsruhe
Percoll™ GE Healthcare Bio Sciences 17089101
AB, Uppsala (S)
Propidiumiodid (PI) Sigma Aldrich, Schnelldorf P-4170-100MG Sodiumbicarbonate Sigma-Aldrich, Schnelldorf S5761
139
Thapsigargin Adipogen International, 450-001-M005 Liestal (CH)
Thimerosal Sigma- Aldrich, Schnelldorf T5125 tri-Natriumcitrat-Dihydrat Carl Roth GmbH+Co.KG, 3580
Karlsruhe
9.3 Rezepte
1. A23187-Gebrauchslösung 0,955 M 0,50 g A23187
1,00 ml Ethanol 96%
Die Lösung wurde bei -20°C aliquotiert aufbewahrt.
2. Modifizierte Beltsville Thawing Solution (BTS) 20,40 mmol/ l tri-Natriumcitrat-Dihydrat 20,00 mmol/ l HEPES
10,06 mmol/ l Kaliumchlorid
α-D(+)-Glucose-Monohydrat bis zu einer Osmolarität von 300 mOsmol hinzufügen aqua dest.
Osmolalität: 300 ± 5 mOsmol/ kg
pH 7,4 bei Gebrauchstemperatur von 32°C
Nach der Sterilfiltration wurden 1,5 g (3 g/ ml) BSA Cohn's Fraction V hinzugefügt.
Die Aufbewahrung erfolgte für höchstens 24 h in einem verschlossenen Glaskolben im Kühlschrank.
3. Fluo-4 AM-Stammlösung 2mM 50,00 µg Fluo-4 AM
23,00 ml DMSO
Die Lösung wurde bei -20°C und unter vor Licht geschützten Bedingungen aliquotiert.
140 4. Formolcitrat
9,86 mmol tri-Natriumcitrat-Dihydrat ad 100 ml aqua dest.
4 ml der Lösung verwerfen, durch 4 ml 37%-iges Formalin ersetzen und vermischen.
Die Aufbewahrung der Lösung erfolgte aliquotiert (300 μl) bei 4°C.
5. HBS (HEPES®-buffered saline)
pH 7,4 bei Gebrauchstemperatur von 38°C (Titration mit 1 M NaOH)
Die Aufbewahrung erfolgte für höchstens 24 h in einem verschlossenen Glaskolben im Kühlschrank.
HBS-Inkubationsmedien
Substanz HBSKontrolle HBSCa HBSBic HBSBicCa
BSA* 1 mg/ ml
CaCl2 2 mmol/ l 2 mmol/ l
NaHCO3 15 mmol/ l 15 mmol/ l
* Cohn's Fraction V
6. Herstellung der Percoll®-Gebrauchslösungen 70% und 35%
a) HBS-Stammlösung (zehnfach konzentriert):
Die Aufbewahrung der Lösung erfolgt sterilfiltriert und aliquotiert (10,8 g und 5,4 g) bei -20°C.
141
e) Berechnung der Zugabemasse von Percoll® zu Lösung „1 + 9P“
Oa = 0,1 x (10 x M + 9p)
R = [Oa – (0,1 x dp)] / (0,9 x dp) (ca. 0.85) Vp = (10 x M – 295) / [Rx (295 – p)] (ca. 11)
Zugabemasse von Percoll® in Gramm [g] zu der Lösung „1+ 9P“: (Vp – 9) x 1,13 x 5 Die errechnete Menge an sterilfiltriertem Percoll® zu der Lösung „1 + 9P“ geben und gut durchmischen. Die Osmolalität sollte ca. 295 mOsmol/kg betragen.
Diese Lösung wird als „100% Percoll®-Saline-Lösung“ bezeichnet und dient als Ausgangsbasis um die 35%-ige und 70%-ige Waschlösung herzustellen.
f) Herstellung der 35%-igen und 70%-igen Waschlösung
Die „100% Percoll®-Saline-Lösung“ im Verhältnis 1:1 zwischen zwei 100 ml Stand-zylindern aufteilen. Das Volumen (V) ablesen.
Endvolumen um eine 35%-ige Lösung herzustellen: (V x 100) / 35 Endvolumen, um eine 70%-ige Lösung herzustellen: (V x 100) / 70 Zugabe von Lösung „M“ bis zum jeweils errechneten Endvolumen.
Gut durchmischen.
Osmolalität 295- 305 mOsmol/kg
Die Waschlösungen wurden sterilfiltriert, bei 4°C aufbewahrt und bis maximal 2 Wochen nach Herstellung verwendet.
142
Um alle im Umgang mit der Reinsubstanz Thimerosal relevanten Sicherheitshinweise beachten zu können, wurden die Lösungen im Institut für Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt.
143
144 9.5 Geräte und Verbrauchsmaterialien
CO2-Inkubator MCO-17AC Sanyo, Bad Nenndorf
Deckgläser (18x18 mm) Interessengemeinschaft der
Laborfachhändler (IDL) GmbH & Co. KG, Nidderau
Durchflusszytometer Dako Galaxy Partec GmbH, Münster Ebersamenflaschen mit Verschluss Minitüb GmbH, Tiefenbach Einmalhandschuhe:
Manuplast Landgraf Laborsysteme, Langenhagen
Nobaglove Latex NOBA Verbandmittel Danz GmbH u. Co.KG,
Nobaglove-Nitril Wetter
Vinyl 2000 PF Meditrade, Kiefersfelden
Einmalspritzen, steril 20 ml Braun, Melsungen variable Eppendorfreaktionsgefäße Ratiolab, Dreieich Filter; PES-Membran; 0,22 µm Millipore; Irland Porendurchmesser
Gefrierpunktosmometer, Gonotec, Berlin Osmomat 030
Heizplatten: Minitüb GmbH, Tiefenbach
HT 50 HT 200
Laborwaagen: Sartorius AG, Göttingen
PT 12 ALC-80
Laborzentrifuge, Megafuge 2.0 R Fa. Hareaus, Hanau
Magnetrührer Heidolph, Schwabach
Messgefässe Osmomat 030 Gonotec, Berlin
NaCl-Röhrchen Sarstedt, Nürnbrecht
Objektträger 76x26 mm Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig
145
Parafilm Landgraf Laborsysteme, Langenhagen
Phasenkontrastmikroskope: Zeiss, Jena Anxiostar Plus
Zeiss 4713849
pH-Meter, Multiplex 3000/ pmx WTW, Weilheim variable Einkanalpipetten Eppendorf, Hamburg variable Pipettenspitzen nerbe plus, Winsen/ Luhe Reagenzröhrchen 3,5 ml mit Sarstedt, Nürnbrecht Eindrückstopfen
Samenauffangbeutel, US-Bag™ Minitüb GmbH, Tiefenbach Samenauffangbecher, Semen Minitüb GmbH, Tiefenbach Collection Cup
Spritzensatzfilter, PES-Membran, Carl Roth GmbH+Co.KG, Karlsruhe 0,22 μm Porendurchmesser, steril
Vortex, Reax top Heidolph, Schwabach
Wärmeschränke Memmert, Schwabach
Wasserbäder:
Typ 1013 GFL, Burgwedel
WNB 745 Memmert, Schwabach
Wasserstrahlpumpe Landgraf Laborsysteme, Langenhagen Zählkammer „Leja“ Leja Products B.V., Nieuw-Vennep, The
Netherlands
Zählkammer nach Thoma, “neu” Jürgens, Hannover Zentrifugenröhrchen 15 & 50 ml Biochrom, Berlin
Zentrifugenröhrchen aus Glas, Landgraf Laborsysteme, Langenhagen 12 ml mit Spitzboden
146
10 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Nur plasmamembranintakte Spermien sind dargestellt. Unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 unter Zugabe von DMSO (A, B) und Thapsigargin (C, D). Beispielhaft dargestellt sind die Veränderungen des Fluoreszenzsignals von Fluo-4 ohne (A, C) und mit (B, D) Zusatz von 2 mM Calcium im Inkubationsmedium sowie die Entstehung der Spermiensubpopulation mit hohem intrazellulären Calciumgehalt unter Zugabe von Thapsigargin (C, D)...38 Abb. 2: Nur plasmamembranintakte Spermien sind dargestellt. Beispiel für die Unterschiede in der Reaktionskinetik nach Behandlung mit Thimerosal (A) und Thapsigargin (B). Die Erhöhung des intrazellulären Calciumgehaltes
verlief nach Zugabe von Thimerosal als ubiquitäre Reaktion der PI-negativen Spermien...42
Abb. 3: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) ohne Zugabe von DMSO sowie nach Zugabe von DMSO. Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5µM). Mittelwerte aus n = 3 Ebern………48 Abb. 4: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv)
unter Verwendung von Thapsigargin (Th) in unterschiedlichen Konzentrationen (0,625/ 1,25/ 2,5/ 5,0 µM). Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5 µM). Mittelwerte aus n = 3 Ebern...49 Abb. 5: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde
(a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von Thapsigargin (Th) oder DMSO. Dargestellt sind die niedrigste (0,625 µM, A) sowie die höchste (5,0 µM, B) verwendete Konzentration Thapsigargin in HBSKontrolle sowie HBSCa. Mittelwerte aus n = 3 Ebern………...52 Abb. 6.: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von Thapsigargin (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien.
Dargestellt sind alle verwendeten Konzentrationen Thapsigargin (0,625/
1,25/ 2,5 und 5,0 µM) in HBSKontrolle (A) sowie HBSCa (B).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...53
147
Abb. 7: Messung nach Zugabe von Thapsigargin. Dargestellt ist beispielhaft das durchflusszytometrische Histogramm der Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal, aufgetragen gegen die Messdauer. Die Markierung zeigt die im Messverlauf entstandene Spermiensubpopulation plasmamembranintakter Spermien mit deutlich erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4……….54 Abb. 8: Prozentualer Anteil plasmamembranintakter Spermien mit hohem intrazellulärem Calciumgehalt in HBSKontrolle (A) sowie HBSCa (B).
Dargestellt jeweils alle Konzentrationen Thapsigargin. Das Volumen der verwendeten Menge DMSO entsprach dem Volumen der höchsten verwendeten Konzentration Thapsigargin (5 µM).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...56 .
Abb. 9: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) in den Messungen ohne Zugabe von DMSO oder Thimerosal, sowie unter Verwendung der höchsten Konzentration Thimerosal (200 µM) und der entsprechenden Menge DMSO. Dargestellt sind HBS (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...59 Abb. 10: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde
(a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von DMSO oder Thimerosal (Thim). Dargestellt sind die niedrigste (6,0 µM, A) sowie die höchste (200 µM, B) verwendete Konzentration Thimerosal in HBSKontrolle sowie HBSCa. Mittelwerte aus n = 3 Ebern………...61 Abb. 11: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von Thimerosal (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien. Dargestellt sind alle verwendeten Konzentrationen Thimerosal (6,0/ 12,5/ 25,0/ 50,0/
100 und 200 µM) in HBSKontrolle (A) sowie HBSCa (B).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...62 Abb. 12: Veränderung des Anteils PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO
bzw. 1,25 µM Thapsigargin (Th) nach unterschiedlich langer Inkubation (5, 30 und 60 min). Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), (C) mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic) sowie (D) mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...65 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa). Mittelwerte aus n = 3 Ebern………...68
148
Abb. 14: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von Thapsigargin (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien.
Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5, 30 und 60 min in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), (C) mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic) sowie (D) mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat
(HBSBicCa). Mittelwerte aus n = 3 Ebern……….70
Abb. 15: Prozentualer Anteil plasmamembranintakter Spermien mit hohem intrazellulärem Calciumgehalt nach Zugabe von Thapsigargin (Th) oder DMSO. Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5, 30 und 60 min in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), (C) mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic)sowie (D) mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa). Mittelwerte aus n = 3 Ebern...73 Abb. 16: Veränderung des Anteils PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO
bzw. 100 µM Thimerosal (Thim) nach unterschiedlich langer Inkubation (5, 30 und 60 min). Dargestellt sind Änderungen in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), (C) mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic) sowie (D) mit Zusatz von 2mM Calcium und 15 mM Bicarbonat(HBSBicCa).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...
Abb. 17: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 (a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von DMSO bzw. 100 µM Thimerosal (Thim). Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5, 30 und 60 min in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), (C) mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic) sowie (D) mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa). Mittelwerte aus n = 3 Ebern...79 Abb. 18: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von
Thimerosal (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien. Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5, 30 und 60 min in HBS (A) ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), (B) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), (C) mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic) sowie (D) mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa).
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...…...81
149
Abb. 19: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde (a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von DMSO bzw. 1,25 µM Thapsigargin (Th). Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A) und 60 min (B) in HBS ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic) sowie mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa). Mittelwerte aus n = 6 Ebern...87 Abb. 20: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde (a. u.) nach Zugabe von DMSO bzw. 100 µM Thimerosal (Thim).
Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A) und 60 min (B) in HBS ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), mit Zusatz von 15 mM
Bicarbonat (HBSBic) sowie mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa). Mittelwerte aus n = 6 Ebern...88
Abb. 21: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von Thapsigargin (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien. Dargestellt sind Änderungen in den Inkubationsmedien ohne Zusatz von Calcium Abb. 23: Prozentualer Anteil plasmamembranintakter Spermien mit erhöhter Fluoreszenzintensität von Fluo-4. Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A) und 60 min (B) in HBS ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat (HBSKontrolle), mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa), mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat (HBSBic) sowie mit Zusatz von 2 mM Calcium und 15 mM Bicarbonat (HBSBicCa).
Mittelwerte aus n = 6 Ebern...95 Abb. 24: Anteil plasmamembranintakter, akrosomdefekter Spermien (PI-negativ/
FITC-PNA-positiv) unter Verwendung von 1,25 µM Thapsigargin (Th) abzüglich des Anteilsplasmamembranintakter, akrosomdefekter Spermien nach Zugabe von DMSO. Dargestellt sind Änderungen in den Inkubationsmedien (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle und HBSBic) und (B) in den Medien mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa und HBSBicCa).
Mittelwerte aus n = 6 Ebern...97
150
Abb. 25: Anteile plasmamembrandefekter (PI-positiv) sowie plasmamembranintakter, akrosomdefekter Spermien (PI-negativ/ FITC-PNA-positiv) nach Zugabe von1,25 µM Thapsigargin (Th) abzüglich der Anteile plasmamembran-defekter (PI-positiv) sowie plasmamembranintakter, akrosomplasmamembran-defekter Spermien (PI-negativ/ FITC-PNA-positiv) nach Zugabe von DMSO.
Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A, B) in den Medien ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle und HBSBic, (A)) und mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa und HBSBicCa (B)) und 60 min (C,D) in den Medien ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle und HBSBic, (C)) und mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa und HBSBicCa (D)).
Mittelwerte aus n = 6 Ebern...98 Abb. 26: Anteil plasmamembranintakter, akrosomdefekter Spermien (PI-negativ/
FITC-PNA-positiv) unter Verwendung von 100 µM Thimerosal (Thim) abzüglich des Anteils plasmamembranintakter, akrosomdefekter Spermien nach Zugabe von DMSO. Dargestellt sind Änderungen in den Inkubationsmedien (A) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle und HBSBic) und (B) in den Medien mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa und HBSBicCa).
Mittelwerte aus n = 6 Ebern……….99 Abb. 27: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde
(a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von Thapsigargin (Th) oder DMSO. Dargestellt sind die Konzentrationen 1,25 µM (A) sowie 2,5 µM (B) Thapsigargin in HBSKontrolle sowie HBSCa.
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...131 Abb. 28: Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien (PI-positiv) nach Zugabe von 1,25 µM Thapsigargin (Th (A, C)) oder DMSO (B, D).
Dargestellt sind Änderungen in HBS (A, B) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (C, D) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa).
Wiederholungsmessungen mit n = 2 Ebern...132 Abb. 29: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde
(a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von Thapsigargin (Th (A, C)) oder DMSO (B, D). Dargestellt sind Änderungen in HBS (A, B) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (C, D) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa).
Wiederholungsmessungen mit n = 2 Ebern...133 Abb. 30: Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Fluo-4 (F/F0) nach Zugabe von
Thapsigargin (F) oder DMSO (F0) in den PI-negativen Spermien. Dargestellt sind Änderungen in HBS (A, B) ohne Zusatz von Calcium (HBSKontrolle) und (C) mit Zusatz von 2 mM Calcium (HBSCa). In der Graphik B wurde auf die Darstellung von 1.1_Eber1 wurde verzichtet, um für die übrigen Werte eine bessere Aussagekraft zu erreichen.
Wiederholungsmessungen mit n = 2 Ebern...134
151
Abb. 31: Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität von Fluo-4 pro Sekunde (a. u.) der PI-negativen Spermien nach Zugabe von DMSO oder Thimerosal (Thim). Dargestellt sind die Konzentrationen 12,5 µM (A), 25,0 µM (B), 50,0 µM (C) sowie 100 µM (D) in HBSKontrolle sowie HBSCa.
Mittelwerte aus n = 3 Ebern...135
Abb. 32: Veränderung des Anteils PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO bzw. 1,25 µM Thapsigargin (Th) in HBSKontrolle, HBSCa, HBSBic und HBSBicCa. Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A, C) und 60 min (B, D). Messungen unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Fluo-4 AM (A, B) sowie FITC-PNA (C, D).
Mittelwerte aus n = 6 Ebern...136 Abb. 33: Veränderung des Anteils PI-positiver Spermien nach Zugabe von DMSO bzw. 100 µM Thimerosal (Thim) in HBSKontrolle, HBSCa, HBSBic und HBSBicCa. Dargestellt sind Änderungen nach den Inkubationszeiten 5 min (A, C) und 60 (B, D) Messungen unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Fluo-4 AM (A, B) sowie FITC-PNA (C, D). Mittelwerte aus n = 6 Ebern…..…….137
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11 Tabellenverzeichnis
Tab 1: Jeder Behandlung mit Thapsigargin wurde eine gleichvolumige Menge DMSO in einer Kontrolle gegenüber gestellt. Die höchste verwendete Menge Thapsigargin/ DMSO entspricht 1 % Vol. des Probenansatzes...40 Tab. 2: Jeder Behandlung mit Thimerosal wurde eine gleichvolumige Menge DMSO in einer Kontrolle gegenüber gestellt. Die höchste verwendete Menge Thimerosal/ DMSO entspricht 4 % Vol. des Probenansatzes. Alle Konzentrationen > 6,0 µM wurden aus der 50 mM Stammlösung hergestellt...42 Tab. 3: CASA-Motilitätsparameter (MW ± SD) für alle mit Thapsigargin sowie Thimerosal durchgeführten Versuche………..128 Tab. 4: Membranintegritätsparameter (MW ± SD) für alle mit Thapsigargin sowie Thimerosal durchgeführten Versuche………..130
Danksagung
Ich danke sehr herzlich meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Dagmar Waberski für die Überlassung des interessanten Themas und die immer gewährte Motivation und Unterstützung bei der Anfertigung der Dissertation.
Für die intensive Begleitung dieser Dissertation in Form vieler fachlicher Anregungen, konstruktiver Kritik und last but not least ansteckender Begeisterung danke ich Dr.
Heiko Henning ganz herzlich.
Ein großer Dank geht an die Mitarbeiter der Reproduktionsmedizinischen Einheit für ihre große Hilfsbereitschaft und die freundliche Arbeitsatmosphäre. Insbesondere möchte ich hier Anja sowie Caro und Karo erwähnen.
Bei meinen Mitdoktoranden aus der Reproduktionsmedizinischen Einheit bedanke ich mich herzlich für ein hilfsbereites und humorvolles Miteinander. Denen, die noch an der Dissertation arbeiten, wünsche ich gutes Durchhalten und denen, die es schon geschafft haben ein erfolgreiches Berufsleben.
Ein besonderer Dank geht an meinen Bruder Matthias, der mir so oft mit Rat und Tat bei allen Fragen rund um den Computer beiseite gestanden und mir damit ein
konzentriertes Arbeiten im „Home Office“ ermöglicht hat.
Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir das Studium ermöglicht haben.
All meinen Freunden, aber insbesondere meinen Freundinnen Vera und Caro danke ich für motivierende Worte, viel Humor und unvergessliche Erlebnisse.
Ein ganz spezieller Dank geht an Robert, der mich die letzten Jahre mit viel Geduld unterstützt und immer wieder Schwung in meinen Alltag gebracht hat.
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation (Funktionelle Charakterisierung
calciumregulatorischer Mechanismen bei Eberspermien mittels Durchflusszytometrie) selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurde folgende Hilfe dritter in
Anspruch genommen:
Das Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik hat mich einmalig freundlichst bei der Anfertigung einer Thimerosal-Stammlösung unterstützt.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation in der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken, Abteilung Kleine Klauentiere, der Tierärztlichen Hochschule Hannover angefertigt.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.