Der blau emittierende Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 diente der Unterscheidung DNA-haltiger (Spermien) und nicht DNA-haltiger (Schmutzpartikel) Messereignisse. Hoechst 33342 permeiert intakte Plasmamembranen und bindet im Zellkern an doppelsträngige DNA. Angeregt wird Hoechst 33342 durch Licht der Wellenlänge 365 nm aus der HBO Quecksilberlampe. Das Emissionsmaximum des Farbstoffes liegt mit 445 nm im blauen bis cyanfarbenen Spektrum. Das Fluoreszenzsignal wird im FL-4-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert.
Hoechst 33342 wurde bei der Erhebung des Membranstatus (s. Kapitel 3.12.2) verwendet.
Der rot emittierende Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid (PI) wurde zur Differenzierung der plasmamembranintakten von den plasmamembrandefekten Zellen verwendet. Das Prinzip der Unterscheidung beruht auf der Permeabilität
22
defekter Plasmamembranen für PI. Intakte Plasmamembranen sind für den Farbstoff nicht passierbar. Im plasmamembrandefekten Spermium dringt PI in die Zelle ein und interkaliert an doppelsträngige DNA und RNA (TAS u. WESTERNENG 1981). Die Anregungsenergie wird vom Argonlaser bereitgestellt. Die Emission des roten Fluoreszenzlichts wird im FL-3-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert. Das Emissionsmaximum liegt bei 617 nm. PI wurde bei jeder Messung eingesetzt.
Der grün emittierende Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM wurde zur Detektion des intrazellulären Calciumgehaltes eingesetzt. Als Azetoxymethylester (AM) permeiert der Farbstoff plasmamembranintakte Zellen. Unter dem Einfluss zytoplasmatischer Esterasen wird Fluo-4 AM zu Fluo-4 deesterifiziert. Fluo-4 verbleibt im Zytoplasma und bindet dort spezifisch Calciumionen (Ca2+). Unter der Anregungsenergie des Argonlasers emittiert das an Ca2+ gebundene Fluo-4 grünes Fluoreszenzlicht mit dem Emissionsmaximum 506 nm. Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist umso höher, je mehr Calciumionen in der Zelle an Fluo-4 gebunden sind. Die Signalstärke erlaubt damit Rückschlüsse auf den intrazellulären Calciumgehalt der untersuchten Spermien. Die Emission des grünen Fluoreszenzlichts wird im FL-1-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert
Der grün emittierende Fluoreszenzfarbstoff FITC-PNA ermöglichte die Differenzierung von Spermien mit intakter oder defekter Akrosommembran. FITC bezeichnet Fluoreszeinisothiocyanat und PNA das daran gekoppelte Peanut Agglutinin. PNA ist ein Lectin aus der Erdnuss und bindet an der Innenseite der äußeren Akrosommembranen von Eberspermien (FLESCH et al. 1998). Die Anregungsenergie wird vom Argonlaser bereitgestellt. Die Emission des grünen Fluoreszenzlichts wird im FL-1-Kanal auf einer logarithmischen Skala detektiert. Das Emissionsmaximum liegt bei 520 nm. FITC-PNA wurde bei der Erhebung des Membranstatus eingesetzt. Weiterhin wurde es zur Untersuchung der Modulatorwirkungen auf die Akrosomintegrität verwendet.
23 3.4 Inhibitoren
Thapsigargin wird aus der Pflanze Thapsia garganica extrahiert. Strukturell gehört es zu den Sesquiterpenlactonen. Funktionell wird es als Inhibitor der SERCA-Enzyme eingesetzt (SERCA = sarco-/ endoplasmatisches Retikulum Ca2+-ATPase).
Unter der Blockade durch Thapsigargin ist die Ca2+-ATPase nicht mehr fähig, Calciumionen aus dem Zytoplasma in die intrazellulären Speicher zu pumpen.
Dadurch steigt der intrazelluläre Calciumgehalt in den mit Thapsigargin versetzten Zellen. Durch die Leerung der intrazellulären Calciumspeicher bzw. den Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes können sekundär plasmamembranständige, spannungsgesteuerte Calciumkanäle geöffnet werden. Abhängig vom Calciumgehalt des extrazellulären Mediums kann es infolgedessen zu einem Calciuminflux von extrazellulär kommen (BREITBART 2002).
Thimerosal ist eine organische Verbindung. Das Natriumsalz einer Quecksilber-verbindung wurde in den Experimenten eingesetzt, um IP3- und ryanodinrezeptor-gesteuerte Calciumkanäle zu öffnen, welche an den intrazellulären Calciumspeichern vermutet werden. Diese Kanäle entlassen Calciumionen aus den Speichern in das Zytoplasma. Durch die Öffnung der Calciumkanäle nach Thimerosalzugabe kommt es zu einem Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes (HO u. SUAREZ 2001).
3.5 HBS-Inkubationsmedien
Für alle nachfolgend beschriebenen Experimente wurden HBS-basierte Inkubationsmedien verwendet (s. Kapitel 9.3). Die Medien enthielten 1 mg/ ml bovines Serumalbumin Fraktion V. Es wurden vier HBS-Medien hergestellt, die sich hinsichtlich des Gehaltes von Calcium und Bicarbonat unterschieden:
1) HBSKontrolle ohne Zusatz von Calcium und Bicarbonat 2) HBSCa mit Zusatz von 2 mM Calcium
3) HBSBic mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat
4) HBSBicCa 2 mM mit Zusatz von Calcium sowie 15 mM Bicarbonat .
24
Die Medien wurden auf den pH-Wert 7,4 bei der Gebrauchstemperatur von 38°C und eine Osmolarität von 295 bis 305 mOsmol/ kg eingestellt. Auf ein EGTA-haltiges Inkubationsmedium wurde verzichtet.
Pro 1 ml HBS-Medium wurden 5 µl PI-Stammlösung (1 mg/ ml) hinzugefügt. Die mit PI versetzten Medien wurden in Portionen zu 1990 µl in 3,5 ml Reagenzröhrchen (Sarstedt, Nürnbrecht) vorgelegt. Vor Messbeginn waren alle Medien für mindestens 120 min einer Temperatur von 38°C ausgesetzt. Die Medien ohne Zusatz von Bicarbonat befanden sich verschlossen im Wärmeschrank (Memmert, Schwabach).
Die Medien mit Zusatz von 15 mM Bicarbonat wurden bei einer Konzentration von 5 % CO2 unverschlossen im CO2-Inkubator (Sanyo, Bad Nenndorf) belassen.
Für die in den Kapiteln 3.14.1, 3.14.2 und 3.14.3 beschriebenen Experimente wurden ausschließlich HBSKontrolle und HBSCa verwendet.
3.6 Tiere und Samengewinnung
Die in den Experimenten verwendeten Ejakulate stammten von neun Ebern aus dem Bestand der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Eber gehörten den Rassen Duroc, Pietrain und Deutsche Landrasse an. Das Alter der Eber betrug im Mittel 2,3 Jahre (Minimum: 1,2 Jahre, Maximum: 4,3 Jahre). Alle Tiere waren klinisch gesund. Die Samengewinnung erfolgte mittels der
„Handmethode“. Die Ejakulate wurden in einem Samenauffangbeutel (US-Bag™, Minitüb GmbH, Tiefenbach), welcher sich in einem Samenauffangbecher (Semen Collection Cup, Minitüb GmbH, Tiefenbach) befand, gesammelt. Sowohl Beutel als auch Becher waren zum Verwendungszeitpunkt auf 38°C temperiert. Nach der Samengewinnung wurde der im Auffangbeutel integrierte Gazefilter inclusive des darin enthaltenen Bulbourethraldrüsensekretes entfernt. Das verbliebene Ejakulat wurde im Samenauffangbeutel luftarm verschlossen und in einer ebenfalls auf 38°C gewärmten Styroporbox umgehend in das institutseigene Labor transportiert.
25 3.7 Standardspermatologie
Im Labor wurde das Ejakulat zügig in einen auf 38°C temperierten, sterilen Glaszylinder umgefüllt. Zunächst wurden Volumen, Farbe und Konsistenz bestimmt.
Danach erfolgte die Untersuchung von Motilität, Spermienkonzentration und Morphologie.
Zur Motilitätsschätzung wurde ein auf 38°C beheizbares Phasenkontrastmikroskop (Anxiostar Plus, Zeiss, Jena) eingesetzt (x 200, Phase 2). Die verwendeten Objektträger (76 x 26 mm, Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig), Deckgläschen (18 x 18 mm, Interessengemeinschaft der Laborfachhändler (IDL) GmbH & Co. KG, Nidderau) sowie Pipettenspitzen (nerbe plus, Winsen/ Luhe) sind auf einer Heizplatte (HT 200, Minitüb GmbH, Tiefenbach) ebenfalls auf 38°C vorgewärmt worden. Mit einer Einkanalpipette (Eppendorf, Hamburg) wurden mindestens zwei senfkorngroße Tropfen (1,5 bis 5,0 µl) nativen Ejakulates auf einen Objektträger verbracht und mit einem Deckgläschen versehen. Darin wurden jeweils mindestens drei Gesichtsfelder betrachtet. Die Gesichtsfelder sollten frei von Luftblasen sein und nicht am Rand des Präparates liegen, da Sauerstoff die Motilität beeinflussen kann. Sowohl vorwärts- als auch ortsbewegliche Spermien wurden als motil eingestuft. Das Gesichtsfeld mit dem höchsten Anteil motiler Samenzellen wurde als repräsentativ erachtet.
Die Spermienkonzentration wurde mit der Zählkammer „Thoma-neu“ (Jürgens, Hannover) im Phasenkontrastmikroskop (Anxiostar Plus, Zeiss, Jena) bestimmt (x 400, Phase 2). Die Auswertung erfolgte in Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966). Aus der Spermienkonzentration, multipliziert mit dem Ejakulatvolumen, wurde die Spermiengesamtzahl ermittelt.
Der prozentuale Anteil morphologisch abweichender Samenzellen wurde aus einer in Formolcitrat fixierten Probe durch Auszählung von 200 Spermien untersucht. Es wurden, abhängig von der Spermienkonzentration, zwischen 5 und 25 µl des nativen Ejakulates mit einer variablen Einkanalpipette in 300 µl Formolcitrat pipettiert. Die Beurteilung erfolgte in Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966) unter Ölimmersion (x 1000, Phase 3) im Phasenkontrastmikroskop (Zeiss 4713849, Zeiss, Jena). Letzter Schritt der Standardspermatologie war die Ermittlung des pH-Wertes
26
mittels pH-Meter (pH-Meter, Multiplex 3000/ pmx, WTW, Weilheim).
Alle verwendeten Ejakulate entsprachen den Gewährschaftsbestimmungen des ZDS (Version Oktober 2005). Der Anteil der als motil eingestuften Spermien durfte im nativen Ejakulat 70 % nicht unterschreiten. Die Spermienkonzentration durfte bei Ebern, die älter als neun Monate waren 0,20 x 106/ µl nicht unterschreiten. Der Anteil morphologisch abweichender Samenzellen durfte 25% nicht überschreiten.
3.8 Samenverdünnung
Alle Versuche mit Thapsigargin und Thimerosal wurden mit einem am Versuchstag frisch hergestellten modifizierten BTS-Medium durchgeführt. Dieser Verdünner enthielt weder EDTA noch Bicarbonat. Dadurch sollte die Beeinflussung von intrazellulärem Calciumgehalt und Kapazitationsverhalten vermieden werden. Der pH-Wert wurde auf 7,4 bei 32°C und die Osmolarität auf 295 bis 305 mOsmol/ kg eingestellt.
Alle verwendeten Ejakulate wurden auf die Spermienkonzentration 20 x 106 verdünnt.
Das Verdünnermedium war zum Verwendungszeitpunkt 32°C warm. In 38°C warmen Ebersamenflaschen (Minitüb GmbH, Tiefenbach) wurden Portionen von je 100 ml Spermiensuspension hergestellt. Das Verdünnen erfolgte durch Vorlegen der benötigten Ejakulatmenge mittels einer auf 38°C temperierten Glaspipette.
Anschließend wurde schrittweise und zügig der Verdünner zugefügt. Durch vorsichtiges Schwenken wurden Ejakulat und Verdünnermedium vermischt. Die Spermiensuspension wurde luftarm verschlossen und stehend für mindestens 90 min bei Raumtemperatur gelagert. Dieses Temperaturregime stellt in der Reproduktions-medizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover die Standardmethodik im Umgang mit Eberspermien dar (SCHMID et al. 2013).
3.9 Beladen der Spermien mit Fluo-4 AM und Dichtegradientenzentrifugation
Die Verwendung von Fluo-4 AM erfolgte stets unter vor Licht geschützten
27
Verhältnissen. Für die Beladung der Samenzellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff wurden 3,5 ml Reagenzröhrchen mit passenden Eindrückstopfen (Sarstedt, Nürnbrecht) verwendet. Fluo-4 AM lag in DMSO gelöst als 2 mM Stammlösung vor.
Für alle Versuche unter Verwendung von Thapsigargin oder Thimerosal wurden die Spermiensuspensionen jeweils mit der Konzentration 2 µM Fluo-4 AM beladen. Dem verdünnten Ejakulat wurde eine Menge von 20 ml entnommen und zu je 2 ml auf zehn 3,5 ml Reagenzröhrchen verteilt. Fünf dieser Röhrchen wurden jeweils 2 µl Fluo-4 AM-Stammlösung zugefügt. Die Spermiensuspension in den übrigen fünf Reagenzröhrchen blieb ungefärbt. Die Reagenzröhrchen wurden verschlossen für 30 min bei Raumtemperatur präinkubiert. Nach der Hälfte der Inkubationszeit wurden die Spermiensuspensionen vorsichtig aufgeschwenkt. Die Beladung der Spermien mit Fluo-4 AM erfolgte in Anlehnung an die Methodik von HARRISON et al. (1993).
Nach Ablauf der 30-minütigen Präinkubation wurden die Spermiensuspensionen durch einen diskontinuierlichen Percoll®-Gradienten zentrifugiert. Zu diesem Zweck wurden in einem Reagenzglasständer 4 gläserne 12 ml Zentrifugenröhrchen mit Spitzboden vorbereitet. Jedes Röhrchen wurde zunächst mit 1 ml einer 70%-igen Percoll®-Gebrauchslösung befüllt. Darüber wurden vorsichtig je 2 ml einer 35%-igen Percoll®-Gebrauchslösung geschichtet. Eine deutliche Phasengrenze zwischen den Konzentrationen musste erkennbar sein. Die Percoll®-Gebrauchslösungen wurden bei Raumtemperatur verwendet.
Die ohne bzw. mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspensionen wurden separat zu jeweils 2 x 5 ml auf das vorgelegte Percoll® geschichtet. Dabei wurde ebenfalls auf die Entstehung einer deutlichen Phasengrenze geachtet.
Im nächsten Schritt erfolgte die Zentrifugation der Spermien durch den Percoll® -Gradienten (Megafuge 2.0 R, Hareaus, Hanau). Nach 10 min bei 300 gmax wurde die Zentrifuge ohne Anhalten auf 15 min bei 750 gmax umgestellt. In der Zentrifuge bestand ebenfalls Raumtemperatur. Nach abgeschlossener Zentrifugation wurde mittels einer Wasserstrahlpumpe der Überstand bis auf ca. 0,5 ml entfernt. Die verbliebenen Spermienpellets wurden mit dem auf 32°C gehaltenen BTS erneut auf 20 x 106/ ml eingestellt. Dabei wurden je zwei Spermiensuspensionen á 2 ml ohne bzw. mit Fluo-4 AM hergestellt. Diese wurden in verschlossenen 3,5 ml
28
Reagenzröhrchen aufbewahrt. Ein Röhrchen diente als Ersatz bzw. zur Erhebung der Motilitäts- und Bewegungsparameter (s. Kapitel 3.10).
3.10 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)
Die Motilität der verwendeten Spermien wurde bei allen Experimenten mit Thapsigargin und Thimerosal mittels SpermVision® (Minitüb GmbH, Tiefenbach) erfasst.
Es handelt sich bei diesem System um eine computergestützte Motilitätsanalyse.
Zum System gehörten ein Mikroskop (Okular 10, Objektiv 20, BX41TF, Olympus, Hamburg), ein TV-Adapter (U-TV 0.63XC; Olympus, Hamburg), eine Digitalkamera (AccuPiXEL TM6760 CL, Auflösung 600 x 800 Pixel, JAI A/S, Glostrup, Dänemark), eine Heizplatte (HT 300, Minitüb GmbH, Tiefenbach) und ein Computer mit der Software SpermVision® (Version 3.7, Minitüb GmbH, Tiefenbach).
Das Mikroskop war mit einem automatisch fahrendem Kreuztisch und einem beheizbaren Objekttisch ausgestattet. Die Heizung des Objekttisches wurde von der beheizbaren Arbeitsplatte gesteuert. Der TV-Adapter verband das Mikroskop mit der Digitalkamera. Der Computer verarbeitete die Aufnahmen der Digitalkamera. Die Motilitäts- sowie Bewegungsparameter der Spermien wurden im negativen Phasenkontrast untersucht. Für jede Messung wurden 2,9 µl Spermiensuspension in eine Leja-Messkammer mit 20 μm Schichtdicke (SC 20-01-04-B, Leja Products B.V., Nieuw-Vennep, The Netherlands) pipettiert. Pro Messdurchgang wurden mindestens 400 Spermien oder 10 Messfelder erfasst. Das Ansteuern der Messfelder wurde automatisiert durch den fahrbaren Kreuztisch vorgenommen. Partikel mit einer Fläche zwischen 23 und 120 µm2 wurden als potentielle Spermien angesprochen.
Die genauen Messpositionen sind im Anhang (s. Kapitel 9.4) dargestellt. Für jede Messposition wurden aus 30 Einzelbildern die Motilitäts- und Bewegungsparameter der dort vorhandenen Spermien erfasst.
29
zurückgelegte Wegstrecken [μm]:
DSL = straight-line distance DCL = curvelinear distance DAP = average path distance
Geschwindigkeiten [μm/s]:
VSL = straight-line velocity VCL = curvilinear velocity VAP =average path velocity
gemittelte maximale seitliche Kopfauslenkung von der mittleren Bahn [μm] : ALH = amplitude of lateral headdisplacement
Frequenz des Kreuzens des gewundenen Bewegungspfades mit der gemittelten Bewegungsbahn [Hz] :
BCF = beat cross frequency
Gerichtetheit der Bewegung:
WOB = VAP / VCL = wobble STR = VSL / VAP = straightness LIN = VSL / VCL = linearity
durchschnittlicher Richtungswechsel des Spermienkopfes:
AOC = average orientation change
Spermien mit einem AOC < 2,5 wurden als immotil eingestuft. Spermien mit einer DSL < 4,5 galten als lokal motil.
Alle Spermien, die nicht durch diese Klassifikation erfasst wurden, galten als progressiv motil. Das SpermVision®-System ermittelte für jede Messung den Prozent-satz der als motil und progressiv motil eingeordneten Spermien. Die Bewegungs-parameter wurden als Mittelwerte für die progressiv motilen Spermien ausgewiesen.
30
Jeweils nach Beginn der letzten Inkubation eines Messdurchgangs wurden ca. 2 ml der ohne Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspensionen in ein Reagenzröhrchen aus Glas überführt. Die Spermiensuspensionen wurden für 5 min in einem auf 38°C temperiertem Wasserbad (WNB 745, Memmert, Schwabach) inkubiert. Im Anschluss wurden die Röhrchen mit vorgewärmtem (38°C) Parafilm (Landgraf Laborsysteme, Langenhagen) verschlossen und vorsichtig 3 x über Kopf geschwenkt. Es wurden 2,9 µl entnommen und in eine vorgewärmte (38°C) Leja-Kammer pipettiert. Beim Pipettieren wurde darauf geachtet, dass ein hängender Tropfen der Spermiensuspension in die Kammer angesaugt wurde und dabei keine Luftblasen entstanden. Nicht vorschriftsmäßig befüllte Felder sowie Felder mit Luftblasen wurden verworfen.
3.11 Durchflusszytometer
Für alle nachfolgend beschriebenen durchflusszytometrischen Erhebungen wurde mit dem Durchflusszytometer „Dako Galaxy“ (Fa. Dako, Hamburg) gearbeitet.
Das Gerät enthält einen Argonlaser (488 nm, 20 mW), und verschiedene Filter. Für grünes Fluoreszenzlicht wird der Filter FL-1 (537,5/ 22,5 nm) verwendet, für rotes Fluoreszenzlicht der FL-3 (630 nm LP) und für blaues Fluoreszenzlicht der FL-4 (465 nm BP). Die zweite Anregungslichtquelle ist eine HBO Quecksilberlampe (300 bis 400 nm, 100 W). Im Strahlengang der Quecksilberlampe befinden sich zwei weitere Filter zur Selektion auf das Anregungsspektrum der Quecksilberlampe. Der erste selektiert auf Wellenlängen von 300 bis 700 nm. Der zweite Filter lässt nur Licht der Wellenlänge zwischen 270 nm und 405 nm passieren. Damit ergibt sich ein Hauptemissionspeak von 365 nm. Die dem Durchflusszytometer zugehörige Software ist FloMax 2.4 (Fa. Partec, Münster).
Als sheath fluid wurde HEPES®-buffered Saline verwendet. Diese HEPES®-buffered saline wurde am Versuchstag frisch hergestellt. Die Osmolarität wurde auf 295 bis 305 mOsmol/ kg eingestellt. Der pH-Wert betrug 7,55 bei Raumtemperatur bzw. 7,40 bei der Gebrauchstemperatur von 38°C. Die Sterilfiltration erfolgte mittels einer Filtriereinheit (PES-Membran; 0,22 µm Porendurchmesser, Millipore; Irland). Die
31
sheath fluid wurde während des Versuchs auf 38°C gehalten und durch regelmäßiges Schwenken des Kanisters durchmengt.
Vor der Erhebung der eigentlichen Messdaten musste grundsätzlich die Signalverstärkung für die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe festgelegt werden.
Diese Einstellungen wurden gespeichert und dienten als einheitliche Basis für die folgenden Messungen.
Es wurden zwei Grundeinstellungen festgelegt. Erst wurden die Signalverstärkungen für die Erhebung des Membranstatus (s. Kapitel 3.12) festgelegt, anschließend für die Time-gate-Messungen mit den Inhibitoren (s. Kapitel 3.13). Das Volumen aller Probenansätze wurde auf 2 ml reguliert um eine Divergenz zwischen der Messung des Membranstatus und den Time-Gate-Messungen zu vermeiden. Alle Probenansätze wurden für 5 min bei 38°C im Wärmeschrank inkubiert. Das Vorgehen zur Grundeinstellung des Durchflusszytometers wurde für alle nachfolgend beschriebenen Experimente (s. Kapitel 3.14) angewandt.
3.12 Erhebung des Membranstatus
3.12.1 Grundeinstellungen
Die Signalverstärkungen für alle Parameter wurden an diesem Probenansatz festgelegt:
1960 µl HBSKontrolle
10 µl Hoechst 33342-Stammlösung (150 µg/ ml) 10 µl PI-Stammlösung (1,0 mg/ ml) 10 µl FITC-PNA- Stammlösung (600 µg/ ml) 10 µl ungefärbte Spermiensuspension.
Es wurden die Signalverstärkungen für die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC), Seitwärtsstreuung (SSC) sowie die Signalverstärkungen für die Blaufluoreszenz im FL-4-Kanal, für die Rotfluoreszenz im FL-3-Kanal und die Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal eingestellt.
32
Im Histogramm zur Darstellung des FSC wurde eine glockenförmige Verteilung der Messereignisse angestrebt. Signale von Schmutzpartikeln wurden links der Messereignisse dargestellt und durch die Justierung der Signalverstärkung aus dem Histogramm entfernt. In einem zweiten Histogramm wurden FSC (Abszisse) sowie SSC (Ordinate) gegeneinander aufgetragen. Spermien stellten sich in diesem Punktewolkendiagramm in einer „L“- oder Dreiecksform dar. Im FL-4-Kanal wurde das Signal in den Bereich der zweiten und dritten Dekade der logarithmischen Skala verstärkt.
Die Signalverstärkung für die Rotfluoreszenz im FL-3-Kanal musste eine klare Differenzierung zwischen den mit PI angefärbten und den nicht angefärbten
Spermien gewährleisten. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der PI-negativen Spermien wurde dazu mittig um den Wert 1 auf der logarithmischen
Abszisse verschoben. Die PI-positive Spermienpopulation wies eine mindestens zehnfache Fluoreszenzintensität auf.
Bei der Signalverstärkung für die Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal musste ebenfalls eine klare Differenzierung zwischen den mit FITC-PNA angefärbten und den nicht angefärbten Spermien gewährleistet sein. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der FITC-PNA-negativen Spermien wurde dazu mittig um den Wert 1 auf der logarithmischen Abszisse verschoben. Die FITC-PNA-positive Spermiensub-population wies eine mindestens zehnfache Fluoreszenzintensität auf.
3.12.2 Durchführung der Messungen
Vor Beginn und nach Beendigung der Inkubationsreihen wurde für jedes verwendete Ejakulat der Membranstatus festgestellt. Dazu dienten die ohne Fluo-4 AM präinkubierten Spermien. Der Probenansatz beinhaltete:
1960 µl HBSKontrolle
10 µl Hoechst 33342-Stammlösung (150 µg/ ml) 10 µl PI-Stammlösung (1,0 mg/ ml) 10 µl FITC-PNA- Stammlösung (600 µg/ ml) 10 µl Spermiensuspension.
33
Pro Messung wurden 10000 Zellen erfasst. Die gerätespezifische Geschwindigkeit war 2. Das Vorgehen zur Erhebung des Membranstatus wurde für alle nachfolgend beschriebenen Experimente angewandt. In Versuchen, die in mehreren Durchgängen (Kapitel 3.13.2) ausgeführt wurden, ist der Membranstatus jeder verwendeten Spermiensuspension erhoben worden.
3.12.3 Auswertung
Das im Folgenden beschriebene Vorgehen zur Auswertung des Membranstatus wurde bei allen Versuchen angewandt.
Die erste Range (RN1) definierte die DNA-haltigen Messereignisse im FL-4-Kanal.
Die zweite Range (RN2) wurde im FSC-Kanal im Bereich 0 bis 150 auf der linearen Abszisse gesetzt. Dadurch wurde eine Eingrenzung auf Messereignisse, die der Größe von Eberspermien entsprachen, vollzogen. Aus den Ranges wurde das logische Gate G1 (RN1 + RN2 = G1) gebildet. G1 wurde auf alle Histogramme gelegt.
Nachfolgend wurden nur noch Spermien betrachtet, die G1 entsprachen. Anhand des FL-1/ FL-3-Punktewolken-histogramms wurde eine mögliche Überlagerung des Emissionsspektrums von FITC-PNA und PI durch mathematische Kompensation ausgeglichen.
Weiterhin wurde im Punktewolkendiagramm eine Trennung der FITC-PNA- bzw.
PI-negativen und -positiven Spermien vollzogen. In den entstandenen Quadranten konnten die prozentualen Anteile folgender Subpopulationen abgelesen werden:
Q1: PI-positiv & FITC-PNA-negativ Q2: PI-positiv & FITC-PNA-positiv Q3: PI-negativ & FITC-PNA-negativ Q4: PI-negativ & FITC-PNA-positiv.
34 3.13 Time-gate Messungen
3.13.1 Grundeinstellungen
Die Signalverstärkungen für alle Parameter wurden an diesen Probenansätzen festgelegt:
1) 1990 µl HBSKontrolle inclusive Propidiumiodid (5 µl PI-Stammlösung
(1 mg/ ml)/ ml), 10 µl der mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension
2) 1985 µl HBSCa inclusive Propidiumiodid (5 µl PI-Stammlösung (1 mg/ ml)/ ml) , 5 µl des Calciumionophors A23187,
10 µl der mit Fluo-4 AM präinkubierten Spermiensuspension
Mit dem Probenansatz 1) wurden die Signalverstärkungen für die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC), Seitwärtsstreuung (SSC), Rotfluoreszenz im FL-3-Kanal und Grünfluoreszenz im FL-1-Kanal festgelegt. Das Vorgehen zur Einstellung der Parameter FSC, SSC und Rotfluoreszenz entsprach dem in Kapitel 3.12.1 beschriebenen (s. oben). Auf den Einsatz von Hoechst 33342 wurde verzichtet, da die Zellen mittels der Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Percoll® -Gradienten von Seminalplasmabestandteilen und Schmutzpartikeln gereinigt waren.
Mit dem Probenansatz 2) wurde die erfolgreiche Beladung der Spermien mit Fluo-4 AM kontrolliert. A23187 ist ein Ionophor für divalente Kationen. Im Versuch diente es der Permeabilisierung der Plasmamembran für Calciumionen aus dem extrazellulären Inkubationsmedium. Unter dem Einfluss des Ionophors und der Calciumionen in HBSCa musste im FL-1-Kanal eine Erhöhung der Signalintensität in den Bereich der dritten Dekade auf der logarithmischen Abszisse zu sehen sein.
35 3.13.2 Durchführung der Messungen
Für jeden Messdurchgang wurde ein Aliquot des verdünnten Ejakulates ohne Zusatz eines Fluoreszenzfarbstoffes oder mit Fluo-4 AM präinkubiert, über einen diskontinuierlichen Percoll®-Gradienten zentrifugiert und erneut verdünnt.
Komplexere, zeitlich aufwändigere Experimente wurden in mehreren Versuchsdurchgängen ausgeführt, um eine mögliche Beeinträchtigung der Spermien durch zu lange Verwendungszeiten zu vermeiden. D. h. es wurden mehrfach Aliquots des verdünnten Samens mit und ohne Fluo-4 AM präinkubiert und durch den Percoll®-Gradienten zentrifugiert.
Als Messdurchgang werden nachfolgend Versuchseinheiten beschrieben, die an demselben Aliquot einer Spermiensusupension nach Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wurden. Vom Beginn der ersten Messung eines Durchganges bis zur
Als Messdurchgang werden nachfolgend Versuchseinheiten beschrieben, die an demselben Aliquot einer Spermiensusupension nach Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wurden. Vom Beginn der ersten Messung eines Durchganges bis zur