Die eigenen Untersuchungen geben auf funktioneller Ebene Hinweise auf die Beteiligung rezeptorgesteuerter Calciumkanäle an der Regulation der Calcium-homöostase von Eberspermien. Es konnte gezeigt werden, dass die modulierten Strukturen sowohl unter kapazitierenden als auch nicht kapazitierenden Inkubations-bedingungen eine Rolle für die Calciumregulation bei Eberspermien spielen.
IP3- oder ryanodinrezeptorgesteuerte Calciumkanäle scheinen an der Aufrechter-haltung eines niedrigen intrazellulären Calciumgehaltes bei Eberspermien beteiligt zu sein. Die Beteiligung von SERCAs blieb uneindeutig, da der Inhibitor zu einer kausal nicht näher differenzierbaren Abnahme der Akrosomintegrität führte. Zukünftige durchflusszytometrische Studien sollten auch calciumfreie (d. h. EGTA-haltige) Inkubationsmedien beinhalten, um die Rolle des extrazellulären Calciums für die beschriebenen Regulationsvorgänge exakter bestimmen zu können. Die Lokalisation der in der vorliegenden Studie funktionell charakterisierten Strukturen bei Eberspermien sollten durch immunhistochemische Experimente untermauert werden.
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6 Zusammenfassung
Annett Noack (2014)
Funktionelle Charakterisierung calciumregulatorischer Mechanismen bei Eberspermien mittels Durchflusszytometrie
Ziel der vorliegenden Studie war es, Einblicke in die Regulation der intrazellulären Calciumhomöostase von Eberspermien zu erhalten. Insbesondere das Vorhanden-sein von Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3)- bzw. ryanodinrezeptorgesteuerten Calcium-kanälen sowie sarco-/ endoplasmatischen Retikulum Calcium-ATPasen (SERCAs) sollte auf funktioneller Ebene nachgewiesen werden. Um diese Strukturen zu modulieren, wurden Thapsigargin und Thimerosal verwendet. Thapsigargin inhibiert die SERCA während Thimerosal IP3- sowie ryanodinrezeptorgesteuerte Calcium-kanäle öffnet.
Es wurden sechs durchflusszytometrische Experimente durchgeführt. Die ersten fünf Experimente wurden mit je drei und das abschließende Experiment mit sechs normospermen, frisch verdünnten Ejakulaten durchgeführt. Die Proben wurden mit Fluo-4 AM angefärbt, anschließend mittels Percoll®-Dichtegradientenzentrifugation (35 %/ 70 %) von Seminalplasma sowie überschüssigem Fluoreszenzfarbstoff gereinigt und in HBS resuspendiert. Alle Messungen wurden bei 38°C durchgeführt, nachdem die Spermien unterschiedlich lange in HBS-Medien inkubiert wurden. Diese Medien variierten ausschließlich im Gehalt an Calcium und Bicarbonat. In jeder Messung wurde die Spermienviabilität mittels Propidiumiodid (PI) erfasst. Für Auswertungen hinsichtlich intrazellulärem Calciumgehalt und Akrosomintegrität wurden nur plasmamembranintakte Zellen berücksichtigt.
Im ersten und dritten Experiment wurden jeweils die optimalen Wirkkonzentrationen von Thapsigargin und Thimerosal in zwei Inkubationsmedien bestimmt. Beide Modulatoren erhöhten dosisabhängig den intrazellulären Calciumgehalt. Allerdings wirkte sich die Applikation von Thapsigargin, ebenfalls dosisabhängig, negativ auf die Plasmamembranintegrität aus. Ein weiterer Unterschied zwischen den Modulator-wirkungen war die Entstehung einer Spermiensubpopulation mit erhöhter
114
Fluoreszenzintensität von Fluo-4 in den Messungen mit Thapsigargin.
Im zweiten Experiment wurde die Verlässlichkeit der Versuchsanordnung überprüft.
Dazu wurden Proben von zwei Ebern in Wiederholungsmessungen verglichen. Die Reproduzierbarkeit der Daten konnte demonstriert werden.
Im vierten und fünften Experiment wurden Thapsigargin und Thimerosal jeweils nach verschiedenen Inkubationszeiten in vier verschiedenen Inkubationsmedien eingesetzt. Es zeigte sich, dass insbesondere kapazitierende Inkubations-bedingungen (60 min Inkubation unter Zusatz von 15 mM Bicarbonat und 2 mM Calcium), auch in Abwesenheit der Modulatoren, zur Destabilisierung der Plasmamembran und zum Zelltod eines Teils der Spermien führten.
In einem abschließenden Experiment wurde zusätzlich zum intrazellulären Calcium-gehalt auch die Akrosomintegrität detektiert. Zu diesem Zweck fand ein weiterer grüner Fluoreszenzfarbstoff Verwendung: FITC-PNA. Thapsigargin und Thimerosal wurden jeweils an denselben Proben verwendet. Inkubiert wurde in allen vier HBS-Medien, entweder für 5 oder 60 min. Beide Modulatoren steigerten die intrazelluläre Calciumkonzentration. Aber nur Thapsigargin bedingte einen deutlichen Anteil akrosomreagierter Spermien in allen Messungen, während Thimerosal die Akrosomintegrität nicht beeinflusste.
Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration nach Thapsigarginzugabe kann auf einen store operated calcium entry als Folge einer spezifischen Hemmung der SERCAs zurückzuführen sein. Alternativ ist eine unspezifische Membran-destabilisierung oder ein Ansprechen plasmamembranständiger Rezeptoren zu berücksichtigen.
IP3- oder ryanodinrezeptorgesteuerte Calciumkanäle scheinen an der Aufrechter-haltung eines niedrigen intrazellulären Calciumgehaltes bei Eberspermien beteiligt zu sein. Zukünftige durchflusszytometrische Studien sollten auch calciumfreie (d. h.
EGTA-haltige) Inkubationsmedien beinhalten, um die Rolle des extrazellulären Calciums für die beschriebenen Regulationsvorgänge exakter bestimmen zu können.
Die Lokalisation der in der vorliegenden Studie funktionell charakterisierten Strukturen bei Eberspermien sollten durch immunhistochemische Experimente untermauert werden.
115 homeostasis of boar spermatozoa. Especially the presence of Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) and ryanodine receptor-gated calcium channels as well as the sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum Ca-ATPase (SERCA) ought to be functionally proven. For modulating these structures, Thapsigargin and Thimerosal were utilised.
Thapsigargin inhibits SERCA, while Thimerosal opens IP3 and ryanodine receptor-gated calcium channels.
Six flow cytometric experiments were conducted. The first five experiments included the measurements of each three, and the concluding experiment of six freshly diluted ejaculates, which all complied with the standard. Semen samples were stained with Fluo-4 AM, subsequently washed from seminal plasma as well as excess fluorescent dye by Percoll discontinuous gradient (35 %/ 70 %) and resuspended in Hepes buffered saline (HBS). All measurements were carried out at 38 °C after different periods of incubation in varying HBS media. The Media differed only in their content of calcium and bicarbonate. In each experiment sperm viability was detected by using PI. Analyses relating to intracellular calcium concentrations and acrosomal integrity were made exclusively of plasma membrane-intact cells.
In the first and the third experiment, the effective concentrations of Thapsigargin and Thimerosal were determined in two incubation media. Both modulators elevated the intracellular calcium concentration in a dose dependent manner. However, Thapsigargin, also dose dependent, negatively affected the plasma membrane integrity. Another difference between the modulating effects was the formation of a sperm subpopulation with increased fluorescent intensity of Fluo-4 in the measurements with added Thapsigargin.
In the second experiment, the test system dependability was surveyed. Therefore, probes of two boars were repeatedly measured and compared. The reproducibility of
116 the data could be demonstrated.
In the fourth and fifth experiment, Thapsigargin or Thimerosal were each added after different incubation periods in four different media. It was figured out that especially capacitating conditions (60 min of incubation with 15 mM bicarbonate and 2 mM calcium) partially lead to plasma membrane destabilisation and cell death, also in the absence of the modulators.
The final experiment was a study including not only the detection of the intracellular calcium parameters but also of the acrosome integrity. Therefore, another green fluorescent dye was utilized: FITC-PNA. The same probes were tested each with Thapsigargin and Thimerosal. Incubation was conducted in all four HBS-media for 5 as well as 60 minutes. Both modulators elevated the intracellular calcium concentration. But only Thapsigargin lead to a marked percentage of acrosome reacted spermatozoa in all measurements, while Thimerosal did not affect acrosomal integrity at all. The elevation of the intracellular calcium concentration after addition of Thapsigargin could result from a store operated calcium entry as a consequence of a specific SERCA inhibition. Alternatively, a nonspecific membrane destabilization or an activation of plasma membrane receptors must be considered.
IP3 or ryanodine receptor-gated calcium channels appear to be involved in maintaining a low intracellular calcium concentration in boar spermatozoa. Future flow cytometric studies should also include calcium-free (that means EGTA-containing) incubation media, to determine more exactly the role of extracellular calcium for the described regulatory processes. The structures characterised in the present study should be localized within the boar spermatozoa by immunohistochemistry.
117
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