3. Material und Methoden
3.2 Methoden
3.2.1 Zellexperimentelle Methoden
3.2.1.4 Analyse von Proteinen
3.2.1.4.1 Isolierung von Gesamtzellextrakten für Western Blot Analyse
Die Zellkulturschalen mit adhärent wachsenden Zellen werden auf Eis gestellt. Nach Abnahme des Mediums werden die Zellen zweimal vorsichtig mit ca. 10 ml PBS gewaschen und mit RIPA-Puffer inkubiert (500 µl / 10 cm Schale). Nach fünf-minütiger Inkubation wird das Lysat abgeschabt, in 15 ml Falcon-Tubes überführt und fortan auf Eis gelagert. Die Lysate werden ultraschallbehandelt (Duty-cycle 50 %, level 5), um die Membranen zu zerstören und die DNA zu scheren. Nachdem die Suspension 30 min auf Eis inkubiert hat, wird sie zentrifugiert (14.000 × g, 5 min, 4 °C), um die Proteine von den Zelltrümmern zu trennen. Der Überstand mit den Proteinen wird abgenommen und in 1,5 ml Eppendorf Tubes bei –70 °C gelagert.
3.2.1.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen (BRADFORD, 1976)
Bei dieser Methode wird die Farbänderung ausgenutzt, die entsteht, wenn der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G250 an Proteine bindet. Dabei kommt es zu einer Verschiebung der Absorption zu 595 nm (blau), bei der die Protein-konzentration der zu analysierenden Lösung bestimmt und mit der von Standard-Proteinlösungen verglichen wird. Als Proteinstandard wird eine Rinderserum-Albumin(BSA)-Lösung verwendet, mit dem eine Eichgerade erstellt wird, deren Absorptionswerte den Konzentrationen von 1 – 10 µg / µl entsprechen. Zur Erstellung der Eichgerade und Vermessung der Proben werden die gewünschten Mengen der BSA-Lösung bzw. 1 – 4 µl der Proben mit bidest. Wasser auf 800 µl aufgefüllt und 200 µl Bradford-Reagenz dazugegeben. Nach mindestens 2 min Stehenlassen bei Raumtemperatur werden die Absorptionswerte mittels Photometer gemessen.
3.2.1.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (LÄMMLI, 1970) Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dient der Auftrennung und Analyse von Proteinen. Unter denaturierenden Bedingungen lagern sich SDS-Moleküle an die Proteine proportional zu deren Länge und damit deren Gewicht an.
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Dadurch werden so viele negative Ladungen gebunden, dass die Ladungen der Aminosäuren des Proteins selbst keine Rolle spielen und zur Anode wandern.
Die Proteinextrakte werden in Westernladepuffer aufgenommen und durch Kochen denaturiert. Der Puffer enthält SDS und β-Mercaptoethanol, die die Neubildung von Sekundärstrukturen verhindern.
Das SDS-Polyacrylamid-Gel besteht aus einem Sammel- und einem Trenngel. Das Sammelgel hat große Poren und einen niedrigen pH-Wert. Die Proteine passieren es schneller und sammeln sich unabhängig vom Ladungsvolumen an der Grenze zum Trenngel. Im Trenngel, das kleinere Poren und einen höheren pH-Wert hat, werden die Proteine nach der Größe aufgetrennt. Durch die Verwendung von Protein-standards kann die Größe der analysierten Proteine bestimmt werden.
Zuerst wird das Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet, um einen glatten Gelrand zu gewährleisten und die Polymerisation unter Sauerstoffabschluß zu beschleunigen. Nach einer Stunde ist das Gel polymerisiert, der Alkohol wird abgegossen, das Sammelgel auf das Trenngel gegossen und der Kamm luftblasen-frei im Sammelgel fixiert. Nach der Polymerisation wird der Kamm entfernt, und das Gel kann mit den Proben (50 µg Protein pro Spur) beladen werden. Die elektro-phoretische Auftrennung der Proteine erfolgt bei Raumtemperatur in 1 × Lämmli-Puffer innerhalb 3 – 5 Stunden bei 25 – 50 mA.
3.2.1.4.4 Western Blot-Technik
Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine werden durch den Transfer auf eine Membran immobilisiert. Dabei bleibt das Trennmuster und die Immunreaktivität der Proteine erhalten.
Der Transfer erfolgt durch eine elektrische Spannung, wobei die SDS-beladenen Proteine wieder zur Anode wandern. Danach wird die Membran mit einem gegen ein bestimmtes Protein gerichteten Antikörper inkubiert. An diesen bindet dann ein Zweitantikörper, der gegen den Erstantikörper gerichtet ist und mit Meerrettich-peroxidase konjugiert ist. Dieses Enzym katalysiert unter alkalischen Bedingungen mit Wasserstoffperoxid die Oxidation von Luminol zu einem Dioxetan, das instabil ist.
Bei dessen Zerfall entsteht Licht, das mittels Autoradiographie nachgewiesen wird.
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Diese Chemolumineszens wird in Gegenwart von Verstärkern wie Phenol erhöht (Enhanced Chemolumineszens = ECL).
Für den Transfer der Proteine auf die Membran wird der „semi-dry“-Transfer verwendet: Die Membran wird zur Aktivierung zunächst in technischem Methanol inkubiert, und dann 5 min mit bidestilliertem Wasser gespült. Schließlich wird sie für 15 min in 1 × Towbin-Puffer + 10 % Methanol äquilibriert. Dann wird das Gel aus der Glaskammer entfernt und vom Sammelgel abgetrennt. Gel und Membran werden zwischen mehrere Lagen in Towbin-Puffer getränkte Whatman-Papiere in die wasserfeuchte Blotkammer (Anode) gelegt. Von der Anode zur Kathode hin werden folgende Schichten übereinandergelegt: 9 Whatman-Papiere, die PVDF-Membran, das Trenngel, und nochmals 9 Whatman-Papiere. Die einzelnen Lagen werden jeweils mit Hilfe eines Douncers luftblasenfrei aufeinandergelegt. Der Deckel (Kathode) wird auf die Kammer gelegt und die Kammer bei 4 °C an eine Spannungsquelle angeschlossen. Die Stromstärke berechnet sich aus Fläche der Membran × Stromstärke pro cm2 . Die Stromstärke pro cm2 beträgt 1,2 mA, die Blot-Zeit 70 min. Die Membran wird mit Blockierpuffer (5 % Milchpulver in TBS-T) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen abzudecken.
Immunologischer Nachweis: Der spezifische Antikörper wird nach Vorgabe in Blockierpuffer verdünnt. In dieser Lösung wird die Membran über Nacht bei 4 °C auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Am folgenden Tag wird ungebundener Antikörper durch dreimaliges Waschen für je 10 min mit Waschpuffer (TBS-T) entfernt.
Anschließend gibt man den Zweitantikörper, ebenfalls in Blockierpuffer verdünnt, auf die Membran und inkubiert bei Raumtemperatur auf einem Überkopfschüttler. Nach einer Stunde wird die Membran erneut dreimal 10 min mit TBS-T und einmal 10 min mit TBS gewaschen, um auch hier die nichtgebundenen Antikörper zu entfernen. Der Nachweis der Antikörperkomplexe erfolgt mit dem ECL-Western Blotting Detection Kit. Die beiden Reagenzien werden im Verhältnis 1 : 1 miteinander gemischt und auf die Membran gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 – 2 min wird die ECL-Flüssigkeit abgegossen, die Membran in eine Autoradiographiekassette geklebt und mit Klarsichtfolie bedeckt. Röntgenfilme werden bei Raumtemperatur zwischen 1 sec und bis zu 30 min exponiert.
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Zur Lagerung der Membranen wird die ECL-Flüssigkeit nach der Autoradiographie mit bidestilliertem Wasser abgewaschen. Die Membranen können danach entweder trocken gelagert oder für den Nachweis anderer Proteine weiterverwendet werden.
Im letzteren Fall müssen durch „Strippen“ die bereits gebundenen Antikörper entfernt werden, ohne die Epitope der Proteine zu verändern. Eine schon getrocknete Membran wird vorher mit Methanol 5 min lang aktiviert und 5 min in bidestilliertem Wasser gewaschen. Dann wird die Membran zweimal für 10 min in 0,2 M Glycin/HCl inkubiert. Mit bidestilliertem Wasser wird anschließend der Glycinpuffer entfernt und die Membran zweimal 5 min lang in 1 x TBS gewaschen. Bevor die Membran mit einem neuen Erstantikörper inkubiert werden kann, muss sie erneut mit Blockier-puffer geblockt werden (siehe oben).
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