Histologische und immunhistochemische Methoden

3.2.2.4.1 Hämatoxylin-Eosin (HE-Färbung) der formalinfixierten Gewebeschnitte Die HE-Färbung der formalinfixierten Schnitte erfolgt in Zusammenarbeit mit den Mitarbeitern der Pathologie des DKFZ (Abteilung Prof. Gröne). Die Schnitte werden 2 × 10 min in Xylol und einer absteigenden Alkoholreihe je 2 × 1 min in 100 %, 96 %, 90 % und 1 × 1 min in 80 % und 70 % Ethanol entparaffiniert und rehydriert, in Aqua bidest. gestellt und 5 min in Hämalaunlösung inkubiert. Nach Waschen in Aqua bidest. wird in 0,5 %iger HCl – Ethanollösung durch kurzes Spülen überschüssiges Hämalaun entfernt, und anschließend werden die Schnitte 10 min lang in Leitungs-wasser gewaschen. Die Objektträger werden 30 sec in Eosinlösung gestellt, in Aqua bidest. gespült und in einer aufsteigenden Alkoholreihe von 70 % bis 100 % Ethanol entwässert, in Xylol inkubiert und mit Eukitt eingedeckelt.

3.2.2.4.2 Morphometriemessung

Mit einem halbautomatischen Bildanalysesysem (Leica Q600 Qwin, Cambridge, England) kann man den prozentualen Anteil markierter Flächen im Vergleich zur Gesamtfläche eines histologischen Präparats unter dem Mikroskop bestimmen. Im vorliegenden Fall wird der Anteil an Nekrose im Vergleich zur Gesamtfläche im HE-gefärbten Tumorparaffinschnitt bei 50facher Vergrößerung gemessen.

Mit dem Programm wird die Vergrößerung ausgewählt und Flächenteile des Gesichtsfeldes, die von der Messung ausgeschlossen werden (z. B. Hintergrund-fläche), eliminiert. Zum Messen der Nekrosen werden mit Hilfe der Maus die entsprechenden Flächen umfahren, die auf dem Bildschirm dann grün gefärbt dargestellt werden. Nach Beendigung der Vermessung des gewählten Ausschnitts berechnet der Computer den prozentualen Anteil an markierten Flächen. Nach Vermessung der ganzen Schnittfläche wird der Gesamtanteil ermittelt.

Material und Methoden 43

3.2.2.4.3 Ki-67 Immunhistochemie nach der Avidin-Biotin-Streptavidin-Komplex- Methode

Zur immunhistochemischen Untersuchung werden die Tumorschnitte entparaffiniert (siehe HE-Färbung). Die Antigendemaskierung erfolgt mit Citratpuffer in der Mikro-welle. Zum „Vorheizen“ wird ein mit Aqua bidest. gefülltes Becherglas bei maximaler Leistung 3 min zum Kochen gebracht. Die deparaffinierten Schnitte werden in eine mit 0,1 M Citratpuffer (pH 6,0) gefüllte Standküvette aus Plexiglas gestellt und in der Mikrowelle 5 mal 4 min bei 650 W gekocht. Damit die Präparate nicht austrocknen, füllt man die Küvetten zwischen den Kochvorgängen mit dem heißen Aqua bidest.

auf. Die Objektträger lässt man in den Kochgefäßen mindestens 30 min langsam abkühlen. Anschließend schüttelt man sie trocken, ohne dass die Schnitte völlig austrocknen, und umfährt die Schnitte mit Fixogum, damit aufpipettierte Lösungen auf den liegenden Objektträgern nicht abfließen können. Nach dem Trocknen des Klebstoffs werden die Objektträger 3 × 5 min in PBS gewaschen. Die endogene Peroxidase wird durch Inkubation in 3 % H 2O2 / PBS für 10 min blockiert und die Schnitte danach erneut 2 × 5 min in PBS gewaschen. Das Blockieren erfolgt in einer feuchten Kammer je 15 min lang mit der Avidin- und anschließend mit der Biotin-Lösung (Bestandteil des Avidin-Biotin-Streptavidin-Kits, 1 Tropfen pro Schnitt).

Zwischen und nach den beiden Blockierungsschritten werden die Objektträger nicht gespült. Als feuchte Kammer werden Diaaufbewahrungskästen benutzt, die mit wassergetränkten Papiertüchern ausgelegt sind. Die Schnitte werden in der feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C mit dem 1. Antikörper inkubiert. Am nächsten Tag werden die Schnitte 3 × 5 min in PBS gewaschen und in der feuchten Kammer für 40 min bei Raumtemperatur mit dem 2. Antikörper inkubiert. Der Zweitantikörper ist an Biotin gekoppelt. Er wird 1 : 2 in Glycerin vorverdünnt bei -20 °C gelagert und zur Anwendung 1 : 125 in BSA-Lösung verdünnt. Die Endverdünnung beträgt 1 : 250.

Nach der Inkubationszeit werden die Schnitte erneut 3 × 5 min in PBS gewaschen.

Anschließend erfolgt eine Inkubation mit Peroxygenase-gekoppeltem Streptavidin (Bestandteil des Kits), welches 1 : 200 in BSA-Lösung verdünnt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf den Gewebeschnitten belassen wird. Anschließend werden die Objektträger wieder 3 × 5 min in PBS gewaschen.

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Zur Färbereaktion wird die AEC-Färbelösung benutzt. Die Färbelösung wird tropfenweise auf die Schnitte gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert, bis eine Färbung auftritt. Die Reaktion wird durch Eintauchen und vorsichtiges Waschen für 3 min in PBS abgestoppt. Anschließend werden die Schnitte in verdünnter Meyers Hämalaunlösung für ca. 2 – 3 min gegengefärbt und danach ca. 5 min lang in Leitungswasser gebläut. Danach werden die Schnitte mit einem Tropfen Immu-Mount-Eindeckelmedium und Standard-Deckgläschen eingedeckelt.

3.2.2.4.4 TUNEL-Assay

Der TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling)-Assay dient dazu, apoptotische Zellen zu identifizieren. Die bei der Apoptose entstehenden freien einsträngigen 3'-OH-Enden („nicks“) der DNA-Fragmente werden mit Terminal-deoxynucleotidyl- Transferase (TdT) markiert. An das Enzym gekoppeltes Fluoreszin wird mit einem Anti-Fluoreszin-Antikörper detektiert, der mit Meerrettichperoxidase gekoppelt ist.

Nach Zugabe von Substrat färben sich die betroffenen Zellen an.

Die Schnitte werden entparaffiniert (siehe oben). Die Antigendemaskierung erfolgt mit Citratpuffer 5 min in der Mikrowelle bei 350 W. Nach dem Abkühlen werden die Objektträger 2 х 5 min in PBS gewaschen und die Schnitte mit Fixogum umfahren.

Bei der Verwendung des In Situ Cell Death Detection Kits, POD (Fa. Vector Laboratories) wird die Herstellervorschrift befolgt. Für die Positivkontrolle werden 2 Schnitte mit DNase I Grade I behandelt. Dazu werden 20 µl DNase mit 20 µl dazugehörigem Reaktionspuffer, 20 µl BSA-Lösung und 140 µl Wasser gemischt und davon je 100 µl für 10 min bei 15 – 25 min auf einen Schnitt gegeben. Danach wird mit PBS gewaschen. Zum Labeln wird als Negativkontrolle auf 1 - 2 Schnitte je 50 – 100 der abgezweigten Label-Lösung (Bestandteil des Kits) gegeben, alle anderen Schnitte (inkl. Positivkontrollen) werden mit der TUNEL-Lösung (Bestandteil des Kits) behandelt. Um Verdunstung zu verhindern, werden Parafilmstückchen auf die Schnitte gelegt. Die Objektträger werden in einer feuchten Kammer 60 min lang bei 37 °C abgedunkelt inkubiert. Anschließend wird 3 х mit PBS gewaschen.

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Für die Signalkonversion wird je 50 µl der Anti-Fluoreszin-Antikörperlösung auf die Schnitte gegeben, mit Parafilm bedeckt und 30 min lang bei 37 °C inkubiert. Danach wird wieder mit PBS gewaschen.

Die Färbung erfolgt mit AEC-Färbelösung für ca. 3 min bei 15 – 25 min und wird mit PBS gestoppt. Nach kurzer Gegenfärbung mit verdünnter Meyers Hämalaunlösung werden die Schnitte in Leitungswasser gebläut und anschließend mit Immu-Mount eingedeckelt.