2. Literaturübersicht
2.2 Der Zellzyklus
2.2.2 HPV und Zellzyklus
In Zervixkarzinomzellen beeinträchtigen die viralen Oncoproteine E6 und E7 der
„high-risk“-HPV-Typen die zellulären Kontrollmechanismen.
In Zellen wird nach verschiedenen Stresseinflüssen wie DNA-Schädigung das Protein p53 induziert (FRITSCHE et al., 1993, MALTZMAN u. CZYZYK, 1994), das zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase führt. Dadurch werden Reparatur-prozesse in der Zelle ermöglicht. Bei irreversibler DNA-Schädigung induziert p53 Apoptose, um die geschädigte Zelle zu eliminieren (LOWE et al., 1993). E6 bindet an p53 und führt zu dessen Degradation über das Ubiquitin-Proteasom-System (SCHEFFNER et al., 1990). Dies verursacht die Aufhebung des Zellzyklusarrests und erhöht die Wahrscheinlichkeit weiterer genetischer Veränderungen (FEHRMANN u. LAIMINS, 2003). Gleichzeitig bewirkt die Degradation von p53 einen antiapaptotischen Effekt (WERNESS et al., 1990). Darüber hinaus aktivieren E6-Proteine der „high-risk“ HPVs indirekt Telomerase und unterstützen damit die Proliferation der infizierten Zelle (KLINGELHUTZ et al., 1996). Diese Funktionen
Literaturübersicht 12
fördern die Induktion genomischer Instabilität in HPV-infizierten Zellen und damit die Entstehung von Tumoren (DUENSING u. MÜNGER, 2004)
E7 interagiert mit Rb-Proteinen, die eine wichtige Rolle bei der Zellzyklusregulation am G1/S-Übergang spielen. Die Bindung von E7 an den Tumorsuppressor pRb führt zu dessen verstärktem ubiquitin-vermittelten Abbau (BOYER et al., 1996). Dadurch fällt die hemmende Wirkung von pRb auf den Transkriptionsfaktor E2F weg, wodurch Gene induziert werden, die für den Eintritt in die S-Phase benötigt werden (BAGCHI et al., 1990, BANDARA et al., 1991). Außerdem binden und inaktivieren E7-Proteine die Zellzyklusinhibitoren p21 und p27, wodurch die Proliferation infizierter Zellen gefördert wird (ZERFASS-THOME et al., 1996, JONES et al., 1997a). Weiterhin interagiert E7 mit den S-Phase-Genen Cyclin A und Cyclin E (ZERFASS et al., 1995), wodurch ebenfalls die Zellproliferation induziert wird.
2.3 Apoptose
Einen physiologischen Mechanismus zur Elimination viral infizierter Zellen stellt die sogenannte Apoptose, der programmierte Zelltod, dar (IGNEY u. KRAMMER, 2002).
Das Wort „Apoptose“ ist griechischen Ursprungs und bedeutet „das Abfallen der Blätter“. Im Gegensatz zur Nekrose, bei der die Zelle anschwillt, Zellorganellen zerstört werden und der Körper mit einer Immunantwort reagiert, werden bei der Apoptose die Zellen kleiner, die Zellmembranen bilden „Blasen“ („membrane blebbing“) und die Chromatinsubstanz legt sich in kompakten Konglomeraten der Kernmembran innen an („Kondensation“). Schließlich zerfällt der Zellkern in große Granula. Da der Zellinhalt nicht freigesetzt wird und die Phagozytose rasch einsetzt, folgt keine Immunreaktion bzw. Entzündung (MCCARTHY, 2002). Die Vorgänge laufen im Zeitraum von Minuten bis wenigen Stunden ab.
Die Apoptose stellt die Grundlage einer geregelten Embryogenese, Gewebehomöostase und Funktion des Immunsystems dar (VAN OPHOVEN et al., 1999). Einzelne Zellen oder Zellverbände werden gezielt inmitten einer sonst nicht berührten Zellpopulation entfernt, und im Zusammenspiel mit der Proliferation wird
Literaturübersicht 13
das Gleichgewicht im Organismus aufrechterhalten. Außerdem werden überzählige, hinderliche oder potentiell gefährliche Zellen abgetötet (HENGARTNER, 2000).
Man unterscheidet zwei Signalwege der Apoptoseinduktion: Der extrinsische Weg wird über Todesrezeptoren vermittelt (SCHMITZ et al., 2000), der intrinsische Weg durch die Mitochondrien (HENGARTNER, 2000). Beide Wege führen zu einer Aktivierung von Caspasen, hochselektiven Cystein-Proteasen, die sich kaskadenartig gegenseitig aktivieren. Schließlich zerstören Exekutionscaspasen das Zellgerüst und die Kernmatrix und aktivieren Endonukleasen, die die DNA zerlegen (IGNEY u.
KRAMMER, 2002). Der intrinsische Weg der Apoptoseinduktion beginnt durch zell-schädigende Ereignisse wie Hypoxie, direkte DNA-Schädigung oder Oncoproteine;
pro-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie greifen dabei an der mitochondrialen Membran an (GROSS et al., 1999).
2.3.1 Apoptose und Krebs
An der Entstehung verschiedener Krankheiten, u. a. Krebs, sind ebenfalls Apoptose-vorgänge beteiligt. Für ein unbegrenztes Wachstum muss bei der Tumorentstehung die Apoptose unterdrückt werden (HANAHAN u. WEINBERG, 2000).
Die Apoptose spielt nicht nur bei der Tumorentstehung eine große Rolle, sondern die Wiederherstellung von Apoptosemechanismen ist für die chemotherapeutische Elimination von Tumorzellen von großer Bedeutung (REED, 2003). Deshalb könnte ein Abzielen auf die pro- und antiapoptotischen Proteine eine wichtige Richtung in der Krebsbehandlung sein (HU u. KAVANAGH, 2003).
2.3.2 HPV und Apoptoseregulation
Die Unterdrückung der Apoptose fördert maßgeblich die Entwicklung von der Dysplasie bis zur invasiven und metastasierenden Tumorzelle (IGNEY u.
KRAMMER, 2002). Um den Tod der infizierten Zelle während der Karzinogenese zu verhindern, greifen die viralen Oncoproteine E6 und E7 in die Apoptoseregulation ein (JONES et al., 1997b, FINZER et al., 2002a). E6 inaktiviert beispielsweise
Literaturübersicht 14
proapoptotische Moleküle wie p53, Bak und Bax durch Proteolyse (ZUR HAUSEN, 2002).
2.4 Therapie des Zervixkarzinoms
Das Zervixkarzinom stellt weiterhin eine bedrohliche Erkrankung dar (siehe 2.1.2.1 mukosale Typen). Allein in Deutschland erkranken jährlich rund 5800 Frauen am Zervixkarzinom (FISCHER et al., 1997).
2.4.1 Standardtherapie
Die derzeitigen Standardbehandlungen sind die Chirurgie, Bestrahlung und/oder Chemotherapie: Durch die Chirurgie werden die veränderten Gewebe bis zur totalen Hysterektomie entnommen. Lokale Bestrahlung wird erfolgreich bei fortgeschrittenen Zervixkarzinomen eingesetzt, die Prognose wird im wesentlichen durch die Tumor-größe bestimmt (ROSE, 2002). Dabei stellt die Beeinflussung benachbarter Organe (z. B. Fibrose des Darms, Harnblase etc.) eine schwerwiegende Nebenwirkung dar (STEHMANN et al., 2003). Bei der Chemotherapie wird hauptsächlich Cisplatin eingesetzt, das mit einer Ansprechrate zwischen 23 und 50 % das effektivste Mono-präparat ist (SAVARESE u. COGNETTI, 2003). Die Wirksamkeit kann durch Kombination mit Bestrahlung erheblich gesteigert werden (MORRIS et al., 1999) und wird heute als Standardtherapie des fortgeschrittenen Zervixkarzinoms empfohlen (ROSE et al., 1999). Nebenwirkungen der Chemotherapeutika sind eine hohe Toxizität; bei fortgeschrittener Erkrankung steht oft ein palliativer Ansatz im Vordergrund.
2.4.2 Prävention
Die Prävention des Zervixkarzinoms lässt sich in primäre, sekundäre und tertiäre Strategien einteilen. Primäre Strategien zielen auf eine Reduktion der Neuerkrankungen ab und umfassen z. B. die Vermeidung von Risikofaktoren.
Literaturübersicht 15
Sekundäre Strategien beinhalten die Früherkennung der asymptomatischen Phase durch den Papanicolaou-Screening-Test, bei dem mit einem Watteträger Zellen von Portiooberfläche und Zervixkanal entnommen und nach Spezialfärbung ausgewertet werden (PAPANICOLAOU, 1928). Je nach Ergebnis reichen zytologische Kontrollen aus, oder es werden kolposkopische Untersuchungen durchgeführt. Zur definitiven Klärung von Epithelatypien kann eine konusförmige Gewebeprobe entnommen (Konisation) und anschließend histologisch untersucht werden. Tertiäre Präventions-strategien konzentrieren sich auf die Früherkennung und Reduktion von wiederkehrenden Karzinomen bei bereits behandelten Patientinnen (ROCK et al., 2000).
2.5 Nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAIDs) in der Krebstherapie und –prävention
Die Ergebnisse der Standardtherapie bei fortgeschrittenem Zervixkarzinom bleiben jedoch vielfach enttäuschend bei oftmals erheblichen Nebenwirkungsbelastungen für die einzelnen Patientinnen (WAGGONER, 2003). Daher ist die weitere Suche nach neuen, nicht-toxischen und wirksameren Behandlungsansätzen dringend geboten.
Von Interesse sind dabei die nichtsteroidalen antiinflammatorischen Substanzen („nonsteroidal anti-inflammatory drugs“, NSAIDs).
Diese sind in Abgrenzung zu den Corticosteroiden aromatische organische Säuren ohne Steroidgrundgerüst. Sie besitzen entzündungshemmende, analgetische und antipyretische Wirkung (GOLBS u. SCHERKL, 1996). Das älteste bekannte NSAID ist das Salicin, ein Bestandteil der Weiderinde, dessen Wirkung seit der Frühzeit bekannt ist. Salicin wird zu Salicylsäure metabolisiert.
Die Hauptindikation der NSAIDs in der Humanmedizin ist die Behandlung von Schmerzen und entzündlichen und degenerativen Gelenkerkrankungen (DUBOIS et al., 1998), während in der Veterinärmedizin die entzündungshemmende Wirkung dieser Stoffe im Vordergrund steht. Weiterhin wird Aspirin auch in der Prophylaxe von (Re-)Infarkten des Herzens eingesetzt (HUR et al., 2005). Darüber hinaus zeigen epidemiologische Studien einen Zusammenhang zwischen der regelmäßigen
Literaturübersicht 16
Einnahme von NSAIDs und einer geringeren Todesrate durch Speiseröhren-, Magen-, Brust-, Lungen-, Prostata-, Harnblasen- und Eierstockkrebs (MORAN, 2002, THUN et al., 2002). Auch in vitro hemmen sie das Wachstum verschiedener Krebs-zelllinien und induzieren Apoptose.
2.5.1 Wirkmechanismus der NSAIDs
NSAIDs vermitteln ihre entzündungshemmende Wirkung durch die Hemmung der enzymatischen Aktivität der Cyclooxygenase (COX) (VANE, 1971).
Cyclooxygenasen katalysieren die Synthese von Prostaglandinen aus Arachidon-säure (Abb. 3). Der erste Schritt der Prostaglandinsynthese ist die Hydrolyse von Membranphospholipiden, um freie Arachidonsäure zu produzieren. Dieser Schritt wird durch Phospholipase A2 katalysiert. Anschließend katalysieren Cyclo-oxygenasen eine Reaktion, bei der molekularer Sauerstoff in Arachidonsäure eingebaut wird und ein instabiles Zwischenprodukt, PGG2, entsteht, das schnell zu PGH2 umgewandelt wird. Spezifische Isomerasen katalysieren die Weiterentwicklung zu Prostaglandinen und Thromboxan A2 (DANNENBERG u. SUBBARAMAIAH, 2003).
Es gibt mindestens zwei Isoformen der Cyclooxygenasen: COX-1 und COX-2.
COX-1 wird in den meisten Geweben konstitutiv exprimiert und scheint für die Produktion von Prostaglandinen verantwortlich zu sein, die normale physiologische Funktionen kontrollieren, wie die Integrität der Magenschleimhaut oder die Durchblutung der Niere (DUBOIS et al., 1998). COX-2 ist in den meisten Geweben nicht nachweisbar. Durch mitogene und entzündliche Stimuli wird sie jedoch induziert, was zur verstärkten Prostaglandinsynthese führt. COX-2 wird z. B. bei Fieber im Gehirn, bei Infektionen in Darmepithelzellen und während Entzündungen induziert. Darüber hinaus ist COX-2 bei der Sensibilisierung von Schmerzrezeptoren beteiligt und erleichtert im Rückenmark die Weiterleitung der Schmerzstimuli.
Literaturübersicht 17
Abbildung 3: Arachidonsäuremetabolismus: Arachidonsäure, die durch Phospholipase A2 aus Membranphospholipiden freigesetzt wird, wird durch Cyclooxygenasen in zwei Schritten zu Prostaglandin H2 metabolisiert. Dieses wird durch spezifische Isomerasen in eine Anzahl von Prostaglandine und Thromboxan umgewandelt.
2.5.2 Mögliche Rolle von COX-2 in der Tumorentwicklung
In Kolorektaltumoren ist die COX-2-Konzentration in bis zu 90 % der Fälle erhöht, während in normaler Darmschleimhaut eine niedrige bis nicht nachweisbare COX-2-Expression vorherrscht (EBERHART et al., 1994, SANO et al., 1995). Auch in vielen anderen Krebsarten und Krebsvorstufen ist z. T. COX-2 induziert (SOSLOW et al., 2000, GUPTA u. DUBOIS, 2001, DANNENBERG u. SUBBARAMAIAH, 2003), u. a.
auch im Zervixkarzinom (GAFFNEY et al., 2001, KULKARNI et al., 2001). COX-2 kann durch Wachstumsfaktoren, Zytokine, Oncogene und Tumorpromotoren stimuliert werden (SMITH et al., 2000), und eine vermehrte COX-2-Expression tritt gemeinsam mit Apoptosehemmung (SUN et al., 2002), Angiogenese (TSUJII et al., 1998) und einer verstärkten Metastasierungsfähigkeit (TSUJII et al., 1997) auf.
In verschiedenen Tierexperimenten und pharmakologischen Studien konnte gezeigt werden, dass COX-Hemmer das Wachstum von Tumoren und die Entstehung von Metastasen reduzieren. Allerdings mehren sich in letzter Zeit Hinweise, dass NSAIDs
Literaturübersicht 18
auch COX-unabhängige Wirkungen auslösen. Beispielsweise lässt sich die tumorhemmende Wirkung der NSAIDs nicht allein auf die COX-Hemmung zurück-führen: Einige NSAIDs hemmen die Proliferation und induzieren Apoptose bei Krebszellen, die weder COX-1 noch COX-2 exprimieren (HANIF et al., 1996).
2.5.3 Sulindac
Zu den NSAIDs gehört der unspezifische COX-Inhibitor Sulindac, der auch zur Chemoprävention der familiären adenomatösen Polyposis coli (FAP) erfolgreich eingesetzt wird. Bei dieser autosomal-dominant vererbten Erkrankung entwickeln alle betroffenen Patienten im Laufe ihres Lebens multiple Polypen im gesamten Verdauungstrakt. Sulindac hemmt das Wachstum der Polypen und bewirkt den Rückgang von existierenden Polypen (WADDEL u. LOUGHRY, 1983, LABAYLE et al., 1991).
Sulindac (cis-5-Fluor-2-methyl-1-(p-methylsulfinylbenzyliden)inden-3-acetat) ist ein negativ geladenes Molekül, das sich frei durch Plasmamembranen bewegen kann (WADDELL, 1998).
Abbildung 4: Molekularer Aufbau von Sulindac und seinen Metaboliten.
Literaturübersicht 19
Sulindac stellt eine Weiterentwicklung des NSAID Indomethacin mit dem Ziel einer Verminderung der gastrointestinalen Wirkungen dar. Sulindac kann durch Reduktion in das Sulindac-Sulfid und durch Oxidation in das gegenüber COX-1 wie COX-2 inaktive Sulindac-Sulfon übergehen (Abb. 4). Nach oraler Aufnahme und Absorption im Dünndarm unterliegt Sulindac Oxidation und Reduktion. Dünndarm- und Leber-epithel wandeln einen Teil der verschiedenen Sulindacmetabolite in entsprechende Acyl-Glucuronide um. Sulindac wird auch im Kolon durch bakterielle Enzyme reduziert und absorbiert (SHEN u. WINTER, 1977, STRONG et al., 1985). Nach Acyl-Glucuronidierung sind beide Formen im Blutplasma zu 95 % an Albumin gekoppelt und besitzen so als aktive Formen die Halbwertszeit von Albumin (ca. 20 Tage) (KROEMER u. KLOTZ, 1992). Durch die Kopplung an Albumin wird auch die Aufnahme von Sulindac in entzündliche oder maligne Gewebe erleichtert und gesteigert (RUSSEVA u. ZHIVKOVA, 1999).
Material und Methoden 20
3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien und Reagenzien
Acrylamid/Bisacrylamid Sigma-Aldrich, Taufkirchen Ammoniumpersulfat (APS) Serva, Heidelberg
Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen BenchMark (Proteinmarker) Gibco Life Technologies, Eggenstein Bradford-Reagenz (Biorad Protein Assay) BioRad, München
Lowry
Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DAPI Serva, Heidelberg
DMSO Merck, Darmstadt
DNase I Grade I Promega, Mannheim
EDTA Roche Diagnostics, Mannheim
Ethanol p.a. Merck, Darmstadt
Formaldehydlösung p.a., 37 % Merck, Darmstadt Glycerin p.a., 87 % Merck, Darmstadt
Glycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Isopropanol p.a. Merck, Darmstadt
Macrodex Schiwa, Glandorf
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Methanol p.a. Merck, Darmstadt
Milchpulver Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid p.a. Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Nonidet-P40 Roche Diagnostics, Mannheim
PMSF Gibco Life Technologies, Eggenstein
PBS Gibco Life Technologies, Eggenstein
Proteinstandard Gibco Life Technologies, Eggenstein
Material und Methoden 21
Salzsäure konz. (32 %) p.a. Merck, Darmstadt
SR101 Eastman Kodak, Rochester, USA
TEMED Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tri(hydroxymethyl)aminoethan (Tris) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tris Base Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tween 20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3.1.2 Verbrauchsmaterialien und Hilfsmittel
Einmalspritzen (steril) Becton and Dickinson, Heidelberg Eppendorf tubes (0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml) Eppendorf, Hamburg
Faltenfilter Schleicher & Schuell, Dassel
Frischhaltefolie Igefa, Bremen
Glaspipetten Renner, Darmstadt
Hyperfilms TM ECL Amersham-Pharmacia, Freiburg
Kryoröhrchen Greiner, Nürtingen
Pipettenspitzen Greiner, Nürtingen
Plastikküvetten (1 ml) Greiner, Nürtingen PVDF-Membran (Immobilon P; 0,5 µm) Millipore, Eschborn
Röntgenfilme Amersham-Pharmacia, Freiburg
Sterilfilter Millipore, Eschborn
Whatman-Papier Schleicher & Schuell, Dassel Zellkulturflaschen Greiner, Nürtingen Zellkulturschalen Greiner, Nürtingen
3.1.3 Laborausstattung
Analysewaage (2004 MP) Sartorius, Göttingen Begasungsbrutschrank ( B5061, EC/CO2) Heraeus, Hanau
Blotkammer (semi-dry; Hoefer, SemiPhor) Amersham-Pharmacia, Freiburg
Material und Methoden 22
Elektrophoresekammer, vertikal Amersham-Pharmacia, Freiburg (Hoefer SE600)
Handrührgerät Bosch
Hochspannungsgerät EPS 600 Amersham-Pharmacia, Freiburg Heizblock / Schüttler Eppendorf, Hamburg
Lichtmikroskop CK2 Olympus
Neubauer-Zählkammer Bender & Hobein, Bruchsal pH-Meter Calimatic 765 Knick
Photometer Ultraspec 3000 Amersham-Pharmacia, Freiburg Ultrazentrifuge Centricon T-1065 Kontron, München
Ultraschallgerät Sonifier 250 Branson/Heinemann, Schwäbisch Gmünd
Vortexer Heidolf, Rust
Waage 1216 MP Sartorius, Göttingen
Wasserbad Julabo, Seelbach
Zentrifuge Minifuge Heraeus, Hanau Zentrifuge 2K15 Sigma, Deisenhofen
3.1.4 Reagenzien für die Zellkultur
Dulbecco´s modified Eagle´s Medium Gibco Life Technologies, Eggenstein Dimethylsulfoxid p.a. Merck, Darmstadt
Fetal Calf Serum Gibco Life Technologies, Eggenstein NS-398 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Phosphate Buffered Saline Gibco Life Technologies, Eggenstein Penicillin 10.000 U/ml / Streptomycin Gibco Life Technologies, Eggenstein
10.000 U/ml
SC-560 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sulindac Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sulindac-Sulfid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypanblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Material und Methoden 23
Trypsin / EDTA-Lösung Gibco Life Technologies, Eggenstein
3.1.5 Materialien für die Tierversuche
Ascorbinsäure Fluka, Deisenhofen
D(-)-Fructose extra pure Riedel-deHaën, Seelze Döschen für Formalinkonservierung Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat Fluka, Deisenhofen Na2HPO4 · 2 H2O
Einbettförmchen Cryomold Vogel, Giessen Einbettmedium Tissue Tek Jung, Nussloch Einmalkanülen 0,65 × 30 mm (Nr. 14) Rose, Trier
Einmalskalpelle Feather
Einstreu Animal bedding Granular Altromin, Lage Gelatine aus Schweinehaut Fluka, Deisenhofen Lactalbumin-Hydrolysat Fluka, Deisenhofen Latex OP-Handschuhe Gammex Ansell Medical, München L-Lysin-Monohydrat Alfa Aesar, Karlsruhe Multivitamine für Nager Albrecht, Aulendorf Natriumdihydrogenphosphat Fluka, Deisenhofen NaH2PO4 · 2 H2O
Standardfutter ssniff NM V1244-727 SSNIFF, Soest
Sulindac Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Zucht-/Haltungsfutter Nackt-Ratten/Mäuse Altromin, Lage Standard-Diät 1431 FORTI
3.1.6 Chemikalien und Materialien für die Histologie/Immunohistochemie Adhäsions-Objektträger Histobond® Marienfeld, Lauda-Königshofen Amino-ethyl-carbazol Sigma, Taufkirchen
Citrat Merck, Darmstadt
Material und Methoden 24
Dimethylformamid (DMSO) Roth, Karlsruhe
Eisessig Merck, Darmstadt
Eosin Sigma, Taufkirchen
Essigsäure Riedel de-Haën, Seelze
Eukitt® Einschlussmittel Kindler, Freiburg Fixogum Montagekleber Marabuwerke, Tamm Immu-Mount Eindeckelmedium Shandon, Pittsburgh Meyers Hämalaun AppliChem, Darmstadt
Hämalaunlösung Merck, Darmstadt
Natriumacetat Merck, Darmstadt
Natriumcitrat Fluka, Deisenhofen
Xylol Riedel-deHaën, Seelze
3.1.7 Lösungen
AEC-Färbelösung 4 mg Amino-ethyl-carbazol (AEC) lösen in
500 µl Dimethylformamid;
2,1 ml 0,1 M Essigsäure mit
7,9 ml 0,1 M Natriumacetat mischen,
500 µl davon ersetzen durch das gelöste AEC, filtrieren (Porengröße 0,45 µm), lichtgeschützt (Alufolie) aufbewahren, kurz vor Färbung 5 µl 30 % H2O2 hinzufügen
Blocking-Puffer (Western Blot) TBS-T + 5 % Milch
BSA-Lösung 1 % BSA in PBS
Citratpuffer pH 6,0 18 ml 0,1 M Zitronensäure
82 ml 0,1 M Natriumcitrat
900 ml bidest. Wasser
Material und Methoden 25
DAPI-Stammlösung 10 mg DAPI in
28,5 ml bidest. Wasser
bei 4 – 8 °C im Dunkeln lagern
Einfriermedium 10 % DMSO
30 % FCS 60 % DMEM
sterilfiltrieren durch 0,22 µm-Filter
Lagerung bei –20 °C
Eosin-Färbelösung 1 % Eosin in
70 %igem Ethanol, zusätzlich
1 Tropfen Eisessig pro Küvette
Formalinlösung 3,3 g Na2HPO4 · 2 H2O und 0,8 g NaH2PO4 · 2 H2O
in Wasser lösen, auffüllen auf 450 ml, 50 ml Formalin zufügen
Glycin/HCl-Puffer 0,1 M Glycin pH 2,9
HCl – Ethanol – Lösung 0,5 % HCl 25 % in
Ethanol 70 %
Lämmli-Puffer (10 x) 0,25 M Tris Base 1,9 M Glycin 1 % SDS
Macrodex-Lösung 6 % in physiol. NaCl-Lösung
Material und Methoden 26
PBS 123 mM Natriumchlorid
7,6 mM Di-Natriumhydrogenphosphat-
dihydrat
10 mM Kaliumdihydrogenphosphat
pH 7,2 – 7,8
Phosphat-DAPI-Färbelösung 7,1 g Natriumhydrogenphosphat
0,5 ml DAPI-Stammlösung
ad 100 ml bidest. Wasser
Lagerung bei RT im Dunkeln
RIPA-Puffer 100 mM Tris/HCl pH 8,0
150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 % Nonidet-P40
0,1 % SDS
kurz vor Gebrauch frisch in Isopropanol gelöstes PMSF (10 µg / ml) zufügen (10 µl / ml RIPA)
TBS (1 x) 20 mM Tris/HCl pH 7,5
137 mM NaCl
1 M hydrochloric acid
TBS-T (1 x) 20 mM Tris/HCl pH 7,5
137 mM NaCl
1 M hydrochloric acid
0,01 % Tween
Towbin Puffer (10 x) 0,25 M Tris Base 1,9 M Glycin
Material und Methoden 27
Transferpuffer (Western Blot) 1 x Towbin
10 % Methanol
Tris-Puffer 1 M Tris,
je nach Bedarf mit HCl auf pH 6,8 – 8,8 einstellen
dabei auf RT kühlen,
da sich der pH-Wert verschiebt
Trypanblau-Lösung 0,25 % Trypanblau
Western Ladepuffer (5 x) 10 % SDS
0,02 % Bromphenolblau
12,5 % 2-Mercaptoethanol
0,3 M Tris/HCl pH 6,8
5 mM EDTA pH 8 50 % Glycerol
zur Lösung auf 37°C erhitzen
Zitronensäure/Tween 2,1 g Citrat
0,5 g Tween 20
ad 100 ml bidest. Wasser
bei 4 – 8 °C lagern
3.1.8 Polyacrylamidgele
Sammelgel (4 %) 0,22 M Tris/HCl pH 6,8 0,1 % SDS
4 % Acrylamid/Bisacrylamid
0,5 % Ammoniumpersulfat
0,16 % TEMED
Material und Methoden 28
Trenngel (12 %) 0,22 M Tris/HCl pH 6,8 0,1 % SDS
12 % Acrylamid/Bisacrylamid
0,5 % Ammoniumpersulfat
0,07 % TEMED
3.1.9 Kits
ECL-Western Blotting Detection Reagents Amersham-Pharmacia, Freiburg In vivo Cell Death Detection Kit, POD Roche-Diagnostics, Mannheim Avidin-Biotin-Streptavidin-Kit VectorLaboratories, Burlingame, USA
3.1.10 Antikörper
Antikörper für Western Blot
Erstantikörper: HPV18-E7 (N-19) sc-1590 Ziege polyklonal IgG, Lot J161
Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Verdünnung 1:500
HPV16-E7 NM2
Maus (MICHEL, 2003; der Antikörper wurde freundlicherweise von M. Müller, DKFZ, zur Verfügung gestellt)
Verdünnung 1:4
Anti-actin Code 691001
Maus monoklonal, Lot 7010, Klon 4 ICN Biomedicals, Inc., Aurora
Verdünnung 1:5000
Material und Methoden 29
Zweitantikörper: anti-goat IgG-HRP, sc-2020 HRP-konjugiert, Lot K169
Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg
Verdünnung 1:5000
Anti-mouse IgG-HRP W402B, 16066001
Promega, Mannheim
Verdünnung 1:10 000
Antikörper für die Immunohistochemie Erstantikörper: Ki-67 Antigen human
Kaninchen polyklonal, NCL Ki67p
Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK
Verdünnung 1:700
Zweitantikörper: Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)
Biotin-SP-konjugiert, Code 111-065-045
Lot 48697
Dianova, Hamburg
Verdünnung 1:250
Material und Methoden 30
3.2 Methoden
3.2.1 Zellexperimentelle Methoden
3.2.1.1 Tumorzellen
Für die In-vitro-Versuche wurden die folgenden humanen Zervixkarzinomzelllinien verwendet:
HeLa-Zellen: Sie entstammen epithelialen Zellen eines Adenokarzinoms und enthalten 20 - 50 Kopien von HPV18 DNA (KAHN et al., 1999). SW756-Zellen ent-stammen Biopsiematerial eines Plattenepithelkarzinoms und sind HPV18-positiv mit ca. 10 - 50 DNA-Kopien (SCHNEIDER-GÄDICKE u. SCHWARZ, 1986). Die CaSki-Zelllinie wurde aus Zellen einer Zervixkarzinommetastase im Dünndarm-mesenterium etabliert (PATILLO et al., 1977). CaSki-Zellen enthalten 60 - 600 Kopien an HPV16-DNA pro Zelle (MEISSNER, 1999). SiHa-Zellen stammen aus Fragmenten einer primären operativ entnommenen Gewebeprobe eines Platten-epithelkarzinoms der Zervix. Die Zellen besitzen 1 – 2 Kopien des HPV16-Genoms (KAHN et al., 1999).
3.2.1.2 Zellkulturtechniken
3.2.1.2.1 Stammhaltung
Die verwendeten Zellen werden im Brutschrank bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 – Gehalt kultiviert. Sie wachsen als Monolayer-Kulturen. Dem verwendeten Kulturmedium DMEM wird 10 % FCS, 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin zugesetzt. Zum Passagieren der Zellen wird das Medium mit einer Glaspipette abgezogen und verworfen. Der Zellrasen wird mit ca. 10 ml PBS gewaschen, anschließend werden 1 – 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben und auf dem Zellrasen verteilt, um die Zellen vom Flaschenboden zu lösen. Nach 3 – 5 minütiger Inkubation im Brutschrank wird die Trypsinierung durch Zugabe von FCS-haltigem Medium gestoppt. Je nach Dichte und Wachstumsgeschwindigkeit werden die Zellen 1 : 10 bis 1 : 40 gesplittet. Die verbleibenden Zellen werden in ca. 25 ml frisches
Material und Methoden 31
Kulturmedium aufgenommen, so dass sie bei erneuter Aussaat von ca. 3 mm Flüssigkeit bedeckt sind, und im Brutschrank inkubiert.
3.2.1.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zum Einfrieren werden die Zellen durch Trypsinierung vom Boden des Kulturgefäßes abgelöst und in FCS-haltigem Zellkulturmedium resuspendiert. Durch Zentrifugation bei Raumtemperatur (800 rpm für 5 min) wird das Kulturmedium von den Zellen getrennt. Das Zellpellet wird in Einfriermedium gelöst und je 1 ml in ein 2 ml-Kryoröhrchen überführt. Die Röhrchen werden in reichlich Zellstoff verpackt und auf –70 °C heruntergekühlt. Nach mindestens einem Tag werden die tiefgefrorenen Zellen in den Flüssigstickstofftank überführt.
Eingefrorene Zellen werden in der Hand langsam aufgetaut, in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und 5 min bei 800 rpm bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, um das im Einfriermedium enthaltene DMSO zu entfernen. Die Zellen werden in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und in eine Zellkulturflasche überführt. Am folgenden Tag erfolgt ein Mediumwechsel. Vor der ersten Versuchsdurchführung werden die Zellen mindestens zweimal passagiert.
3.2.1.2.3 Aussaat der Zellen
Zur Aussaat der Zellen für Versuche werden subkonfluente Zellen mit PBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA-Lösung vom Flaschenboden gelöst und in FCS-haltigem Medium resuspendiert. Für die Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen wird eine kleine Menge der Zellsuspension 1 : 2 mit Trypanblau-Lösung verdünnt, die nur tote Zellen anfärbt. Die Zahl der vitalen Zellen pro ml erfolgt mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer unter Berücksichtigung der Verdünnung mit der Färbelösung. Je nach Versuchsziel werden die Zellen in Kulturmedium verdünnt und in unterschiedlicher Zahl und unterschiedlich großen Zellkulturschalen ausgesät.
Material und Methoden 32
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