3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.5 Materialien für die Tierversuche
Ascorbinsäure Fluka, Deisenhofen
D(-)-Fructose extra pure Riedel-deHaën, Seelze Döschen für Formalinkonservierung Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat Fluka, Deisenhofen Na2HPO4 · 2 H2O
Einbettförmchen Cryomold Vogel, Giessen Einbettmedium Tissue Tek Jung, Nussloch Einmalkanülen 0,65 × 30 mm (Nr. 14) Rose, Trier
Einmalskalpelle Feather
Einstreu Animal bedding Granular Altromin, Lage Gelatine aus Schweinehaut Fluka, Deisenhofen Lactalbumin-Hydrolysat Fluka, Deisenhofen Latex OP-Handschuhe Gammex Ansell Medical, München L-Lysin-Monohydrat Alfa Aesar, Karlsruhe Multivitamine für Nager Albrecht, Aulendorf Natriumdihydrogenphosphat Fluka, Deisenhofen NaH2PO4 · 2 H2O
Standardfutter ssniff NM V1244-727 SSNIFF, Soest
Sulindac Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Zucht-/Haltungsfutter Nackt-Ratten/Mäuse Altromin, Lage Standard-Diät 1431 FORTI
3.1.6 Chemikalien und Materialien für die Histologie/Immunohistochemie Adhäsions-Objektträger Histobond® Marienfeld, Lauda-Königshofen Amino-ethyl-carbazol Sigma, Taufkirchen
Citrat Merck, Darmstadt
Material und Methoden 24
Dimethylformamid (DMSO) Roth, Karlsruhe
Eisessig Merck, Darmstadt
Eosin Sigma, Taufkirchen
Essigsäure Riedel de-Haën, Seelze
Eukitt® Einschlussmittel Kindler, Freiburg Fixogum Montagekleber Marabuwerke, Tamm Immu-Mount Eindeckelmedium Shandon, Pittsburgh Meyers Hämalaun AppliChem, Darmstadt
Hämalaunlösung Merck, Darmstadt
Natriumacetat Merck, Darmstadt
Natriumcitrat Fluka, Deisenhofen
Xylol Riedel-deHaën, Seelze
3.1.7 Lösungen
AEC-Färbelösung 4 mg Amino-ethyl-carbazol (AEC) lösen in
500 µl Dimethylformamid;
2,1 ml 0,1 M Essigsäure mit
7,9 ml 0,1 M Natriumacetat mischen,
500 µl davon ersetzen durch das gelöste AEC, filtrieren (Porengröße 0,45 µm), lichtgeschützt (Alufolie) aufbewahren, kurz vor Färbung 5 µl 30 % H2O2 hinzufügen
Blocking-Puffer (Western Blot) TBS-T + 5 % Milch
BSA-Lösung 1 % BSA in PBS
Citratpuffer pH 6,0 18 ml 0,1 M Zitronensäure
82 ml 0,1 M Natriumcitrat
900 ml bidest. Wasser
Material und Methoden 25
DAPI-Stammlösung 10 mg DAPI in
28,5 ml bidest. Wasser
bei 4 – 8 °C im Dunkeln lagern
Einfriermedium 10 % DMSO
30 % FCS 60 % DMEM
sterilfiltrieren durch 0,22 µm-Filter
Lagerung bei –20 °C
Eosin-Färbelösung 1 % Eosin in
70 %igem Ethanol, zusätzlich
1 Tropfen Eisessig pro Küvette
Formalinlösung 3,3 g Na2HPO4 · 2 H2O und 0,8 g NaH2PO4 · 2 H2O
in Wasser lösen, auffüllen auf 450 ml, 50 ml Formalin zufügen
Glycin/HCl-Puffer 0,1 M Glycin pH 2,9
HCl – Ethanol – Lösung 0,5 % HCl 25 % in
Ethanol 70 %
Lämmli-Puffer (10 x) 0,25 M Tris Base 1,9 M Glycin 1 % SDS
Macrodex-Lösung 6 % in physiol. NaCl-Lösung
Material und Methoden 26
PBS 123 mM Natriumchlorid
7,6 mM Di-Natriumhydrogenphosphat-
dihydrat
10 mM Kaliumdihydrogenphosphat
pH 7,2 – 7,8
Phosphat-DAPI-Färbelösung 7,1 g Natriumhydrogenphosphat
0,5 ml DAPI-Stammlösung
ad 100 ml bidest. Wasser
Lagerung bei RT im Dunkeln
RIPA-Puffer 100 mM Tris/HCl pH 8,0
150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 % Nonidet-P40
0,1 % SDS
kurz vor Gebrauch frisch in Isopropanol gelöstes PMSF (10 µg / ml) zufügen (10 µl / ml RIPA)
TBS (1 x) 20 mM Tris/HCl pH 7,5
137 mM NaCl
1 M hydrochloric acid
TBS-T (1 x) 20 mM Tris/HCl pH 7,5
137 mM NaCl
1 M hydrochloric acid
0,01 % Tween
Towbin Puffer (10 x) 0,25 M Tris Base 1,9 M Glycin
Material und Methoden 27
Transferpuffer (Western Blot) 1 x Towbin
10 % Methanol
Tris-Puffer 1 M Tris,
je nach Bedarf mit HCl auf pH 6,8 – 8,8 einstellen
dabei auf RT kühlen,
da sich der pH-Wert verschiebt
Trypanblau-Lösung 0,25 % Trypanblau
Western Ladepuffer (5 x) 10 % SDS
0,02 % Bromphenolblau
12,5 % 2-Mercaptoethanol
0,3 M Tris/HCl pH 6,8
5 mM EDTA pH 8 50 % Glycerol
zur Lösung auf 37°C erhitzen
Zitronensäure/Tween 2,1 g Citrat
0,5 g Tween 20
ad 100 ml bidest. Wasser
bei 4 – 8 °C lagern
3.1.8 Polyacrylamidgele
Sammelgel (4 %) 0,22 M Tris/HCl pH 6,8 0,1 % SDS
4 % Acrylamid/Bisacrylamid
0,5 % Ammoniumpersulfat
0,16 % TEMED
Material und Methoden 28
Trenngel (12 %) 0,22 M Tris/HCl pH 6,8 0,1 % SDS
12 % Acrylamid/Bisacrylamid
0,5 % Ammoniumpersulfat
0,07 % TEMED
3.1.9 Kits
ECL-Western Blotting Detection Reagents Amersham-Pharmacia, Freiburg In vivo Cell Death Detection Kit, POD Roche-Diagnostics, Mannheim Avidin-Biotin-Streptavidin-Kit VectorLaboratories, Burlingame, USA
3.1.10 Antikörper
Antikörper für Western Blot
Erstantikörper: HPV18-E7 (N-19) sc-1590 Ziege polyklonal IgG, Lot J161
Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Verdünnung 1:500
HPV16-E7 NM2
Maus (MICHEL, 2003; der Antikörper wurde freundlicherweise von M. Müller, DKFZ, zur Verfügung gestellt)
Verdünnung 1:4
Anti-actin Code 691001
Maus monoklonal, Lot 7010, Klon 4 ICN Biomedicals, Inc., Aurora
Verdünnung 1:5000
Material und Methoden 29
Zweitantikörper: anti-goat IgG-HRP, sc-2020 HRP-konjugiert, Lot K169
Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg
Verdünnung 1:5000
Anti-mouse IgG-HRP W402B, 16066001
Promega, Mannheim
Verdünnung 1:10 000
Antikörper für die Immunohistochemie Erstantikörper: Ki-67 Antigen human
Kaninchen polyklonal, NCL Ki67p
Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK
Verdünnung 1:700
Zweitantikörper: Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)
Biotin-SP-konjugiert, Code 111-065-045
Lot 48697
Dianova, Hamburg
Verdünnung 1:250
Material und Methoden 30
3.2 Methoden
3.2.1 Zellexperimentelle Methoden
3.2.1.1 Tumorzellen
Für die In-vitro-Versuche wurden die folgenden humanen Zervixkarzinomzelllinien verwendet:
HeLa-Zellen: Sie entstammen epithelialen Zellen eines Adenokarzinoms und enthalten 20 - 50 Kopien von HPV18 DNA (KAHN et al., 1999). SW756-Zellen ent-stammen Biopsiematerial eines Plattenepithelkarzinoms und sind HPV18-positiv mit ca. 10 - 50 DNA-Kopien (SCHNEIDER-GÄDICKE u. SCHWARZ, 1986). Die CaSki-Zelllinie wurde aus Zellen einer Zervixkarzinommetastase im Dünndarm-mesenterium etabliert (PATILLO et al., 1977). CaSki-Zellen enthalten 60 - 600 Kopien an HPV16-DNA pro Zelle (MEISSNER, 1999). SiHa-Zellen stammen aus Fragmenten einer primären operativ entnommenen Gewebeprobe eines Platten-epithelkarzinoms der Zervix. Die Zellen besitzen 1 – 2 Kopien des HPV16-Genoms (KAHN et al., 1999).
3.2.1.2 Zellkulturtechniken
3.2.1.2.1 Stammhaltung
Die verwendeten Zellen werden im Brutschrank bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 – Gehalt kultiviert. Sie wachsen als Monolayer-Kulturen. Dem verwendeten Kulturmedium DMEM wird 10 % FCS, 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin zugesetzt. Zum Passagieren der Zellen wird das Medium mit einer Glaspipette abgezogen und verworfen. Der Zellrasen wird mit ca. 10 ml PBS gewaschen, anschließend werden 1 – 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben und auf dem Zellrasen verteilt, um die Zellen vom Flaschenboden zu lösen. Nach 3 – 5 minütiger Inkubation im Brutschrank wird die Trypsinierung durch Zugabe von FCS-haltigem Medium gestoppt. Je nach Dichte und Wachstumsgeschwindigkeit werden die Zellen 1 : 10 bis 1 : 40 gesplittet. Die verbleibenden Zellen werden in ca. 25 ml frisches
Material und Methoden 31
Kulturmedium aufgenommen, so dass sie bei erneuter Aussaat von ca. 3 mm Flüssigkeit bedeckt sind, und im Brutschrank inkubiert.
3.2.1.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zum Einfrieren werden die Zellen durch Trypsinierung vom Boden des Kulturgefäßes abgelöst und in FCS-haltigem Zellkulturmedium resuspendiert. Durch Zentrifugation bei Raumtemperatur (800 rpm für 5 min) wird das Kulturmedium von den Zellen getrennt. Das Zellpellet wird in Einfriermedium gelöst und je 1 ml in ein 2 ml-Kryoröhrchen überführt. Die Röhrchen werden in reichlich Zellstoff verpackt und auf –70 °C heruntergekühlt. Nach mindestens einem Tag werden die tiefgefrorenen Zellen in den Flüssigstickstofftank überführt.
Eingefrorene Zellen werden in der Hand langsam aufgetaut, in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und 5 min bei 800 rpm bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, um das im Einfriermedium enthaltene DMSO zu entfernen. Die Zellen werden in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und in eine Zellkulturflasche überführt. Am folgenden Tag erfolgt ein Mediumwechsel. Vor der ersten Versuchsdurchführung werden die Zellen mindestens zweimal passagiert.
3.2.1.2.3 Aussaat der Zellen
Zur Aussaat der Zellen für Versuche werden subkonfluente Zellen mit PBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA-Lösung vom Flaschenboden gelöst und in FCS-haltigem Medium resuspendiert. Für die Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen wird eine kleine Menge der Zellsuspension 1 : 2 mit Trypanblau-Lösung verdünnt, die nur tote Zellen anfärbt. Die Zahl der vitalen Zellen pro ml erfolgt mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer unter Berücksichtigung der Verdünnung mit der Färbelösung. Je nach Versuchsziel werden die Zellen in Kulturmedium verdünnt und in unterschiedlicher Zahl und unterschiedlich großen Zellkulturschalen ausgesät.
Material und Methoden 32
3.2.1.2.4 Behandlung der Zellen
Am Tag nach der Aussaat der Zellen wird das Kulturmedium aus den Schalen entfernt und durch frisches Medium, das die gelösten Behandlungssubstanzen enthält, ersetzt.
3.2.1.3 Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie (FCM-Analyse)
Die Durchflusszytometrie („flow cytometry analysis“) wird u. a. dazu verwendet, um die Zellzyklusverteilung einer Zellpopulation oder den Anteil apoptotischer Zellen zu bestimmen. Dafür wird die Menge an DNA mittels LASER gemessen. Durch die Quantifizierung der DNA kann die Zelle aufgrund ihres jeweiligen DNA-Gehalts von 2n bis 4n in die verschiedenen Phasen (G1, S, G2/M) eingeordnet werden.
Während der Apoptose entstehen in der Zelle durch Doppelstrangbrüche und Fragmentation der DNA Oligonucleotide. Während der Zellfixierung, bei der die Membranen porös werden, können die niedermolekularen DNA-Fragmente die Zelle verlassen und so deren DNA-Gehalt verringern. Diese Zellen erscheinen auf dem Diagramm als hypodiploid oder „sub-G1-peak“. Die Durchflusszytometrie wurde in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Zytometrie durchgeführt.
3.2.1.3.1 Zellernte für die FCM-Analyse
Zunächst wird das Medium abgenommen und in ein 15 ml Falcon Tube gegeben, damit apoptotische Zellen im Überstand aufbewahrt werden. Anschließend werden die Zellen mit PBS gewaschen. Das PBS wird nicht verworfen, sondern ebenfalls im Falcon Tube aufgefangen, da sich beim Waschen Zellen vom Zellkulturschalenboden lösen. Danach werden die Zellen trypsiniert, in ca. 10 ml Medium aufgenommen und in das Falcon Tube überführt, in dem sich bereits das ursprüngliche Medium und das PBS mit den abgelösten Zellen befinden. Bei 1500 rpm und 4 °C werden die Zellen 5 min lang abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wird dabei dreimal in 5 ml PBS gewaschen. Anschließend wird das Pellet in 1 ml PBS
Material und Methoden 33
resuspendiert und in 10 ml 70 %igem Ethanol gelöst. Bis zur FCM-Analyse werden die Proben im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt.
3.2.1.3.2 Durchflusszytometrie
Nach Ethanolfixierung und Zentrifugation werden die Zellen mit einer Färbelösung resuspendiert, die den Fluoreszenzfarbstoff DAPI (2,4-Diamidin-2-phenylindol-dihydrochlorid) zur Färbung der DNA und Sulforhodamin 101 (SR101) zur Proteingegenfärbung enthält. Die gefärbten Zellen werden in einem feinen Flüssig-keitsstrom durch eine Kapillare gesaugt. Ein UV-LASER-Strahl regt die blaue und rote Fluoreszenz von DAPI bzw. SR101 an, die mit optischen Filtern aufgetrennt und von separaten Detektoren in elektrische Spannungssignale umgewandelt werden.
Die Durchflusszytometriedaten werden mittels Computer zur Zellzyklusanalyse und Quantifizierung der Apoptose weiterverarbeitet (DEAN u. JETT, 1974, STÖHR et al., 1976, STÖHR et al., 1978).
3.2.1.3.3 Aufbereitung von gefrorenem, solidem Gewebe für die Durchflusszytometrie
Den tiefgefrorenen Tumoren werden je zwei ca. stecknadelkopfgroße Proben entnommen. Das eingefrorene Gewebestück wird bei Raumtemperatur aufgetaut und in 0,5 ml Macrodex-Lösung mit einer Schere zu einem homogenen Brei zerkleinert, der anschließend in 3,5 ml Zitronensäure/Tween-Lösung aufgenommen wird. Nach vorsichtigem Schütteln (20 min bei RT) und Filtration (Maschenweite 60 µm) wird die Zellsuspension zentrifugiert (10 min bei 100 × g) und das Sediment in 1 ml Phosphat-DAPI-Färbelösung überführt und die Messung vollzogen (siehe 3.2.1.3.2) (OTTO, 1994, EHEMANN et al., 1999, leicht modifiziert).
Material und Methoden 34
3.2.1.4 Analyse von Proteinen
3.2.1.4.1 Isolierung von Gesamtzellextrakten für Western Blot Analyse
Die Zellkulturschalen mit adhärent wachsenden Zellen werden auf Eis gestellt. Nach Abnahme des Mediums werden die Zellen zweimal vorsichtig mit ca. 10 ml PBS gewaschen und mit RIPA-Puffer inkubiert (500 µl / 10 cm Schale). Nach fünf-minütiger Inkubation wird das Lysat abgeschabt, in 15 ml Falcon-Tubes überführt und fortan auf Eis gelagert. Die Lysate werden ultraschallbehandelt (Duty-cycle 50 %, level 5), um die Membranen zu zerstören und die DNA zu scheren. Nachdem die Suspension 30 min auf Eis inkubiert hat, wird sie zentrifugiert (14.000 × g, 5 min, 4 °C), um die Proteine von den Zelltrümmern zu trennen. Der Überstand mit den Proteinen wird abgenommen und in 1,5 ml Eppendorf Tubes bei –70 °C gelagert.
3.2.1.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen (BRADFORD, 1976)
Bei dieser Methode wird die Farbänderung ausgenutzt, die entsteht, wenn der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G250 an Proteine bindet. Dabei kommt es zu einer Verschiebung der Absorption zu 595 nm (blau), bei der die Protein-konzentration der zu analysierenden Lösung bestimmt und mit der von Standard-Proteinlösungen verglichen wird. Als Proteinstandard wird eine Rinderserum-Albumin(BSA)-Lösung verwendet, mit dem eine Eichgerade erstellt wird, deren Absorptionswerte den Konzentrationen von 1 – 10 µg / µl entsprechen. Zur Erstellung der Eichgerade und Vermessung der Proben werden die gewünschten Mengen der BSA-Lösung bzw. 1 – 4 µl der Proben mit bidest. Wasser auf 800 µl aufgefüllt und 200 µl Bradford-Reagenz dazugegeben. Nach mindestens 2 min Stehenlassen bei Raumtemperatur werden die Absorptionswerte mittels Photometer gemessen.
3.2.1.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (LÄMMLI, 1970) Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dient der Auftrennung und Analyse von Proteinen. Unter denaturierenden Bedingungen lagern sich SDS-Moleküle an die Proteine proportional zu deren Länge und damit deren Gewicht an.
Material und Methoden 35
Dadurch werden so viele negative Ladungen gebunden, dass die Ladungen der Aminosäuren des Proteins selbst keine Rolle spielen und zur Anode wandern.
Die Proteinextrakte werden in Westernladepuffer aufgenommen und durch Kochen denaturiert. Der Puffer enthält SDS und β-Mercaptoethanol, die die Neubildung von Sekundärstrukturen verhindern.
Das SDS-Polyacrylamid-Gel besteht aus einem Sammel- und einem Trenngel. Das Sammelgel hat große Poren und einen niedrigen pH-Wert. Die Proteine passieren es schneller und sammeln sich unabhängig vom Ladungsvolumen an der Grenze zum Trenngel. Im Trenngel, das kleinere Poren und einen höheren pH-Wert hat, werden die Proteine nach der Größe aufgetrennt. Durch die Verwendung von Protein-standards kann die Größe der analysierten Proteine bestimmt werden.
Zuerst wird das Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet, um einen glatten Gelrand zu gewährleisten und die Polymerisation unter Sauerstoffabschluß zu beschleunigen. Nach einer Stunde ist das Gel polymerisiert, der Alkohol wird abgegossen, das Sammelgel auf das Trenngel gegossen und der Kamm luftblasen-frei im Sammelgel fixiert. Nach der Polymerisation wird der Kamm entfernt, und das Gel kann mit den Proben (50 µg Protein pro Spur) beladen werden. Die elektro-phoretische Auftrennung der Proteine erfolgt bei Raumtemperatur in 1 × Lämmli-Puffer innerhalb 3 – 5 Stunden bei 25 – 50 mA.
3.2.1.4.4 Western Blot-Technik
Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine werden durch den Transfer auf eine Membran immobilisiert. Dabei bleibt das Trennmuster und die Immunreaktivität der Proteine erhalten.
Der Transfer erfolgt durch eine elektrische Spannung, wobei die SDS-beladenen Proteine wieder zur Anode wandern. Danach wird die Membran mit einem gegen ein bestimmtes Protein gerichteten Antikörper inkubiert. An diesen bindet dann ein Zweitantikörper, der gegen den Erstantikörper gerichtet ist und mit Meerrettich-peroxidase konjugiert ist. Dieses Enzym katalysiert unter alkalischen Bedingungen mit Wasserstoffperoxid die Oxidation von Luminol zu einem Dioxetan, das instabil ist.
Bei dessen Zerfall entsteht Licht, das mittels Autoradiographie nachgewiesen wird.
Material und Methoden 36
Diese Chemolumineszens wird in Gegenwart von Verstärkern wie Phenol erhöht (Enhanced Chemolumineszens = ECL).
Für den Transfer der Proteine auf die Membran wird der „semi-dry“-Transfer verwendet: Die Membran wird zur Aktivierung zunächst in technischem Methanol inkubiert, und dann 5 min mit bidestilliertem Wasser gespült. Schließlich wird sie für 15 min in 1 × Towbin-Puffer + 10 % Methanol äquilibriert. Dann wird das Gel aus der Glaskammer entfernt und vom Sammelgel abgetrennt. Gel und Membran werden zwischen mehrere Lagen in Towbin-Puffer getränkte Whatman-Papiere in die wasserfeuchte Blotkammer (Anode) gelegt. Von der Anode zur Kathode hin werden folgende Schichten übereinandergelegt: 9 Whatman-Papiere, die PVDF-Membran, das Trenngel, und nochmals 9 Whatman-Papiere. Die einzelnen Lagen werden jeweils mit Hilfe eines Douncers luftblasenfrei aufeinandergelegt. Der Deckel (Kathode) wird auf die Kammer gelegt und die Kammer bei 4 °C an eine Spannungsquelle angeschlossen. Die Stromstärke berechnet sich aus Fläche der Membran × Stromstärke pro cm2 . Die Stromstärke pro cm2 beträgt 1,2 mA, die Blot-Zeit 70 min. Die Membran wird mit Blockierpuffer (5 % Milchpulver in TBS-T) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen abzudecken.
Immunologischer Nachweis: Der spezifische Antikörper wird nach Vorgabe in Blockierpuffer verdünnt. In dieser Lösung wird die Membran über Nacht bei 4 °C auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Am folgenden Tag wird ungebundener Antikörper durch dreimaliges Waschen für je 10 min mit Waschpuffer (TBS-T) entfernt.
Anschließend gibt man den Zweitantikörper, ebenfalls in Blockierpuffer verdünnt, auf die Membran und inkubiert bei Raumtemperatur auf einem Überkopfschüttler. Nach einer Stunde wird die Membran erneut dreimal 10 min mit TBS-T und einmal 10 min mit TBS gewaschen, um auch hier die nichtgebundenen Antikörper zu entfernen. Der Nachweis der Antikörperkomplexe erfolgt mit dem ECL-Western Blotting Detection Kit. Die beiden Reagenzien werden im Verhältnis 1 : 1 miteinander gemischt und auf die Membran gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 – 2 min wird die ECL-Flüssigkeit abgegossen, die Membran in eine Autoradiographiekassette geklebt und mit Klarsichtfolie bedeckt. Röntgenfilme werden bei Raumtemperatur zwischen 1 sec und bis zu 30 min exponiert.
Material und Methoden 37
Zur Lagerung der Membranen wird die ECL-Flüssigkeit nach der Autoradiographie mit bidestilliertem Wasser abgewaschen. Die Membranen können danach entweder trocken gelagert oder für den Nachweis anderer Proteine weiterverwendet werden.
Im letzteren Fall müssen durch „Strippen“ die bereits gebundenen Antikörper entfernt werden, ohne die Epitope der Proteine zu verändern. Eine schon getrocknete Membran wird vorher mit Methanol 5 min lang aktiviert und 5 min in bidestilliertem Wasser gewaschen. Dann wird die Membran zweimal für 10 min in 0,2 M Glycin/HCl inkubiert. Mit bidestilliertem Wasser wird anschließend der Glycinpuffer entfernt und die Membran zweimal 5 min lang in 1 x TBS gewaschen. Bevor die Membran mit einem neuen Erstantikörper inkubiert werden kann, muss sie erneut mit Blockier-puffer geblockt werden (siehe oben).
Material und Methoden 38
3.2.2 Tierexperimentelle Methoden
3.2.2.1 Tiermodell
Als Tiermodell werden Nacktmäuse verwendet. Sie sind Träger einer Mutation auf dem Chromosom 11 im Bereich des „nude“-Gens (nu), die autosomal rezessiv vererbt wird. Die typischen Merkmale der homozygoten Tiere bestehen in einer Thymusaplasie, verminderten Lebensfähigkeit und Haarlosigkeit. Dabei besitzen die Mäuse zwar etwa die gleiche Anzahl an Haarbälgen wie normal behaarte Tiere, allerdings ist der Keratinisierungsprozess gestört. Dies führt zu kurzen, verkrüppelten und gebogenen Haarschäften, die selten aus den Haarfollikeln auswachsen (KÖPF-MAIER et al., 1990).
Darüber hinaus tritt während der Embryonalentwicklung keine Differenzierung der Thymusanlage in Rinde und Mark ein. Der Thymus bleibt klein und funktionslos und wird nicht mit lymphoiden Zellen besiedelt. Durch die Thymusaplasie entfallen die thymusabhängigen Funktionen des Immunsystems (PELLEITIER u. MONTPLAISIR, 1975). Die reduzierte Lymphozytenanzahl besteht fast vollständig aus B-Zellen.
Durch das Fehlen der Oberflächenantigenerkennung von Zellen über den MHC-Komplex wird ein Abstoßen körperfremder Gewebe verhindert. Das Ausschalten der zellulären Abwehr ermöglicht Allo- und Xenotransplantationen ohne Abstoßungs-reaktion. Durch die Funktionseinschränkung des Immunsystems sind die Tiere anfällig gegenüber Infektionen und müssen deshalb in Isolatoren gehalten und mit autoklaviertem Futter gefüttert werden (siehe Abb. 5). Weibliche, ca. 12 Wochen alte, etwa 22 – 25 g schwere Nacktmäuse vom Stamm Swiss nu/nu werden von der Firma Charles River, Frankreich, bezogen. Die Tiere werden in Gruppen zu je vier Tieren in Makrolonkäfigen Typ II (360 cm2) in Isolatoren bei 21 – 22 °C, 45 – 50 % relativer Luftfeuchtigkeit und 12 Luftwechseln je Stunde gehalten. Der Tag-Nacht-Rhythmus beträgt 12 Stunden bei künstlichem Licht. Die Mäuse werden ad libitum mit Standardfutter und autoklaviertem Wasser versorgt. Manipulationen an den Tieren erfolgen in S2-Sicherheitswerkbänken.
Material und Methoden 39
Abbildung 5: Isolator angeschlossen an eine S2-Sicherheitswerkbank.
3.2.2.2 Tierversuch
3.2.2.2.1 Inokulation von Tumorzellen in Nacktmäuse
Als Tumormodell dienen Nacktmäuse, heterotransplantiert mit HeLa-Zellen. Dazu werden Tumorzellen nach Abnahme des Kulturmediums und Waschen mit PBS vom Boden der Kulturflaschen abtrypsiniert und die Zellen mit Hilfe der Neubauer Zählkammer gezählt. Nach Zentrifugieren für 5 min bei 800 rpm wird das Medium abgenommen und die Zellen in PBS resuspendiert. Um Mediumreste zu entfernen, werden die Zellen noch zweimal mit PBS gewaschen, wobei zwischen den Wasch-schritten jeweils zentrifugiert und der Überstand abgesaugt wird. Nach dem letzten Zentrifugieren folgt die Verdünnung der Zellen mit PBS auf die gewünschte Inokulationskonzentration (Zellzahl pro Maus in 100 µl) und auf Eis gestellt. Die Tumorzellen werden umgehend durch Injektion mit einer 1 ml-Spritze und einer
Material und Methoden 40
Kanüle Nr. 14 subkutan am rechten medialen Oberschenkels der Mäuse inokuliert.
Dazu wird nach Desinfektion der Hautstich an der Flanke der Maus, etwa auf Höhe der letzten Rippen, gesetzt und die Kanülenspitze subkutan bis zum Oberschenkel geführt. Dort werden die Zellen abgesetzt.
3.2.2.2.2 Behandlung
Zwei Tage nach der Tumorzellinokulation beginnt die Behandlung mit Sulindac über das Futter. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in 2 Behandlungsgruppen (Kontrolle, Sulindac) zu je 8 Mäusen eingeteilt. Die Kontrollgruppe erhält das gleiche Futter ohne Zusatz von Sulindac.
Das Futter setzt sich wie folgt zusammen: 0,5 g Ascorbinsäure, 10 g Fructose, 58 mg L-Lysin-Monohydrat, 37 g Lactalbumin-Hydrolysat, 4 ml Multivitamine für Nager und 125 mg Sulindac werden in ca. 150 ml Wasser gelöst und mit 500 g Grundfutter gründlich vermengt. 15 g Gelatine aus Schweinehaut lässt man in ca. 150 ml Wasser etwas quellen, verflüssigt sie durch Erhitzen in der Mikrowelle (1 min bei 750 W) und gibt sie noch warm zur Futtermischung. Das Ganze wird mit Hilfe des
Das Futter setzt sich wie folgt zusammen: 0,5 g Ascorbinsäure, 10 g Fructose, 58 mg L-Lysin-Monohydrat, 37 g Lactalbumin-Hydrolysat, 4 ml Multivitamine für Nager und 125 mg Sulindac werden in ca. 150 ml Wasser gelöst und mit 500 g Grundfutter gründlich vermengt. 15 g Gelatine aus Schweinehaut lässt man in ca. 150 ml Wasser etwas quellen, verflüssigt sie durch Erhitzen in der Mikrowelle (1 min bei 750 W) und gibt sie noch warm zur Futtermischung. Das Ganze wird mit Hilfe des