4. Ergebnisse
4.1 In-vitro-Ergebnisse
4.1.1 Sulindac und Sulindac-Sulfid hemmen das Wachstum der Zervixkarzinomzelllinie HeLa
Da die tumorhemmende (antineoplastische) und die chemopräventive (anti-dysplastische) Wirksamkeit von Sulindac etwa bei Kolontumoren nachgewiesen ist, stellte sich die Frage der Effektivität von Sulindac bei viral bedingten Tumoren. Als Modell wurde zunächst die HPV18-positive Zelllinie HeLa verwendet, die aus einem Zervixkarzinom etabliert wurde.
Zunächst sollte der Einfluss von Sulindac auf das Wachstum und den Zellzyklus von HeLa-Zellen untersucht werden. Dazu wurden die Zellen mit Konzentrationen von 100 µM und 500 µM Sulindac für 24 h behandelt und nach der Ernte durchflusszytometrisch hinsichtlich der Verteilung der Zellzyklusphasen untersucht.
Bei einer Konzentration von 100 µM erhöhte sich der Anteil von Zellen in der S-Phase gegenüber der unbehandelten Kontrolle von 27,1 % auf 32,4 % nur leicht, während der Anteil der Zellen in der G1-Phase unverändert blieb (Abb. 6). Der Prozentsatz von Zellen in G1 stieg hingegen bei einer Sulindac-Konzentration von 500 µM stark an (von 56,5 % auf 72,1 %), wohingegen der Anteil der Zellen in der S-Phase von 27,1 % auf 22,9 % sank.
Sulindac wird im Organismus im Darm und in der Leber durch Reduktion in seinen aktiven Metaboliten Sulindac-Sulfid umgewandelt (siehe 2.5.3). Um zu testen, ob auch Sulindac-Sulfid das Wachstum von HeLa-Zellen hemmt, wurden diese für 24 h mit 200 µM und 300 µM Sulindac-Sulfid behandelt und mittels Durchflusszytometrie untersucht. Schon bei 200 µM Sulindac-Sulfid ließ sich der G1-S-Übergang hemmen;
der G1-Anteil stieg von 63 % auf 81 %, wohingegen der Prozentsatz der S-Zellen von 24,6 % auf 14,5 % sank. 300 µM hatten einen sehr ähnlichen Effekt (G1-Anteil 81,1 %, S-Anteil 13 %) (Abb. 7).
Somit verursachen Sulindac und Sulindac-Sulfid eine konzentrationsabhängige Hemmung des G1-S-Übergangs in HeLa-Zellen.
Ergebnisse 47
Kontr. Sul 100 Sul 500
Abbildung 6: Sulindac hemmt konzentrationsabhängig den G1-S-Übergang in HeLa-Zellen.
Durchflusszytometrie: Analyse von unbehandelten und mit verschiedenen Konzentrationen von Sulindac behandelten HeLa-Zellen. Der Prozentsatz der Zellen in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen (S, G1, G2/M) ist durch die Balkengröße mit Standardabweichung angegeben. Die Tabelle zeigt den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (Kontr.): unbehandelte Zellen;
(Sul 100): 100 µM Sulindac; (Sul 500): 500 µM Sulindac; Behandlungsdauer: 24 h
Kontr. SulSul 200 SulSul 300
Abbildung 7: Sulindac-Sulfid hemmt konzentrationsabhängig den G1-S-Übergang in HeLa-Zellen. Durchflusszytometrie: Analyse von unbehandelten und mit verschiedenen Konzentrationen von Sulindac-Sulfid behandelten HeLa-Zellen. Der Prozentsatz der Zellen in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen (S, G1, G2/M) ist durch die Balkengröße mit Standardabweichung angegeben. Die Tabelle zeigt den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (Kontr.): unbehandelte Zellen;
(SulSul 200): 200 µM Sulindac-Sulfid; (SulSul 300): 300 µM Sulindac-Sulfid; Behandlungsdauer: 24 h
Ergebnisse 48
4.1.2 Sulindac-Sulfid hemmt das Wachstum von Zervixkarzinomzellen unabhängig vom HPV-Typ und der viralen Kopienzahl
HeLa-Zellen sind HPV18 positiv und tragen 20 – 50 virale Kopien. Damit unter-scheiden sie sich von anderen Zervixkarzinomzellen, die wiederum untereinander hinsichtlich des HPV-Typs und der viralen Kopienzahl variieren. Deswegen wurden eine weitere HPV18-positive Zervixkarzinomzelllinie, SW756, mit 10 – 50 Kopien, und zwei HPV16-positive Zelllinien, SiHa mit 1 – 2 Kopien und CaSki mit 60 – 600 Kopien, verwendet. Im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Relevanz erfolgte die Behandlung dieser Zelllinien mit dem biologisch aktiven Metaboliten Sulindac-Sulfid.
Zur Beurteilung einer Wachstumshemmung durch Sulindac-Sulfid wurden Zervixkarzinomzellen mittels Durchflusszytometrie untersucht. Bei einer 24stündigen Behandlung von SW756-, SiHa- und CaSki-Zellen mit 200 µM Sulindac-Sulfid sank der Anteil der Zellen in der S-Phase bei SW756-Zellen von 18,1 % auf 3,7 %, bei SiHa-Zellen von 20,7 % auf 6,1 % und bei CaSki-Zellen von 27,8 % auf 13,9 % ab.
Der G1-Phasenanteil stieg dagegen bei SW756-Zellen von 71,4 % auf 86,4 %, bei SiHa-Zellen von 68,1 % auf 86,2 % und bei CaSki-Zellen von 51,4 % auf 75,0 % an.
Abbildung 8: Sulindac-Sulfid hemmt den G1-S-Übergang in Zervixkarzinomzellen unabhängig vom HPV-Typ und viraler Kopienzahl. Durchflusszytometrie: Einfluss von Sulindac-Sulfid auf den Zellzyklus der Zervixkarzinomzellen SW756, SiHa und CaSki. Der Prozentsatz der Zellen in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen ist durch die Balkengröße mit Standardabweichung angegeben.
Die Tabelle zeigt den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten.(Kontr.): unbehandelte Zellen;
(SulSul): 200 µM Sulindac-Sulfid; Behandlungsdauer: 24 h
Ergebnisse 49
Der aktive Sulindac-Metabolit Sulindac-Sulfid hemmt Zervixkarzinomzellen unabhängig vom HPV-Typ und der viralen Kopienzahl im G1-S-Übergang des Zellzyklus.
4.1.3 Sulindac und Sulindac-Sulfid supprimieren die Expression des HPV Oncoproteins E7 in HeLa-Zellen
In Zervixkarzinomzellen sind die viralen Oncoproteine zur Aufrechterhaltung des tumorigenen Phänotyps notwendig (VON KNEBEL DÖBERITZ et al., 1988). Da Sulindac bzw. sein aktiver Metabolit Sulindac-Sulfid das Wachstum von Zervix-karzinomzellen blockiert, lag es nahe, die Expression der viralen Oncoproteine zu untersuchen. Das E7-Protein ist dabei an der Induktion des G1-S-Übergangs wesentlich beteiligt (BANKS et al., 1990).
Um den Einfluss von Sulindac auf die Expression des HPV-Oncoproteins E7 zu testen, wurden Proteinextrakte von behandelten HeLa-Zellen in Western Blots untersucht. Eine Konzentration von 100 µM Sulindac hatte keine feststellbare Aus-wirkung auf die E7-Expression, bei 500 µM ließ sich das Protein jedoch im Western Blot nur noch als extrem schwache Bande nachweisen (Abb. 9).
Abbildung 9: Konzentrationsabhängige Suppression von E7 durch Sulindac. Western Blot aus unbehandelten und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Sulindac behandelten HeLa-Zellen.
Gesamtproteinextrakte wurden in 12 %igem SDS-Gel aufgetrennt und die Membran mit Antikörpern gegen HPV18-E7 inkubiert. Die Membran wurde mit Anti-Aktin zur Kontrolle gleicher Proteinladungen nachinkubiert. (-): unbehandelte Kontrolle; (100): 100 µM; (500): 500 µM; (Sul): Sulindac;
Behandlungsdauer: 24 h
Ergebnisse 50
Um herauszufinden, ob auch der aktive Sulindac-Metabolit Sulindac-Sulfid die Expression von E7 supprimiert, wurden HeLa-Zellen für 24 h mit 100 µM, 200 µM und 300 µM Sulindac-Sulfid behandelt.
Im Western Blot zeigte sich, dass schon 200 µM ausreichten, um die E7-Expression so stark zu supprimieren, dass sie im Western Blot nicht mehr nachzuweisen war.
Auch bei einer Konzentration von 300 µM Sulindac-Sulfid blieb E7 komplett supprimiert (Abb. 10).
Abbildung 10: Konzentrationsabhängige Suppression von E7 durch Sulindac-Sulfid. Western Blot aus unbehandelten und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Sulindac-Sulfid behandelten HeLa-Zellen. Gesamtproteinextrakte wurden in 12 %igem SDS-Gel aufgetrennt und die Membran mit Antikörpern gegen HPV18-E7 inkubiert. Die Membran wurde mit Anti-Aktin zur Kontrolle gleicher Proteinladungen nachinkubiert. (-): unbehandelte Kontrolle; (100): 100 µM; (200): 200 µM; (300): 300 µM; (SulS): Sulindac-Sulfid; Behandlungsdauer: 24 h
Sulindac und Sulindac-Sulfid induzieren eine konzentrationsabhängige Suppression von E7 in HeLa-Zellen. Dabei korreliert der Verlust der E7-Expression mit der Hemmung des G1-S-Übergangs in HeLa-Zellen (vergleiche Abb. 6 und 7).
4.1.4 Sulindac-Sulfid supprimiert die E7-Expression in HPV16- und HPV18- positiven Zervixkarzinomzelllinien
Obgleich die Suppression von E7 mit der G1-S-Hemmung korreliert, ließ sich nicht ausschließen, dass es sich dabei um ein singuläres Phänomen von HeLa-Zellen handelte bzw. auf den HPV-Typ oder die viralen Kopienzahl beschränkt war. Mit den in der Zellzyklus-Analyse verwendeten weiteren Zelllinien ließ sich die Frage beantworten, ob die Suppression von E7 ein genereller Sulindac-Sulfid-Effekt war.
Ergebnisse 51
Deshalb wurden CaSki-, SiHa- und SW756-Zellen mit 100 µM, 200 µM und 300 µM Sulindac-Sulfid für 24 h behandelt und anschließend die nach Zellernte gewonnenen Proteinextrakte im Western Blot getestet. In SW756- und CaSki-Zellen war schon bei einer Konzentration von 200 µM die E7-Expression kaum noch nachweisbar, in SiHa-Zellen war dies allerdings erst bei 300 µM der Fall (Abb. 11).
100 200 300
Abbildung 11: Sulindac-Sulfid führt zur konzentrationsabhängigen Suppression von E7 unabhängig von HPV-Typ und der Kopienzahl. Western Blot aus unbehandelten und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Sulindac-Sulfid behandelten SW756-, SiHa- und CaSki-Zellen. Gesamtproteinextrakte wurden in 12 %igem SDS-Gel aufgetrennt und die Membran mit Antikörpern gegen HPV18-E7 (SW756) bzw. HPV16-E7 (SiHa und CaSki) inkubiert. Die Membran wurde mit Anti-Aktin zur Kontrolle gleicher Proteinladungen nachinkubiert. (K.): unbehandelte Kontrolle; (100): 100 µM; (200): 200 µM; (300): 300 µM; (SulS): Sulindac-Sulfid; Behandlungsdauer:
24 h
Sulindac-Sulfid supprimiert in verschiedenen Zervixkarzinomzellen konzentrations- abhängig das virale Oncoprotein E7, unabhängig vom HPV-Typ und der viralen Kopienzahl. Allerdings korreliert der E7-Verlust nicht völlig mit der Hemmung des G1-S-Übergangs: Bei 200 µM geht in SW756- und CaSki-Zellen die E7-Suppression mit dem Wachstumsarrest einher, wohingegen die SiHa-Zellen in der G1-Phase arretiert werden trotz weiterer E7-Expression (vergleiche Abb. 8).
4.1.5 Suppression von HPV E7 ist unabhängig von der COX-Hemmung
Sowohl Sulindac als auch Sulindac-Sulfid induzieren die Suppression von E7 in Zervixkarzinomzellen. Beide Substanzen sind als unspezifische COX-Inhibitoren
Ergebnisse 52
bekannt (RIENDEAU et al., 1997, KELLER u. GIARDIELLO, 2003). Deshalb ergab sich die Frage, ob die E7-Suppression von der COX-Hemmung abhängig ist.
Dazu wurden HeLa-Zellen mit selektiven COX-Hemmern behandelt: SC-560 wirkt als ein hochselektiver COX-1-Hemmer (IC50 = 9 nM), und NS-398 blockt hochselektiv die COX-2 (IC50 = 0,1 µM) (CHU et al., 2003). Nach Behandlung der Zellen mit Dosierungen, die in der Literatur üblicherweise verwendet werden (CHU et al., 2003, SMARTT et al., 2003), wurden Proteinextrakte gewonnen und Western Blots durch-geführt (Abb. 12). Beim Vergleich mit der unbehandelten Kontrolle wies keine der Substanzen einen Einfluss auf die E7-Expression auf, bis auf eine minimale Suppression bei 100 µM NS-398. Die Hemmung der Cyclooxygenase hat demnach keinen Einfluss auf die E7-Expression; die Suppression des viralen Oncoproteins E7 durch Sulindac erfolgt daher unabhängig von einer COX-1- oder COX-2-Hemmung.
Abbildung 12: Die spezifische Hemmung von COX-1 oder COX-2 hat keinen Einfluss auf die E7-Expression. Western Blot aus unbehandelten und mit den selektiven Cyclooxygenasehemmern SC-560 (COX-1-Hemmer) und NS-398 (COX-2-Hemmer) behandelten HeLa-Zellen. Gesamt-proteinextrakte wurden in 12 %igem SDS-Gel aufgetrennt und die Membran mit Antikörpern gegen HPV18-E7 inkubiert. Die Membran wurde mit Anti-Aktin zur Kontrolle gleicher Protein- ladungen nachinkubiert. (Kontr.): unbehandelte Kontrolle; SC-560: 1 µM und 10 µM; NS-398: 50 µM und 100 µM; Behandlungsdauer: 24 h
4.1.6 Sulindac und Sulindac-Sulfid induzieren Apoptose in HeLa-Zellen
Für die Wirkung von Sulindac oder Sulindacderivaten in der Therapie sind neben wachstumshemmenden auch Apoptose-auslösende Eigenschaften relevant. Daher wurde untersucht, ob Sulindac Apoptose in Zervixkarzinomzellen induziert.
Ergebnisse 53
Dazu wurden zunächst HeLa-Zellen 24 Stunden lang mit Sulindac behandelt und das Ausmaß der Apoptose über den „sub-G1-peak“ in der Durchflusszytometrie quanti-fiziert. Zusätzlich erfolgte in jedem Fall eine mikroskopisch-morphologische Kontrolle der Apoptose in den Kulturschalen.
Wurden HeLa-Zellen mit Sulindac behandelt, so zeigte sich eine starke konzentrationsabhänge Apoptoseinduktion. Bei 100 µM waren kaum tote Zellen nachweisbar, bei 500 µM finden sich bereits 41,6 % apoptotische Zellen. Mit 1000 µM konnte dies noch auf 64,2 % gesteigert werden (Abb. 13).
0 10 20 30 40 50 60 70
% sub-G1 Zellen
sub-G1 1,1 2,6 41,6 64,2
Kontr. Sul 100 Sul 500 Sul 1000
Abbildung 13: Sulindac induziert konzentrationsabhängig Apoptose in HeLa-Zellen.
Durchflusszytometrie: Analyse von unbehandelten und mit verschiedenen Konzentrationen von Sulindac behandelten HeLa-Zellen. Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen ist durch die Säulengröße mit Standardabweichung angegeben. Die Tabelle zeigt den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (Kontr.): unbehandelte Zellen, (Sul 100): 100 µM Sulindac; (Sul 500):
500 µM Sulindac; (Sul 1000): 1000 µM Sulindac; Behandlungsdauer: 24 h
Behandelte man HeLa-Zellen mit Sulindac-Sulfid, so ließ sich ebenfalls eine starke Induktion von Apoptose beobachten. Bei einer Konzentration von 200 µM betrug der Anteil apoptotischer Zellen 22,5 %, bei 300 µM 34,2 % (Abb. 14).
Ergebnisse 54
Kontr. SulSul 200 SulSul 300
*
Abbildung 14: Sulindac-Sulfid induziert Apoptose in HeLa-Zellen. Durchflusszytometrie: Analyse von unbehandelten und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Sulindac-Sulfid behandelten HeLa-Zellen. Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen ist durch die Säulengröße mit Standardabweichung angegeben. Die Tabelle zeigt den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (Kontr.):
unbehandelte Zellen; (SulSul 200): 200 µM Sulindac-Sulfid; (SulSul 300): 300 µM Sulindac-Sulfid;
Behandlungsdauer: 24 h . * Apoptoserate kleiner 1 %.
Sulindac und Sulindac-Sulfid induzieren in HeLa-Zellen konzentrationsabhängig Apoptose.
4.1.7 Sulindac-Sulfid induziert Apoptose unabhängig vom HPV-Typ und der viralen Kopienzahl
Um zu testen, ob der aktive Sulindac-Metabolit auch in weiteren Zervix-karzinomzelllinien mit unterschiedlichem HPV-Typ und viraler Kopienzahl Apoptose auslösen kann, wurden SW756-, SiHa- und CaSki-Zellen mit einer Konzentration von 200 µM Sulindac-Sulfid behandelt und der Anteil an apoptotischen Zellen mittels Durchflusszytometrie ermittelt.
Sulindac-Sulfid löste in allen verwendeten Zervixkarzinomzelllinien Apoptose aus.
Bei einer 24stündigen Behandlung mit 200 µM wurde in SW756-Zellen 10,4 % und in SiHa-Zellen 13,0 % Apoptose ausgelöst. CaSki-Zellen zeigten nach 24 h keine
Ergebnisse 55
Apoptose, erst nach einer 32stündigen Behandlung ließ sich Apoptose nachweisen (14,2 %) (Abb. 15).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
sub-G1 [%]
sub-G1 1 10,4 1 13 1,7 14,2
Kontr. SulSul Kontr. SulSul Kontr. SulSul
SW756 SiHa CaSki*
+ +
Abbildung 15: Sulindac-Sulfid induziert Apoptose in SW756-, SiHa- und CaSki-Zellen.
Durchflusszytometrie: Analyse von unbehandelten und mit Sulindac-Sulfid behandelten SW756-, SiHa- und CaSki-Zellen. Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen ist durch die Säulengröße mit Standardabweichung angegeben. Die Tabelle zeigt den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (Kontr.): unbehandelte Zellen, (SulSul): 200 µM Sulindac-Sulfid; Behandlungsdauer:
24 h, *Behandlungsdauer: 32 h. + Apoptoserate kleiner 1 %.
Sulindac-Sulfid löst demnach in Zervixkarzinomzellen, unabhängig von HPV-Typ und der viralen Kopienzahl, konzentrationsabhängig Apoptose aus. Die verwendeten Zell-linien zeigen sich dabei unterschiedlich sensibel. HeLa-Zellen sind gegenüber den Apoptose-auslösenden Effekten von Sulindac-Sulfid besonders empfindlich, wohin-gegen sich in CaSki-Zellen erst nach 32stündiger Behandlung Apoptose nachweisen lässt (vergleiche Abb. 14 und 15).
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