Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2012
© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-0
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net 70-0
Prokonvulsiva als pharmakologische Strategie zur Epilepsieprävention
THESE
zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY
– Ph.D. – im Fachgebiet Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover und das Zentrum für Systemische Neurowissenschaften (ZSN) Hannover
vorgelegt von Marta Małgorzata Rattka
Bielsko-Biała Hannover 2012
Supervisor: Prof. Dr. W. Löscher
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. W. Löscher Prof. Dr. G. Bicker Prof. Dr. E. Ponimaskin
1. Gutachten:
Prof. Dr. W. Löscher (Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
Prof. Dr. G. Bicker (Institut für Tierökologie und Zellbiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
Prof. Dr. E. Ponimaskin (Institut für Neurophysiologie der Medizinischen Hochschule Hannover)
2. Gutachten: Prof. Dr. R. Köhling (Institut für Physiologie der Universität Rostock)
Tag der mündlichen Prüfung: 30.03.2012
Gefördert durch ein Stipendium der Friedrich-Ebert-Stiftung. Diese Arbeit ist ein Teilprojekt der DFG-Forschergruppe Neurodegeneration und -regeneration bei ZSN -Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).
Zuzannie Gąsior
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
2. Literaturübersicht ... 3
2.1 Epilepsie ...3
2.2 Temporallappenepilepsie ...4
2.3 Epileptogenese und Epilepsieprävention ...6
2.4. Antikonvulsiva in der Epileptogeneseforschung ...8
2.4.1 Untersuchungen im Tiermodell ... 8
2.4.2 Klinische Studien ...10
2.5 Prokonvulsiva in der Epileptogeneseforschung ... 11
2.6 GABA und Epilepsie ... 12
2.6.1 Theorie der exzitatorischen GABA ...13
2.6.2 Synchronisations-Theorie ...14
2.7 Tiermodelle für Temporallappenepilepsie ... 15
2.7.1 Das Lithium-Pilokarpin-Modell ...17
2.7.2 Das fokale Kainsäure-Modell ...18
2.8 Pentylenterazol (PTZ) ... 19
3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen ...21
4. Material und Methoden ...23
4.1 Tiere ... 23
4.2 Stereotaktische Operation ... 24
4.3.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell ...28
4.3.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ...29
4.5 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells ... 33
4.5.1 Studiendesign ...33
4.5.2 Implantation von Führungsrohren und Ableitelektroden ...33
4.5.3 SE-Induktion ...34
4.5.4 EEG- und Videoüberwachung ...34
4.5.5 Verhaltenstests ...35
4.5.5.1 Der Hyperexzitabilitätstest (HET) ...36
4.5.5.2 Der Elevated-Plus Maze-Test (EPM) ...37
4.5.5.3 Der Open Field-Test (OF) ...39
4.5.5.4 Der Morris Water Maze-Test (MWM) ...39
4.5.6 Phenobarbital-Selektion ...41
4.5.7 Tötung der Tiere und Histologie ...43
4.5.7.1 Transkardiale Perfusion ...43
4.5.7.2 Dekapitation ...44
4.5.7.2.1 Histologie nach Dekapitation ...44
4.6 Studie 2: PTZ-Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell ... 45
4.6.1 Studiendesign ...45
4.6.2 Implantation von Führungsrohren und Ableitelektroden ...46
4.6.3 SE-Induktion ...47
4.6.3.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell ...47
4.6.3.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ...48
4.6.4 PTZ-Schwellenbestimmung ...48
4.6.5 Bestimmung der Latenzzeit im Pilokarpin-Modell ...49
4.6.6 Diazepam-Vorversuch im Pilokarpin-Modell ...50
4.6.7 Bestimmung des ovariellen Zyklusstandes ...50
4.7 Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell .... 50
4.7.1 Pharmakokinetische Vorversuche ...51
4.7.1.1 PTZ-Halbwertszeitbestimmung ...51
4.7.1.2 Etablierung des Infusionsprotokolls ...51
4.7.2 Studiendesign PTZ-Behandlung ...52
4.7.3 Implantation von Ableitelektroden und Führungsrohren ...53
4.7.4 Implantation von Kathetern in die Vena jugularis externa ...54
4.7.5 SE-Induktion ...55
4.7.5.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell ...55
4.7.5.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ...56
4.7.6 PTZ-Infusion ...56
4.7.7 EEG- und Videoüberwachung ...58
4.8 Statistik ... 58
5. Ergebnisse ...59
5.1 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells ... 59
5.1.1 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ...59
5.1.2 Entwicklung von spontanen, wiederkehrenden, epileptische Anfällen im fokalen Kainsäure-Modell ...61
5.1.3 Verhaltensänderungen im fokalen Kainsäure-Modell ...66
5.1.3.1 Der Hyperexcitabilitätstest (HET) ...66
5.1.3.2 Der Elevated-Plus Maze-Test (EPM) ...69
5.1.3.4 Der Morris Water Maze-Test (MWM) ...75
5.1.4 Die Phenobarbital-Selektion ...77
5.1.5 Histologie ...80
5.1.5.1 Histologie der 1. Gruppe ...80
5.1.5.2 Histologie der 2. Gruppe ...80
5.2 Studie 2: Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell ... 83
5.2.1 Die SE-Induktion ...83
5.2.1.1 Die SE-Induktion und Latenzzeit im Pilokarpin-Modell ...83
5.2.1.2 Die SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ...85
5.2.2 Der PTZ-Schwellentest ...87
5.2.2.1 Schwellenveränderungen nach SE im Pilokarpin-Modell ...89
5.2.2.2 Schwellenveränderungen nach SE im fokalen Kainsäure-Modell ...90
5.2.3 Vergleich beider SE-Modelle ...91
5.2.4 Einfluss des ovariellen Zyklusstandes auf die PTZ-Schwelle ...92
5.3 Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell .... 98
5.3.1 Pharmakokinetische Vorversuche ...98
5.3.1.1 Bestimmung der Plasmahalbwertszeit von PTZ ...98
5.3.1.2 Korrelation zwischen konvulsiver PTZ-Dosis und dem Plasmaspiegel ... 100
5.3.1.3 Etablierung des Infusionsprotokolls ... 101
5.3.2 Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin-Modell (60 Minuten SE-Gruppe) ... 102
5.3.2.1 SE-Induktion ... 102
5.3.2.2 PTZ-Behandlung ... 102
5.3.2.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ... 102
5.3.3 Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin-Modell (90 Minuten SE-Gruppe) ... 103
5.3.3.1 SE-Induktion ... 103
5.3.3.2 PTZ-Behandlung ... 103
5.3.3.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ... 104
5.3.4 Infusionsversuche im fokalen Kainsäure-Modell (13-16 Stunden-Gruppe) ... 105
5.3.4.1 SE-Induktion ... 105
5.3.4.2 PTZ-Behandlung ... 105
5.3.4.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ... 105
5.3.5 Infusionsversuche im fokalen Kainsäure-Modell (7 Tage-Gruppe) ... 106
5.3.5.1 SE-Induktion ... 106
5.3.5.2 PTZ-Behandlung ... 107
5.3.5.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ... 107
5.3.5.4 Gemeinsame Auswertung der Kainsäure-Gruppen ... 109
6. Diskussion ... 110
6.1 Einleitung ... 110
6.2 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells. ... 110
6.2.1 SE-Induktion ... 110
6.2.2 Anfallsausprägung nach SE ... 112
6.2.3 Verhaltensänderungen ... 112
6.2.4 Pharmakologische Untersuchungen ... 115
6.2.5 Neurodegeneration ... 117
6.2.6 Zusammenfassung ... 118
6.3 Studie 2: Schwellenversuche im Pilokarpin- und im fokalen Kainsäure-Modell ... 118
6.3.1 Einfluss von Diazepam auf die individuelle Krampfschwelle ... 118
6.3.2 Latenzzeit im Pilokarpin-Modell ... 119
6.3.3 Veränderungen der individuellen Krampfschwelle bei Kontrollen ... 120
6.3.4 Veränderungen der Krampfschwelle nach SE ... 120
6.3.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Krampfschwelle ... 122
6.4 Studie 3: PTZ-Behandlung zur Epilepsieprävention ... 123
6.4.1 Etablierung des Behandlungsprotokolls ... 123
6.4.2 PTZ-Behandlung ... 124
6.5 PTZ zur Epilepsieprävention: Ergebnisse und Ausblick ... 125
7. Zusammenfassung ... 129
8. Summary ... 131
9. Literatur ... 133
10. Anhang ... 142
Publikationen ... 151
Erklärung ... 152
Danksagung ... 153
Abbildungsverzeichnis:
Abb. 1: Epilepsieentstehung und –progression und Möglichkeiten der Intervention. ...8
Abb. 2: Aufsicht auf einen Rattenschädel mit eingezeichneten Kreuzungen der Knochennähte ... 26
Abb. 3: Schematische Darstellung der Lokalisation der Ableitelektrode . ... 27
Abb. 4: Schematische Darstellung der Lokalisation des Führungsrohres ... 27
Abb. 5 :Schematische Darstellung der Lokalisation der Injektionsnadel ... 30
Abb. 6 :Intrahippokampale Mikroinjektion von Kainsäure ... 30
Abb. 7: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie 1 ... 33
Abb. 8: Schematischer Aufbau des Elevated Plus Maze. ... 38
Abb. 9: Schematischer Aufbau des Open field. ... 39
Abb. 10: Schematische Darstellung des Morris Water Maze. ... 40
Abb. 11: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie 2 ... 46
Abb. 12 (A-C): EEG-Veränderungen vor und nach Kainsäure-Mikroinjektion ... 60
Abb. 13 (A-C): Spontane epileptische Anfälle 8 Wochen nach SE-Induktion ... 64
Abb. 14: Tägliche Anfallsfrequenz in der 2. Tiergruppe ... 65
Abb. 15 (A-H): Ergebnisse des HET ... 68
Abb. 16 (A-J): Ergebnisse des EPM. ... 70
Abb. 17 (A-F): Ergebnisse des OF I ... 72
Abb. 18 (A-F): Ergebnisse des OF II ... 73
Abb. 19 (A-F): Ergebnisse OF III ... 74
Abb. 20 : Ergebnisse des MWM. ... 76
Abb. 21 (A-B): MWM: Mittlere Schwimmgeschwindigkeit und Plattformkreuzungen ... 76
Abb. 22: Tägliche Anfallsfrequenz während der PB-Selektion. ... 79
Abb. 23 (A-D): Neurodegeneration im Hippokampus 40 Wochen nach Kainsäure . 82
Abb. 24: Typisches EEG-Muster eines spontanen, epileptischen Anfalls ... 84
Abb. 25: Kein Enfluss von Diazepam (3x10 mg/kg) auf die PTZ-Schwelle... 86
Abb. 26 (A-E): EEG-Ableitung während einer PTZ-Schwellenbestimmung. ... 88
Abb. 27 (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen im Pilokarpin-Modell ... 93
Abb. 28 (A-F): Zusammengefasste Verhaltensänderungen nach PTZ-Infusion ... 94
Abb. 29 (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen im fokalen Kainsäure-Modell ... 95
Abb. 30 (A-C): Weitere Endpunkte nach PTZ-Schwellentest ... 96
Abb. 31 (A-C): Verhaltensänderungen nach Ende des PTZ-Schwellentests ... 97
Abb. 32 :Vergleich der PTZ-Schwelle ... 98
Abb. 33: PTZ-Plasmaspiegel ... 99
Abb. 34: Darstellung der konvulsiven PTZ-Dosis ... 100
Abb. 35: Wöchentliche Anfallsfrequenz im Pilokarpin-Modell ... . 104
Abb. 36: Wöchentliche Anfallsfrequenz im fokalen Kainsäure-Modell I. ... 106
Abb. 37 :Wöchentliche Anfallsfrequenz im fokalen Kainsäure-Modell II. ... 108
Abb. 38 :Wöchentliche Anfallsfrequenz nach PTZ-Behandlung kombinierte Daten ... 109
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Stereotaktische Koordinaten für die Implantation von DG-Elektroden und
Führungsrohren. ... 25
Tabelle 2: Modifizierte Anfallsskala nach Racine (1972) ... 32
Tabelle 3: Tabellarische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Verhaltensbatterie ... 35
Tabelle 4: Verwendeter Hypolokomotion-, Hyperlokomotion- und Ataxie-Score. ... 43
Tabelle 5: Übersicht über die Tiergruppen in Studie 2. ... 46
Tabelle 6: Score-Systeme zur Beurteilung der Verhaltensänderungen ... 49
Tabelle 7: Übersicht über die Behandlungsgruppen in Studie 3 ... 53
Tabelle 8: Übersicht über die Zeitpunkte der Katheter-Implantation Studie 3 ... 54
Tabelle 9: Übersicht über die zum SE-Abbruch verwendeten Substanzen ... 56
Tabelle 10: Übersicht über die Überwachungszeitpunkte in den einzelnen Tiergruppen . ... 58
Tabelle 11: Durchschnittliche tägliche Anfallsfrequenz ... 63
Tabelle 12: Phenobarbital-Plasmakonzentration ... 77
Tabelle 13: Mittlerer Neurodegenerationsscore ... 81
Tabelle 14: Latenzzeit und Anfälle in den ersten 3 Tagen nach SE ... 84
Tabelle 15: PTZ-Halbwertszeit der einzelnen Tiere nach 12 mg/kg PTZ Injektion ... 99
Tabelle 16: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h (1. Infusionsprotokoll) ... 101
Tabelle 17: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h (2. Infusionsprotokoll) ... 101
Tabelle 18: Anfälle während der 48 h PTZ-Behandlung... 107
Abkürzungen
Aqua dest. destilliertes Wasser
bzw. beziehungsweise
CA1 Cornu Ammonis Region 1
CA2 Cornu Ammonis Region 2
CA3a Cornu Ammonis Region 3a
CA3c Cornu Ammonis Region 3c
cm Zentimeter
DG Gyrus Dentatus
ECoG Elektrokortikogramm
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EEG Elektroenzephalogramm
EPM Elevated-Plus Maze
g Gramm
GABA Gamma-Amino-Buttersäure
GABAA-Rezeptor Gamma-Amino-Buttersäure-Rezeptor Typ A
h Stunde
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(High Performance Liquid Chromatography)
Hz Herz
ILAE Internationale Liga gegen Epilepsie
(International League Against Epilepsy)
i. p. intraperitoneal
i. v. intravenös
KCC2 Kalium-Chlorid-Cotransporter Subtyp 2
kg Kilogramm
M Mol
Mg Milligramm
min Minute
mmol Millimol
mm Millimeter
mV Millivolt
MWM Morris Water Maze
NaCl Natriumchlorid
NKCC1 Natrium-Kalium-Chlorid-Cotransporter
Subtyp 1
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
OF Open Field
p.a. pro analysi
PTZ Pentylentetrazol
RNA Ribonukleinsäure
s Sekunde
s. c. subkutan
SE Status epileptikus
SEM gemittelter Standartdfehler (Standard Error of Mean)
µl Mikroliter
WHO Weltgesundheitsorganisation (World Health
Organisation)
z. B. zum Beispiel
1
1. Einleitung
Epilepsie ist die häufigste chronische neurologische Erkrankung des Menschen. Sie ist charakterisiert durch das Auftreten von spontanen, wiederkehrenden epileptischen Anfällen (CHANG und LOWENSTEIN 2003). Sie kann einhergehen mit psychischen Begleiterkrankungen wie Depressionen, Angststörungen oder kognitiven Dysfunktionen (JACOBS et al. 2009, JONES et al. 2010). Die häufigste Epilepsieform bei Erwachsenen ist die Temporallappenepilepsie. Bei symptomatischen Epilepsieformen, wie der Temporallappenepilepsie, ist ein Hirninsult (z. B. Schädel-Hirn-Trauma, Status epileptikus) der primäre Auslöser der Erkrankung. Der Prozess zwischen Hirninsult und Epilepsieentstehung wird als Epileptogenese bezeichnet (LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011). Das Risiko einer posttraumatischen Epilepsie liegt je nach Insult durchschnittlich bei 20%, das bedeutet, dass 20% der Patienten nach Insult an Epilepsie erkranken werden. Bei schwersten, penetrierenden Schädel-Hirn- Traumata, z. B. nach Schussverletzungen, steigt das Risiko sogar auf 50% (TEMKIN et al. 1995, AARABI et al. 2000, Richtlinien der American Association for the Trauma Surgery 2001, EFTEKHAR et al. 2009). Die Erkrankung tritt in den meisten Fällen in den ersten zwei Jahren nach Hirninsult auf (ENGLANDER et al. 2003). Die derzeitige Therapie der Epilepsie ist auf eine symptomatische Anfallsunterdrückung beschränkt.
Obwohl Patienten aus der Risikogruppe leicht identifiziert werden können, gibt es bis heute keine Möglichkeit, diese Menschen präventiv zu behandeln (DICHTER 2009 PITKÄNEN und LUKASIUK 2011).
Aus diesem Grund ist es dringend notwendig, Strategien zu entwickeln, die die Epileptogenese verhindern oder zumindest modulieren könnten (DICHTER 2009 LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011). Der Versuch, Patienten präventiv mit Medikamenten zu behandeln, die zur symptomatischen Anfallsunterdrückung verabreicht werden, war nicht erfolgreich, da sich bis heute keiner dieser Stoffe als antiepileptogen erwies (TEMKIN et al. 1990 und 1999, TEMKIN 2001 und 2009). Während der Epileptogenese kommt es zu einer Reihe von Veränderungen im Gehirn.
2
Zu ihnen zählen der Verlust von Neuronen, Entzündungsprozesse und die Entstehung von neuronaler Übererregbarkeit (STABLES et al. 2002). Zu rationalen Strategien der Antiepileptogenese zählen die Neuromodulation, die Entzündungshemmung, die Neuroprotektion und die Immunmodulation (LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN 2010, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011). Die Neuromodulation ist eine Strategie der Antiepileptogenese, die das Entstehen der neuronalen Übererregbarkeit nach einem Insult verhindern soll (LÖSCHER und BRANDT 2010 a). In dieser Arbeit soll die Neuromodulation nach Insult durch Behandlung mit einem GABAA-Rezeptor-Antagonisten erfolgen. Unter physiologischen Bedingungen prokonvulsiv wirkende GABAA-Rezeptor-Antagonisten konnten in experimentellen Untersuchungen antikonvulsive Effekte in epileptischen Netzwerken entfalten (KHAZIPOV und HOLMES 2003, KLAASSEN et al. 2006). Der Einfluss solcher Mittel auf die Epileptogenese wurde bislang nicht untersucht.
Ziel dieser Arbeit war deshalb die Behandlung mit dem GABAA-Rezeptor- Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ) als pharmakologische Strategie der Epilepsieprävention. Das antiepileptogene Potential von PTZ wurde in zwei Rattenmodellen für Temporallappenepilepsie untersucht. Der Behandlungserfolg wurde anhand des Auftretens von spontanen Anfällen nach Behandlung beurteilt.
3
2. Literaturübersicht
2.1 Epilepsie
Epilepsien sind die häufigsten neurologischen Erkrankungen des Menschen. Etwa 50 Millionen Menschen sind weltweit von Epilepsien betroffen, das entspricht etwa 1%
der Weltbevölkerung (WHO 2009). Es handelt sich bei Epilepsien um eine seit langem bekannte Gruppe von Erkrankungen, die bereits im Altertum beschrieben wurden. Epilepsien sind charakterisiert durch spontane wiederkehrende Anfälle, die infolge von pathologischen, synchronen Neuronenentladungen auftreten (FISHER et al. 2005). Nach Nomenklatur der Internationalen Liga gegen Epilepsie (International League Againist Epilepsy ILAE) lassen sich sowohl Epilepsien, als auch epileptische Anfälle verschiedenen Gruppen zuordnen.
Epilepsien kann man je nach Ätiologie in idiopathisch, symptomatisch und kryptogen einteilen (SHORVON 2011). Bei idiopathischen Epilepsien handelt es sich um Erkrankungen genetischen Ursprungs. Symptomatische Epilepsien haben einen primären Hirninsult, wie z. B. ein Schädel-Hirn-Trauma als Auslöser. Kryptogene Epilepsien sind unbekannten Ursprungs, vermutlich symptomatisch. Durch immer genauer werdende diagnostische Verfahren werden heutzutage auch kleinste Hirnveränderungen besser erkannt, so dass eine Vielzahl von früher kryptogen eingestuften Epilepsien nun als symptomatisch klassifiziert wird. Aus diesem Grund wird vermutet, dass die Mehrzahl kryptogener Epilepsien eigentlich symptomatischer Natur ist (SHORVON 2011).
Epileptische Anfälle können ebenfalls klassifiziert werden. Je nachdem, ob während eines Anfalls beide Hirnhemisphären betroffen sind oder nicht, werden Anfälle als fokal oder generalisiert bezeichnet. Bei fokalen Anfällen entsteht der Anfall im epileptischen Fokus, meist in den Strukturen des limbischen Systems im Temporallappen und bleibt auf den Fokus begrenzt. Fokale Anfälle können bei erhaltenem Bewusstsein auftreten (einfache fokale Anfälle), oder mit Bewusstseinsverlust einhergehen (komplex fokale Anfälle).
4
Wenn sich ein fokaler Anfall über den Fokus hinaus auf beide Hirnhemisphären ausbreitet, sprechen wir von sekundär generalisierten Anfällen. Primär generalisierte Anfälle können mit tonisch-klonischen Krämpfen einhergehen (konvulsiver Anfall).
Es kann aber auch zu einer kurzen Bewusstseinstrübung ohne Krämpfe kommen (Absence-Anfall) (SHORVON 2011) .
Epilepsien werden ganzheitlich als Epilepsie-Syndrom zusammengefasst (FISHER et al. 2005). Neben epileptischen Anfällen kann die Krankheit mit einer Reihe von psychiatrischen Begleiterkrankungen einhergehen, die bedeutend für die Lebensqualität der Betroffenen sind. Zu den häufigsten psychiatrischen Komorbiditäten zählen Depressionen, Angststörungen, Psychosen und kognitive Dysfunktionen (KANNER 2011). Ein weiterer Faktor, der für die Lebensqualität der Patienten von Bedeutung ist, ist die immer noch große Stigmatisierung der Erkrankung (GARCIA-MORALES et al. 2008, JONES et al. 2010).
2.2 Temporallappenepilepsie
Temporallappenepilepsie ist die am häufigsten auftretende Epilepsieform bei Erwachsenen. Sie ist außerdem die Epilepsieform mit der höchsten Anzahl der therapieresistenten Fälle und somit von besonderer Bedeutung für die medizinische Forschung (ENGEL 1996 a). Auf dem Markt vorhandene Medikamente können vielen Patienten helfen, die Anfälle zu kontrollieren, jedoch wird weniger als die Hälfte der Patienten dauerhaft anfallsfrei (SPENCER 2002).
Bei dieser Erkrankung ist der Epilepsieherd in den Strukturen des Temporallappens lokalisiert (vorwiegend im Hippokampus). Die Temporallappenepilepsie ist gekennzeichnet durch wiederkehrende, spontane Anfälle (komplex-fokal und sekundär generalisiert), neuronale Degeneration und psychiatrische Begleiterkrankungen wie Depressionen und Lern- und Gedächtnisstörungen (MAJORES et al. 2004, JONES et al. 2010). Ein möglicher Grund für die Verknüpfung psychiatrischer Auffälligkeiten mit Temporallappenepilepsien ist die Tatsache, dass die Anfälle im Temporallappen entstehen und dieser für emotionales Verhalten eine besondere Rolle spielt (SCHACHER et al. 2006).
5
Die Neurodegeneration, auch hippokampale Sklerose genannt, betrifft bestimmte Regionen des Hippokampus (Hiluszellen des Gyrus Dentatus, Pyramidalzellschichten CA1 und CA3c) (MARGERISON und CORSELLIS 1966, SLOVITER 1994, KÄLVIÄINEN et al. 1998, MAJORES et al. 2004).
Die Temporallappenepilepsie ist eine symptomatische Epilepsieform. Der Erkrankung geht ein primärer Hirninsult voraus. Eine Vielzahl von Ereignissen kann das Entstehen einer Temporallappenepilepsie begünstigen. Zu den häufigsten Hirninsulten zählen Schädel-Hirn-Traumata, Hirntumore, ein lang anhaltender epileptischer Anfall, welcher als Status epileptikus (SE) bezeichnet wird, Fieberkrämpfe, Schlaganfälle oder Infektionen des zentralen Nervensystems (STABLES et al. 2002). Der Prozess zwischen Hirninsult und ersten spontanen epileptischen Anfällen wird als Epileptogenese bezeichnet. Während der Epileptogenese kommt es zu einer Reihe von Veränderungen im Gehirn, unter anderem zu neuronaler Übererregbarkeit, Entzündung und Neurodegeneration.
Welcher dieser Prozesse ursächlich für die Epilepsieentstehung ist, ist zur Zeit nicht bekannt (LÖSCHER und BRANDT 2010 a).
Da es bislang nicht möglich ist, der Epilepsieentstehung bei Risikopatienten durch prophylaktische Behandlung nach einem Insult entgegenzuwirken, ist die gegenwärtige Therapie auf eine symptomatische beschränkt (DICHTER 2009 Alle auf dem Markt erhältlichen Antiepileptika sind antikonvulsive Stoffe, welche symptomatisch die Anfälle unterdrücken, ohne zu einer Heilung zu führen. Die Einnahme von Antiepileptika ist mit Nebenwirkungen verbunden, welche einen Einfluss auf die Lebensqualität der Betroffenen haben können. Das größte Problem der gegenwärtigen Therapie mit Antiepileptika ist jedoch die Tatsache, dass bis zu 75% der Patienten mit Temporallappenepilepsie pharmakoresistent sind (SPENCER 2002). Das bedeutet, dass sie trotz Therapie mit zwei verschiedenen Antiepileptika (kombiniert oder als Monotherapie) nicht dauerhaft anfallsfrei werden (KWAN et al.
2010). Für pharmakoresistente Patienten ist eine chirurgische Resektion des epileptischen Fokus oftmals die einzige Alternative. Auch nach einem solchen Eingriff werden nicht alle Patienten anfallsfrei. Viele sind trotz Resektion auf eine Therapie mit Antiepileptika angewiesen (FOLDVARY et al. 2001, LÖSCHER und SCHMIDT 2006). Aus diesen Gründen ist die Antiepileptogeneseforschung von größter Bedeutung für Patienten aus der Risikogruppe.
6
2.3 Epileptogenese und Epilepsieprävention
Als Epileptogenese werden die Prozesse bezeichnet, die im Gehirn zur Epilepsieentstehung nach einem initialem Insult führen. Die Latenzzeit zwischen primärem Hirninsult und der Epilepsieentstehung bietet ein Zeitfenster für eine präventive Behandlung (STABLES et al. 2002, STAFSTROM und SUTULA 2005).
Leider ist nicht bekannt, welcher Zeitpunkt nach Insult optimal für eine präventive Behandlung ist. Es gibt Hinweise aus tierexperimentellen Arbeiten, dass eine solche Behandlung schnellstmöglich erfolgen sollte (CHEN et al. 2007, ECHEGOYEN et al.
2009). In einer Studie von PITKÄNEN et al. (2004) konnte jedoch selbst eine Behandlung sieben Tage nach Hirninsult noch zu krankheitsmodifizierenden Effekten führen. Die Latenzzeit kann bei Menschen viele Jahre andauern (FRENCH et al.
1993, SILLANPÄÄ und SCHMIDT 2006). In Nagermodellen, die zur Epilepsieforschung etabliert wurden, ist sie auf einige Tage bis Wochen beschränkt.
Während der Epileptogenese kommt es zu verschiedenen Veränderungen im Gehirn.
Insultassoziierter Neuronenverlust, Entzündung, synaptische Reorganisation und neuronale Übererregbarkeit sind einige von ihnen (STABLES et al. 2002). Da bis heute nicht geklärt ist, welche dieser Prozesse ursächlich an der Epilepsieentstehung beteiligt sind, und welche eine Konsequenz der Epilepsie darstellen, ist ein rationaler antiepileptogener Ansatz schwierig. Als rationale Strategien der Antiepileptogenese sind die antiinflammatorische, die immunmodulatorische, die neuromodulatorische sowie die neuroprotektive Strategie zu nennen (PITKÄNEN et al. 2004, VEZZANI und GRANATA 2005, BRANDT et al. 2006, JUNG et al. 2006, ANDRE et al. 2007, ZENG et al. 2009, BRANDT et al. 2010, POLASCHECK et al. 2010, STARK und BAZAN 2011). Neuroprotektion wurde lange Zeit als Strategie zur Epilepsieprävention verfolgt. Obwohl neuroprotektive Stoffe identifiziert werden konnten, blieb die Neuroprotektion ohne Auswirkungen auf die Anfallsentwicklung (ANDRE et al. 2001, BRANDT et al. 2006, ANDRE et al. 2007, POLASCHECK et al.
2010, LANGER et al. 2011). Leider konnte bis heute kein Mittel identifiziert werden, welches einen wahren antiepileptogenen Effekt hervorruft, das heißt, die Epilepsieentstehung nach einem Insult verhindern kann (LÖSCHER und BRANDT 2010 a).
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Der Prozess der Epilepsieentstehung und Progression (Epileptogenese) bietet mehrere Möglichkeiten der therapeutischen Intervention.
Am Anfang des Prozesses steht der initiale Insult. Das sind meist Schädel-Hirn- Traumata, Fieberkrämpfe im Kleinkindalter, ein SE, ein Schlaganfall oder auch eine Infektion des zentralen Nervensystems. Wenn es nicht gelingt, den durch den Insult entstandenen Schaden zu reparieren, kann es durch begünstigende Faktoren wie
„second hit“, Empfindlichkeitsgene oder Komorbiditäten zum Auftreten von spontanen epileptischen Anfällen kommen (WALKER et al. 2002). Der Krankheitsverlauf kann progressiv sein, es können psychiatrische Komorbiditäten auftreten. Oftmals ist die Epilepsie pharmakoresistent, das bedeutet, dass es zu keiner vollständigen Anfallsunterdrückung durch Medikamente kommt (KWAN et al.
2010). Die Zeit zwischen dem initialem Insult und der klinischen Manifestation der Epilepsie, dem Auftreten von spontanen Anfällen, wird als Latenzzeit bezeichnet. Die Latenzzeit bietet mehrere Möglichkeiten der therapeutischen Intervention (LÖSCHER et al. 2008). Das Ziel aller Antiepileptogenese-Studien ist es, eine wirklich antiepileptogene Substanz zu finden, welche das Auftreten von epileptischen Anfällen nach Hirninsult verhindern könnte. Patienten aus der Risikogruppe könnten mit einer solchen Substanz prophylaktisch nach Insult behandelt werden. Leider ist es bis heute nicht gelungen eine solche Substanz zu identifizieren (DICHTER 2009 Es gibt verschiedene Probleme bei therapeutischen Ansätzen. Zum einen die Wahl des geeigneten Behandlungszeitpunktes und der Behandlungsdauer mit einer antiepileptogenen Substanz. Zum anderen die Abgrenzung einer wirklich antiepileptogenen Wirkung von einer Insultmodifizierung und Krankheitsmodifizierung (LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011).
Die Antiepileptogenese ist nur während der Latenzzeit, vor dem ersten Auftreten von epileptischen Anfällen möglich. Eine andere Möglichkeit der therapeutischen Intervention ist die Insultmodifizierung. Eine Insultmodifizierung ist z. B. ein schnellstmöglicher SE-Abbruch oder Fiebersenkung im Falle von Fieberkrämpfen.
Durch Insultmodifizierung soll das Risiko von spontanen Anfällen gesenkt werden, sie kann aber auch einen krankheitsmodulierenden Effekt zufolge haben z. B. einen milderen, nichtprogressiven Krankheitsverlauf. Eine Insultmodifizierung ist nur zeitnah zum Insult möglich. Ein krankheitsmodulierender Effekt wäre auch nach klinischer Manifestation der Epilepsie möglich. Eine symptomatische
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Anfallsunterdrückung mit Antikonvulsiva ist derzeit die einzige Therapie für Epilepsiepatienten (LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN 2010, MANI et al.
2011). Aus diesem Grund ist die Suche nach prophylaktischen Behandlungsmaßnahmen von größter Bedeutung. Die Epilepsieentstehung und Progression ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.
2.4. Antikonvulsiva in der Epileptogeneseforschung
Eine Reihe von Antiepileptika, die zur symptomatischen Anfallsunterdrückung verwendet werden, wurde auf ihr antiepileptogenes Potential hin untersucht.
Solche Untersuchungen fanden in Tiermodellen, aber auch in klinischen Studien an Patienten statt.
2.4.1 Untersuchungen im Tiermodell
Im Kindling-Modell konnte ein antiepileptogener Effekt für Phenobarbital, Valproat und Levetiracetam gezeigt werden (TURNER et al. 1977, SILVER et al. 1991, LÖSCHER et al. 1998, STRATTON et al. 2003). Ein Nachteil des Kindling-Modells ist
Primärer Hirninsult
Intervention
Insult-Modifizierung
Reparatur
Keine Reparatur Keine Konsequenz
Spontane Anfälle
Chronische Epilepsie
Progression der Epilepsie Keine Progression Epileptogenese
z. B. durch „second hit“
Antiepileptogenese
Anfallsunterdrückung
Krankheitsmodifizierung
Abb. 1: Epilepsieentstehung und –progression und Möglichkeiten der Intervention.
Modifiziert nach LÖSCHER et al. (2008).
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jedoch die Tatsache, dass die Tiere in diesem Modell nicht chronisch epileptisch sind, sondern nur akut induzierte Anfälle haben.
Da sie jedoch im Laufe des Kindling-Prozesses immer empfindlicher auf die induzierten Anfälle reagieren und es somit zu chronischen Veränderungen der individuellen Krampfschwelle kommt, wird das Kindling-Modell als Epileptogenese- Modell eingestuft. Weder Phenobarbital, noch Valproat zeigten antiepileptogene Effekte in klinischen Studien (TEMKIN 2001). In post SE-Epilepsiemodellen wurden ebenfalls verschiedene Antiepileptika untersucht. Solche Modelle unterscheiden sich vom Kindling-Modell dadurch, dass die Tiere eine chronische Epilepsie nach einem SE entwickeln (in diesen Modellen ist ein SE der initiale Insult). Bis auf Topiramat konnte für keinen dieser Stoffe ein antiepileptogener Effekt gezeigt werden (BRANDT et al. 2006, SUCHOMELOVA et al. 2006, BRANDT et al. 2007, JESSBERGER et al.
2007, BRANDT et al. 2010, FRANCOIS et al. 2011). Die Behandlung mit den Antiepileptika Valproat, Carisbamat und Topiramat führte zur Krankheitsmodifizierung in post SE-Epilepsiemodellen (BRANDT et al. 2006, SUCHOMELOVA et al. 2006, JESSBERGER et al. 2007, FRANCOIS et al. 2011) . Eine Behandlung mit dem Antiepileptikum Valproat war in Rattenmodellen für Temporallappenepilepsie neuroprotektiv, ein antiepileptogener Effekt konnte jedoch nicht erzielt werden (BRANDT et al. 2006, JESSBERGER et al. 2007). Die einzige Studie, in der ein antiepileptogener Effekt einer Valproat-Behandlung gezeigt werden konnte wurde von BOLANOS et al. (1998) durchgeführt. Da in dieser Arbeit die Anfallsausprägung während der Phase ds Valproatausschleichens untersucht wurde, ist nicht sicher, ob der beobachtete Effekt einen wahren antiepileptogenen Effekt darstellt oder nur auf die antikonvulsive Wirkung des Valproats zurückzuführen ist.
Für Carisbamat konnte im Tiermodell ebenfalls ein starker neuroprotektiver Effekt gezeigt werden. Zusätzlich hatte Carisbamat durch eine Insultmodifikation einen krankheitsmodifizierenden Effekt bei der Ratte, wenn es direkt nach pilokarpin- induziertem SE verabreicht wurde (FRANCOIS et al. 2011). Für Topiramat konnte ebenfalls ein neuroprotektiver Effekt gezeigt werden (RIGOULOT et al. 2004). In einer Studie von SUCHOMELOVA et al. (2006) war eine Topiramat-Behandlung krankheitsmodifizierend. In einer Arbeit von (2002) konnte ein antiepileptogener Effekt mit einer Topiramat-Behandlung erzielt werden, die Studie wurde 2002 als Abstract, jedoch bislang nicht als Manuskript veröffentlicht. Eine klinische Studie zum
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Einsatz von Topiramat nach Schädel-Hirn-Trauma wird derzeit durchgeführt, die Ergebnisse sind noch nicht bekannt (Quelle: clinicaltrials Datenbank).
Insgesamt ist es gelungen neuroprotektive Substanzen zu identifizieren, die Neuroprotektion hatte jedoch keinen Einfluss auf die Epilepsieentstehung. Somit ist es nicht gelungen einen antiepileptogenen Effekt über Neuroprotektion zu erreichen.
2.4.2 Klinische Studien
Es wurden mehrere klinische Studien mit verschiedenen Antiepileptika durchgeführt (MANI et al. 2011). In einer verblindeten, placebokontrollierten Studie von TEMKIN et al. (1990) wurde das Antiepileptikum Phenytoin bei Patienten mit Schädel-Hirn- Trauma untersucht. Die prophylaktische Behandlung startete 24 h nach Insult und wurde ein Jahr lang fortgeführt. Sie hatte keinen Effekt auf die spätere Anfallsentwicklung. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Anfallsentstehung zwischen behandelter Gruppe und Placebo-Gruppe. In einem weiteren Versuch dieser Arbeitsgruppe (TEMKIN et al. 1999) wurden die Antiepileptika Phenytoin und Valproat bei Patienten mit Schädel-Hirn-Trauma untersucht. Drei verschiedene Studiendesigns wurden gewählt: 1. Phenytoin-Behandlung über eine Woche, 2.
Valproat-Behandlung über eine Woche, 3. Valproat-Behandlung über sechs Monate.
Auch in dieser Studie konnte kein antiepileptogener Behandlungseffekt gezeigt werden. In einer Metaanalyse verschiedener Antiepileptogenesestudien konnte für keinen der getesteten Stoffe ein antiepileptogener Effekt gezeigt werden (TEMKIN 2001). Untersucht wurden Diazepam und Phenobarbital bei Patienten mit Fieberkrämpfen, Phenytoin und Valproat bei Hirntumorpatienten und Carbamazepin und Phenobarbital bei Schädel-Hirn-Trauma Patienten (TEMKIN 2001). In einer weiteren Studie von TEMKIN (2009) wurde der Einsatz von Phenobarbital, Carbamazepin, Phenytoin, Valproat und Magnesium bei Patienten nach Schädel- Hirn-Trauma untersucht. Mit keinem dieser Stoffe konnte ein antiepileptogener Effekt erzielt werden. Keines der getesteten Antiepileptika erwies sich bei Risikopatienten zur prophylaktischen Behandlung geeignet. Diese Befunde lassen darauf schliessen, dass Prozesse, die während der Epileptogenese zur Epilepsieentstehung führen, sich von dem Prozess der akuten Anfallsentstehung, welcher durch Antiepileptika
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unterdrückt wird, unterscheiden (WEAVER 2003). Aus diesem Grund werden zunehmend andere Strategien der Antiepileptogenese verfolgt.
2.5 Prokonvulsiva in der Epileptogeneseforschung
Für verschiedene Stoffe, die bei naiven Tieren prokonvulsiv wirken (HALONEN et al.
1995, WALLACE et al. 2003, CHROSCINSKA-KRAWCZYK et al. 2011), konnte experimentell ein antikonvulsiver, neuromodulierender oder krankheitsmodifizierender Effekt gezeigt werden (ARMSTRONG et al. 2009).
Untersucht wurden der Adenosin-Rezeptor-Agonist Koffein, der α2-Rezeptor- Antagonist Atipamezol und der Typ 1 Cannabinoid-Rezeptor-Antagonist Rimonabant.
In einer Studie von RIGOULOT et al. (2003) wurde der Einfluss einer Koffein- Behandlung im Lithium-Pilokarpin-Modell untersucht. Ratten wurden hierfür 15 Tage vor SE und 7 Tage danach oral mit Koffein behandelt. Die Behandlung hatte keinen antiepileptogenen Effekt, wirkte jedoch neuroprotektiv. Die Ergebnisse dieser Studie sind insofern kritisch zu sehen, da die Behandlung bereits vor Insult (SE) startete, was zu einer Modifikation des Insults führen kann und für eine Behandlung von Risikopatienten nicht umsetzbar ist. Das Prokonvulsivum Atipamezol wurde in einer Studie von PITKÄNEN et al. (2004) in einem Rattenmodell für Temporallappenepilepsie (elektrisches post SE-Epilepsiemodell) untersucht. Das Atipamezol wurde verwendet, da es bereits im Rattenmodell für Schlaganfall zum Einsatz kam und dort zu positiven Effekten führte (PUURUNEN et al. 2001). Eine systemische Behandlung mit Atipamezol konnte die Epilepsieentstehung zwar nicht verhindern, die Krankheit hatte jedoch einen milderen, nichtprogressiven Verlauf (PITKÄNEN et al. 2004). Zudem hatte die Behandlung einen neuroprotektiven Effekt.
Die Behandlung führte insgesamt zu einer Krankheitsmodifizierung.
Der Typ 1 Cannabinoid-Rezeptor-Antagonist Rimonabant wurde in mehreren Studien auf sein antiepileptogenes Potential hin untersucht (CHEN et al. 2007, ECHEGOYEN et al. 2009, DUDEK et al. 2010). Der Einsatz von Cannabinoid-Rezeptor- Antagonisten sollte über Neuromodulation zur Verhinderung der neuronalen Übererregbarkeit führen. Es gibt Hinweise, dass Veränderungen der Cannabinoid- Rezeptoren, die nach einem Insult erfolgen, die Entstehung von neuronaler Übererregbarkeit begünstigen können. Eine Applikation von Cannabinoid-Rezeptor-
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Antagonisten sollte die Entstehung der neuronalen Übererregbarkeit durch eine Blockade der Plastizität der Cannabinoid-Rezeptoren nach einem Hirninsult verhindern. In der Studie von CHEN et al. (2007) wurde eine Rimonabant-Applikation 2 min nach Induktion von Fieberkrämpfen bei Ratten vorgenommen.
Sechs Wochen nach Behandlung wurde die neuronale Erregbarkeit anhand einer Kainsäure-Krampfschwelle ermittelt. Die Behandlung mit Rimonabant konnte das Entstehen einer neuronalen Übererregbarkeit sechs Wochen nach Behandlung verhindern. Das Auftreten von spontanen Anfällen wurde in dieser Studie jedoch nicht untersucht. In der Studie von ECHEGOYEN et al. (2009) wurde ein ähnliches Studiendesign in einem Schädel-Hirn-Trauma-Modell bei Ratten angewendet. Auch in diesem Modell gelang es durch eine einmalige Rimonabant-Gabe direkt nach Insult, die neuronale Übererregbarkeit sechs Wochen später zu verhindern. Die neuronale Erregbarkeit wurde auch hier mittels Kainsäure-Krampfschwelle ermittelt.
Da diese Studien vielversprechende Ergebnisse lieferten, wurde Rimonabant auch in einer Antiepileptogenese-Studie untersucht. In der Arbeit von DUDEK et al. (2010) wurde Rimonabant im systemischen Kainsäure-Modell (chemisches post SE- Epilepsiemodell) bei der Ratte untersucht. Die Rimonabant-Applikation erfolgte einmalig nach SE-Induktion. Der Behandlungserfolg wurde mittels EEG- und Videoüberwachung bis zwei Wochen nach SE überprüft. Die Rimonabant- Behandlung hatte in dieser Untersuchung keinen Einfluss auf die Anfallsentwicklung.
Es konnte somit kein antiepileptogener Effekt erzielt werden.
Prokonvulsive GABAA-Rezeptor-Antagonisten wurden ebenfalls in der Epilepsieforschung verwendet. Sie werden im nächsten Kapitel näher beschrieben.
2.6 GABA und Epilepsie
GABA ist als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter von besonderem Interesse für die Epilepsieforschung. Lange wurde Epilepsie als Ungleichgewicht zwischen Inhibition und Exzitation gesehen und die Anfallsentstehung wurde als Konsequenz von Veränderungen des GABAergen Systems beschrieben (ENGEL 1996 b, DALBY und MODY 2001). Eine Reihe von antikonvulsiven Stoffen (Phenobarbital, Diazepam, Vigabatrin, Valproat) wirkt zumindest teilweise über eine Verstärkung des GABAergen Sytems. Neuere Hypothesen belegen jedoch, dass GABA auch
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proepileptogen wirken kann (COHEN et al. 2002, KHAZIPOV und HOLMES 2003, KLAASSEN et al. 2006).
2.6.1 Theorie der exzitatorischen GABA
Es konnte gezeigt werden, dass GABA nach Insult depolarisierend und somit exzitatorisch wirken kann. Bei Epilepsiepatienten kann es zu einem GABA-switch von inhibitorisch zu exzitatorisch kommen. Dieser beruht auf einer veränderten Exprimierung von Chlorid-Cotransportern in bestimmten Hirnregionen (Subiculum).
Eine Hochregulierung von NKCC1 (Subtyp 1 Natrium-Kalium-Chlorid-Cotransporter) bei gleichzeitig gesenkter Exprimierung von KCC2 (Sybtyp 2 Kalium-Chlorid- Cotransporter) an Neuronen führt zu Veränderungen des Chloridhaushaltes. Der intrazelluläre Chloridgehalt steigt an. Das hat zufolge, dass GABA depolarisiered wirkt (COHEN et al. 2002, PALMA et al. 2006). Dieser Zustand ist neonatal physiologisch (BEN-ARI et al. 1989). Es wird vermutet, dass das Gehirn nach einem Insult auf neonatale Funktionsweisen zurückgreift. Somit wird während der Epileptogenese die Ontogenese wiederholt. Dieser ursächlich als Reparaturmechanismus bestehende Prozess ist in diesem Fall kontraproduktiv (KÖHLING 2002, BEN-ARI und HOLMES 2005). In reseziertem humanen Temporallappengewebe von chronisch epileptischen Patienten konnte eine depolarisiernde Wirkung von GABA im Subiculum gezeigt werden (COHEN et al.
2002). In einer Studie von PALMA et al. (2006) konnte die unphysiologische Exprimierung von NKKC1 und KCC2 in Temporallappengewebe von chronisch epileptischen Patienten auf RNA-Ebene gezeigt werden. Ein GABA-switch nach Hirninsult konnte auch tierexperimentell gezeigt werden (PATHAK et al. 2007). In der Studie von PATHAK et al. (2007) konnte bereits 24 h nach pilokarpin-induziertem SE ein positiver EGABA-Shift (GABA Umkehr-Potential) im Hippokampus festgestellt werden. Das lässt auf eine depolarisiernde Wirkung von GABA schließen. Zwei weitere Arbeiten geben indirekt Hinweise auf den GABA-switch (LI et al. 2008, BRANDT et al. 2010). In der Studie von LI et al. (2008) wurde im Maus Pilokarpin- Modell (chemisches post SE-Epilepsiemodell) eine NKCC1-Expression im Hippokampus bereits einen Tag nach SE auf RNA- und Protein-Ebene gezeigt. In der Arbeit von BRANDT et al. (2010) konnte die NKCC1-Expression 24 h sowie vier
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Tage nach pilokarpin-induziertem SE bei Ratten immunhistochemisch gezeigt werden. All das lässt vermuten, dass es nach einem Insult durch eine Veränderte Exprimierung von Chlorid-Cotransportern zu einem GABA-switch von inhibitorisch zu exzitatorisch kommt.
Da eine depolarisiernde Wirkung von GABA neonatal physiologisch ist, lassen sich Anfälle bei Kleinkindern nur schwer mit traditionellen Antikonvulsiva unterdrücken. In verschiedenen tierexperimentellen in vivo und in vitro Studien konnte eine pharmakologische Blockade des NKCC1-Transporters mit dem selektiven NKCC1- Inhibitor Bumetanid Anfälle bei Neonaten unterdrücken (DZHALA et al. 2005 und 2008, GLYKYS et al. 2009). Es wurden ebenfalls Epileptogenesestudien mit Bumetanid vorgenommen, sowohl im modifizierten Kindlig-Modell, als auch in einem post SE-Epilepsiemodell (MAZARATI et al. 2009, BRANDT et al. 2010). In der Kindling-Studie von MAZARATI et al. (2009) gab es Hinweise auf einen antiepileptogenen Effekt einer Bumetanid-Behandlung bei neonatalen Ratten. In der Studie von BRANDT et al. (2010) konnte im Pilokarpin-Modell kein antiepileptogener Effekt mit einer Bumetanid-Behandlung erzielt werden. Dies könnte jedoch an methodischen Schwierigkeiten liegen (kurze Plasmahalbwertszeit und schlechte Penetration der Blut-Hirn-Schranke durch Bumetanid).
Der Einsatz von GABAA-Rezeptor-Antagonisten wäre in Hinsicht auf diese Theorie ebenfalls eine Möglichkeit, um durch antagonistische Wirkung am GABAA-Rezeptor depolarisierende GABA-Aktionen zu verhindern.
2.6.2 Synchronisations-Theorie
GABA kann auch proepileptogen wirken, ohne direkte exzitatorische Eigenwirkung zu entfalten. Nach einem Insult kommt es initial zu einem kompensatorischen Anstieg der GABAergen Inhibition (GREEN 1986). Dadurch werden erregende glutamaterge Neurone zunächst gehemmt. Die gesteigerte GABAerge Inhibition kann jedoch nicht lange aufrechterhalten werden. Nach ihrem Kollaps werden viele erregende glutamaterge Neurone gleichzeitig aus ihrer Hemmung entlassen und können synchron feuern (MANN und MODY 2008). Diese Netzwerk- Synchronisierung führt zu einer Übererregbarkeit in der betroffen Hirnregion, was die Entstehung von epileptischen Anfällen begünstigen kann (MANN und MODY 2008).
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Der Einsatz von GABAA-Rezeptor-Antagonisten wäre in Hinsicht auf diese Theorie sinnvoll, um den initialen Anstieg der GABAergen Inhibition zu verhindern. Das würde in Konsequenz die Netzwerk-Synchronisierung und die daraus resultierende neuronale Übererregbarkeit verhindern.
Es wurden bereits Studien zum Einsatz von GABAA-Rezeptor-Antagonisten in der Epilepsieforschung durchgeführt. In einer Studie von KHAZIPOV und HOLMES (2003) wurden elektrophysiologische Untersuchungen des Hippokampus in vivo an anästhesierten Ratten durchgeführt. Epileptiforme Aktivität wurde mittels Kainsäure erzeugt. Eine Zugabe des GABAA-Rezeptor-Antagonisten Bicucullin konnte die epileptiforme Aktivität unterbinden. Es wurde postuliert, dass GABA zu einer Netzwerk-Synchronisierung führte, die durch Bicucullin-Gabe unterbrochen wurde.
Somit hatte in dieser Untersuchung die Behandlung mit einem GABAA-Rezeptor- Antagonisten einen antikonvulsiven Effekt. In einer Studie von KLAASSEN et al.
(2006) wurden Untersuchungen in einem genetischen Mausmodell für humane autosomal dominante nokturnale Frontallappenepilepsie durchgeführt. In dieser Studie konnte eine subkonvulsive Dosis des GABAA-Rezeptor-Antagonisten Picrotoxin die klinische und elektrographische Anfallsausprägung unterdrücken. In diesen Studien konnte in zwei verschiedenen Modellen und Untersuchungsdesigns gezeigt werden, dass GABAA-Rezeptor-Antagonisten antikonvulsiv wirken können.
Der antikonvulsive Effekt wird auf eine Verhinderung der Netzwerk-Synchronisierung zurückgeführt. Es wurden jedoch bislang keine Antiepileptogenesestudien mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten durchgeführt, obwohl es nach einem Insult wahrscheinlich zu einer Übererregbarkeit infolge von Netzwerk-Synchronisierung kommt. Aus diesem Grund haben wir entschieden eine Behandlung mit dem GABAA- Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ) als Strategie der Epilepsieprävention durchzuführen.
2.7 Tiermodelle für Temporallappenepilepsie
Um Substanzen auf ihr antiepileptogenes Potential hin zu untersuchen, sind geeignete Tiermodelle notwendig. Ein ideales Tiermodell der Temporallappenepilepsie sollte die Konditionen der Temporallappenepilepsie beim Menschen widerspiegeln, d.h. die Epilepsie sollte infolge eines Hirninsults und nach
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einer gewissen Latenzzeit auftreten, die Tiere sollten komplex fokale und sekundär generalisierte Anfälle haben, mit Ursprung im Temporallappen, und es sollten pathologische Veränderungen im Hippokampus auftreten (hippokampale Sklerose) (CURIA et al. 2008). Ferner sollten die Tiere Verhaltensauffälligkeiten zeigen, welche den psychiatrischen Komorbiditäten der Humanpatienten ähnlich sind.
Ein geeignetes Modell sollte Prädiktivität hinsichtlich der klinischen Wirksamkeit der getesteten Arzneimittel aufweisen. Es gibt kein „ideales“ Epilepsiemodell, welches allen Anforderungen genügt und zusätzlich praktikabel ist, aus diesem Grund kann es sinnvoll sein, verschiedene Modelle ergänzend zu nutzen, um falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden (LÖSCHER und BRANDT 2010 a). Es gibt eine Vielzahl an Epilepsie- und Anfallsmodellen, nicht alle sind jedoch gleichermaßen für Antiepileptogenestudien geeignet. Schädel-Hirn-Trauma-Modelle spiegeln die Ätiologie der humanen Epilepsie gut wider. Sie sind jedoch aufgrund von Praktikabilitätsgründen (lange Latenzzeit und die geringe Anzahl an epileptischen Tieren nach Insult) nur bedingt für Antiepileptogenesestudien geeignet (BOLKVADZE und PITKÄNEN 2011, PITKÄNEN et al. 2011 ). Die NIH/NINDS (National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke) empfehlen das Kindling-Modell und post SE-Epilepsiemodelle zur Erforschung von antiepileptogenen Therapien (STABLES et al. 2002). Im Kindling-Modell sind die Tiere nicht chronisch epileptisch, sie haben keine spontanen Anfälle, sondern nur akut induzierte. Trotzdem kommt es bei den Tieren zu chronischen Veränderungen (Senkung der Krampfschwelle). In post SE-Epilepsiemodellen sind die Tiere chronisch epileptisch und haben spontane epileptische Anfälle. Da in dieser Arbeit ausschließlich post SE-Epilepsiemodelle an der Ratte verwendet werden, wird auf diese im Weiteren näher eingegangen.
In post SE-Epilepsiemodellen ist ein SE der initiale Hirninsult. Dieser kann elektrisch, durch Stimulation bestimmter Hirnareale oder chemisch, durch Krampfgifte ausgelöst werden. Diese können entweder systemisch oder fokal also direkt in Zielareale des Gehirns verabreicht werden. Nach einer modellabhängig unterschiedlich langen Latenzzeit kommt es bei den Tieren zu spontanen, wiederkehrenden epileptischen Anfällen. Die Epilepsie bleibt meist lebenslänglich bestehen (LÖSCHER 2002).
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2.7.1 Das Lithium-Pilokarpin-Modell
Pilokarpin ist ein Parasypathomimetikum welches die Blut-Hirn-Schranke passieren kann und dadurch sowohl periphere, als auch zentrale Wirkungen entfaltet. Das systemische Pilokarpin-Modell, als Rattenmodell für Temporallappenepilepsie, wurde erstmals von TURSKI et al. (1983) beschrieben.
Die Applikation von Pilokarpin führt über eine Aktivierung von muskarinergen M1- Rezeptoren zu Krämpfen, die in einen SE übergehen (HAMILTON et al. 1997). Der pilokarpin-induzierte SE wird nicht ausschließlich über eine Aktivierung von muskarinergen Rezeptoren vermittelt, eine Aktivierung der NMDA-Rezeptoren ist für die Aufrechterhaltung des SE verantwortlich (NAGAO et al. 1996, SMOLDERS et al.
1997). Die Pilokarpin-Applikation kann entweder als Bolus (400 mg/kg) oder fraktioniert (10 mg/kg in 30 min Abständen) erfolgen (TURSKI et al. 1983, GLIEN et al. 2001). Die fraktionierte Pilokarpin-Gabe ermöglicht es, durch eine individuelle Dosisanpassung die ansonsten hohe Mortalitätsrate zu senken (GLIEN et al. 2001).
Eine weitere Möglichkeit der Dosissenkung besteht bei einer Vorbehandlung der Tiere mit Lithium. Lithium, das in der Humanmedizin als Antipsychotikum Verwendung findet, führt über eine periphere Entzündungsreaktion zu Schädigungen der Blut-Hirn-Schranke. Es kommt zu einer Ausschüttung von Interleukin 1β und Monozyten, die die Blut-Hirn-Schranke schädigen. Aus diesem Grund kann 12-16 h vor Pilokarpin-Applikation eine Behandlung mit Lithium erfolgen, um durch die Vorschädigung der Blut-Hirn-Schranke die Pilokarpin-Dosis zu senken (MARCHI et al. 2009). Der SE wird für gewöhnlich nach 60-120 min pharmakologisch (meist durch Diazepam) unterbrochen, da die Tiere sonst sterben würden. Nach einer Latenzzeit von Tagen bis Wochen kommt es bei den Tieren zum Auftreten von spontanen, wiederkehrenden epileptischen Anfällen, die lebenslang bestehen bleiben (LEITE et al. 1990 a). Die epileptischen Tiere zeigen hyperexzitables Verhalten sowie kognitive Störungen (RICE et al. 1998, LEITE et al. 1990 b). Bei den Tieren kommt es außerdem zu histopathologischen Veränderungen im Gehirn, die dem Bild der hippokampalen Sklerose des Menschen entsprechen. Die Neuronenverluste sind jedoch stärker ausgeprägt und sind nicht ausschliesslich auf Strukturen des Temporallappens beschränkt (SLOVITER 2005). Zusammenfassend kann man sagen, dass das Lithium-Pilokarpin-Modell ein gutes, durch die systemische Applikation einfaches und praktikables Modell der
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Temporallappenepilepsie darstellt, welches viele der Konditionen der humanen Temporallappenepilepsie widerspiegelt (CURIA et al. 2008). Wie jedes Modell hat es auch Nachteile, das sind vor allem das Ausmaß und die Ausprägung der histologischen Veränderungen und Verhaltensänderungen.
Es wird auch vermutet, dass der pilokarpin-induzierte SE einen derart schweren Insult darstellt, dass es nur bedingt möglich ist, in diesem Modell antiepileptogene Stoffe zu entdecken (SLOVITER 2005). Aus diesem Grund haben wir beschlossen, unsere Arbeit vergleichend an zwei Rattenmodellen für Temporallappenepilepsie durchzuführen.
2.7.2 Das fokale Kainsäure-Modell
Kainsäure ist ein aus der Alge Dignea simplex gewonnenes Glutamat-Analogon, welches, wie Glutamat selbst, erregend wirkt. Es entfaltet seine Wirkung über ionotrope Glutamat-Rezeptoren (Kainat-Rezeptoren) (OLNEY et al. 1974, LODGE et al. 1979, BEN-ARI und COSSART 2000). Eine fokale intracerebrale Kainsäure- Applikation führt bei den Tieren zu epileptischen Anfällen (komplex fokal und sekundär generalisiert), die in einen limbischen SE übergehen (BEN-ARI 1985). Der SE wird in diesem Modell nicht unterbrochen und kann mehrere Stunden andauern.
Trotzdem ist die Mortalitätsrate sehr gering (RAEDT et al. 2009). Die meisten Arbeiten zu diesem Modell wurden in den achtziger Jahren des 20. Jahrhunderts durchgeführt. Neuere Arbeiten wurden von Bragin et al. (1999, 2004, 2005 und 2007) und RAEDT et al. durchgeführt. Die Kainsäure-Applikation kann entweder unter Narkose oder an wachen Ratten erfolgen (CAVALHEIRO et al. 1982, BRAGIN et al.
1999, RAEDT et al. 2009). Eine Applikation unter Narkose ist zwar einfacher durchzuführen, die Narkose kann aber einen insultmodifizierenden Effekt haben und dadurch die spätere Entstehung von epileptischen Anfällen beeinflussen. In einer Studie von CAVALHEIRO et al. (1982) konnte ein kainsäure-induzierter SE zwar spontane epileptische Anfälle auslösen, diese hörten jedoch nach 30 Tagen auf (spontane Remission). Vermutlich ist dies auf einen insultmodifizierenden Effekt der Narkose zurückzuführen. Aus diesem Grund haben wir uns für eine SE-Induktion an wachen Ratten entschieden. Auch in diesem Modell kommt es zur Ausprägung von epileptischen Anfällen nach einer Latenzzeit von Tagen bis Wochen (BABB et al.
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1995, RAEDT et al. 2009). In der Studie von RAEDT et al. (2009) konnte eine Progression der Krankheit gezeigt werden. Die Tiere zeigen Verhaltensänderungen wie gesteigerte Aggressivität und kognitive Dysfunktionen (HANDELMANN und OLTON 1981, CAVALHEIRO et al. 1982).
Eine einseitige Kainsäure-Injektion in die CA3-Region des Hippokampus führt primär zu Schäden der ipsilateralen Injektionsseite. Betroffen sind vor allem die CA3a- und CA3c-Region, sowie die Hilusneurone des Gyrus Dentatus. Die CA1-Region und die Körnerzellschicht des Gyrus Dentatus werden relativ verschont (RAEDT et al. 2009).
Die Veränderungen treten dosisabhängig auf (HANDELMANN und OLTON 1981, CAVALHEIRO et al. 1982) . Die histopathologischen Veränderungen spiegeln das Bild der hippokampalen Sklerose bei Humanpatienten gut wider (BABB et al. 1995, RAEDT et al. 2009). Dadurch, dass der SE in diesem Modell nicht abgebrochen wird, variiert die SE-Länge von Tier zu Tier, was einen Nachteil des Modells darstellt.
Durch die fokale Applikation der Kainsäure sind die Neurodegeneration und die Verhaltensänderungen moderater als in systemischen post SE-Epilepsiemodellen.
Aus diesem Grund wollten wir dieses Modell für unser Labor etablieren.
2.8 Pentylenterazol (PTZ)
PTZ ist ein GABAA-Rezeptor-Antagonist, der seine Wirkung durch Bindung an der Picrotoxin-Bindungsstelle im Inneren des Chloridionophors entfaltet (RAMANJANEYULU und TICKU 1984, HUANG et al. 2001). Durch seine antagonistische Wirkung am GABAA-Rezeptor ist PTZ prokonvulsiv (MACDONALD und BARKER 1977). PTZ wurde erstmalig in den dreißiger Jahren des 20.
Jahrhunderts zur Krampftherapie bei Behandlung von Patienten mit Depression eingesetzt (FINK 1972 und 1984). Diese Form der Behandlung wurde durch die elektrokonvulsive Therapie ersetzt. PTZ wurde außerdem als zentrales Analeptikum bei Narkosezwischenfällen verwendet. Durch seine geringe therapeutische Breite ist es für diese Indikation jedoch obsolet (COPER und HERRMANN 1988). PTZ wird experimentell als anxiogener (JUNG et al. 2002) und aufmerksamkeitssteigernder Stoff verwendet. In einem Maus-Modell des Down-Syndroms konnte eine PTZ- Behandlung die Langzeitpotenzierung und dadurch die Kognition verbessern (FERNANDEZ et al. 2007).
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In der experimentellen Epilepsieforschung wird PTZ zur Anfallsinduktion verwendet.
Die akute Anfallsinduktion wird auch im PTZ-Schwellentest genutzt. Mittels des PTZ- Schwellentests kann die individuelle Krampfschwelle bestimmt werden. Der Test kann durch subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Applikation durchgeführt werden.
Die intravenöse Applikation erhöht die Sensitivität des Tests durch individuelle Dosierung. Während des Tests wird PTZ intravenös bis zum Auftreten eines Krampfes verabreicht. Anhand der Zeit bis zum Auftreten des Anfalls, der PTZ- Konzentration und -Infusionsrate und des Gewichtes des Tieres, kann die individuelle Krampfschwelle ermittelt werden. Diese wird ausgedrückt in der PTZ-Dosis [mg/kg], die nötig war, um den Anfall auszulösen. Der Test kann angewendet werden, um Medikamente auf eventuelle antikonvulsive oder prokonvulsive Wirkung zu untersuchen und findet breite Verwendung in der pharmazeutischen Industrie (ORLOFF et al. 1949, LÖSCHER 2009). Der PTZ-Schwellentest kann bei einem Tier mehrmals wiederholt werden und ermöglicht es, Änderungen der individuellen Krampfschwelle zu erfassen, z. B. nach Prämedikation mit verschieden Medikamenten. Dadurch, dass PTZ seine Wirkung am GABAA-Rezeptor entfaltet, ist es vorwiegend prädiktiv für Medikamente mit GABA-potenzierendem Wirkungsmechanismus und könnte Hinweise auf Veränderungen des GABAergen Systems geben (LÖSCHER 2009 und2011).
Es gibt eine Reihe von Untersuchungen, die den PTZ-Metabolismus bei Ratten beschreiben. Die PTZ-Plasmahalbwertszeit liegt bei 2-3h (ESPLIN und WOODBURY 1956, VOHLAND und ZUFELDE 1976, RAMZAN und LEVY 1985). PTZ wird bei der Ratte in der Leber metabolisiert und renal ausgeschieden. Es penetriert die Blut-Hirn- Schranke und breitet sich im Gehirn aus (ESPLIN und WOODBURY 1956). Die prokonvulsive Wirkung wird durch den Hippokampus und parahippokampale Regionen (GOLARAI et al. 1992, STRINGER 1994, WALSH et al. 1999, QIAN et al.
2011) aber auch durch den mamillothalamischen Trakt vermittelt (MIRSKI und FERRENDELLI 1986 und 1987). Es gibt bislang keine Studien über den Einsatz einer PTZ-Behandlung zur Epilepsieprävention.
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3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen
Es ist bislang nicht möglich, die Epilepsieentstehung nach einem Hirninsult zu verhindern. In zahlreichen Studien wird versucht, die Epileptogenese durch unterschiedliche Strategien zu verhindern. Während der Epileptogenese kommt es zu einer Reihe von Veränderungen im Gehirn, unter anderem zur neuronalen Übererregbarkeit, zur Entzündung und zu Neuronenverlusten. In dieser Arbeit haben wir uns auf die neuronale Übererregbarkeit fokussiert. Mit einer pharmakologischen Strategie wollen wir die neuronale Übererregbarkeit nach einem Insult verhindern, um in Konsequenz die Epileptogenese zu verhindern. Da es bis heute keine Möglichkeit gibt, Patienten aus klar definierbaren Risikogruppen nach einem Insult präventiv zu behandeln, ist eine Forschung auf diesem Gebiet von größter Bedeutung. Da konservative Strategien einer Behandlung mit antikonvulsiven Mitteln nach Insult bis heute nicht erfolgreich waren, wird der Einsatz von prokonvulsiven Mitteln in der Antiepileptogeneseforschung immer häufiger diskutiert. Grund dafür ist die Annahme, dass bei der Epileptogenese andere Mechanismen eine Rolle spielen als bei der akuten Anfallsentstehung und deshalb der Einsatz von Antikonvulsiva ohne Erfolg blieb. Es gibt Hinweise, dass der Einsatz von Stoffen, die eigentlich prokonvulsiv wirken, von Vorteil sein könnte. In diesem Projekt soll der prokonvulsive GABAA-Rezeptor-Antagonist PTZ zur Verhinderung der neuronalen Übererregbarkeit verwendet werden. Die Wahl eines GABAA-Rezeptor-Antagonisten hat folgende Gründe: Trotz der früheren Annahmen, dass Epilepsie durch einen Mangel an GABAerger Inhibition ausgelöst wird, gibt es zunehmend Hinweise, dass der inhibitorische Transmitter GABA auch proepileptogen wirken kann (KHAZIPOV und HOLMES 2003, KLAASSEN et al. 2006). Zum einen konnte gezeigt werden, dass eine nach Hirninsult kompensatorisch gesteigerte GABAerge Inhibition nach ihrem Kollaps erregende Netzwerke synchronisieren kann (MANN und MODY 2008). Zum anderen wurde ein GABA-switch von inhibitorisch zu exzitatorisch gezeigt (COHEN et al. 2002, PATHAK et al. 2007). Dieser beruht auf einer Veränderung in der Expression von Chlorid-Cotransportern nach einem Insult.
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Ziel dieser Arbeit war es, durch Applikation von PTZ in subkonvulsiver Dosierung die initiale GABA-Hochregulierung nach einem Insult zu verhindern und somit der Netzwerk-Synchronisierung entgegenzuwirken. Eine Behandlung mit PTZ wäre ebenfalls bei einem GABA-switch sinnvoll, da PTZ die depolarisiernde Wirkung von GABA antagonisieren könnte. Für andere GABAA-Rezeptor-Antagonisten (Picrotoxin, Bicucullin) konnte sowohl in vivo, als auch in vitro, ein antikonvulsiver Effekt auf epileptische Netzwerke gezeigt werden (KHAZIPOV und HOLMES 2003, KLAASSEN et al. 2006). Der Einfluss eines solchen Stoffes auf die Epileptogenese wurde jedoch noch nicht untersucht. Unsere Arbeitshypothese lautete:
Eine präventive Behandlung mit subkonvulsiven PTZ-Dosen nach Insult wirkt antiepileptogen.
Diese Arbeitshypothese wollten wir in zwei Rattenmodellen für Temporallappenepilepsie testen, im systemischen Pilokarpin-Modell und im fokalen Kainsäure-Modell. Da wir das fokale Kainsäure-Modell für unser Institut erst etablieren mussten, ergab sich für die Modelletablierung folgende Arbeitshypothese:
Das fokale Kainsäure-Modell ist ein geeignetes Rattenmodell für Temporallappenepilepsie, welches ein moderateres Modell darstellt als das systemische Pilokarpin-Modell.
Um Veränderungen des GABAergen Systems nach Insult zu beschreiben, haben wir Veränderungen der individuellen Krampfschwelle nach SE untersucht. Das sollte uns helfen, den am besten geeigneten Behandlungszeitpunkt nach SE herauszufinden.
Diese Untersuchungen wurden vergleichend in beiden Epilepsiemodellen durchgeführt. Unsere Arbeitshypothese lautete hier:
Ein SE führt als initialer Insult zu Veränderungen des GABAergen Systems, welche sich modellunabhängig im PTZ-Schwellentest als Veränderungen der individuellen Krampfschwelle erfassen lassen.
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Untersuchung des antiepileptogenen Potentials von PTZ. Die Schwellenversuche waren Vorrausetzung zur Festlegung eines Behandlungszeitfensters. Darüber hinaus sollten sie zusätzliche Informationen über den Prozess der Epileptogenese und die zeitlichen Abläufe während dieses Prozesses geben. Die Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells sollte es ermöglichen, dieses chemische SE-Modell bei der Ratte besser zu charakterisieren.
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4. Material und Methoden
Im Anhang befindet sich eine Auflistung der verwendeten Substanzen, Verbrauchsmaterialien und Geräte sowie die Herstellungsprotokolle verwendeter Lösungen und die Färbeprotokolle.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Studien durchgeführt.
Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells.
Studie 2: PTZ-Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell.
Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell.
In allen Studien wurden die Methoden der stereotaktischen Operation, der Status epileptikus-Induktion (SE-Induktion) und der EEG- und Videoüberwachung angewendet, aus diesem Grund werden sie einleitend beschrieben. Die studienspezifischen Details sind dann bei der entsprechenden Studie eingehend erklärt.
4.1 Tiere
Für die Versuche dieser Studien wurden weibliche Sprague Dawley-Ratten von Harlan (Horst, Niederlande) und Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet.
Alle Ratten wogen bei ihrer Ankunft 200-220 g (Alter ~ 9 Wochen). Die Tiere mit EEG-Aufsätzen wurden einzeln in durchsichtigen Makrolonkäfigen Typ III (Ebeco, Caustrop-Rauxel) auf Weichholzgranulat gehalten. Tiere ohne EEG-Aufsätze wurden in Gruppen von 5 Ratten in Makrolonkäfigen Typ IV (Ebeco, Caustrop-Rauxel) gehalten. Sie erhielten Leitungswasser und Standardnagerdiät (Altromin, Lage) ad libitum. Das Umsetzen in saubere Käfige erfolgte einmal pro Woche. Das Futter wurde einmal pro Woche aufgefüllt, das Wasser zweimal pro Woche erneuert. Die weiblichen Ratten wurden ohne männliche Tiere gehalten, um einen synchronen Zyklusstand zu vermeiden. Die Raumtemperatur betrug 22-24° C, die Luftfeuchtigkeit lag bei 50-60%. Die Tiere wurden in einem 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus gehalten (helle Phase von 6-18 Uhr, mitteleuropäische Zeit).
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Nach Ankunft hatten die Tiere mindestens eine Woche, um sich an die neue Umgebung zu gewöhnen, in dieser Zeit wurden sie täglich an den Umgang mit Menschen und die späteren Eingriffe (Fixieren etc.) gewöhnt.
4.2 Stereotaktische Operation
Nach der Eingewöhnungsphase erfolgte die stereotaktische Operation. Dieser Eingriff diente der Implantation von EEG-Ableitelektroden und bei Tieren aus dem fokalen Kainsäure-Modell auch von Führungsrohren zur Kainsäure-Mikroinjektion.
Die bipolaren Ableitelektroden wurden in unserem Institut aus teflonisoliertem, rostfreien Stahldraht (Science Products, Hofheim) hergestellt. Die Führungsrohre wurden, ebenfalls in unserem Institut, aus rostfreiem Edelstahldraht (Schoeller Werke, Hellenthal) hergestellt, waren 17 mm lang und hatten einen Innendurchmesser von 0,52 mm.
Die Methode der stereotaktischen Operation ermöglicht es, bestimmte Gehirnregionen anhand ihrer Lage relativ zu sichtbaren Kreuzungen von Knochennähten an der Schädeloberfläche (z. B. Bregma, Lambda) zu lokalisieren.
Mithilfe von ermittelten Koordinaten aus dem Rattenhirnatlas von PAXINOS und WATSON (2007) kann die Lage von spezifischen Gehirnregionen bestimmt werden.
Diese Technik kann angewendet werden, um Ableit-, Stimulationselektroden, oder auch Führungsrohre zu implantieren oder auch um Substanzen im Verfahren der Mikroinjektion in bestimmte Hirnareale zu injizieren.
Die Ableitelektrode wurde in den rechten Gyrus Dentatus (DG) des Hippokampus implantiert (siehe Abbildung 3). Die Koordinaten waren bereits in unserem Labor etabliert. Das Führungsrohr wurde analog zu BRAGIN et al. (2004) in den rechten, posterioren Hippokampus, 1 mm über der Zielregion (CA3-Region) implantiert (siehe Abbildung 4). Die Koordinaten wurden in Vorversuchen ermittelt und waren anterior- posterior für Ratten von Harlan und Charles River unterschiedlich. Die stereotaktischen Koordinaten für Elektrode und Führungsrohr sind in nachfolgender Tabelle dargestellt
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