5. Ergebnisse
5.2 Studie 2: Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell
5.2.4 Einfluss des ovariellen Zyklusstandes auf die PTZ-Schwelle
Der Zyklusstand wurde mittels Vaginalabstrichen anhand des Zellbildes lichtmikroskopisch bestimmt. Diese Untersuchungen wurden ausschließlich in der fokalen Kainsäure-Gruppe durchgeführt. Die weiblichen Ratten wurden ohne männliche Ratten gehalten, was dazu führte, dass ihr Zyklus nicht synchron war.
Viele Tiere (26 von 31) hatten keinen regelmäßigen Zyklus. Es konnte kein Zusammenhang zwischen Zyklusstand und Höhe der PTZ-Schwelle festgestellt werden, so dass ein hormoneller Einfluss auf die PTZ-Schwelle nicht anzunehmen ist.
93
Abb. 27 (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen, ausgedrückt in mg/kg, im Pilokarpin-Modell im Zeitverlauf. Dargestellt sind Schwellenveränderungen bei Kontrolltieren (A) und Pilokarpin-Tieren (B) in Relation zur Kontrollschwelle, sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt.
Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse der Kontrolltiere wurden mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und dem Bonferroni-Test als post hoc-Test verglichen. Die Ergebnisse der Pilokarpin-Tiere wurden mittels Student`s t-Test verglichen (Kontrollschwelle mit 2-Tages Schwelle). Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Student`s t-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=18, Pilokarpin-Tiere n=15.
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Abb. 28 (A-F): Zusammengefasste Verhaltensänderungen nach PTZ-Infusion (Score I in A, B, C und Score II in D, E, F) im Pilokarpin-Modell. Score I beschreibt die weiteren
Endpunkte nach PTZ-Infusion. Score II beschreibt Verhaltensänderungen nach Ende der PTZ-Infusion.
Dargestellt sind Verhaltensänderungen der Kontrollen (A, D), der Pilokarpin-Tiere (B, E), sowie ein Vergleich beider Gruppen (C, F). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt.
Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse für nichtparametrische Daten (Kruskal Wallis-Test) und dem Dunn`s-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Mann Whitney-U-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=18, Pilokarpin-Tiere n=15.
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Abb. 29: (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen, ausgedrückt in mg/kg, im fokalen Kainsäure-Modell im Zeitverlauf.
Dargestellt sind Schwellenveränderungen der Kontrolltiere (A) und Kainsäure-Tiere (B) in Relation zur Kontrollschwelle, sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt.
Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) und dem Bonferroni-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Student`s t-Test.
Gruppengrößen: Kontrollen n=15, Kainsäure-Tiere n=19.
96 Abb. 30 (A--C): Weitere Endpunkte nach PTZ-Schwellentest, ausgedrückt durch ein Score-System (Score I) im fokalen Kainsäure-Modell im Zeitverlauf.
Dargestellt sind weitere Endpunkte der Kontrolltiere (A) und der Kainsäure-Tiere (B), sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt.
Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse für nichtparametrische Daten (Kruskal Wallis-Test) und dem Dunn`s-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Mann Whitney-U-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=15, Kainsäure-Tiere n=19.
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Abb. 31(A-C): Verhaltensänderungen nach Ende des PTZ-Schwellentests, ausgedrückt durch ein Score-System (Score II), im fokalen Kainsäure-Modell im Zeitverlauf.
Dargstellt sind die Verhaltensänderungen der Kontrolltiere (A) und der Kainsäure-Tiere (B), sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt.
Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse für nichtparametrische Daten (Kruskal Wallis-Test) und dem Dunn`s-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Mann Whitney-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=15, Kainsäure-Tiere n=19.
98
5.3 Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell
5.3.1 Pharmakokinetische Vorversuche
Um ein Infusionsprotokoll für PTZ zu etablieren, wurden pharmakokinetische Versuche durchgeführt. Wichtig am Infusionsprotokoll war die Aufrechterhaltung einer konstanten PTZ-Konzentration im Plasma, die jedoch über die gesamte Behandlungsdauer im subkonvulsiven Bereich bleiben sollte. Zum einen wurde die PTZ-Plasmahalbwertszeit bestimmt. Zum anderen sollte der Zusammenhang zwischen individueller Krampfschwelle [mg/kg] und dazugehöriger PTZ-Plasmakonzentration [µg/ml] untersucht werden. Des Weiteren wurden die beiden errechneten Infusionsdosen von 15 und 60 µg/kg/min auf Nebenwirkungen und Erreichen der Zielplasmakonzentration untersucht.
5.3.1.1 Bestimmung der Plasmahalbwertszeit von PTZ
Die Bestimmung der PTZ-Plasmahalbwertszeit wurde an 4 Tieren durchgeführt, an 2 naiven Ratten und an 2 Ratten 24 h nach pilokarpin-induziertem SE.
-5 +2 +4 +6 +9 +14 +22 0
10 20 30
# Pilokarpin-Tiere
Kainsäure-Tiere PTZ-Schwelle Modellvergleich
PTZ [mg/kg]
Abb. 32 : : Vergleich der PTZ-Schwelle, ausgedrückt in mg/kg, in beiden SE-Modellen im Zeitverlauf (siehe Legende). Signifikante Unterschiede werden durch eine Raute # angezeigt. Die Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt und wurden mittels Student`s t-Test verglichen. Gruppengrößen: Kainsäure-Tiere n=19, Pilokarpin-Tiere n=15.
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Alle Ratten erhielten eine intravenöse Applikation von 12 mg/kg PTZ. Nach 15 min, 1 h, 2 h und 4 h wurde bei den Tieren retrobulbär Blut entnommen und die PTZ-Plasmakonzentration wurde mittels HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle und Abbildung 33 dargestellt. Bei einem Tier (MR 144) war der PTZ-Plasmaspiegel von Anfang an sehr niedrig, was vermutlich auf eine paravenöse Injektion zurückzuführen ist. Die mittels PK Solutions Software errechnete mittlere PTZ-Halbwertszeit lag bei 3,3 h (Daten aller Tiere als Mittelwert).
0 1 2 3 4
0 5 10 15
naive Tiere n=2 SE-Tiere n=2
PTZ-Plasmahalbwertszeit
Zeit [h]
PTZ [µg /ml]
Abb. 33: PTZ-Plasmaspiegel [µg/ml] im Zeitverlauf, als Rechtecke dargestellt naive Tiere, als Kreise dargestellt post SE-Tiere (siehe Legende).
Tier PTZ [µg/ml]
0,25 h
PTZ [µg/ml]
1 h
PTZ [µg/ml]
2 h
PTZ [µg/ml]
4 h
Halbwertszeit [h]
MR 105 11,41 10,57 5.94 4,45 2,59
MR 108 13,03 12,14 9,14 3,07 1,73
MR 151 post
SE-Tier 11,48 11,22 10,13 7,4 5,69
MR 144 post
SE-Tier 7,02 3,89 3,03 2,78 3,22
Tabelle 15: PTZ-Halbwertszeit der einzelnen Tiere nach 12 mg/kg PTZ Injektion i.v.. Die ermittelten Plasmaspiegel sind in µg/ml Plasma angegeben.
100
5.3.1.2 Korrelation zwischen konvulsiver PTZ-Dosis und dem Plasmaspiegel Um den Zusammenhang zwischen konvulsiver PTZ-Dosis und dem dazugehörigen Plasmaspiegel zu erfassen, haben wir den PTZ-Schwellentest durchgeführt und direkt nach dem Krampf (Myoklonus) Plasmaspiegel bestimmt. Der PTZ-Schwellentest wurde wie in Kapitel 4.6.4 beschrieben durchgeführt. Direkt nach dem Myoklonus wurde bei den Tieren retrobulbär Blut entnommen (unter Tetracain-Lokalanästhesie). Der PTZ-Gehalt der Plasmaproben wurde mittels HPLC analysiert.
Der Versuch wurde an 2 naiven Ratten und 2 Ratten 24 h nach pilokarpin-induziertem SE durchgeführt. Die Plasmaspiegel [µg/ml] waren hochsignifikant mit der errechneten PTZ-Schwelle [mg/kg] korreliert, Korrelationskoeffizient r=0,9831 (p=0,0085). Es gab keinen Unterschied zwischen den naiven- und den post SE-Tieren. Da die niedrigste konvulsive Dosis bei 14 mg/kg lag und diese mit einem Plasmaspiegel von 18 µg/ml korrelierte, haben wir uns entschlossen in den Infunsionsversuchen eine Plasmakonzentration von 10 µg PTZ pro ml Plasma anzustreben. Das Ziel war, einen Plasmaspiegel aufrechtzuerhalten, der im subkonvulsiven Bereich liegt.
Abb. 34: Darstellung der konvulsiven PTZ-Dosis [mg/kg] in Verhältnis zur PTZ- Plasmakonzentration [µg/ml]. Dargestellt die Tiere 24 h nach pilokarpin-induziertem SE, und naive Tiere (siehe Legende). Die Korrelation wurde mittels Pearson`s–Korrelationstest ermitelt.
0 10 20 30 40
0 10 20 30 40
PTZ-Schwelle versus Plasmaspiegel
SE-Tiere naive Tiere
PTZ im Plasma [µg/ml]
PTZ [mg/kg]
101 5.3.1.3 Etablierung des Infusionsprotokolls
Als subkonvulsive Plasmakonzentration haben wir anhand der PTZ-Schwellenversuche und der pharmakokinetischen Vorversuche PTZ-Plasmaspiegel von 10 µg/ml festgelegt. Um diese Plasmakonzentration aufrechtzuerhalten, haben die Ratten (n=3) der ersten Behandlungsgruppe einen Bolus von 10 mg/kg und zur Aufrechterhaltung eine Infusion von 15 µg/kg/min erhalten. Vierundzwanzig und 48 Stunden nach Infusionsbeginn wurde bei den Tieren retrobulbär Blut entnommen und der PTZ-Plasmaspiegel mittels HPLC analysiert. Die PTZ-Plasmaspiegel sind in nachfolgender Tabelle dargestellt. Da die Zielkonzentration von PTZ im Plasma nicht erreicht werden konnte, wurde in der nächsten Tiergruppe (n=2) das Infusionsprotokoll auf 60 µg/kg/min umgestellt. Bei beiden Tieren lag die ermittelte Plasmakonzentration im Bereich der Zielplasmakonzentration (siehe Tabelle 17).
Tier PTZ [µg/ml] nach 24 h PTZ [µg/ml] nach 48 h
MR 138 2,48 -
MR 139 1,75 3,11
BUM 36 1,63 1,15
Tabelle 16: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h nach Infusion von 15 µg/kg/min PTZ. Ein leeres Feld bedeutet, dass keine Blutprobe entnommen werden konnte.
Tier PTZ [µg/ml] nach 24 h PTZ [µg/ml] nach 48 h
MR 156 8,38 9,53
MR 157 7,18 10,23
Tabelle 17: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h nach Infusion von 60 µg/kg/min PTZ.
Weder in der 15 µg-Gruppe, noch in der 60 µg-Gruppe kam es bei den naiven Ratten zu PTZ-induzierten Nebenwirkungen. Aus diesem Grund haben wir uns entschlossen, das zweite Infusionsprotokoll in allen weiteren Versuchen zu verwenden.
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